MODUL PRAKTIKUM

TEKNIK ANALISA DALAM

BIOTEKNOLOGI

Disusun oleh :

Tunjung Mahatmanto, STP., M.Si., Ph.D.

Sudarma Dita Wijayanti, STP., M.Sc., MP.
Endrika Widyastuti, SPt., M.Sc., MP.
Freini Dessi E., STP.,MP.

PROGRAM STUDI BIOTEKNOLOGI

JURUSAN TEKNOLOGI HASIL PERTANIAN
FAKULTAS TEKNOLOGI PERTANIAN
UNIVERSITAS BRAWIJAYA
MALANG
2020
 KATA PENGANTAR

Puji syukur kepada Tuhan Yang Maha Esa, karena atas rahmat, kasih
sayang, dan tuntunan-Nya Modul Praktikum Teknik Analisa dalam Bioteknologi ini
dapat diselesaikan dengan baik. Modul ini telah kami susun dengan bantuan dari
berbagai pihak sehingga dapat memperlancar penyelesaian modul ini. Untuk itu
kami menyampaikan banyak terima kasih kepada semua pihak yang telah
berkontribusi dalam pembuatan modul ini.
Modul Praktikum Teknik Analisa dalam Bioteknologi ini disusun untuk
membantu mahasiswa dalam melaksanakan praktikum mata kuliah Praktikum
Teknik Analisa dalam Bioteknologi, sehingga dapat menguasai ketrampilan di
laboratorium secara maksimal sesuai dengan apa yang didapat selama mengikuti
perkuliahan. Modul Praktikum Teknik Analisa dalam Bioteknologi ini mencakup
Dasar-Dasar Pemipetan dan Pembuatan Bufer, Kromatografi Lapis Tipis (KLT),
Polimerase Chain Reaction (PCR), Elektroforesis DNA, Presipitasi Protein, dan
Elektroforesis Protein.
Disadari bahwa penyusunan modul ini belum lah sempurna, maka masukan
yang positif dari pembaca sangat diharapkan demi perbaikan di masa datang.
Semoga modul ini bermanfaat bagi kita semua.
Akhir kata saya ucapkan terima kasih dan semoga modul praktikum Teknik
Analisa dalam Bioteknologi ini dapat bermanfaat bagi kita semua. Aamiin.

Malang, 2019

Penyusun

Praktikum TAB | 2
 DAFTAR ISI

Kata Pengantar..........................................................................................................2
Daftar Isi..................................................................................................................3
Daftar Gambar............................................................................................................4
Deskripsi Praktikum Teknik Analisis dalam Bioteknologi.................................................5
Peraturan Praktikum di jurusan THP..................................................................6
Tata Tertib Praktikum Teknik Analisis dalam Bioteknologi..............................................8
Bab I. Dasar-Dasar Pemipetan Dan Pembuatan Bufer ..................................................10
Bab II. Kromatografi Lapis Tipis ................................................................................15
Bab III. Polymerase Chain Reaction (PCR)..................................................................18
Bab IV. Elektroforesis Gel Agarosa .............................................................................21
Bab V. Presipitasi Protein Menggunakan Amonium Sulfat .............................................24
Bab VI. Elektroforesis Protein (SDS-PAGE)..................................................................27

Praktikum TAB | 3
 DAFTAR GAMBAR

Gambar 1 Teknik pemipetan berdasarkan aplikasinya ..................................................11

Gambar 2 Perbedaan antara presisi dan akurasi dalam pemipetan................................12
Gambar 3. Pengaruh posisi pemipetan terhadap tingkat akurasinya. .............................13
Gambar 4. Ilustrasi kromatografi lapis tipis .................................................................16
Gambar 5. Ilustrasi perhitungan TLC..........................................................................17
Gambar 6. Ilustrasi tahapan PCR ...............................................................................20
Gambar 7. Ilustrasi elektroforesis gel DNA..................................................................22
Gambar 8. Kiri: kelarutan protein pada beberapa konsentasi garam. Kanan: solubilitas
protein menggunakan berbagai garam ........................................................25
Gambar 9. Perangkat alat elektroforesis (Biorad, 2013) ...............................................28
Gambar 10. Manual prosedur pemasangan alat elektroforesis (Biorad, 2013) ................31
Gambar 11. Pemisahan protein berdasarkan ukuran molekul .......................................32

Praktikum TAB | 4
PRAKTIKUM TEKNIK ANALISA DALAM BIOTEKNOLOGI

A. DESKRIPSI
Materi praktikum ini mencakup prinsip-prinsip dasar analisis di bidang bioteknologi
dan juga mencakup prinsip penggunaan alat instrumen diantaranya kromatografi lapis
tipis, elektroforesis dan Polimerase Chain Reaction (PCR).

B. TUJUAN INSTRUKSIONAL UMUM

Setelah menyelesaikan praktikum Teknik Analisis dalam Bioteknologi ini
mahasiswa diharapkan akan memahami prinsip-prinsip dasar analisa dalam bidang
bioteknologi dan memiliki keterampilan dalam analisis berbagai komponen bahan,
menggunakan beberapa alat instrumen sederhana dan kit yang berkaitan dengan
bioteknologi.

C. MATERI PRAKTIKUM

Praktikum ini mencakup :

1. Dasar-Dasar Pemipetan dan Pembuatan Bufer
2. Kromatografi Lapis Tipis (KLT)
3. Polimerase Chain Reaction (PCR)
4. Elektroforesis DNA
5. Presipitasi Protein
6. Elektroforesis Protein

D. Penilaian Hasil Belajar

Penilaian hasil belajar meliputi hasil penilaian dari :
No Komponen Bobot
1 Pre/Post test 20%
Laporan Praktikum:
2 a. pre-lab (10%) 30%
b. laporan akhir (20%)
3 Aktifitas Praktikum 20%
4 UAP 30%
Total 100 %

Hasil penilaian dalam bentuk huruf, yaitu:

A : ≥ 80 D+ : 55 - 59
B+ : 75 - 79 D : 50 - 54
B : 70 - 74 E : 0 – 49
C+ : 65 - 69 F : nilai tidak lengkap
C : 60 - 64

Praktikum TAB | 5
 Peraturan Praktikum
di Jurusan THP
1. Mahasiswa yang diperkenankan mengikuti praktikum Teknik Analisa dalam
Bioteknologi adalah mahasiswa Jurusan Teknologi Pertanian yang telah
mengisi KRS untuk mata kuliah Teknik Analisa dalam Bioteknologi.
2. Setiap peserta harus hadir tepat waktu di dalam laboratorium. Apabila
peserta terlambat hingga 10menit, maka akan dikenakan pengurangan -5
dari nilai total pada bab tersebut. Apabila peserta terlambat lebih dari 10
menit, maka peserta tidak diperkenankan mengikuti praktikum, namun bisa
mengejar nilai laporan praktikum.
3. Seluruh praktikan wajib bertanggung jawab atas seluruh rangkaian kegiatan
praktikum.
4. Sebelum mengikuti praktikum, peserta diharuskan mengisi pre-Lab dan
mempersiapkan diagram alir dari prosedur analisis yang akan dikerjakan.
Sanksi: tidak mendapatkan nilai Pre-Lab dan diagram alir.
5. Selama mengikuti praktikum, peserta harus mengenakan jas laboratorium
bersih lengan panjang dan name tag, sesuai dengan peraturan
laboratorium terkait. Sanksi: tidak boleh ikut praktikum.
6. Praktikan harus menggunakan pakaian rapi, tidak boleh menggunakan kaos
oblong dan celana pendek. Sanksi: tidak diperbolehkan mengikuti praktikum
pada bab tersebut dan tidak mendapatkan nilai .
7. Praktikan tidak diperbolehkan menggunakan aksesoris dalam bentuk apapun
(seperti gelang, jam tangan, dan cincin), kecuali ikat rambut dan anting.
8. Praktikan yang berambut panjang, rambut wajib diikat dengan ikat
rambut, bagi yang berkerudung, kerudung wajib dimasukkan ke dalam
jas lab.
9. Mahasiswa tidak diperkenankan mengoperasikan gadget selama praktikum,
kecuali untuk aktivitas praktikum dengan seijin asisten, apabila melanggar -30
di total nilai praktikum pada bab tersebut.
10. Setiap kelompok praktikum diwajibkan mentabulasi data hasil
pengamatan untuk dibahas oleh masing-masing peserta di dalam lembar
kerja praktikum.
11. Setiap praktikan harus mengembalikan alat-alat yang telah dipakai dalam
keadaan bersih dan kering serta mengembalikan ke tempat semula.
12. Setiap praktikan harus mengembalikan bahan-bahan kimia yang diambil
ke tempat semula dengan tutup botol jangan sampai tertukar.
13. Setiap praktikan harus bertanggung jawab terhadap kebersihan
laboratorium selama praktikum.

Praktikum TAB | 6
14. Setiap kelompok wajib menyapu, mengelap, mengepel, dan membuang
sampah sesudah praktikum selesai secara bergilir dengan jadwal yang telah
ditentukan asisten praktikum. Sanksi : membantu 2 kali membersihkan
laboratorium di waktu yang berbeda.
15. Bagi praktikan yang memecahkan/merusak alat harus segera melapor ke
asisten, laboran, dan dosen pengampu. Praktikan berkewajiban mengganti
atau memperbaiki kerusakan tersebut sebagai wujud tanggung jawab. Alat
sudah harus ada maksimal H+7 dari hari merusak alat.
16. Apabila terjadi kecelakaan selama praktikum (tertusuk, terluka, mata
kemasukan sesuatu) segera lapor ke asisten, laboran, dan dosen.
17. Perijinan terkait ijin dispensasi dari akademik, sehingga tidak dapat
mengikuti praktikum dilakukan ke dosen pengampu, maksimal H-1, dan
konfirmasi ke asisten praktikum. Peserta diperkenankan mengikuti shift
praktikum di kelas lain. Jika tidak ada kelas lain, maka bisa mengejar nilai
laporan praktikum.
18. Semua laporan ditulis tangan menggunakan bolpoint biru dan Laporan
dikumpulkan H+7 DHP atau sesuai dengan perjanjian dengan asisten.
19. Plagiasi Laporan dikenakan sanksi berupa nilai laporan/praktikum saat bab
tersebut dibagi sesuai dengan jumlah praktikan yang melakukan plagiasi pada
hal yang sama (semisal 3 orang, maka dibagi 3).
20. setiap peserta praktikum wajib mengisi kuisioner online di akhir praktikum
agar nilai praktikum dapat diproses lebih lanjut.
21. Tidak diperkenankan membuat kegaduhan dan keramaian. Sanksi: 1 kelas
dikurangi 5 pada nilai total keaktifan.

Praktikum TAB | 7
 TATA TERTIB PRAKTIKUM
TEKNIK ANALISA DALAM BIOTEKNOLOGI

1. Selama praktikum diwajibkan memakai baju lengan panjang.

2. Selama praktikum dilarang makan, minum, atau merokok di dalam laboratorium.
3. Sebelum mengikuti praktikum, praktikan harus mengumpulkan tiket masuk berupa
prelab, diagram alir dan daftar pustaka (sesuai ketentuan masing-masing materi).
4. Sebelum memasuki laboratorium, pastikan kaki dan tangan dalam keadaan bersih.
5. Dilarang makan/minum dengan menggunakan alat laboratorium, kecuali hal
tersebut berkaitan dengan acara praktikum, pengujian organoleptik dan sebagainya.
6. Selama praktikum wajib mengenakan kaos kaki. Kaos kaki yang digunakan dalam
laboratorium harus dalam keadaan bersih dan tidak berbau, dan kuku dipotong
pendek.
7. Alat-alat yang akan digunakan dalam praktikum harus dalam keadaan bersih dan
atau steril.
8. Praktikan harus mengetahui cara pemakaian peralatan laboratorium sebelum
menggunakannya, bila perlu menanyakan ke asisten atau laboran.
9. Sebelum praktikum dimulai, meja kerja harus dibersihkan dengan disinfektan (detol)
atau alkohol 70% atau 200 ppm klorin.
10. Selama praktikum, meja kerja atau peralatan yang terkena kultur mikrobia harus
segera dibersihkan dengan disinfektan (detol) atau alkohol 70%.
11. Selama bekerja di laboratorium sebaiknya dihindari untuk mengusap (menyentuh)
mulut, telinga, hidung, mata ataupun muka.
12. Dilarang menggunakan pipet dengan mulut untuk menghindari kemungkinan
masuknya bahan yang berbahaya (bahan kimia atau mikrobia) ke dalam tubuh.
13. Dilarang membuang biakan yang masih hidup atau media ke dalam bak pencuci atau
sembarang tempat pembuangan, tetapi dibuang di tempat khusus yang telah
disediakan.
14. Biakan mikrobia yang tidak terpakai lagi, harus dibuang/diletakkan di tempat khusus
yang telah disediakan atau disterilkan dengan autoklaf kemudian segera dicuci.
15. Praktikan wajib menjaga keselamatan diri dan lingkungan ketika bekerja dengan
mikroorganisme selama kegiatan praktikum, terutama mikroba pathogen dan
reagen berbahaya.
16. Setelah praktikum selesai, meja kerja dan peralatan harus dibersihkan dengan
desinfektan.
17. Sebelum meninggalkan laboratorium, praktikan dianjurkan untuk mencuci tangan
dengan bersih.
18. Laporan berupa tiket masuk (prelab, tinjauan pustaka, diagram alir, daftar pustaka),
LKP dan log book. Laporan diketik dengan format sesuai prosedur. Untuk pertanyaan
prelab maupun LKP harus diberi sitasi.
19. Jika pre lab atau laporan ditemukan kesamaan, nilai total akan dibagi sejumlah
laporan yang sama.
20. Secara umum dianjurkan bahwa tata tertib yang ditentukan di atas menjadi
kebiasaan praktikan terutama sewaktu bekerja dengan mikroba.
21. Seluruh praktikan wajib bertanggung jawab atas seluruh rangkaian kegiatan
praktikum meliputi preparasi, praktikum, dan destruksi.

Praktikum TAB | 8
22. Segala jenis perizinan dilakukan ke dosen koordinator Praktikum Teknik Analisa dalam
Bioteknologi (Bu Freini), maksimal H-2, dan konfirmasi ke asisten praktikum.

Ketentuan praktikum
1. Prelab, diagram alir, serta laporan praktikum ditulis tangan menggunakan bolpoin
bertinta warna biru pada kertas A4. Menggunakan border (warna biru) dengan
margin 3,2,2,2. Tulisan Rapi dan dapat dibaca, tulisan yang tidak terbaca akan
mempengaruhi nilai. Tiap lembar diberi header berisi nama, nim, kelompok,
diketik. Tanpa header -1 per halaman.
1 paragraf min 3 kalimat.
Ketauan copas, akan dibagi sejumlah orang yang sama
2. Praktikan membawa seluruh laporan yang sudah di print out saat praktikum.
Analisa prosedur dikerjakan saat praktikum.
3. Praktikan membawa diagram alir setiap preparasi maupun praktikum.
4. Laporan dikumpulkan H+3 dari hari praktikum. Lakukan konfirmasi pengumpulan
laporan H-1 kepada masing-masing asisten.
5. Cover menggunakan kertas berwarna ABU-ABU, ketidaksesuaian pada cover -2
6. Menyontek pada saat pretest/postest -30 tanpa peringatan
7. Preparasi minimal dilakukan oleh 2 orang, dengan toleransi keterlambatan 15
menit. Kelompok yang tidak melakukan preparasi tidak diperkenankan mengikuti
praktikum.
8. Tidak ada evaluasi (presentasi) pada akhir praktikum
9. Di akhir praktikum wajib mengisi kuisioner praktikum
10. Tgl untuk cek loker pertama 2 November 2019, diharapkan membawa kertas abu-
abu yg udah dipotong, selotip, gunting
11. Mulai praktikum tanggal 5 November 2019 (Q) dan 6 November 2019 (RE)
12. Format cover, nametag, dan kelengkapan lainnya akan diupload di blog
13. Blog : praktikumtab2019.wixsite.com/praktikum

Praktikum TAB | 9
 BAB I. DASAR-DASAR PEMIPETAN DAN
PEMBUATAN BUFER
A. TUJUAN INSTRUKSIONAL UMUM
Praktikum ini bertujuan untuk membekali mahasiswa dengan pengetahuan dan
kemampuan dasar pemipetan dan pembuatan bufer yang umum digunakan dalam
eksperimen bioteknologi.

B. TUJUAN INSTRUKSIONAL KHUSUS

Setelah menyelesaikan praktikum ini, mahasiswa diharapkan:
1. Mengetahui dasar-dasar pemipetan dan mampu mempraktikkan pemipetan dengan
baik dan benar. Praktik pemipetan meliputi pembersihan pipet dan tipnya, sterilisasi
pipet dan tipnya (jika diperlukan), pengaturan skala pipet, pemasangan tip pada pipet,
pengambilan sampel menggunakan pipet, pengeluaran sampel dari tip pipet, pelepasan
tip, dan penyimpanan pipet dan tipnya.
2. Mengetahui prinsip dan mampu mempraktikkan pembuatan bufer dengan baik dan
benar. Praktik pembuatan bufer meliputi evaluasi material safety data sheet (MSDS)
bahan, penghitungan bahan, penimbangan bahan, pencampuran dan pelarutan bahan
(reaksi endotermis dan eksotermis), pengaturan pH larutan, penyaringan bufer (jika
diperlukan), pelabelan bufer, dan penyimpanan bufer.

C. DASAR TEORI
C1. DASAR-DASAR PEMIPETAN
Pengetahuan dan kemampuan pemipetan yang baik dan benar harus dimiliki
seseorang yang bekerja di bidang bioteknologi. Dalam praktikum ini, mahasiswa akan
diperkenalkan dengan istilah-istilah dalam pemipetan, tipe pipet, panduan pemipetan
secara umum, teknik pemipetan, faktor-faktor yang berpengaruh terhadap akurasi
pemipetan, kontaminasi silang, dan pemeliharaan pipet.

Istilah-istilah dalam pemipetan

1. Aspirate (aspirasi) : Mengaspirasi cairan ke dalam tip pipet.
2. Dispense (keluarkan) : Mengeluarkan cairan dari dalam tip pipet.
3. Blow-out (buang) : Membuang sisa cairan dari dalam tip pipet.
4. Pre-rinse (basahi) : Membasahi tip dengan cairan yang akan dipipet.
5. Adjust (atur) : Mengatur volume pemipetan cairan.
6. Calibrate (kalibrasi) : Mengkalibrasi pipet.

Tipe pipet
Berdasarkan modenya, pipet dapat dibedakan menjadi dua tipe: air displacement
dan positive displacement. Kedua tipe tersebut sama-sama memiliki piston, namun pada
pipet air displacement terdapat udara dengan volume tertentu yang memisahkan antara
piston dan cairan yang dipipet. Sebaliknya, pada pipet positive displacement, pistonnya
kontak langsung dengan cairan yang dipipet. Pipet air displacement didesain untuk
pemipetan cairan secara umum sedangkan pipet positive displacement didesain khusus
untuk pemipetan cairan dengan viskositas tinggi dan volatil. Tipe pipet yang digunakan
dalam praktikum ini adalah air displacement.

Panduan pemipetan secara umum

Berikut adalah hal-hal yang harus diperhatikan dan dipraktikkan dalam pemipetan:

Praktikum TAB | 10
1. Cek kondisi kebersihan pipet sebelum digunakan. Apabila diperlukan, bersihkan pipet
(bagian luar) dengan kain atau tisu yang dibasahi etanol 70%.
2. Cek kondisi kebersihan tip. Meskipun tip didesain untuk sekali pakai guna menjaga
akurasi pemipetan, untuk keperluan praktikum, tip dapat digunakan berulang. Apabila
kotor, tip dapat dibersihkan menggunakan cairan sabun, alkohol 70%, sonikasi, dan
kemudian dikeringkan. Apabila memerlukan tip steril, tip dapat diautoklof di dalam
plastik atau wadah bertutup.
3. Cek kesesuaian tip dengan pipetnya. Beberapa merk pipet hanya bisa menggunakan
tip khusus dari produsennya. Pastikan menggunakan tip yang sesuai ukuran pipetnya.
4. Basahi tip tiga sampai lima kali (aspirasi–keluarkan–buang) dengan cairan yang akan
dipipet. Hal ini akan meningkatkan akurasi pemipetan.
5. Jangan membaringkan pipet dengan tip yang mengandung cairan atau sisa cairan
karena dapat mengkontaminasi pipet! Setelah digunakan, pipet sebaiknya disimpan
dalam posisi tegak.
6. Hindari penggunaan jari tangan untuk mengencangkan dan melepas tip dari pipet
karena dapat menyebabkan kontaminasi silang.

Teknik pemipetan
Berdasarkan aplikasinya, terdapat empat teknik pemipetan: forward, repetitive,
reverse, dan heterogenous. Keempat teknik tersebut memiliki perbedaan dalam cara
mengaspirasi cairan ke dalam tip, mengeluarkan cairan, dan membuang sisanya dari
dalam tip berdasarkan dua posisi stop (Gambar 1). Teknik forward digunakan untuk
pemipetan dan pencampuran sampel atau reagen dengan larutan lain, misalnya bufer,
larutan asam atau basa dalam konsentrasi rendah. Teknik repetitive digunakan untuk
pemipetan reagen ke dalam tabung secara berulang dengan volume yang sama. Teknik
reverse meminimalkan terjadinya splashing dan terbentuknya buih sehingga cocok
digunakan untuk pemipetan sampel atau reagen yang tidak memerlukan pencampuran
larutan, memiliki viskositas tinggi atau kecenderungan membentuk buih. Teknik ini juga
direkomendasikan untuk pemipetan dengan volume kecil. Teknik heterogenous digunakan
ketika pembasahan tip tidak mungkin dilakukan dan sampel harus dikeluarkan tanpa sisa
dari tip untuk ketepatan analisis. Teknik ini digunakan untuk pemipetan sampel heterogen
seperti serum darah.

A. Teknik forward B. Teknik repetitive

C. Teknik reverse D. Teknik heterogenous

Gambar 1. Teknik pemipetan berdasarkan aplikasinya

: teknik forward (A), repetitive (B), reverse (C), dan heterogenous (D). Tiap langkah pemipetan
digambarkan dalam posisi siap (angka 1–6) dan posisi stop (pertama dan kedua). Gambar
diadaptasi dari referensi 1.

Praktikum TAB | 11
Faktor-faktor yang berpengaruh terhadap akurasi pemipetan
Pemipetan yang baik memerlukan tingkat akurasi dan presisi yang tinggi. Apa yang
dimaksud dengan akurasi dan presisi dalam pemipetan? Mari kita lihat Gambar 2 untuk
menjelaskan konsep ini. Akurasi merujuk pada tingkat kedekatan volume pemipetan
terhadap ukuran yang telah ditentukan sedangkan presisi merujuk tingkat ketepatan
volume pemipetan yang dilakukan secara berulang. Tingkat presisi pemipetan ditentukan
oleh kualitas pipet dan tipnya. Sebaliknya, tingkat akurasi pemipetan dipengaruhi oleh
faktor eksternal seperti temperatur, densitas, ketinggian geografis, dan posisi pemipetan.

Gambar 2. Perbedaan antara presisi dan akurasi dalam pemipetan.

Gambar diambil dari referensi 1.

1. Temperatur. Faktor paling berpengaruh terhadap akurasi pemipetan adalah perbedaan

temperatur tip dan cairan yang akan dipipet. Gap udara antara piston dan permukaan
cairan akan mengalami ekspansi termal akibat perbedaan temperatur ini. Hal ini dapat
meningkatkan atau menurunkan volume cairan yang teraspirasi ke dalam tip.
2. Densitas. Rasio antara massa dan volume memiliki pengaruh terhadap volume cairan
yang teraspirasi dalam pemipetan. Cairan dengan densitas yang lebih tinggi dari air
akan teraspirasi lebih sedikit ke dalam tip untuk ukuran pemipetan yang sama jika
dibandingkan dengan air. Densitas cairan juga bergantung pada temperatur.
3. Ketinggian geografis berpengaruh terhadap akurasi pemipetan melalui tekanan udara.
Semakin tinggi tempatnya, semakin rendah tekanan udara dan faktor konversi Z-nya.
Faktor Z adalah faktor yang digunakan untuk menghitung densitas air yang tersuspensi
di udara pada temperatur dan tekanan pengujian. Selain itu, titik didih cairan juga
menurun dengan meningkatnya ketinggian. Hal ini akan meningkatkan laju evaporasi
cairan tersebut.
4. Posisi pemipetan. Sudut tip terhadap cairan dan kedalaman tip di dalam cairan dapat
berpengaruh terhadap akurasi pemipetan (Gambar 3).

Praktikum TAB | 12
 Gambar 3. Pengaruh posisi pemipetan terhadap tingkat akurasinya.
Gambar diambil dari referensi 1.

Kontaminasi silang
Kontaminasi dapat terjadi dari:
1. Pipet ke sampel atau reagen. Pipet atau tip yang terkontaminasi bisa menyebabkan
sampel atau reagen terkontaminasi. Untuk menghindari kontaminasi, gunakan pipet
yang telah dibersihkan, gunakan tip steril, dan ganti tip setiap sampel atau reagen.
2. Sampel atau reagen ke pipet. Sampel atau reagen dan aerosolnya dapat masuk ke
dalam mulut pipet dan menyebabkan kontaminasi. Untuk menghindari kontaminasi,
gunakan posisi pemipetan secara vertikal, aspirasi cairan secara perlahan, gunakan tip
berfilter atau pipet positive displacement, dan simpan pipet secara vertikal.
3. Satu sampel atau reagen ke sampel atau reagen lain (carry-over). Sisa dari satu
sampel atau reagen dapat bercampur dengan sampel atau reagen lain di dalam tip.
Untuk menghindari kontaminasi, ganti tip setiap sampel atau reagen dan gunakan
pipet yang telah dibersihkan.

Pemeliharaan pipet
Pipet harus dijaga kebersihannya setiap hari. Sebelum digunakan, pipet harus dicek
secara seksama apakah terdapat kotoran, debu, atau residu cairan pada pipet (terutama
bagian mulutnya). Apabila diperlukan, bersihkan dengan menggunakan 70% etanol yang
dibasahkan pada kain/tisu. Selain dijaga kebersihannya, pipet sebaiknya dikalibrasi dan
diservis secara berkala. Pipet yang digunakan setiap hari sebaiknya dikalibrasi setiap tiga
bulan dan diservis setiap enam bulan.

Praktikum TAB | 13
C2. DASAR-DASAR PEMBUATAN BUFER

Setelah memahami dasar-dasar pemipetan, mahasiswa akan diperkenalkan dengan

beberapa macam bufer yang umum digunakan di bidang bioteknologi. Mahasiswa akan
belajar membuat larutan stok, melakukan pencampuran dan pengenceran larutan, serta
mengatur pH larutan. Dalam praktikum ini, mahasiswa akan belajar membuat bufer tris
asetat EDTA (TAE) dengan konsentrasi 50X (bufer stok) dan 1X (bufer kerja).

D. ALAT DAN BAHAN

Alat
Pipet, tip, spatula, kertas timbang, timbangan, gelas ukur, gelas beker, pengaduk, pH
meter, kertas label, botol.

Bahan
Aquades, HCl, NaOH, basa tris, asam asetat, EDTA

E. PROSEDUR KERJA
Dasar-dasar pemipetan
Cara mengecek, membersihkan, dan menyimpan pipet serta cara memasang dan melepas
tip yang baik dan benar akan didemonstrasikan oleh asisten dan dipraktikkan langsung
oleh praktikan.

Pembuatan bufer TAE 50X dan 1X

Bufer TAE dibuat dari basa tris, asam asetat, dan EDTA. pH bufer diatur menggunakan
HCl dan NaOH. Untuk membuat bufer TAE 50X, terlebih dahulu kita harus menyiapkan
larutan stok basa tris dan EDTA. Asam asetat tersedia dalam bentuk cair.

1. Larutan stok basa tris 1 M. Larutkan 121.1 g basa tris di dalam 800 mL aquades. Atur
pH ke 8,5 dengan HCl. Diamkan larutan hingga mencapai temperatur ruang sebelum
melakukan pengaturan pH akhir. Tambahkan aquades hingga volume akhir 1 L.
Larutan stok dapat dipisah ke dalam beberapa botol (200–500 mL). Sterilkan larutan
stok dengan autoklaf dan simpan pada temperatur ruang.
2. Larutan stok EDTA 0.5 M. Tambahkan 181.6 g Na2EDTA2H2O ke dalam 800 mL
aquades. Aduk di atas magnetic stirrer. Atur pH ke 8,0 dengan (~20 g) pelet NaOH.
Garam disodium EDTA tidak akan larut sebelum pH mencapai 8,0. Tambahkan
aquades hingga volume akhir 1 L. Sterilkan larutan stok dengan autoklaf dan simpan
pada temperatur ruang.

Setelah larutan stok diatas siap, kita dapat membuat bufer TAE 50X dengan komposisi:

Reagen Konsentrasi akhir

Basa tris 40 mM
EDTA 2 mM
Asam asetat 20 mM

Setelah mencampur bahan diatas, atur pH ke 8,5. Sebelum digunakan, larutan TAE 50X
harus diencerkan menjadi 1X.

REFERENSI
1. Thermo Scientific Pipetting Guide: Tips for Good Laboratory Pipetting
2. http://cshprotocols.cshlp.org/content/2013/5/pdb.rec074294.full

Praktikum TAB | 14
 BAB II. KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS

F. TUJUAN INSTRUKSIONAL UMUM

Setelah menyelesaikan praktikum ini mahasiswa diharapkan akan mampu
melakukan pengujian menggunakan metode kromatografi lapis tipis dengan benar.

G. TUJUAN INSTRUKSIONAL KHUSUS

1. Mampu mengidentifikasi peralatan yang diperlukan untuk analisis dengan
kromatografi lapis tipis
2. Mengetahui prinsip dasar visualisasi dan analisis komponen sampel A, B,
dan C dengan kromatografi lapis tipis untuk mengetahui apakah sampel
mengandung glukosa, sukrosa, dan maltose.

H. DASAR TEORI
Kromatografi lapis tipis (KLT) atau thin layer chromatography (TLC) digunakan
untuk memisahkan komponen-komponen yang terkandung dalam suatu senyawa dengan
menggunakan gaya kapilaritas suatu senyawa. Komponen-komponen yang terkandung
dalam suatu senyawa tersebut diidentifikasi berdasarkan pola pemisahannya dan
dibandingkan dengan marker. Marker biasanya merupakan komponen murni yang sudah
diketahui. Kromatografi lapis tipis digunakan untuk mengidentifikasi komponen dalam
suatu senyawa yang belum diketahui, menentukan tingkat kemurnian suatu senyawa dan
mengidentifikasi komponen yang terbentuk dari pemecahan suatu senyawa. Kromatografi
lapis tipis merupakan teknik yang sangat sensitif karena dapat mengidentifikasi senyawa
dalam jumlah yang sangat kecil (10-6 gr).
Seperti halnya sistem kromatografi lainnya, kromatografi lapis tipis juga memiliki
fase diam dan fase bergerak. Fase diam yang sering digunakan adalah pelat silika,
sedangkan fase gerak disesuaikan dengan polaritas senyawa yang ingin dipisahkan.
Semakin dekat tingkat kepolaran antara senyawa sampel dengan pelarut fase gerak,
maka sampel akan semakin terbawa oleh fase gerak.
Kromatografi lapis tipis terdiri dari 4 tahap yaitu spotting, development,
pengeringan dan visualisasi.
1. Spotting
Proses spotting adalah proses meneteskan senyawa yang akan diidentifikasi pada
pelat kromatografi lapis tipis (fase diam). Senyawa yang digunakan dalam jumlah
yang sangat sedikit.
2. Development
Development merupakan proses pencelupan pelat kromatografi lapis tipis ke fase
bergeraknya secara vertikal berdasarkan kapileritas senyawa. Pada proses ini, pelarut
fase gerak akan membawa senyawa yang diuji menuju ke atas. Pergerakan senyawa
yang diuji dipengaruhi oleh berat molekul dan polaritas dari senyawa, fase diam dan
fase gerak yang digunakan. Proses kapilerisasi dihentikan saat fase gerak mendekati
bagian atas dari pelat kromatografi lapis tipis.
3. Pengeringan
Pengeringan dilakukan untuk menghentikan proses kapilerisasi solvent fase gerak
agar senyawa yang diuji dapat terpisah dengan baik dan tidak menumpuk pada
bagian atas pelat kromatografi lapis tipis. Proses pengeringan biasanya dilakukan
dengan cara kering angin di dalam lemari asam.

Praktikum TAB | 15
 4. Visualisasi
Visualisasi dilakukan bila senyawa yang diidentifikasi tidak memiliki warna. Proses
visualisasi dapat dilakukan dngan bantuan sinar UV atau mengguakan reagen
tertentu seperti iodin dan orchinol monohidrat.
Jarak antara jalannya pelarut bersifat relatif. Oleh karena itu, diperlukan suatu
perhitungan tertentu untuk memastikan spot yang terbentuk memiliki jarak yang sama
walaupun ukuran jarak platnya berbeda. Nilai perhitungan tersebut adalah nilai Retention
factor (Rf), nilai ini digunakan sebagai nilai perbandingan relatif antar sampel. Nilai Rf
juga menyatakan derajat retensi suatu komponen dalam fase diam sehingga nilai Rf
sering juga disebut faktor retensi. Nilai Rf dapat dihitung dengan rumus berikut :

Semakin besar nilai Rf dari sampel maka semakin besar pula jarak bergeraknya
senyawa tersebut pada plat kromatografi lapis tipis. Saat membandingkan dua sampel
yang berbeda di bawah kondisi kromatografi yang sama, nilai Rf akan besar bila senyawa
tersebut kurang polar dan berinteraksi dengan adsorbent polar dari plat kromatografi lapis
tipis.
Niai Rf dapat dijadikan bukti dalam mengidentifikasikan senyawa. Bila identifikasi
nilai Rf memiliki nilai yang sama, maka senyawa tersebut dapat dikatakan memiliki
karakteristik yang sama atau mirip. Sedangkan bila nilai Rf nya berbeda, senyawa
tersebut dapat dikatakan merupakan senyawa yang berbeda.

Gambar 4. Ilustrasi kromatografi lapis tipis

Praktikum TAB | 16
Contoh perhitungan nilai Rf sesuai ilustrasi Gambar 2.2, yaitu

jarak yang ditempuh sampel

nilai Rf 
jarak yang ditempuh pelarut
4

5,5
 0,73

Gambar 5. Ilustrasi perhitungan TLC

I. ALAT DAN BAHAN

Alat:
Mikropipet, mikrotip, penggaris, pensil kayu, alat semprot, gelas beaker, oven,
mikrotube, kompor listrik, sarung tangan latex.
Bahan:
Pelat TLC silika, n-butanol, asam asetat, aquades, silver nitrat, NaOH, larutan glukosa
1 mg/ml, larutan fruktosa 1mg/ml, larutan maltosa 1mg/ml, sampel A, sampel B, dan
sampel C.

J. PROSEDUR KERJA:
Note: semua tahapan kerja harus dilakukan dengan menggunakan sarung tangan
latex.

1) Buat garis pada dasar pelat TLC silika menggunakan pensil dengan jarak 1 cm dari
tepi bawah dan 1 cm antar titik.
2) Lakukan proses spotting pada titik pelat TLC silika sebanyak 1 µl tiap sampel, 1 µl
untuk marker larutan glukosa, 1 µl untuk marker larutan fruktosa, dan 1 µl untuk
marker larutan maltosa.
3) Letakkan pelat silika pada larutan fase gerak n-butanol : asam asetat : aquades
(4:1:5) (v/v). Pastikan fase gerak berada d bawah titik spotting dan tidak
mengenai titik tersebut.
4) Tunggu hingga fase gerak mencapai tepi atas pelat TLC silika.
5) Angkat pelat TLC silika, kering anginkan di dalam lemari asam.
6) Semprotkan larutan silver nitrat-NaOH secara merata pada permukaan pelat TLC
silica di dalam lemari asam.
7) Panaskan pada oven 100°C selama 2 menit.
8) Evaluasi hasil kromatografi lapis tipis dan hitung nilai Rf nya.

Referensi
Sherma, J. dan B. Fried. 2003. Thin Layer Chromatography, Third Edition, Revised and
Expanded. Marcel Dekker, Inc. New York.

Praktikum TAB | 17
 BAB III. POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR)

A. TUJUAN INSTRUKSIONAL UMUM

Setelah menyelesaikan praktikum ini mahasiswa diharapkan akan mampu
melakukan pengujian PCR dengan benar.

B. TUJUAN INSTRUKSIONAL KHUSUS

1. Mampu mengidentifikasi peralatan yang diperlukan untuk analisis dengan PCR
2. Mampu mengoperasikan peralatan yang digunakan untuk analisis dengan PCR
dengan benar
3. Mengetahui prinsip dasar analisis dengan PCR
4. Menamplifikasi fragmen DNA coloni Lactobacillus plantarum
menggunakan metode PCR

C. DASAR TEORI
Secara alami, sebagian besar organisme membuat DNA salianan dengan bantuan
enzim polymerase. Metode Polymerase Chain Reaction (PCR) menggunakan prinsip yang
sama dengan yang terjadi di alam, hanya dilakukan di dalam tabung reaksi atau secara in
vitro. Metode PCR ini ditemukan pada tahun 1984 oleh Kary B. Mullis. Pengertian
Polymerase Chain Reaction (PCR) adalah sebuah metode untuk mengamplifikasi specific
regions of DNA menggunakan oligonucleotide primers, dNTPs, dan heat-stable DNA
polymerase (biasanya digunakan Taq-DNA polymerase). PCR merupakan proses siklus,
dimana setiap siklus akan menghasilkan duplikasi DNA (Mullis, 1990).
Metode PCR termasuk metode yang sangat sederhana untuk mengamplifikasi DNA
secara in vitro. Terdapat 3 tahap dalam PCR, yaitu denaturasi, annealing, dan extension.
3 tahap ini dilakukan dalam microfuge tube yang sama dan pada akhir siklus DNA telah di
amplifikasi/duplikasi. Siklus dapat diulang hingga 25 siklus atau lebih. Setiap DNA yang
baru di sintesis dapat bertindak sebagai template baru. Sehingga setelah 25 siklus akan
dihasilkan PCR produk (amplicon) sebanyak ±1juta. Pada setiap n siklus PCR akan
diperoleh 2n kali banyak DNA target.
Pada metode PCR dibutuhkan template DNA, heat-stable DNA polymerase (misal
Taq polymerase), reaction buffers /PCR buffers, Magnesium chloride (MgCl2), PCR primers
(forward dan reverse ), dNTP mix, dan mili-Q water. Selain menggunakan template DNA,
dapat pula menggunakan coloni bakteri, yang disebut dengan coloni PCR. Coloni PCR
biasanya diartikan sebagai metode yang digunakan untuk menyeleksi plasmid yang
mengandung insersi yang diinginkan langsung dari koloni bakteri tanpa perlu langkah
pemurnian plasmid (takara,2018). Menurut Bergkessel dan Guthrie (2013) coloni PCR
adalah metode cepat menyeleksi coloni dari yeast atau bakteri setelah coloni ditumbuhkan
di media selektif (setelah proses transformasi) untuk memverifikasi keberadaan DNA yang
diinginkan.
Adapun macam-macam tipe dan modifikasi PCR sebgai berikut:
1. Real-time PCR
2. REVERSE TRANSCRIPTASE-POLYMERASE CHAIN REACTION (RT-PCR)
3. NESTED PCR
4. MULTIPLEX-PCR
5. PCR-ELISA

Praktikum TAB | 18
D. Alat dan Bahan
Alat : mesin PCR, reaction tube, sterile microfuge tube (0.5 ml), PCR tube, tip dan
mikropipet, wadah tempat es serut.
Bahan:
1. aquabidest / Milli-Q water yang sudah disterilisasi,
2. mix PCR (KAPA SYBR Fast qPCR Mastermix (2X) Kit ABI Prism®)
terdiri dari: KAPA SYBR FAST DNA Polymerase, reaction buffer, dNTPs, SYBR
Green I dye, and MgCl2 at a final concentration of 2.5 mM. Where noted, Master
Mixes contain instrument-specific reference dyes.
3. template DNA / target DNA / jika colony PCR maka sampelnya menggunakan
coloni Lactobacillus plantarum,
4. forward dan reverse primers untuk Bakteri asam laktat ,

reverse primers  Sequence - mlb16

5’ – GGC TGC TGG CAC GTA GTT AG - 3’

forward primers  Sequence - plb16

5’ – AGA GTT TGA TCC TGG CTC AQ – 3’
5. es batu serut

E. Prosedur kerja :
a. Dengan mikropipet, dipersiapkan larutan PCR reaction dengan menambahkan
bahan-bahan dibawah ini kedalam 0,5ml microfuge tube steril yang ditempatkan
diatas es serut.
- PCR
10 µl mili-Q / ddH2Osteril
10 µl Buffer mix PCR (Taq polymerase, reaction buffer,
MgCl2, dNTPs)
3 µl template DNA (pRY121 DNA, 2µg/ml) atau coloni
Lactobacillus plantarum
1,0 µl Forward Primer plb16, 10 µM
1,0 µl Reverse Primer mlb16, 10 µM
25 µl TOTAL
- Coloni PCR
13 µl mili-Q / ddH2Osteril
10 µl Buffer mix PCR (Taq polymerase, reaction buffer,
MgCl2, dNTPs)
1,0 µl Forward Primer plb16, 10 µM
1,0 µl Reverse Primer mlb16, 10 µM
1 pick coloni Lactobacillus plantarum
colony
25 µl TOTAL

b. dihomogenkan dengan vortex.

c. Microfuge berisi larutan di spindown 3 detik
d. Microfuge diletakkan di mesin PCR, dan proses amplifikasi akan berlangsung
dengan kondisi reaksi (kondisi mesin PCR tergantung template DNA yang akan
diamplifikasi dan jumlah DNA copy yang dihasilkan):

Praktikum TAB | 19
 1. Initial denaturation pada suhu 94°C selama 2 menit.
2. Denaturation pada suhu 94°C selama 30 detik.
3. Annealing pada suhu 53-60°C selama 45 detik.
4. Extension pada suhu 72°C selama 2 menit.
5. Dilakukan 30-35 cycles
6. Final extension pada suhu 72°C selama 5 min.

30-35 siklus

Initial
Denaturation
Denaturation
94°C,
94°C,
30 detik
2 menit Extention Final
72°C, Extention
2 menit 72°C, 5 menit

Annealing
53-60°C,
45 detik

Gambar 6. Ilustrasi tahapan PCR

e. Microfuge dikeluarkan dari mesin PCR, disimpan dalam lemari pendingin 4oC untuk
segera dilakukan analisa atau -20oC untuk penyimpanan beberapa hari.
f. Berhasilnya proses PCR menghasilkan produk PCR/amplicon dapat dipastikan
dengan menggunakan elektroforesis DNA.

Daftar pustaka

Becker, JM., Caldwell, GA. dan Zachgo, EN. 1996, Biotechnology. A Laboratory Course. 2nd
edition. Academic Press. New York.
Bergkessel, M. and Guthrie, C. 2013. Colony PCR. Methods Enzymol. 2013;529:299-309.
doi: 10.1016/B978-0-12-418687-3.00025-2.
Brandt, M. 2002. Chemistry 472B Biotechnology Laboratory Manual. Edisi ke-2. Cal state.
Fullerton.
Harisha, S. 2007. Biotechnology Procedures and Experiments Handbook. Infinity Science
Press. India.
Mullis, K. 1990. The unusual origin of the polymerase chain reaction. Scientific American,
April 56–65.
Takara. 2018. Colony PCR: Protocol complete in under an hour. www.takarabio.com.

Praktikum TAB | 20
 BAB IV. ELEKTROFORESIS GEL AGAROSA
(ELEKTROFORESIS DNA)

A. TUJUAN INSTRUKSIONAL UMUM

Setelah menyelesaikan praktikum ini mahasiswa diharapkan akan mampu
melakukan pengujian dengan elektroforesis gel agarosa dengan benar.

B. TUJUAN INSTRUKSIONAL KHUSUS

1. Mampu mengidentifikasi peralatan yang diperlukan untuk analisis dengan
elektroforesis gel agarosa
2. Mampu mengoperasikan peralatan yang digunakan untuk analisis dengan
elektroforesis gel agarosa dengan benar
3. Mengetahui prinsip dasar analisis dengan elektroforesis gel agarosa
4. Mampu memvisualisasikan hasil PCR pada elektroforesis DNA kemudian
menganalisa hasilnya

C. DASAR TEORI
Elektroforesis merupakan teknik pemisahan berdasarkan ukuran yang
menggunakan aliran listrik. Elektroforesis menggunakan agarosa digunakan untuk
memisahkan DNA berdasarkan ukurannya. Gel agarosa mampu memisahkan DNA dengan
ukuran 500 – 30.000 pasangan basa. Keunggulan dari elektroforesis gel agarosa adalah
sederhana, cepat, dan dapat mengidentifikasi lokasi DNA dalam gel melalui senyawa
fluoresens.
Agarosa merupakan polimer yang diekstrak dari rumput laut dan bersifat non
toksik. Polimer agarosa terdiri atas D- dan L-galaktosa yang berikatan melaui ikatan
glikosidik α-(1-3) dan β-(1-4). Hasil proses gelasi dari agarosa akan menghasilkan gel 3
dimensi yang memiliki pori dengan rentang diameter 50 nm hingga >200 nm. Pori
tersebut yang digunakan DNA untuk bermigrasi selama proses elektroforesis.
Molekul DNA bermuatan negatif sehingga di dalam medan listrik akan bermigrasi
melalui matriks gel menuju kutub positif (anode). Makin besar ukuran molekulnya, makin
rendah laju migrasinya. Berat molekul suatu fragmen DNA dapat diperkirakan dengan
membandingkan laju migrasinya dengan laju migrasi fragmen-fragmen molekul DNA
standart (marker) yang telah diketahui ukurannya. Visualisasi DNA selanjutnya dilakukan
dibawah sinar ultra violet. Elektroforesis gel agarosa menggunakan perangkat yang
berbentuk horizontal, dan merupakan tipe yang paling sering digunakan.
Adapun faktor-faktor yang mempengaruhi kecepatan migrasi DNA pada gel
agarosa:
1. Ukuran molekul DNA
Semakin besar ukuran DNA, maka migrasi DNA pada gel agarosa akan semakin
lambat. Hal ini terjadi akibat ketidaksesuaian ukuran pori gel agarose dengan
ukuran DNA yang menyebabkan gesekan yang berlebih sehingga laju DNA
melambat.
2. Konsentrasi gel agarosa
Sebuah fragmen DNA linear dari ukuran tertentu bermigrasi pada tingkat yang
berbeda melalui gel agarosa yang mengandung konsentrasi yang berbeda.
3. Voltase yang digunakan
Migrasi DNA proporsional dengan voltase yang digunakan, terutama pada voltase
rendah. Saat voltase terlalu tinggi, mobilitas DNA menjadi terganggu.

Praktikum TAB | 21
 4. Buffer elektroforesis
Mobilitas DNA saat proses elektroforesis dipengaruhi oleh komposisi dan kekuatan
ion dari buffer yang digunakan. Jika buffer kekurangan ion, konduktifitas akan
melemah, dan migrasi DNA akan melemah. Beberapa jenis Buffer yang sering
digunakan adalah TAE, TBE dan TPE.
5. Ethidium Bromida (EtBr)
Interkalasi etidium bromida akan menyebabkan penurunan muatan negatif dari
DNA.
6. Jenis agarosa
Dua tipe agarosa yang dapat digunakan pada elektroforesis agarosa adalah
standart agarosa dan agarosa yang memiliki titik leleh rendah.
7. Konformasi DNA
DNA yang memiliki bentuk superhelik memiliki kecepatan migrasi yang lebih
rendah daripada DNA yang berbentuk linier.

Gambar 7. Ilustrasi elektroforesis gel DNA

Elektroforesis DNA menggunakan gel agarosa (Sambrook & Russell, 2001 )

D. ALAT DAN BAHAN
Alat:
Set peralatan elektroforesis gel agarosa, power supply, mikropipet, mikrotip, sarung
tangan latex, UV iluminator, kompor listrik, erlenmeyer, timbangan analitik.

Bahan:
Agarose, sampel DNA, 1x TAE buffer, loading dye, DNA marker, larutan EtBr.

E. PROSEDUR KERJA:
Note: Semua pekerjaan harus dilakukan menggunakan sarung tangan latex.
1) Bersihkan set peralatan elektroforesis gel agarosa pada air mengalir.

Praktikum TAB | 22
 2) Larutkan 0,8% agarosa dalam 1xTAE buffer. Panaskan hingga agarosa terlarut
sempurna.
3) Tambahkan 4 µl EtBr pada larutan 0,8% agarosa hangat.
4) Tuangkan larutan agarosa hangat pada cetakan agarosa set peralatan
elektroforesis.
5) Segera pasang sisir pada set elektroforesis gel agarose, beri jarak 1-1,5 cm dari
dasar alat.
6) Perhatikan apakah terdapat gelembung atau tidak. Jika terdapat gelembung,
gunakan ujung mikrotip untuk menghilangkan gelembung.
7) Biarkan 30-45 menit hingga memadat sempurna.
8) Tuangkan sedikit 1xTAE buffer diatas gel agarosa, kemudian angkat sisir dari gel
agarosa padat secara hati-hati.
9) Tuangkan 1x TAE buffer hingga gel agorosa terputup secara sempurna oleh TAE
buffer.
10) Campur sampel DNA dengan 0,2x volume 6x loading dye.
11) Load perlahan campuran sampel DNA dan loading dye lubang gel agarosa dengan
menggunakan mikropipet.
12) Tutup set peralatan elektroforesis dan hubungkan dengan power supply.
13) Jalankan proses elektroforesis menggunakan daya 80-100 V.
14) Deteksi keberadaan DNA menggunakan UV illuminator, kemudian abadikan hasil
visualisasinya.
15) Analisis hasil visualisasi elektroforesis DNA.

Referensi:
Sambrook, J. dan D. W. Russell, 2001. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Third
Edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press.

Lampiran
50x TAE buffer 242 gr Tris Base. 57,1 ml asam asetat glasial. 100 ml 0,5 M EDTA
(1Liter) (pH 8.0).
6x loading dye 0,25% bromophenol blue. 40% (w/v) sukrosa dalam H2O.
Larutan EtBr 10 mg/ml dalam H2O.

Praktikum TAB | 23
 BAB V. PRESIPITASI PROTEIN
MENGGUNAKAN AMONIUM SULFAT

A. TUJUAN INSTRUKSIONAL UMUM

Setelah menyelesaikan praktikum ini mahasiswa diharapkan akan mampu
melakukan presipitasi protein dengan benar.

B. TUJUAN INSTRUKSIONAL KHUSUS

1. Mampu mengidentifikasi peralatan yang diperlukan untuk presipitasi protein
2. Mampu mengoperasikan peralatan yang digunakan untuk analisis
3. Mengetahui prinsip dasar analisis presipitasi protein dengan ammonium sulfat
4. Melakukan praktik analisis presipitasi protein (ekstrak kasar enzim
selulase dari Bacillus subtilis) dengan beberapa tingkatan konsentrasi
ammonium sulfat

C. DASAR TEORI
Protein merupakan makromolekul yang memiliki peran sangat penting bagi sistem
biologis seperti berperan dalam struktur sel, katalis reaksi biokimia dan komponen sistem
komunikasi dalam sel. Protein terdiri dari rangkaian dan kombinasi dari 20 asam amino
yang memiliki jumlah dan urutan asam amino yang khas. Oleh karena itu, protein sering
digunakan dan diteliti, dimana proses ekstraksi protein menjadi sangat penting.
Salah satu metode yang sering digunakan pada proses ekstraksi protein adalah
proses presipitasi atau pengendapan. Presipitasi dapat dilakukan dengan menggunakan
garam, pelarut organik atau dengan cara mengubah pH larutan protein. Metode
presipitasi menggunakan garam amonium sulfat atau sodium sulfat merupakan metode
yang sering digunakan. Amonium sulfat lebih sering digunakan karena tingkat solubilitas
yang tinggi, tingkat kemurnian tinggi, tidak mengubah pH larutan protein secara
signifikan, tidak menyebabkan denaturasi protein dan relatif lebih murah.
Pesipitasi protein menggunakan amonium sulfat dapat digolongkan sebagai proses
salting out. Mekanisme salting out sangat kompleks, tetapi dapat diperkirakan bahwa
pengendapan terjadi karena persaingan antara garam dan protein untuk mengikat air.
Peda konsentrasi tinggi, kekuatan ionik garam semakin kuat sehingga garam lebih dapat
mengikat molekul air. Dengan demikian, tidak cukup banyak air yang terikat pada protein
sehingga gaya tarik menarik antar molekul protein lebih menonjol dibandingkan dengan
tarik menarik antara air dan protein. Dalam kondisi ini protein akan mengendap.
Penambahan amonium sulfat ke dalam larutan protein perlu dilakukan secara
bertahap agar didapat hasil pengendapan yang sempurna dan maksimal. Saat proses
salting out menggunakan amonium sulfat, sangat penting untuk menjaga konsentrasi
garam agar tidak menurun dalam larutan sehingga hanya protein target yang
mengendap. Oleh karena itu, perlu dilakukan pengadukan selama penambahan garam,
agar konsentrasi dapat tetap terjaga.
Untuk mengendapkan protein target dengan optimal, perlu dilakukan uji optimasi
untuk menentukan pada konsetrasi amonium sulfat berapakah protein target Anda
maksimal diendapkan. Optimasi dilakukan dengan melakukan serangkaian uji
pengendapan dengan berbagai konsentrasi amonium sulfat jenuh. Konsentrasi yang
digunakan dari 20%, 30%, 40%, 50% seterusnya selama 24 jam pada suhu 2-4°C. Pada
setiap penambahan garam, endapan protein dapat dipisahkan melalui proses sentrifugasi.
Endapan yang diperoleh disuspensikan dengan larutan bufer fosfat. Pada akhir proses
presipitasi, konsentrasi garam yang terdapat pada larutan protein akan sangat tinggi.

Praktikum TAB | 24
Dialisis merupakan metode yang sering digunakan untuk menghilangkan residu amonium
sulfat.

Gambar 8. Kiri: kelarutan protein pada beberapa konsentasi garam. Kanan: solubilitas protein
menggunakan berbagai garam

Presipitasi Protein Menggunakan Amonium Sulfat (Krisna C., Duong-Ly, S. B.

Gabelli, 2014)

D. ALAT DAN BAHAN

Alat:
Sentrifuge, magnetic stir plate, gelas beaker, mikrotube, magetic stirer bar,
mikropipet, mikro tip, set peralatan SDS PAGE.

Bahan:
Sampel Protein (ekstrak kasar enzim selulase dari Bacillus subtilis), amonium sulfat,
bahan-bahan SDS PAGE.

E. PROSEDUR KERJA
1) Hitung volume larutan protein yang akan dilakukan presipitasi. Tuangkan ke dalam
gelas beaker.
2) Tambahkan amonium sulfat ke dalam larutan protein hingga konsentrasi akhir
menjadi 30% jenuh untuk menghilangkan protein marginal.
3) Tambahkan magnetik stirer bar, kemudian aduk menggunakan magnetik stir plate
pada suhu dingin selama 30 menit.
4) Sentrifugasi pada 8.000rpm selama 15 menit, ambil supernatannya, sisakan sedikit
untuk analisa SDS PAGE.
5) Hitung volume larutan protein pada tahap sebelumnya (no. 4), tuang ke dalam
gelas beaker.
6) Tambahkan amonium sulfat ke dalam larutan protein hingga konsentrasi akhir
60% jenuh.
7) Tambahkan magnetik stirer bar, kemudian aduk menggunakan magnetik stir plate
pada suhu dingin selama 30 menit.
8) Sentrifugasi pada 8.000rpm selama 15 menit, ambil supernatannya, sisakan sedikit
untuk analisa SDS PAGE dan simpan pelletnya pada suhu 4°C.

Praktikum TAB | 25
 9) Hitung volume larutan protein pada tahap sebelumnya (no. 8), tuang ke dalam
gelas beaker.
10) Tambahkan amonium sulfat ke dalam larutan protein hingga konsentrasi akhir
90% jenuh.
11) Tambahkan magnetik stirer bar, kemudian aduk menggunakan magnetik stir plate
pada suhu dingin selama 30 menit.
12) Sentrifugasi pada 8.000rpm selama 15 menit, ambil supernatannya, sisakan sedikit
untuk analisa SDS PAGE dan simpan pelletnya pada suhu 4°C.
13) Analisa protein target menggunakan SDS PAGE menggunakan sampel dari setiap
tahap presipitasi.

Referensi

Krisna C., Duong-Ly, S. B. Gabelli. 2014. Methods in Enzimology, Volume 541, Chapter
Salting Out of Proteins Using Ammonium Sulfate Precipitation. Elsevier Inc.

Lampiran

Praktikum TAB | 26
 BAB VI. ELEKTROFORESIS PROTEIN (SDS-PAGE)

A. TUJUAN INSTRUKSIONAL UMUM

Setelah menyelesaikan praktikum ini mahasiswa diharapkan akan mampu
melakukan elektroforesis protein dengan benar.

B. TUJUAN INSTRUKSIONAL KHUSUS

1. Mampu mengidentifikasi peralatan yang diperlukan untuk analisis elektroforesis
2. Mampu mengoperasikan peralatan yang digunakan untuk analisis elektroforesis
dengan benar
3. Mengetahui prinsip dasar analisis elektroforesis
4. Mengetahui prinsip dasar pemisahan protein dengan metode elektroforesis
5. Menentukan berat molekul protein
6. Melakukan praktik pemisahan protein dengan SDS-PAGE menggunakan
sampel kasein dan isolated soy bean protein kemudian menghitung
berat molekulnya.

C. DASAR TEORI
Elekroforesis secara umum adalah metode memisahkan molekul bermuatan yang
bermigrasi dalam sebuah medan listrik. Pada elektroforesis gel molekul akan dipisahkan
berdasarkan pada muatan, bentuk dan ukurannya. Elektroforesis gel terdiri dari matriks
berupa polimer berpori. Ukuran atau konsentrasi materi polimer menentukan nilai
koefisien gesekan (f), semakin besar persentase gel maka, semakin kecil ukuran pori. Ada
2 jenis matriks yang biasa digunakan, yaitu poliakrilamida dan agarose (polisakarida).
Untuk protein biasanya digunakan matriks jenis poliakrilamide.
Salah satu teknik elektroforesis yang sering digunakan adalah SDS-PAGE (Sodium
Dodecyl Sulfate Polyarcylamide Gel Electrophoresis), yang merupakan metode cepat dan
reproducible dalam mengkuantifikasi dan mengkarakterisasi protein. SDS-PAGE dapat
menganalisis kemurnian protein, mengestimasi berat molekul protein, memverifikasi
konsentrasi protein, mendeteksi proteolysis dan mendeteksi modifikasi protein (Bollag dan
Edelstein 1991, Walker 2002).
Sodium Dodecyl Sulfate - Polyacrylamide Gel Electrophoresis (SDS-PAGE) biasanya
dilakukan untuk memisahkan protein sesuai dengan ukurannya. Selain itu, SDS-PAGE
merupakan elektroforesis gel yang bersifat mendenaturasi. Dalam metode ini, protein
dipisahkan menurut berat molekulnya menggunakan peranan dari gel polyakrilamid
sebagai media. Gel yang digunakan dalam sistem ini terdiri atas gel penumpuk (Stacking
gel) yang berpori besar dan Gel pemisah/lower gel (separating gel/ resolving gel) yang
berpori lebih kecil. Molekul sampel yang melewati gel penumpuk berada di atas gel
pemisah dan sampel diletakkan di atas gel penumpuk. Sampel yang tertumpuk (stacked)
pada gel penumpuk (pori besar), setelah dialirkan arus listrik maka molekul akan bergerak
melewati pori-pori gel pemisah, dan terpisahkan berdasar berat molekul (BM).

Pembuatan Gel Poliakrilamide

Alat dan Bahan

Alat : gelas beker/erlenmayer, tabung reaksi, mikropipet, tip, perangkat
pembentuk gel (glass plates, spacer, sample weel comb), beker glass 100 ml,
beker glass 50 ml, eppendorf, shaker.

Praktikum TAB | 27
 Gambar 9. Perangkat alat elektroforesis (Biorad, 2013)

Bahan :
1. Sampel: kasein 0,1% (b/v), isolated soy bean protein 0,1 % (b/v). (Preparasi
sample menurut Pardo and Natalucci (2002) yang dimodifikasi).
2. Sampel buffer: (Sambrookand Russell, 2006)
Bahan µl
0,0625% 0,5M Tris-HCl (pH 6,8) 125 250
2% SDS 200 400
10% Gliserol 100 200
5% 2-Merkapto etanol 50 100
0,001% Bromophenol blue 10 20
Diencerkan sampai 10 ml

3. Running Buffer : Glysine 14,1 g, Tris 3 g, SDS 1 g dilarutkan akuades sampai 1000
ml
4. Buffer Tris-HCl 0.5 M, pH 6.8
5. Larutan stock akrilamid 30%: 2.92 gram akrilamid ditambah 0.08 gram N’N’-bis-
methylene acrylamid dalam 10ml aquades.
6. Larutan SDS 10 %
7. Amonium persulfat (APS) 10% (di buat setiap akan digunakan dengan melarutkan
100 mg APS dalam 1 ml akuades)
8. TEMED
9. Larutan pewarna dan Larutan pembilas
Bahan Pewarna Penghilang
Croomasil Brilian blue 0,125 g -
Metanol 22,7 ml 14 ml
Asam asetat glasial 4,6 ml 14 ml
Aquabides Sampai volume 50 ml Sampai volume 200 ml
Sumber: Sambrookand Russell (2006)
10. Lower Gel Buffer (LGB) ; 1.82 g Tris, 0.04 g SDS pH 8,8 dilarutkan akuades
sampai 10 mL (untuk mencapai pH 8,8 ditambahkan HCl 0,6 N
11. Upper Buffer Gel (UGB) : 0.75 g Tris, 0.04 g SDS pH 6,8 dilarutkan pada akuades
sampai 10 mL

Praktikum TAB | 28
 12. Komposisi Bahan Separating Gel 12% dan Stacking Gel 3%
Bahan Separating gel (µl) Stacking gel (µl)
Lower Gel Buffer (LGB) 1300 -
30% acrylamide 0,8% bis 2000 400
Upper Gel Buffer (UGB) - 625
Akuades 1700 1475
TEMED 3 / 3,5 * 5/2/4*
10% Ammonium 25 / 30 / 35 / 40 * 30 / 20 *
phosphate (APS)
* Tergantung umur bahan, semakin baru semakin sedikit yang digunakan
Sumber: Sambrookand Russell (2006)

F. PROSEDUR KERJA ELEKTROFORESIS (Sambrook and Russell, 2006)

Pembuatan gel :
1. Pasanglah kaca loading untuk mencetak gel ke tempat yang disediakan (seperti
gambar 11.1)
2. Persiapkan larutan Lower Gel Buffer (LGB) dan Upper Gel Buffer (UGB)
3. Pembuatan Separating Gel 12 % dilakukan dengan mencampurkan bahan sesuai
komposisi diatas. Penambahan APS 10% dan TEMED dilakukan pada proses akhir
pencampuran sesegera mungkin.
4. Aduk hingga tercampur merata
5. Tuangkan ke dalam cetakan gel dengan menggunakan mikropipet hingga tinggi
yang dikehendaki. Beri sisa tempat untuk stacking gel di bawah area peletakan
gigi sisir.
6. Biarkan gel terpolimerisasi selama 15-30 menit dalam suhu ruang.
7. Tuangkan aquades dengan mikropipet ke permukaan gel pemisah (supaya gel
yang terbentuk rata) dan kemudian buang aquades tersebut dengan menyerapkan
tisu
8. Sementara itu buat lagi stacking gel sesuai dengan komposisi diatas.
9. Tuangkan larutan ke atas gel pemisah
10. Sisipkan gigi sisir pada stacking gel dengan perlahan, jangan sampai terbentuk
gelembung.
11. Biarkan gel terpolimerisasi selama 15-30 menit dalam suhu ruang
12. Ambillah sisir secara perlahan dari gel.
13. Pindahkan gel secara perlahan ke dalam tank elektroforesis (inner chamber)
(seperti Gambar 11.2)
14. Masukkan buffer ke dalam tank elektroforesis

Praktikum TAB | 29
Praktikum TAB | 30
 Gambar 10. Manual prosedur pemasangan alat elektroforesis (Biorad, 2013)

Persiapan sampel (Preparasi sample menurut Pardo and Natalucci (2002)

yang dimodifikasi) :
1. Larutkan sampel 0,005; 0,0075; 0,01; 0,0125; 0,015 gram dalam larutan buffer
Tris 0,5 ml
2. Divortex
3. Panaskan pada suhu 90oC selama 5 menit
4. Didinginkan

Pemisahan protein dengan elektroforesis (Bio-rad, 2002) :

1. Masukkan marker ke dalam sumuran sebanyak 5µl
2. Masukkan sampel ke dalam sumuran sebanyak 10µl
3. Masukkan buffer sampel hingga gel terendam.
4. Pasanglah elektrode sesuai dengan warnanya.
5. Gel dijalankan pada tegangan 200 V selama 45 menit atau hingga sampel telah
mencapai bagian dasar.

Praktikum TAB | 31
 Gambar 11. Pemisahan protein berdasarkan ukuran molekul
(https://www. electroforesis.html%3B513%3B292)

Pewarnaan gel (Pardo and Natalucci (2002) yang dimodifikasi) :

1. Matikan listrik, pindahkan gel dari tank
2. Pindahkan glass plate dari gel kedua sisi
3. Tuangkan larutan pewarna pada gel dalam wadah
4. Tutup dengan plastik dan letakkan di atas shaker selama 15-30 menit
5. Pindahkan larutan pewarna dari gel. Simpan untuk digunakan kembali.
6. Bilas gel dengan aquades
7. Tuangkan larutan pembilas selama dan masukkan potongan kertas saring,
biarkan selama 10-15 menit di atas shaker
8. Ganti larutan pembilas dengan yang baru hingga yang terlihat pada gel adalah
pita-pita protein.
Pengamatan :
Amati pita-pita yang terbentuk pada gel elektroforesis. Cari dalam literatur berat
molekul masing-masing komponen penyusun kasein dan tentukan letak komponen
tersebut pada pita gel elektroforesis.

Nilai Rf : Jarak pergerakan pita dari tempat awal

Jarak pergerakan warna dari tempat awal

Dari Plotting RF dan log BM marker didapatkan persamaan y=ax+b dimana y= log BM
dan x = RF. Sehingga BM sampel dapat dicari dengan mencari RF sampel dan plotting
pada persamaan marker.

Referensi:
Sambrook, J. dan D. W. Russell, 2001. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Third
Edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press.

Lampiran
50x TAE buffer 242 gr Tris Base. 57,1 ml asam asetat glasial. 100 ml 0,5 M EDTA (pH
(1Liter) 8.0).
6x loading dye 0,25% bromophenol blue. 40% (w/v) sukrosa dalam H2O.
Larutan EtBr 10 mg/ml dalam H2O.

Praktikum TAB | 32