Modul Praktikum Bioteknologi - 2022

UMC/FAR/MODUL/SFA3102/001/01
PANDUAN PRAKTIKUM
BIOTEKNOLOGI FARMASI
Penyusun:
Nur Aziz, S.Farm., Ph.D
Fibe Yulinda Cesa, S.Farm., M.Biomed
PROGRAM STUDI FARMASI

FAKULTAS SAINS DAN TEKNOLOGI
UNIVERSITAS MA CHUNG
2022
Halaman Pengesahan
No Dokumen : 023
Revisi : 01
Matakuliah Praktikum : Bioteknologi Farmasi
Kode Matakuliah Praktikum : SFA3102
SKS :3
Program Studi : Farmasi
Semester : V (Lima)
ANALISIS SEKUENS GEN DAN DESAIN PRIMER

ISOLASI DNA DARI KULIT JERUK (I)
ISOLASI DNA DARI KULIT JERUK (II)
POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR)
ELEKTROFORESIS DNA
ISOLASI, PURIFIKASI, DAN PENETAPAN KONSENTRASI PROTEIN
Tim Penyusun:
Nur Aziz, S.Farm., Ph.D
Fibe Yulinda Cesa, S.Farm., M.Biomed
Malang, Oktober 2022
Menyetujui, Mengesahkan,
Kepala Program Studi S1 Farmasi Dekan FST
Dr. apt. Rollando, S.Farm., M.Sc. Dr. Kestrilia Rega Prilianti, M.Si.
NIP. 20160002 NIP. 20120035
ii
KATA PENGANTAR
Modul parktikum Bioteknologi Farmasi ini ditujukan bagi mahasiswa Program Studi Farmasi
Universitas Ma Chung sesuai dengan kurikulum matakuliah Bioteknologi Farmasi dengan bobot
3 SKS pada semester 5. Kompetensi mahasiswa yang diasah dalam modul praktikum
Bioteknologi Farmasi ini adalah mahasiswa mampu melakukan Analisis Sekuens Gen dan Desain
Primer, Isolasi DNA dari Kulit Jeruk, PCR dan Elektroforesis DNA, serta Isolasi, Purifikasi, Dan
Penetapan Konsentrasi Protein.
Diharapkan modul yang disusun ini memberikan manfaat bagi mahasiswa prodi Farmasi
dalam mengaplikasikan konsep dengan aplikasi melalui percobaan di Laboratorium dan dapat
mengaitkanya dengan dalam dunia kefarmasian khususnya dalam mata kuliah Bioteknologi
Farmasi.
Malang, Oktober 2022
Tim Penyusun
iii
DAFTAR ISI
DAFTAR ISI ............................................................................................................................................... iv

PERATURAN PRAKTIKUM .................................................................................................................... v
FORMAT LAPORAN SEMENTARA .................................................................................................... vii
MATERI PRAKTIKUM .............................................................................................................................. 1
Praktikum I: Analisis Sekuens Gen Dan Desain Primer ............................................................ 1
Praktikum II dan III: Isolasi DNA dari Kulit Jeruk......................................................................... 6
Praktikum IV dan V: Polymerase Chain Reaction (PCR) dan Elektroforesis DNA............ 10
Praktikum VI: Isolasi, Purifikasi, dan Penetapan Konsentrasi Protein ................................ 12
DAFTAR PUSTAKA ................................................................................................................................ 17
iv
PERATURAN PRAKTIKUM
A. Tempat dan Waktu Praktikum

1. Praktikum Bioteknologi Farmasi dilaksanakan di Laboratorium Farmasi Universitas Ma
Chung.
2. Waktu praktikum dilaksanakan sesuai dengan jadwal praktikum yang telah ditentukan.
3. Praktikan harus berada di ruangan praktikum selambat-lambatnya 10 menit sebelum
praktikum dimulai.
4. Praktikan yang datang terlambat lebih dari 15 menit dari waktu yang telah ditentukan bersedia
menerima sanksi yang telah disepakati bersama pada saat pengantar praktikum.
B. Alat-alat dan Pereaksi

1. Sebelum dan sesudah praktikum, semua praktikan harus mengecek dan mengembalikan
alat-alat inventaris yang digunakan dalam keadaan bersih.
2. Alat-alat yang hilang, pecah, atau cacat harus diganti dengan alat-alat yang sama atau diganti
dengan alat dengan merek dan jenis yang sama atau uang yang besarnya ditentukan oleh
laboratorium.
C. Perlengkapan Praktikum
1. Semua praktikan diwajibkan memakai jas laboratorium, masker, dan glove karet(standar
laboratorium).
2. Tidak diperkenankan membuang sampah atau bahan pada bak pencuci, buanglah sampah
tersebut pada tempat yang telah disediakan.
3. Jika ada bahan yang tumpah, harus cepat dibersihkan dengan air. Jika terjadi kecelakaan
segera melaporkan kepada dosen atau asisten yang bertugas.
4. Ruang laboratorium dalam keadaan bersih setelah selesai digunakan dan menjadi tanggung
jawab praktikan yang menggunakan sebelumnya.
5. Selama praktikum, semua praktikan tidak diperbolehkan makan atau minum dalam ruangan
laboratorium dan tidak diperkenankan memakai sandal.
6. Berbicaralah seperlunya selama praktikum dan tidak diperkenankan mengganggu
ketenangan pekerjaan orang lain.
v
7. Semua bahan atau alat yang berhubungan dengan darah atau jarum merupakan sampah
infeksius dan perlu mendapat penanganan khusus oleh petugas laboratorium. Sampah
infeksius tidak dapat dibuang pada tempat sampah umum yang tersedia di laboratorium.
D. Laporan, Laporan Akhir,dan Penilaian Praktikum

1. Laporan dibuat dalam logbook.
2. Laporan sementara dibuat sesuai dengan format yang telah ditentukan (tulis tangan) yaitu
memuat:
a. Judul
b. Tujuan Percobaan
c. Teori
d. Prosedur Kerja
e. Daftar Pustaka
3. Laporan lengkap kelompok dibuat dengan menambahkan bagian data, pembahasan, dan
kesimpulan (diketik).
4. Laporan sementara harus diserahkan kepada asisten yang bertugas sebelum percobaan
dilakukan, dan harus meminta paraf dari asisten yang menerima laporan tersebut.
5. Penilaian praktikum ditentukan oleh hasil-hasil berikut:
a. Pre test 10%
b. Laporan sementara 20%
c. Laporan akhir 20%
d. Diskusi laporan akhir 10%
e. Ujian Akhir Semester 40%
6. Praktikan yang mendapat nilai D diperkenankan untuk mengikuti ujian lagi bersama
rombongan baru, tanpa harus mengikuti kembali praktikum.
E. Lain-lain
1. Praktikan wajib mengikuti semua kegiatan praktikum.
2. Praktikan yang tidak masuk karena sakit atau ada musibah/halangan harus memberi surat
keterangan dari orang tua/wali atau surat keterangan dokter.
3. Setiap praktikum yang telah 2x berturut-turut tidak masuk praktikum, kegiatannya dihentikan
dan harus mengulang lagi bersama-sama rombongan baru.
4. Hal-hal lain yang belum diatur dalam tata tertib ini akan ditentukan kemudian.
vi
FORMAT LAPORAN SEMENTARA
Laporan sementara dibuat sesuai dengan format yang telah ditentukan (tulis tangan) di buku
SIDU yang memuat:
a. Judul
b. Tujuan Percobaan
c. Teori
d. Kerangka Kerja
e. Daftar Pustaka
vii
MATERI PRAKTIKUM
Praktikum I: Analisis Sekuens Gen Dan Desain Primer
A. Tujuan Praktikum
1. Mahasiswa mampu memahami cara mengambil dan menganalisis sekuens gen
2. Mahasiswa mampu memahami tahapan perancangan primer untuk reaksi berantai
polimerase (PCR)
B. Dasar Teori
Informasi genetik manusia telah diutas oleh ilmuwan dan diselesaikan pada April 2003.
Kode genetik disimpan di genom yang mana merupakan kumpulan dari berbagai gen. Gen
merupakan segmen DNA yang berisi kode atau blueprint yang digunakan untuk mensintesis
protein atau molekul RNA. Bagian dari gen yang mengandung kodon yang pada akhirnya akan
diterjemahkan ke dalam protein disebut coding region, atau open reading frame. Transkripsi
terjadi mulai lebih hulu (upstream) dari kodon awal (start codon), dimana ‘hulu’ artinya ke arah 5’.
Sedangkan situs penghentian transkripsi berada setelah hilir dari kodon stop (stop codon),
dimana ‘hilir’ berarti dalam arah 3’. Yang artinya bahwa hasil transkripsi mRNA berisi sekuens
DNA yang tidak diterjemahkan. Sekuens antara situs awal transkripsi dan kodon awal dinamakan
daerah 5’ yang tidak diterjemahkan (5’ untranslated region). Sekuens antara kodon stop hingga
tempat penghentian transkripsi disebut daerah 3’ yang tidak diterjemahkan (3’ untranslated
region).
Lebih ke hulu dari situs awal transkripsi merupakan sekuen DNA yang relatif pendek yang
dinamakan wilayah pengatur (regulatory region). Dalam wilayah ini terdapat promotor, yang
merupakan situs DNA spesifik dimana protein pengatur tertentu mengikat dan mengatur ekspresi
gen. Protein tersebut disebut faktor transkripsi (transcription factor) karena mereka yang
mengatur proses transkripsi.
Terdapat perbedaan penting antara gen prokariotik dan eukariotik yaitu gen eukariotik
berkemungkinan mengandung intron. Gen eukariotik mungkin mengandung banyak intron, dan
setiap intron mungkin berukuran banyak kilobase (panjang). Sekuens yang ditranskripsi dari gen
eukariotik umumnya merupakan pergantian antara sekuens DNA yang disebut ekson (exon) dan
intron, dimana intron merupakan sekuens yang pada akhirnya akan dikeluarkan dari mRNA
sebelum meninggalkan nukleus. Transkripsi di dalam nukleus menghasilkan molekul RNA yang
disebut pra-mRNA (pre-mRNA) yang mengandung ekson dan intron. Intron dikeluarkan dari pra-
1
mRNA oleh struktur yang disebut spliceosom untuk menghasilkan mRNA matang (mature mRNA)
yang akan diangkut keluar nukleus untuk diterjemahkan menjadi protein.
Dikarenakan mature mRNA tidak mengandung intron, sintesis DNA dari template RNA
melalui transkripsi balik (reverse transcription) merupakan salah satu prosedur umum untuk
mendapatkan sekuen DNA pengkode protein tertentu (cds = coding sequences). Dengan
diketahuinya sekuen DNA pengkode protein tertentu, sekuen tersebut dapat direkombinasi ke
plasmid tertentu yang pada akhirnya dapat digunakan untuk produksi protein termasuk protein
terapeutik.
Proses manipulasi gen, termasuk kloning, umumnya memerlukan PCR. Salah satu
komponen PCR adalah primer. Primer merupakan oligonukleotida sintetik pendek yang
menyediakan poin inisiasi untuk amplifikasi DNA oleh enzim DNA polimerase. Oleh karena itu,
sekuen dari primer menentukan kespesifikan produk amplifikasi. Prinsip umum dalam mendesain
primer:
a. Panjang primer
Pada umumnya 18-22 nukleotida merupakan panjang yang sesuai untuk primer. Jika terlalu
pendek, kemungkinan primer untuk mengikat pada sekuen non-spesifik akan meningkat.
Sebaliknya, primer terlalu panjang akan menyebabkan proses pengikatan primer ke template
lebih sulit pada temperatur annealing (o: Ta).
b. Temperatur leleh (Melting Temperature: Tm)
2
Adalah suhu dimana setengah dari DNA untai ganda berpisah dan menjadi untai tunggal.
Umumnya suhu antara 55-65 derajat merupakan suhu yang sesuai untuk primer. Tm
digunakan untuk menghitung Ta.
c. Konten GC
Primer dengan konten GC antara 40-60% diketahui akan terbentuk pengikatan primer dan
template yang stabil.
d. Struktur sekunder
Pembentukan dari struktur sekunder seperti hairpin, self-dimers, ataupun hetero-dimers,
secara intramolekular dari tiap primer atau antar primer menyebabkan berkurangnya efisiensi
PCR atau bahkan tidak terbentuknya produk PCR yang mencukupi.
C. Alat dan Bahan

• Laptop/PC dengan koneksi internet.
• Software SnapGene Viewer
D. Prosedur Kerja
A. Analisis gen HER2 menggunakan genome viewer
1. Buka https://www.genecards.org/ dan ketik HER2 di panel Search Term.
2. Klik pada simbol + untuk melihat detailnya
3. Buka https://genome.ucsc.edu/ dan pilih Browser Genome
4. Masukkan nama gen ERBB2 .
5. Klik di transcript variant 1
6. Lakukan pencatatan fitur-fitur berikut:
- Transkrip Gencode
- Nomor dan lokasi kromosom
- Berapa banyak intron dan ekson
- Ukuran wilayah pengkodean (coding region)
- Untuk laporan, ambil tangkapan layar pada hasil genome browser seperti ini:
3
7. Unduh sekuen genom ERBB2 dengan kembali ke home, dan pilih Table Browser.
8. Di submenu Define region of interest → identifiers , klik paste list.
9. Pilih Gencode Transcript dan submit.
10. Di submenu Retrieve and display data → output formats, pilih sequence.
11. Lanjutkan untuk get output, pilih genomic dan submit.
12. Pastikan untuk mencentang CDS Exons, Introns, One FASTA record per gene, and
Exons in upper case, everything else in lower case. Dan klik get sequence.
13. Salin sekuen dari gen tersebut
14. Instal SnapGene Viewer dari https://www.snapgene.com/snapgene-viewer/download
(perangkat lunak gratis).
15. Buat file DNA baru, salin sekuen genom dari situs web genome browser dan tempel
ke SnapGene.
B. Mendapatkan sekuen pengkodean (cds) dari gene tertentu (contoh: insulin)

1. Buka https://www.ncbi.nlm.nih.gov/ di browser Anda dan ubah opsi di search panel
dari All Databases ke Nucleotide.
2. Buat tab baru dan buka https://www.genecards.org/ dan ketik insulin di panel Search
Term.
3. Kembali ke tab sebelumnya dan ketik INS di panel Search Term.
4. Pastikan nama gen dan spesies yang sesuai sudah benar, lanjutkan untuk melihat
transkrip dengan mengklik RefSeq transcritps.
5. Pilih Homo sapiens insulin (INS), transcript variant 1, mRNA
6. Buat file DNA baru di SnapGene Viewer, salin cds dari situs ncbi dan tempel ke
SnapGene.
4
C. Desain primer (2 metode)

Metode 1 menggunakan snapgene (manual)
1. Pilih sekuens gen yang diinginkan untuk forward primer
2. Pilih menu Primer → Tambahkan Primer…
3. Lakukan hal yang sama dengan reverse primer
4. Hitung perkiraan ukuran produk PCR dengan memilih wilayah dari forward primer ke
reverse primer.
Metode 2 menggunakan primer blast (tanpa harus mengetahui sekuen

lengkapnya)
1. Buka https://www.ncbi.nlm.nih.gov/ di browser Anda dan ubah opsi di search panel

dari All Databases ke Nucleotide.
2. Buat tab baru dan buka https://www.genecards.org/ dan ketik insulin di panel Search
Term.
3. Kembali ke tab sebelumnya dan ketik INS di panel Search Term.
4. Pastikan nama gen dan spesies yang sesuai sudah benar, lanjutkan untuk melihat
transkrip dengan mengklik RefSeq transcritps.
5. Pilih Homo sapiens insulin (INS), transcript variant 1, mRNA
6. Pada submenu Analyze this sequence, pilih Pick Primers.
7. Klik Get Primers
8. Sebagai laporan, screenshot salah satu pasangan primer yang Anda pilih dan
jelaskan mengapa Anda memilih pasangan tersebut.
5
Praktikum II dan III: Isolasi DNA dari Kulit Jeruk
A. Tujuan Praktikum
1. Mahasiswa dapat memahami cara isolasi DNA dari kulit jeruk.
2. Mahasiswa dapat memahami cara mengukur kemurnian dan konsentrasi DNA
B. Dasar Teori
Untuk mempelajari dan memanipulasi DNA, DNA harus mula-mula diisolasi. Oleh karena
itu, isolasi DNA merupakan salah satu prasyarat penelitian molekuler. Prinsip dari isolasi DNA
yaitu penghancuran dinding sel, membran sel, dan membran inti agar mengeluarkan DNA utuh
dalam jumlah yang besar diikuti dengan pengendapan DNA dan penghilangan biomolekul
kontaminan seperti protein, polisakarida, lipid, fenol, dan metabolit sekunder yang lainnya. Mula-
mula sel dibuka dengan penghancuran menggunakan larutan detergen yang mengandung
senyawa buffer. Untuk mencegah degradasi dan kontaminasi, makromolekul seperti protein dan
RNA dapat dinon-aktifkan dengan enzim. DNA kemudian ditarik dari larutan dengan alkohol yang
menghasilkan massa bergelatin dikarenakan DNA tersusun oleh polimer panjang. Metode
tersebut mengekstraksi semua asam nukleat dalam inti sel termasuk genomik DNA (semua DNA
di dalam genome), dan juga RNA. Apabila DNA akan digunakan untuk studi lebih lanjut, RNA
umumnya di-digesti dengan enzim untuk menghilangkannya.
Kualitas DNA dapat diketahui dari kemurniannya. Pengukuran konsentrasi dan kemurnian
DNA dapat menggunakan spektrofotometri dan fluorometri. Pengukuran konsentrasi DNA
dengan spektrofotometri yaitu dengan mengukur absorbansi pada panjang gelombang 260 nm
(A260). Untuk akurasi terbaik, nilai ukurnya harus diantara 0.1 dan 1.0. Satu unit absorbansi pada
panjang gelombang 260 nm berkorespon terhadap 50 ug genomik DNA per ml (A260 = 1 untuk 50
µg/ml; berdasarkan standar 1 cm panjang jarak). Rasio pengukuran pada panjang gelombang
260 nm dan 280 nm (A260/A280) dapat memberikan gambaran kemurnian DNA terhadap
kontaminan yang mengabsorbsi sinar UV, seperti protein. DNA murni memiliki rasio A260/A280
diantara 1.7 – 1.9.
6
C. Alat dan Bahan

• Mortal dan alu • Buffer ekstraksi : Tris-HCl (pH 8)
• Mikropipet ~20 ul, 20-200 ul, 100- 200 mM, EDTA (pH 8) 25 mM, NaCl
1000 ul, dan tip 200 mM, SDS 0.5%
• Water bath • 2 × CTAB : Tris-HCl (pH 8) 100 mM,
• Eppendorf 2 ml EDTA (pH 8) 20 mM, NaCl 1.4 M,
• Vortex CTAB (cetyltrimethylammonium
• Sentrifuge bromide) 2% (w/v), PVP 1% (w/v)
• Spektrofotometer UV-Vis • Buffer TE : Tris-HCl (pH 8) 10 mM,
• Daun jeruk segar EDTA (pH 8) 1 mM

• Kloroform:Isoamyl alcohol (24:1)
• Isopropanol
• Etanol 70%
D. Prosedur Kerja
A. Isolasi DNA Kulit Daun Jeruk
1. Hangatkan buffer ekstraksi di suhu 60°C
2. Daun jeruk segar ~800 mg di potong-potong kecil (± 0.5 cm) dan dimasukkan ke dalam
mortar
3. Ke dalam mortar tersebut ditambahkan 600 ul buffer ekstraksi dan gerus daun hingga
halus, tambahkan 1200 ul buffer ekstraksi dan gerus kembali hingga halus
4. Pindahkan semua gerusan daun beserta cairan hasil gerusan ke dalam Eppendorf 2 ml
5. Ke dalam Eppendorf tersebut ditambahkan 400 ul 2× CTAB lalu vortex minimum 1 min
6. Spindown di 8.400 × g selama 10 min
7. Pindahkan supernatant ke Eppendorf 2 ml baru dan tambahkan Kloroform:Isoamyl
alcohol 24:1 sebanyak volume yang sama (equal volume)
8. Vortex minimum 1 min dilanjutkan spindown di 8.400 × g selama 10 min
9. Pindahkan fase atas ke Eppendorf 2 ml baru lalu tambahkan isopropanol (equal volume)
10. Inverting 15 × dilanjutkan dengan spindown di 8.400 × g selama 10 min
11. Amati pellet yang terbentuk, tuang hati-hati cairan tanpa mengganggu pellet
12. Tambahkan etanol 70% sebanyak 1 ml, invert tube beberapa kali lalu spindown di 8.400
× g selama 5 min
7
13. Ulang langkah no.12 minimal 2 × lalu keringkan pellet dengan air-dry selama minimum
25 min
14. Suspensikan pelet dengan penambahan 80 ul buffer TE
15. Simpan DNA di -20°C.
B. Pengukuran kemurnian dan konsentrasi DNA

a. Dengan nanodrop
1. Siapkan DNA yang akan di ukur
2. Ukur blank dengan menambahkan 2 ul buffer TE ke dalam nanodrop. Lalu ukur
rasio asam nukleat terhadap protein (260/280 nm)
3. Ukur sample dengan cara yang sama
4. Catat konsentrasi dan kemurnian DNA
b. Dengan spektrofotometer (buffer TE)
1. Nyalakan spektrofotometer
2. Tambahkan 500 ul buffer ke dalam 2 kuvet quartz 500 ul
3. Masukkan kedua kuvet dan read baseline dilanjutkan dengan blank (ukur pada
panjang gelombang 260 nm dan 280 nm
4. Keluarkan kuvet sample, bilas dengan etanol dan aseton lalu keringkan
5. Tambahkan 495 ul buffer TE lalu tambahkan 5 ul DNA, tutup kuvet dan inverting
beberapa kali
6. Masukkan kuvet ke dalam spektrofotometer dan read sample pada panjang
gelombang 260 nm dan 280 nm
7. Hitung konsentrasi dan kemurnian DNA
8
C. Contoh Perhitungan
a. Menghitung konsentrasi DNA
Konsentrasi DNA = Konversi spektrofotometrik × (A260 – Faktor Koreksi) × Faktor
Dilusi
1. Correction Factor = 0.012
2. A260 sample DNA = 0.127
3. Konversi spektrofotometrik untuk dsDNA: 1.0 A260 unit = 50 ug/ml
4. Faktor dilusi = 100 (5 ul sample DNA + 495 ul buffer)
Konsentrasi DNA = 50 ug/ul × (0.127 – 0.012) × 100
Konsentrasi DNA = 575 ug/ml atau 575 ng/ul
b. Menghitung kemurnian DNA
Kemurnian DNA = A260 / A280
1. A260 = 0.127
2. A280 = 0.068
Kemurnian DNA = 0.127 / 0.068
= 1.87
9
Praktikum IV dan V: Polymerase Chain Reaction (PCR) dan

Elektroforesis DNA
A. Tujuan Praktikum
1. Mahasiswa dapat memahami cara kerja polymerase chain reaction (PCR).
2. Mahasiswa dapat memahami cara memisahkan DNA menggunakan elektroforesis
agarosa.
B. Dasar Teori
Polymerase Chain Reaction (PCR) merupakan teknik in vitro untuk amplifikasi bagian dari
DNA. Tujuan dari PCR adalah untuk membuat banyak salinan DNA dari satu fragmen DNA yang
kecil. Dalam PCR dikenal istilah siklus dimana satu siklus terdapat 3 langkah/tahap. Tiga tahapan
PCR terdiri dari denaturasi, dimana pada suhu 94-98°C DNA untai tunggal terbentuk dari
denaturasi DNA untai ganda dimana ini merupakan mimik dari peran helikase di dalam sel.
Dilanjutkan dengan tahap penempelan (annealing), dimana pada suhu 45-60 °C, primer
menempel ke DNA untai tunggal. Tahap yang terakhir yaitu ekstensi/pemanjangan (elongation).
Pada tahap ini enzim polimerase yang resisten terhadap suhu tinggi pada suhu 72 °C mensintesis
DNA untai ganda.
Asam nukleat tidak dapat menyerap cahaya dalam kisaran panjang gelombang yang
sensitif bagi mata manusia sehingga tidak dapat divisualisasikan secara langsung. Terdapat 2
metode yang digunakan untuk menvisualisasikan produk DNA: (1) dengan pewarnaan produk
DNA menggunaan pewarna kimia seperti EtBr, atau (2) dengan cara pelabelan primer PCR atau
pewarna fluoresen sebelum amplifikasi PCR. Salah satu metode yang paling banyak digunakan
untuk analisis produk PCR adalah melalui agarose gel elektroforesis. Agarose yang merupakan
polimer linier yang berpori, dapat digunakan untuk menghambat laju perpindahan DNA dan
memisahkannya berdasarkan ukurannya. Ketika DNA ditempatkan dalam medan listrik, DNA
akan berpindah menuju kutub positif.
C. Alat dan Bahan

• PCR • Primer • PCR tubes
• Aparatus agarose • Premix PCR • Buffer TBE : Tris-
gel elektroforesis • Nuclease-free Boric acid-EDTA
• DNA template water • EtBr
10
D. Prosedur Kerja
A. PCR
1. Siapkan mixture dalam PCR tube dengan komposisi sebagai berikut:
Premix = 4 ul
DNA template = 50-100 ng DNA (2 ul)
Primer Forw (10 uM) = 1 ul
Primer Rev (10 uM) = 1 ul
Nuclease-free water = 12 ul
2. Vortex 1 detik, spindown sesaat
3. Nyalakan PCR, atur kondisi PCR sebagai berikut
95 °C → 5 min
95 °C → 30 s
55 °C → 45 s 30 x
72 °C → 45 s
72 °C → 15 min
B. Agarose Gel Elektroforesis
1. Suspensikan agarose (0.75 g dalam 75 ml buffer TBE), microwave hingga larut,
biarkan beberapa saat lalu tambahkan EtBr 1/10.000 v dan tuang ke gel tray
2. Biarkan hingga memadat, pindahkan ke dalam elektroforesis running tray
3. Load 15 ul PCR mixture ke dalam well agarose gel
4. Mulai elektroforesis selama 1 jam
5. Amati pola pita di bawah sinar UV lamp (TAA15 primers mengamplifikasi DNA
tanaman citrus pada ukuran basa 150, 167, 183, 192, 200, 229, 325, 350, 500, 700,
dan 800 bp)
11
Praktikum VI: Isolasi, Purifikasi, dan Penetapan Konsentrasi Protein
A. Tujuan Praktikum
1. Mahasiswa dapat memahami cara ekstraksi protein.
2. Mahasiswa dapat memahami salah satu teknik purifikasi protein yaitu salting out
3. Mahasiswa dapat menghitung konsentrasi protein menggunakan metode Bradford
B. Dasar Teori
Protein adalah molekul berukuran besar (makromolekul) dan memiliki polimer unit
struktural yang disebut asam amino. Sebanyak 20 asam amino yang berbeda ada dalam protein
dan ratusan hingga ribuan asam amino ini melekat satu sama lain dalam rantai panjang untuk
membentuk protein. Asam amino dapat dilepaskan dari protein melalui hidrolisis (hidrolisis adalah
pemutusan ikatan kovalen dengan penambahan air). Karena ukurannya yang besar, protein akan
membentuk koloid ketika didispersikan dalam pelarut yang sesuai. Sifat ini secara khas
membedakan protein dari larutan yang mengandung molekul berukuran kecil (Blanco & Blanco,
2017). Sama seperti DNA, protein juga dapat diisolasi dari seluruh sampel, baik itu pada sampel
sel prokariotik maupun sel eukariotik. Pada umumnya, prosedur isolasi protein memiliki tahapan
prinsip kerja antara lain: (1) identifikasi sampel, (2) ekstraksi dari protein dari sampel, (3)
pemisahan dari komponen non-protein seperti asam nukleat dan lipid, (4) penetapan konsentrasi
dari protein dan pemisahan menjadi fraksi yang mengandung protein yang berbeda; serta (5)
teknik pemisahan seperti kromatografi yang dapat menunjukkan hasil dari purfikasi tersebut
(Grant, 2016).
Purifikasi atau pemurnian adalah upaya untuk memisahkan protein dari senyawa yang
tidak diperlukan. Ada banyak metode yang bisa dilakukan baik itu ditinjau dari pemisahan ion,
bentuk, maupun kelarutan. Salting out atau penambahan garam dalam konsentrasi tinggi pada
ekstrak protein dapat membantu untuk memisahkan dari senyawa yang tidak diinginkan. Secara
umum, salting out adalah fenomena yang diamati ketika kelarutan senyawa non-elektrolit dalam
air menurun dengan meningkatnya konsentrasi garam (Poole, 2020).
Penetapan kadar protein total dalam sebuah sampeldapat dilakukan dengan
menggunakan metode Bradford. Metode ini lebih cepat dan akurat untuk memperkirakan
konsentrasi protein jika dibandingkan dengan metode penetapan kadar lain, salah satunya
metode Lowry. Prinsip kerja dari penetapan kadar menggunakan metode Bradford adalah
bergantung pada pengikatan pewarna yakni Coomassie Blue G250 ke protein. Pewarna biru
12
tersebut bersifat anionik sehingga mampu mengikat protein dan memiliki absorbansi maksimum
pada 590 nm. Dengan demikian, jumlah protein dapat diperkirakan dengan menentukan itu
jumlah zat warna dalam bentuk ion biru. Hal ini biasanya dicapai dengan mengukur absorbansi
larutan pada 595 nm. Pengikatan protein ke Coomassie Blue G250 dapat menggeser absorbansi
maksimum dari bentuk ion biru pewarna dari 590 nm sampai 620 nm. Pengukuran pada 595 nm
merupakan panjang gelombang yang ideal yang dapat memaksimalkan serapan dari kompleks
yang terbentuk antara pewarna dan protein. Bovine serum albuimin (BSA) adalah protein standar
yang berasal dari albumin sapi dan digunakan dalam metode ini karena banyak tersedia dengan
harga yang relatif terjangkau jika dibandingkan dengan protein standar lainnya. Penetapan
konsentrasi bisa didapatkan dari kurva kalibrasi yang dibuat menggunakan standar protein dan
reagen Bradford yang kurvanya ditunjukkan pada salah satu contoh pembuatan kurva di Gambar
1.
Gambar 1. Kurva Kalibrasi yang didapatkan dengan metode Bradford (Naqid, 2016)
13
C. Alat dan Bahan

Alat Bahan
• Mortar dan alu • Daun tomat
• Tabung eppendorf 12 pcs • Nitrogen cair
• Setrifus dingin • 10% PVP
• Es batu • Buffer ekstraksi (50mM Buffer fosfat;
• Termos 10 mM MgCl2; 1 mM EDTA; 150 mM
• Baki NaCl)
• Mikropipet • Amonnium sulfat
• White tip • Reagen Bradford
• Blue tip • Water for Injection (WFI)
• Yellow tip • Metanol
• Spektrofotometer • Bovine serum albumin (BSA)
• Kuvet
D. Prosedur Kerja
a. Isolasi Protein dari Daun Tomat
Seluruh prosedur ini dilakukan di suhu dingin (40C)
1. Siapkan sampel daun tomat sebanyak 4-5 lembar kemudian bungkus dengan
aluminium foil.
2. Siapkan nitrogen cair dalam termos, kemudian masukkan sampel yang sudah
dibungkus tersebut ke dalamnya.
3. Siapkan mortar dan pestle di atas es kemudian masukkan sampel tersebut dan
tambahkan nitrogen cair sedikit demi sedikit sambil menghaluskan sampel tersebut.
4. Setelah menjadi serbuk, pindah mortar ke atas es kemudian tambahkan 10% PVP dan
buffer ekstraksi sebanyak 2-3 mL (perbandingan 1:3) kemudian homogenkan sampel
bersama dengan bahan tersebut hingga halus dan berbentuk cair berwarna hijau.
5. Setelah halus dan tercampur rata, pindahkan ekstrak pada tabung eppendorf.
6. Setrifugasi ekstrak dalam keadaan dingin (10.000 rpm; 15 menit)
7. Setelah sentrifugasi akan terlihat 2 lapisan yang terpisah, atas dan bawah. Ambil
bagian cairnya (bagian ini dinamakan supernatan) (Sampel A) dan simpan bagian
endapannya untuk uji penetapan protein lebih lanjut (bagian ini disebut dengan pellet)
(Sampel B).
14
b. Purifikasi Protein menggunakan Teknik Salting Out

1. Supernatan yang didapat dari isolat tersebut kemudian ditambahkan dengan
ammonium sulfat ((NH₄)₂SO₄) dengan perbandingan 1:1 sesuai dengan volume yang
didapatkan.
2. Tunggu selama 15 menit, jika terbentuk endapan, pisahkan bagian endapan (Sampel
C) tersebut ke dalam tabung eppendorf yang baru dan simpan bagian yang tidak
mengendap untuk analisis lebih lanjut (Sampel D)
Gambar 2. Supernatan dan Pellet
c. Penetapan Konsentrasi Protein dengan Metode Bradford (Modifikasi)

Pembuatan Kurva Standar
1. Siapkan larutan BSA dengan konsentrasi 1 mg/mL dan water for injection (WFI).
2. Dengan menggunakan mikropipet, masukkan masing-masing ke dalam 7 eppendorf
campuran larutan pada tabel beriku dan tambahkan WFI hingga 100 µL:
Konsentrasi BSA 0.05 mg/mL
0 ng 0 µL
10 ng 10 µL
20 ng 20 µL
40 ng 40 µL
60 ng 60 µL
80 ng 80 µL
100 ng 100 µL
3. Tambahkan reagen Bradford pada 7 konsentrasi tersebut sebanyak 1.5 mL. Tutup
seluruh eppendorf menggunakan aluminium foil dan diamkan selama 10 menit.
4. Setelah 10 menit, ukur absorbansi di panjang gelombang 595 nm atau 615nm dengan
menggunakan spektrofotometer. Catatan: setiap kali mengukur, bilas kuvet
menggunakan methanol untuk mencegah agar pewarna yang terkandung dalam
15
reagen Bradford tidak berinteraksi dengan senyawa-senyawa yang ada di permukaan

kuvet. Blanko yang digunakan adalah WFI.
5. Lakukan pembacaan dengan replikasi sebanyak 3 kali di setiap konsentrasi kemudian
catat masing-masing absorbansinya.
6. Catatlah absorbansi dengan menuliskan pada tabel berikut:
Absorbansi Rata-rata
Konsentrasi
Replikasi 1 Replikasi 2 Replikasi 3 absorbansi
0 ng
10 ng
20 ng
40 ng
60 ng
80 ng
100 ng
7. Buatlah kurva standar dengan menggunakan data konsentrasi vs absorbansi (y =

absorbansi ; x = konsentrasi)
Penetapan Konsentrasi Protein Total dalam Sampel Ekstrak Protein
1. Ambil 100 µL pada sampel (sampel A, B, C, dan D) ke dalam kuvet satu persatu
dengan menambahkan 1.5 mL reagen Bradford kemudian ukur dan catat pada
absorbansi 595 nm atau 615 nm. Setiap hendak mengukur, pastikan sudah dibilas
dengan methanol.
2. Hitung konsentrasi dari persamaan yang didapat:
y = ax + b
Keterangan:
a = slope; b = intercept; y = absorbansi; x = konsentrasi
3. Catatlah konsentrasi dalam tabel di bawah ini:
Sampel Konsentrasi (ng)

A
B
C
D
16
DAFTAR PUSTAKA
Blanco, A dan Blanco, B. Medical Biochemistry: Chapter 3 – Protein. Academic Press. (2017)
Duong-Ly K.C., Gabelli S.B. Salting out of proteins using ammonium sulfate precipitation.
Methods Enzymol. (2014)
Govender, K., Naicker, T., Lin, J. et al. A novel and more efficient biosynthesis approach for
human insulin production in Escherichia coli (E. coli). AMB Expr 10, 43 (2020).
Grant, G. A. Isolation/Purification of Proteins. Encyclopedia of Cell Biology, 66–74. (2016).
Martin, Tompa. Lecture Notes on Biological Sequence Analysis. University of Washington (2000).
Naqid, I. Investigation of antibody-based immune recognition of infections with Salmonella
enterica serovars Typhimurium and Enteritidis. (2016)
Poole, C.F. Handbooks in Separation Science in : Chapter 1 - Milestones in the Development of
Liquid-Phase Extraction Techniques, Elsevier, (2020).
17

Modul Praktikum Bioteknologi - 2022

Diunggah oleh

Informasi Dokumen

Judul Asli

Hak Cipta

Format Tersedia

Bagikan dokumen Ini

Bagikan atau Tanam Dokumen

Opsi Berbagi

Apakah menurut Anda dokumen ini bermanfaat?

Apakah konten ini tidak pantas?

Hak Cipta:

Format Tersedia

Modul Praktikum Bioteknologi - 2022

Diunggah oleh

Hak Cipta:

Format Tersedia

UMC/FAR/MODUL/SFA3102/001/01

PROGRAM STUDI FARMASI

ANALISIS SEKUENS GEN DAN DESAIN PRIMER

Malang, Oktober 2022

Malang, Oktober 2022

DAFTAR ISI ............................................................................................................................................... iv

A. Tempat dan Waktu Praktikum

B. Alat-alat dan Pereaksi

D. Laporan, Laporan Akhir,dan Penilaian Praktikum

FORMAT LAPORAN SEMENTARA

Praktikum I: Analisis Sekuens Gen Dan Desain Primer

C. Alat dan Bahan

B. Mendapatkan sekuen pengkodean (cds) dari gene tertentu (contoh: insulin)

C. Desain primer (2 metode)

Metode 2 menggunakan primer blast (tanpa harus mengetahui sekuen

1. Buka https://www.ncbi.nlm.nih.gov/ di browser Anda dan ubah opsi di search panel

Praktikum II dan III: Isolasi DNA dari Kulit Jeruk

C. Alat dan Bahan

• Spektrofotometer UV-Vis • Buffer TE : Tris-HCl (pH 8) 10 mM,

• Daun jeruk segar EDTA (pH 8) 1 mM

B. Pengukuran kemurnian dan konsentrasi DNA

Praktikum IV dan V: Polymerase Chain Reaction (PCR) dan

C. Alat dan Bahan

Praktikum VI: Isolasi, Purifikasi, dan Penetapan Konsentrasi Protein

C. Alat dan Bahan

b. Purifikasi Protein menggunakan Teknik Salting Out

Gambar 2. Supernatan dan Pellet

c. Penetapan Konsentrasi Protein dengan Metode Bradford (Modifikasi)

reagen Bradford tidak berinteraksi dengan senyawa-senyawa yang ada di permukaan

7. Buatlah kurva standar dengan menggunakan data konsentrasi vs absorbansi (y =

Penetapan Konsentrasi Protein Total dalam Sampel Ekstrak Protein

Sampel Konsentrasi (ng)

Anda mungkin juga menyukai