[Gra

21
b
your
read
er’s
III. METODE PENELITIAN atten
3.1 Tempat dan Waktu Pelaksanaan tion
with
Penelitian dilakukan di laboratorium Bioteknologi dan greenhouse Karang
a
Ploso Universitas Muhammadiyah Malang. Penelitian dimulai pada Mei 2016 great
quot
sampai dengan Oktober 2016. e
from
3.2 Bahan dan Alat the
docu
Bahan yang digunakan dalam penelitian antara lain bibit tomat, limbah
ment
industri biodisel, tanah dan air, tisu steril, isolat Fusarium oxysporium, mediaor
use
PDA, agar - agar, fungisida (bahan aktif benomyl), aquades steril, kapas, tisu, this
spac
clorox 5%. e to
emp
Alat yang digunakan untuk membantu dalam penelitian yaitu, lampu spirtus,
hasiz
scalpel, pinset, jerum preparat, jarum cut, mikroskop, cutter, polybag, spyer, e a
key
tabung reaksi, haemocytomer, autoclave, Laminar Air Flow (LAF), gelas beaker, point
. To
petridish steril, kertas label, spidol, rotavapor. place
this
3.3 Rancangan Penelitian
text
Penelitian ini menggunakan rancangan acak kelompok dengan 2 faktor box
any
dimana faktor pertama adalah cara pemberian (C) yang terdiri dari 5 taraf yaitu C1
wher
= kontrol (air), C2 = Lewat tanah, C3 = disemprotkan, C4 = lewat tanah dan e on
the
disemprotkan, C5 Fungisida, dan faktor kedua adalah interval pemberian (I) yang page
, just
terdiri dari 4 taraf yaitu I1 = seminggu sekali, I2 = dua minggu sekali, I3 = tiga
drag
minggu sekali, I4 = empat minggu sekali. Sebagai kontrol yaitu tanaman yang it.]

tidak diinokulasi pathogen dan tidak diberi ekstrak tanaman. Semua perlakuan di

ulang sebanyak 3 kali.

21
 20

3.4 Denah Penelitian

Denah percobaan di lapang :
C1I1 C2I1 C5I1 C4I4 C4I1 C5I1 C5I2 C2I4 C3I1 C1I4
I II III II I II III III III II

C1I2 C2I2 C4I2 C4I3 C3I4 C2I3 C5I2 C3I2 C5I3 C1I3
I II I II I III II III III II

C1I3 C2I3 C4I3 C4I2 C3I3 C3I3 C5I3 C3I4 C2I2 C1I2
I II I II I III II III III II

C1I4 C2I4 C4I4 C4I1 C3I2 C5I4 C4I1 C2I1 C1I1 C1I1
I II I II I II III III III II

C2I1 C3I1 C5I1 C3I4 C3I1 C1I4 C1I2 C4I2 C5I4 C5I4
I II I II I III III III III I

C2I2 C5I2 C2I4 C3I2 C1I3 C4I3 C5I3 C2I3 C4I4 C3I3
I I I II III III I I III II

Keterangan :

C = Cara pemberian

I = Interval pemberian

I, II, III = Ulangan

3.5 Metode Penelitian

3.5.1 Ekstrak limbah industri biodiesel

1. Merendam limbah industri biodisel yang sudah dihaluskan ke dalam botol

menggunakan methanol 96 % selama 3 hari.

2. Menyiapkan alat dan bahan yang akan digunakan dalam proses ekstraksi,

antara lain rotavapor, corong, kertas whatman, erlenmeyer, beaker glass, gelas

ukur, corong pemisah, timbangan digital, air, methanol, dan dichloromethane.

3. Limbah industri biodisel yang sudah direndam selama 3 hari kemudian disaring

menggunakan kertas whatman untuk diambil filtratnya.

4. Menimbang berat kosong (a) tabung rotavapor. Memasukkan filtrat ke dalam

tabung rotavapor. Rotavapor diatur dengan kecepatan 70 rpm dan suhu 400C.
 21

5. Hasil filtrat yang sudah dirotavapor kemudian ditambahkan dengan

dichloromethane di dalam tabung pemisah untuk memisahkan antara

hidropobik dan hidrofilik.

6. Lapisan yang terbentuk di bawah tabung pemisah diambil perlahan. Kemudian

dirotavapor lagi sampai didapatkan ekstrak limbah biodisel. Kemudian

menimbang tabung rotavapor beserta isinya (b).

3.5.2 Pembuatan Media PDA

1. Mengupas kentang dan memotong bentuk dadu kecil-kecil.

2. Menimbang 20 g dextrose, 20 g agar, dan 200 g potongan kentang untuk 1 liter

PDA.

3. Merebus 800 ml aquades hingga mendidih dan memasukkan kentang kedalam

aquades tersebut serta mendiamkannya selama 10 menit dengan api kecil.

4. Menyaring aquades rebusan kentang tersebut lalu menambahkan dengan 20 g

agar, dan ditambahkan air sampai 1000 ml.

5. Merebus kembali larutan tersebut sambil diaduk hingga mendidih dan

menambahkan 20 g dextrose.

6. Tuang larutan media ke dalam elemeyer untuk disteril dalam autoclave dengan

suhu ± 1210 C selama 15 menit.

3.5.3 Perbanyakan Fusarium oxysporum

1. Mempersiapkan alat dan bahan yang diperlukan.

2. Steril alat menggunakan autoclave dengan suhu ± 121 C, selama ± 60 menit.

3. Mengencerkan media PDA menggunakan microwive.

4. Memasukkan alat dan isolat Fusarium oxysporum kedalam LAF.

 22

5. Menuangkan media PDA yang sudah encer kedalam cawan petri. Tunggu

selama 10 menit hingga padat.

6. Menanam Fusarium oxysporum ke media PDA.

Gambar 5. Inokulasi jamur Fusarium oxysporum ke media PDA

7. Spora Fusarium oxysporum akan muncul setelah 7 hari.

3.5.4 Persiapan menanam Tomat

1. Menyiapkan alat dan bahan yang akan digunakan, antara lain bibit tomat,

tanah, polybag, dan kertas label.

2. Memasukan tanah ke dalam polybag.

3. Meletakkan bibit tomat kedalam polybag.

3.5.5 Perhitungan Jumlah Spora Fusarium oxysporum

1. Menyiapkan alat dan bahan yang akan digunakan, antara lain mikroskop,

haemocytometer, penutup preparat, pipet, batang penebar, beaker glass,

aquades steril, alkohol, isolat Fusarium oxysporum (diperoreh dari koleksi

isolat peneliti sebelumnya), hand counter, kertas label dan alat tulis.

2. Isolat Fusarium oxysporum dipanen dari dalam petri dengan cara

menambahkan 20 ml aquades steril lalu menggesekkan batang penebar

dengan maksud supaya spora terlepas kemudian memasukkannya ke dalam

 23

beaker glass. Mengaduk hasil panen sampai homogen lalu mengambilnya

menggunakan pipet tetes.

3. Meletakkan haemocytometer pada meja mikroskop dan meneteskan suspensi

tepat pada ruang hitungnya sebanyak 1 tetes.

4. Menutup tetesan suspensi dengan penutup preparat dan dijaga agar tidak

terjadi gelembung udara di dalam kotak-kotak haemocytometer.

5. Preparat diamati menggunakan mikroskop dan dihitung jumlah spora dalam

setiap kotak.

Cara menghitung spora :

a. Menyiapkan haemocytometer tipe neubauer improve, letakkan pada meja

benda mirkoskop. Tutup dengan gelas penutup.

Gambar 6. Penutupan Haemocytometer dengan menggunakan gelas

penutup
b. Mengamati dengan perbesaran 100x, untuk mendapatkan bidang hitung

pada haemocytometer.

c. Meneteskan suspensi spora secara perlahan pada bidang hitung dengan

mikropipet hingga memenuhi kanal.

Gambar 7. Penetesan suspensi pada bidang hitung

 24

d. Mendiamkan satu menit agar posisi stabil

e. Mengulangi pengamatan untuk memperoleh fokus pada spora dan bidang

hitung

f. Menghitung jumlah spora yang terdapat pada kotak hitung pada 5 bidang

pandang dengan perbesaran 400x menggunakan handcounter. Lakukan 2

kali penghitungan untuk tiap bidang hitung.

Gambar 8. Perhitungan Spora

g. Menghitung rata-rata spora dalam setiap 16

kotak kecil secara pengamatan diagonal.

Setelah diketahui banyaknya spora pada kotak hitung

haemocytometer, hitung jumlah spora dengan rumus

Keterangan :

N1 = jumlah rata-rata spora pada 5 bidang pandang haemocytometer

N2 = kerapatan spora yang diinginkan

V1 = volume yang di ambil dari jumlah spora yang didapatkan

V2 = volume yang diinginkan dari kerapatan spora yang diingkan

 25

3.5.6 Pengaplikasian ekstrak limbah industri biodisel (pengujian 1 di lapang)

Pengujian dilapang dilakuakan pada tanaman tomat berumur 30 HST

dengan pemberian ekstrak bahan tanam melalui penyemprotan, lewat tanah

dengan meyiramkankan disekitar tanah tanaman tomat.

Penyemprotan dan pemberian lewat tanah ekstrak bahan tanam sebanyak 139

ml / tanaman. Penyemprotan dan pemberian lewat tanah ini dilakuakan dengan

selang waktu satu minggu sekali.

3.5.7 Infeksi Fusarium oxysporum (pengujian 2 di lapang)

Infeksi Fusarium oxysporum dilakukan pada tanaman tomat setelah 1 hari

setelah pengaplikasian ekstrak bahan tanam. Kerapatan spora yang digunakan

untuk menginfeksi tanaman adalah 1 x 107. Isolat Fusarium oxysporum yang akan

digunakan dalam pengaplikasian sebanyak 50 ml/tanaman . Infeksi dilakukan

dengan cara menyiramkan isolat Fusarium oxysporum pada daerah sekitar akar

tanaman.

3.6 Pengamatan
1. Tinggi tanaman, di amati setelah 7 HST dengan interval 7 hari sekali

dengan cara mengukur pangkal tanaman hingga titik tumbuh tanaman

2. Jumlah Daun, di amati setelah 7 HST dengan interval 7 hari sekali dengan

cara menghitung semua daun pada setiap tanaman.

3. Awal muncul bunga dengan cara diamati setiap hari.

4. Berat Buah dan jumlah buah , diamati saat panen

5. Masa Inkubasi, Dihitung sejak awal infeksi sampai muncul gejala awal

terserang fusarium oxysporum dengan cara diamati setiap hari.

 26

6. Presentase Tanaman Terserang, pengamatan dilakukan dengan mengamati

tanaman sampel yang terserang fusarium oxysporum Persentase tanaman

terserang dihitung menggunakan rumus menurut Sudjana (2001):

Keterangan :
P = Persentase tanaman terserang
a = Jumlah tanaman terserang
b = Jumlah total tanaman