MODUL PRAKTIKUM

MIKROBIOLOGI INDUSTRI

Disusun oleh:

Arum Sari S.Si, M.Sc.

Afrizka Premana Sari, S.Si., M.Sc.

LABORATORIUM MIKROBIOLOGI
DIII TEKNIK KIMIA
POLITEKNIK PERKEBUNAN YOGYAKARTA
2020
 KATA PENGANTAR

Mikrobiologi merupakan salah satu cabang ilmu biologi yang mempelajari tentang
makhluk hidup mikroskopis, khususnya bakteri dan jamur. Mikrobiologi mencakup pengenalan
struktur dan karakteristik mikrobia, faktor-faktor yang berpengaruh terhadap pertumbuhan
mikrobia, manfaat mikrobia dalam kehidupan manusia, dan lain sebagainya. Dalam dunia industri,
mikrobia telah lama dimanfaatkan terutama dalam produksi makanan. Sebagai contoh penggunaan
khamir Saccharomyces cereviceae dalam pembuatan wine, kapang Aspergillus sp. dalam
pembuatan kecap, dan Rhizopus sp. dalam pembuatan tempe.

Mikrobia juga sering dimanfaatkan sebagai agen biodegradasi suatu substrat hasil samping
industri untuk mereduksi limbah agar tidak toksik bagi lingkungan. Semua proses ini melibatkan
berbagai aktivitas biokimia seluler mikrobia dalam memanfaatkan substrat dan dipengaruhi oleh
berbagai faktor, baik dari segi jenis mikrobia itu sendiri maupun faktor lingkungan yang memadai,
seperti suhu, pH, oksigen, dan sebagainya. Oleh karena itu, penting kiranya mahasiswa
mempelajari seluk beluk mikrobiologi mulai dari pengenalan struktur morfologi mikrobia hingga
pemanfaatannya dalam dunia industri.

Buku petunjuk praktikum Mikrobiologi Industri ini merupakan pedoman pelaksanaan

praktikum Mikrobiologi Industri bagi mahasiswa DIII Teknik Kimia Politenik Perkebunan
Yogyakarta yang disusun berdasarkan berbagai manual laboratorium, penelusuran pustaka serta
pengalaman penelitian maupun praktikum yang telah dilakukan. Dengan buku petunjuk ini
diharapkan agar mahasiswa dapat melaksanakan praktikum dengan lancar dan menggunakan
teknik yang tepat.

Akhir kata, penulis menyadari masih terdapat banyak kekurangan dalam buku ini. Oleh
karena itu penulis mengharapkan saran dan kritik yang membangun demi menyempurnakannya.

Terimakasih,

Tim Penyusun

ii
 DAFTAR ISI
Halaman
HALAMAN JUDUL ...................................................................................... i
KATA PENGANTAR ..................................................................................... ii
DAFTAR ISI ................................................................................................... iii
DAFTAR GAMBAR ....................................................................................... iv
DAFTAR TABEL ........................................................................................... v
TATA TERTIB PRAKTIKUM ....................................................................... vi
FORMAT PENYUSUNAN LAPORAN ........................................................ vii
ACARA I. TEKNIK-TEKNIK DASAR PRAKTIK MIKROBIOLOGI ....... 1

A. Sub Acara 1: Pengenalan Alat Laboratorium Mikrobiologi ................ 1

B. Sub Acara 2: Metode Sterilisasi .......................................................... 6
C. Sub Acara 3: Pembuatan Medium Pertumbuhan Mikrobia ................. 8
D. Sub Acara 4: Teknik Isolasi dan Inokulasi Mikrobia .......................... 11

ACARA II. KARAKTERISASI MORFOLOGI KOLONI DAN SEL

MIKROBIA DENGAN PENGECATAN ....................................................... 15

A. Sub Acara 1: Karakterisasi Morfologi Koloni Mikrobia ..................... 15

B. Sub Acara 2: Pengecatan Gram Sel Bakteri ........................................ 18
C. Sub Acara 3: Pengecatan Sederhana Fungi ......................................... 21
ACARA III. UJI SENSITIVITAS (PENGARUH BAHAN KIMIA, LOGAM DAN

SINAR UV TERHADAP PERTUMBUHAN MIKROBIA) .......................... 24

A. Sub Acara 1: Pengaruh Desinfektan thd Pertumbuhan Mikrobia ....... 24

B. Sub Acara 2: Pengaruh Logam thd Pertumbuhan Mikrobia................ 27
C. Sub Acara 3: Pengaruh Sinar UV thd Pertumbuhan Mikrobia ............ 29

ACARA IV. KINETIKA PERTUMBUHAN MIKROBIA ........................... 31

DAFTAR PUSTAKA ...................................................................................... 37

iii
 DAFTAR GAMBAR

Halaman
Gambar 1. Alat gelas ...................................................................................... 2
Gambar 2. Alat preparasi mikrobiologi ........................................................... 3
Gambar 3. Alat bantu penglihatan dan perhitungan mikrobia......................... 4
Gambar 4. Media pertumbuhan mikrobia........................................................ 8
Gambar 5. Ilustrasi teknik aseptis dalam mengambil biakan mikrobia ........... 11
Gambar 6. Metode streak plate ....................................................................... 12
Gambar 7. Beberapa kenampakan morfologi pada media agar plate ............. 15
Gambar 8. Ilustrasi bentuk-bentuk koloni mikrobia........................................ 16
Gambar 9. Struktur mikroskopis kapang ......................................................... 22
Gambar 10. Metode difusi disk ....................................................................... 24

Gambar 11. Kurva pertumbuhan mikrobia ...................................................... 32

Gambar 12. Prosedur serial dilusi (viable count) ............................................ 33

iv
 DAFTAR TABEL

Halaman
Tabel 1. Nama dan fungsi peralatan laboratorium mikrobiologi..................... 5
Tabel 2. Hasil pengamatan morfologi koloni mikrobia ................................... 17
Tabel 3. Perbedaan dinding sel bakteri gram positif dan gram negatif ........... 18
Tabel 4. Hasil pengamatan morfologi sel bakteri ............................................ 20
Tabel 5. Hasil pengamatan mikroskopis kapang ............................................. 23
Tabel 6. Hasil pengamatan zona jernih pada uji desinfektan .......................... 26
Tabel 7. Hasil pengamatan zona jernih pada uji oligodinamik logam ............ 28
Tabel 8. Hasil pengamatan uji pengaruh sinar UV .......................................... 29
Tabel 9. Hasil pengamatan optical density dan jumlah koloni mikrobia ........ 36

v
 TATA TERTIB PRAKTIKUM

1. Praktikan wajib datang tepat waktu. Toleransi keterlambatan 15 menit. Melebihi waktu
yang telah ditentukan, praktikan tidak diperkenankan mengikuti praktikum.
2. Apabila praktikan berhalangan hadir, diwajibkan mengajukan surat izin/surat dokter (bila
sakit) dan wajib mengikuti inhal atau mendapatkan tugas khusus dari dosen/asisten
pengampu.
3. Sebelum atau sesudah praktikum, akan diadakan pretest/postest mengenai materi
praktikum. Sehingga diharapkan mahasiswa sudah mempelajari petunjuk praktikum
sebelum bekerja.
4. Selama melakukan praktikum, praktikan diwajibkan mengenakan sepatu, jas laboratorium,
masker dan sarung tangan karet (gloves) sebagai alat perlindungan diri (APD).
5. Selesai melaksanakan praktikum, praktikan bertanggung jawab atas peralatan yang
digunakan.
6. Praktikan wajib menjaga kebersihan laboratorium.
7. Praktikan tidak diperkenankan makan dan minum di dalam laboratorium.

vi
 FORMAT PENYUSUNAN LAPORAN

A. Judul

B. Tujuan

C. Dasar teori

D. Alat dan Bahan

a. Alat

b. Bahan

E. Cara Kerja

F. Hasil

G. Pembahasan

H. Kesimpulan (disesuaikan dengan tujuan)

I. Daftar Pustaka (Sesuaikan dengan kaidah penulisan daftar pustaka, tidak diperkenankan

menggunakan Wikipedia, blogspot, dan sejenisnya). Usahakan referensi dari buku/jurnal

penelitian.

J. Lampiran (dokumentasi gambar, laporan sementara, dan tabel-tabel/kurva bila diperlukan)

vii
 ACARA I

TEKNIK-TEKNIK DASAR PRAKTIK MIKROBIOLOGI

A. Sub Acara 1 : Pengenalan Alat Laboratorium Mikrobiologi

1. Tujuan :
a. Mahasiswa mampu mengenal berbagai alat dan bahan yang digunakan dalam
praktikum Mikrobiologi
b. Mahasiswa mampu memahami prinsip kerja, fungsi, dan cara penggunaan tiap alat
dan bahan yang diperagakan.

2. Pendahuluan
Pengenalan alat-alat laboratorium yang digunakan dalam praktikum mikrobiologi
perlu dilakukan demi keefektifan dan keselamatan kerja penelitian mikrobiologi.
Pengetahuan mengenai prinsip kerja dan prosedur penggunaan alat diharapkan dapat
meminimalisir kerusakan alat dan ketidaktepatan hasil praktikum maupun penelitian.
Alat-alat yang digunakan dalam praktikum mikrobiologi terdiri dari golongan alat gelas
(glassware), alat preparasi, alat bantu penglihatan, dan alat bantu penghitungan.
a. Alat gelas
1) Jarum ose/loop/sengkelit digunakan untuk menanam mikroba dengan cara
goresan/streak.
2) Batang bengkok/spreader/batang Drigalsky digunakan untuk menanam mikroba
dengan cara sebar/pulasan/spread.
3) Jarum enten digunakan untuk mengambil mikroba berupa biakan jamur/fungi.
4) Jarum inokulasi/needle digunakan untuk menanam mikroba dengan cara tusukan.
5) Gelas Bekker: digunakan untuk pembuatan media dan pemanasan.
6) Erlenmeyer digunakan sebagai wadah media atau biakan kultur mikroba.
7) Pipet ukur & pompa/filler pump, mikropipet & mikrotip digunakan untuk
mengambil larutan secara akurat.

1
 8) Tabung reaksi digunakan untuk sediaan kultur mikroba atau pengujian fisiologis
mikroba.
9) Gelas ukur digunakan untuk mengambil larutan dalam jumlah tertentu.
10) Cawan petri/petridish: digunakan untuk membiakkan dan mengamati koloni
mikrobia
11) Alat-alat lain: mikropipet, pelubang sumuran (cork borer), lampu bunsen, kaca
obyek, kaca obyek cekung, kaca penutup, gelas arloji/ timbang, filter bakteri,
tabung Durham.

Cawan petri Erlenmeyer Tabung reaksi + rak

Ose Drigalsky

Gambar 1. Alat gelas

b. Alat preparasi
1) Microbiological Safety Cabinet (MSC) / Laminar Air Flow (LAF), merupakan
ruang/lemari tempat menanam mikroba
2) Autoklaf, digunakan untuk sterilisasi alat/bahan/media tertentu dengan
menggunakan uap panas bertekanan (moist heat).

2
3) Inkubator, digunakan sebagai tempat inkubasi media yang telah ditanami mikroba
dengan suhu tertentu untuk mendukung pertumbuhannya.
4) Lemari pendingin/refrigerator, digunakan untuk menyimpan media steril yang
siap pakai agar isi dan mutu media tersebut tidak berubah, menyimpan untuk
sementara waktu bahan/spesimen yang belum sempat diperiksa agar tidak
mengalami perubahan dan menyimpan cakram antibiotik/antibiotic disk yang
belum dipakai agar tidak mengalami perubahan.
5) Timbangan digital/neraca tiga lengan, digunakan untuk menakar bahan kering
secara akurat.
6) Inkubator shaker: digunakan untuk tempat inkubasi mikroba yang membutuhkan
aerasi yang baik.
7) Vortex : digunakan untuk mengaduk atau mencampur suspensi supaya homogen.

Autoklaf
Laminar Air Flow

Vorteks Inkubator

Gambar 2. Alat preparasi mikrobiologi

3
c. Alat bantu penglihatan
1) Mikroskop : digunakan untuk melihat morfologi mikroskopis sel mikroba dengan
berbagai perbesaran.
2) Lup : digunakan untuk membantu melihat morfologi makroskopis mikroba
(koloni)

d. Alat bantu penghitungan

1) Colony counter: digunakan untuk melihat dan memudahkan menghitung jumlah
koloni mikroba di dalam cawan petri, juga untuk menghitung diameter koloni.
2) Hand counter: digunakan untuk membantu dalam penghitungan jumlah koloni
mikroba dalam cawan petri secara manual.
3) Petroff hausser counting chamber/Hemasitometer: digunakan untuk menghitung
sel mikroba dalam perhitungan langsung.

Colony counter Counting chamber

Mikroskop
Hand counter

Gambar 3. Alat bantu penglihatan dan perhitungan mikrobia

4
3. Cara Kerja
a. Simulasi/demo alat dan penjelasan asisten mengenai prinsip kerja, penggunaan, dan
fungsi masing-masing alat.
b. Praktek penggunaan alat dengan benar sesuai dengan fungsinya.
c. Catat fungsi dan dokumentasikan gambar tiap alat yang didemonstrasikan!

4. Hasil
Tabel 1. Nama dan fungsi peralatan laboratorium mikrobiologi
Nama alat Gambar Fungsi

dst

5. Pembahasan
Paparkan kegunaan serta cara penggunaan peralatan yang ada dalam laboratorium
mikrobiologi tersebut.

5
B. Sub Acara 2 : Metode Sterilisasi
1. Tujuan
a. Mahasiswa mampu mengenal berbagai alat yang digunakan dalam teknik sterilisasi.
b. Mahasiswa mampu memahami prinsip kerja, fungsi, dan cara penggunaan tiap alat
yang digunakan untuk sterilisasi.

2. Pendahuluan
Sterilisasi dalam mikrobiologi berarti suatu proses membebaskan tiap benda atau
substansi dari semua kehidupan dalam bentuk apapun. Sterilisasi perlu dilakukan untuk
mencegah kontaminasi mikroorganisme. Sterilisasi dapat dilakukan secara langsung
dengan bahan kimia, secara mekanik maupun fisik.
a. Sterilisasi kimiawi
Senyawa kimia yang biasanya digunakan untuk sterilisasi antara lain : alkohol 70%,
fenol, formalin, detergen dan karbol.
b. Sterilisasi mekanik
Sterilisasi mekanik dapat dilakukan pada bahan cair yang tidak tahan terhadap
pemanasan, seperti dengan penyaringan/ filtrasi melalui filter berpori sangat kecil.
Contohnya antara lain: membrane milipore, berkefeld filter, chamberland filter.
c. Sterilisasi fisik
Sterilisasi fisik umumnya digunakan untuk mensterilkan alat atau bahan yang tahan
pemanasan, tekanan, dan radiasi. Sterilisasi fisik dapat dilakukan melalui:
1) Sterilisasi pemanasan kering
Yaitu dengan pemijaran menggunakan api spiritus (Bunsen) untuk alat
seperti ose, pinset, bibir tabung reaksi dan Erlenmeyer. Cara lain yang lebih
efektif yaitu dengan menggunakan oven dengan suhu 160o C – 175o C selama
1,5 – 2 jam untuk alat-alat laboratorium yang terbuat dari kaca seperti cawan
petri, tabung reaksi, Erlenmeyer dan tabung kaca.
2) Sterilisasi pemanasan basah
Sterilisasi ini berprinsip pada pemanasan dengan perebusan dan tekanan
uap tinggi. Biasanya menggunakan autoklaf yang dioperasikan dengan suhu
121o C dengan tekanan 2 atm selama 15 menit untuk bahan dan 20 menit untuk

6
 alat. Pada kondisi tersebut mikroba berspora dapat dimusnahkan. Selain itu juga
dapat menggunakan teknik pasteurisasi dengan perebusan berselang dengan
suhu 60o C selama 15 menit kemudian diturunkan suhunya untuk kemudian
dipanaskan kembali pada suhu 60o C. Teknik pasteurisasi ini biasanya
digunakan dalam produk-produk susu (dairy).
3) Radiasi
Sterilisasi ini dilakukan dengan menggunakan sinar UV atau sinar Gamma dan
biasanya digunakan untuk mensterilisasi ruangan.

3. Alat dan Bahan

a. Autoklaf e. Cawan petri
b. Lampu spiritus f. Kapas
c. Jarum inokulasi g. Kertas
d. Tabung reaksi h. Akuades

4. Cara Kerja
a. Bungkus cawan petri dan pipet ukur menggunakan kertas. Perhatikan cara
pembungkusan petri dan pipet ukur!
b. Isi tabung reaksi dengan aquades, lalu tutup dengan sumbat kapas dan kertas.
c. Masukkan alat-alat yang akan disterilisasi ke dalam autoklaf
d. Operasikan autoklaf sesuai SOP yang diperagakan oleh asisten.
e. Setelah selesai, pastikan pengukur tekanan menunjukkan angka 0 sebelum membuka
autoklaf.

7
C. Sub Acara 3 : Pembuatan Medium Pertumbuhan Mikroba
1. Tujuan
a. Mahasiswa mampu mengenal berbagai jenis medium pertumbuhan yang digunakan
dalam praktikum Mikrobiologi
b. Mahasiswa mampu memahami dan melakukan pembuatan medium pertumbuhan
mikroba.

2. Pendahuluan
Pembiakan mikroba di laboratorium memerlukan media yang berisi nutrisi serta
lingkungan pertumbuhan yang sesuai bagi mikroba. Media adalah suatu bahan yang
digunakan untuk menumbuhkan mikroba yang terdiri atas campuran nutrisi atau zat-zat
makanan. Selain untuk menumbuhkan mikroba, media dapat juga digunakan untuk isolasi,
memperbanyak, pengujian sifat-sifat fisiologis dan perhitungan jumlah mikroba
Berdasarkan konsistensinya, media dapat dibedakan menjadi : media cair, media padat,
dan media setengah padat (semisolid). Sedangkan berdasarkan fungsinya dibedakan
menjadi empat yaitu media umum, media selektif, media diferensial, media pengaya
(enrichment culture).

Nutrient agar KIT Agar plate

Media dalam tabung reaksi
(media cair, agar
miring/slant, dan agar
tegak)

Gambar 4. Media pertumbuhan mikrobia

8
 Nutrient Agar (NA) dan Nutrient Broth (NB) merupakan salah satu media
pertumbuhan bakteri yang bersifat umum (general), artinya banyak jenis bakteri yang
mampu tumbuh dalam media ini. Komposisi keduanya sama, perbedaanya terletak pada
konsistensi (NA padat karena mengandung agar, sedangkan NB cair karena tanpa agar).
Berikut komposisi NA dalam 1 L media:
Peptone 5 gr
Ekstrak yeast 2 gr
Sodium klorida 5 gr
Agar 15 gr
Dilarutkan dengan akuades hingga 1 L (pH 7)

PDA (Potato Dekstrose Agar) memiliki komposisi utama kentang. PDA banyak
digunakan sebagai media pertumbuhan yeast dan kapang. Seperti namanya, media ini
terdiri dari ekstrak kentang, dekstrosa, dan agar. Selain kentang, terdapat pula media tauge
yang termasuk media media semi sintetik. Sukrosa sebagai sumber gula dan energi. Agar
sebagai pemadat dan akuades untuk melarutkan komponen-komponen media
pertumbuhan.

3. Alat dan Bahan

Alat: Bahan:
a. Timbangan a. Media Nutrien Agar (NA)
b. Gelas beaker b. Media Nutrien Broth (NB)
c. Erlenmeyer c. Potato Dextrose Agar (PDA)
d. Kompor/hotplate d. Aquades
e. Batang pengaduk e. Kentang
f. Taoge
g. Sukrosa/dekstrosa/gula pasir

9
4. Cara Kerja
a. Pembuatan media NA/NB/PDA
1) Timbang media NA/NB/PDA sesuai dengan instruksi pada kemasan (timbang
untuk pembuatan 250 ml media).
2) Masukkan dalam Erlenmeyer 250 ml
3) Tambahkan 250 ml akuades, panaskan sambil sesekali diaduk hingga hampir
mendidih dan larutan berubah menjadi kuning jernih
4) Untuk pembuatan media di dalam tabung reaksi, tuang media yang sudah jadi di
atas ke dalam tabung reaksi (± 5-7 ml)
5) Tutup Erlenmeyer dan tabung reaksi dengan sumbat kapas dan kertas/aluminium
foil
6) Media siap disterilkan dengan autoklaf
7) Untuk pembuatan agar miring, setelah media dalam tabung reaksi dikeluarkan
dari autoklaf (masih dalam keadaan cair), segera diletakkan dalam posisi miring
(tidur) dengan kemiringan 15-45o agar berbentuk miring saat memadat.

b. Pembuatan media kentang

1) Kupas 200 gr kentang, dicuci, potong dadu, masukkan dalam gelas bekker 1 L.
2) Tambahkan 1 liter akuades, direbus sampai masak
3) Saring dengan kain saring/saringan teh, tambahkan 20 gr dekstrosa, 15 gr agar,
dan akuades hingga volume 1 L, panaskan sambil sesekali diaduk selama 30
menit hingga larut.
4) Untuk pembuatan media di dalam tabung reaksi, tuang media yang sudah jadi ke
dalam tabung reaksi (± 5-7 ml).
5) Tutup Erlenmeyer dan tabung reaksi dengan sumbat kapas dan kertas/aluminium
foil.
6) Media siap disterilkan dengan autoklaf.

10
D. Sub Acara 4 : Teknik Isolasi dan Inokulasi Mikrobia
1. Tujuan
a. Mahasiswa mampu mengenal berbagai jenis teknik isolasi mikrobia.
b. Mahasiswa mampu memahami prinsip kerja dan melakukan teknik isolasi, inokulasi
serta subkultur mikrobia.

2. Pendahuluan
Isolasi mikrobia ialah memisahkan mikroba tersebut dari lingkungannya di alam dan
menumbuhkannya sebagai biakan murni dalam medium buatan. Inokulasi adalah
memindahkan mikrobia dari biakan lama ke media baru. Proses pemindahan mikrobia
hendaknya dilakukan dengan teknik aseptis. Teknik aseptis adalah suatu metode dalam
memindahkan atau mentransfer kultur mikrobia dari satu tempat ke tempat lain agar tidak
terjadi kontaminasi oleh mikroba lain ke dalam kultur, salah satu contohnya adalah dengan
melakukan isolasi dan inokulasi di dekat api maupun di dalam LAF. Jangan lupa di setiap
melakukan isolasi dan inokulasi selalu menggunakan alat perlindungan diri (APD), antara
lain jas laboratorium, gloves/sarung tangan karet, dan masker agar praktikan terlindungi
dari bahan-bahan toksik maupun terhindar dari infeksi mikrobia yang sedang digunakan.

Gambar 5. Ilustrasi teknik aseptis dalam mengambil biakan mikrobia

(Brock, 2015)

Macam-macam cara isolasi dan menanam mikroba adalah : 1). Spread plate method
(cara tebar/sebar), 2). Streak plate method (cara gores), 3). Pour plate method (cara tabur).
Biakan mikroba hasil isolasi tampak dalam bentuk koloni yang disebut dengan kultur atau
isolat. Koloni yang seragam dan terdiri dari satu spesies disebut kultur murni. Apabila

11
 ingin menyimpan sediaan isolat mikroba dapat dilakukan teknik subkultur atau menanam
isolat ke dalam medium agar miring di tabung reaksi.

Gambar 6. Metode streak plate (Brock, 2015)

3. Alat dan Bahan

a. Spreader/batang bengkok/batang Drigalsky
b. Jarum ose bulat
c. Pipet volume, lampu spiritus
d. Media NA dan PDA steril
e. Cawan petri
f. Kultur mikroba
g. Larutan pengencer (aquades atau NaCl 0,9%)

4. Cara Kerja
a. Metode Pour Plate
1) Siapkan alat dan bahan yang diperlukan di atas meja kerja, semprot tangan dan
meja dengan alkohol 75%, nyalakan api spiritus.
2) Buka tutup tabung reaksi yang mengandung kultur murni bakteri, dan lewatkan
mulut tabung pada api. Perhatikan posisi tangan dan jari dalam membuka
tutupnya.

12
 3) Pindahkan 1 ml kultur murni mikroba ke dalam cawan petri steril secara aseptis
menggunakan pipet ukur/mikropipet. Perhatikan cara yang telah diperagakan
asisten dalam membuka tutup cawan petri.
4) Bakar leher Erlenmeyer di atas bunsen, dan tuangkan media NA cair steril ke
dalam cawan petri secara aseptis. Pastikan NA yang dituangkan tidak terlalu
panas.
5) Goyangkan perlahan-lahan untuk mencampur kultur bakteri dengan NA sampai
homogen. Goyangkan seperti membentuk angka 8 di atas meja. Penggoyangan
petri jangan terlalu kuat. Pada saat penuangan media, petri bisa diletakkan dalam
radius maksimal 20 cm dari sumber api (zona steril).
6) Setelah agar memadat diinkubasi terbalik pada suhu kamar selama 24 jam.
Apabila ingin hasil yang lebih maksimal, dapat diinkubasi pada suhu 37oC untuk
bakteri, dan 27oC untuk kapang/yeast di dalam inkubator. Inkubasi terbalik
dilakukan setelah agar memadat, dengan tujuan agar uap air yang terbentuk
dalam cawan petri tidak jatuh di koloni yang terbentuk. Amati
pertumbuhannya!
7) Catat hasil morfologi koloni hasil isolasi dalam tabel tabulasi hasil pada sub acara
Karakterisasi Morfologi Koloni Mikroba.

b. Metode Spread Plate

1) Bakar mulut Erlenmeyer berisi medium NA, di atas bunsen lalu tuangkan media
NA ke dalam cawan petri secara aseptis.
2) Setelah medium agar memadat, tambahkan 0,1 ml kultur murni mikroba ke
permukaan agar secara aseptis.
3) Ratakan kultur mikroba menggunakan drigalsky.
4) Setelah permukaan agar mengering, selanjutnya inkubasikan secara terbalik
selama 24 jam pada suhu kamar dan amati pertumbuhannya.
5) Bandingkan pertumbuhan dari tiap metode.
6) Catat hasil morfologi koloni hasil isolasi dalam tabel tabulasi hasil pada sub acara
Karakterisasi Morfologi Koloni Mikroba.

13
c. Metode Streak Plate
1) Tuang media NA cair ke dalam cawan petri steril. Biarkan memadat.
2) Panaskan jarum ose hingga memijar di atas bunsen, kemudian dinginkan di
samping bunsen.
3) Ambil 1 ose kultur murni bakteri dan goreskan pada permukaan media agar
dimulai pada satu ujung. Perhatikan teknik penggoresan! Ose disentuhkan pada
permukaan media agar dalam cawan petri, sewaktu menggores ose dibiarkan
meluncur di atas permukaan agar.
4) Setiap kali menggoreskan ose untuk kuadran berikutnya, pijarkan ose terlebih
dahulu dan biarkan dingin.
5) Inkubasikan secara terbalik pada suhu kamar selama 24 jam dan amati
pertumbuhannya.
6) Catat hasil morfologi koloni hasil isolasi dalam tabel tabulasi hasil pada sub acara
Karakterisasi Morfologi Koloni Mikroba.

d. Isolasi bakteri dalam ruangan

1) Tuang media NA cair ke dalam cawan petri steril. Biarkan memadat.
2) Letakkan di atas meja dan biarkan media NA plate dalam posisi terbuka selama
15 menit.
3) Tutup NA plate tersebut dan inkubasi dalam suhu ruang selama kurang lebih 1
minggu.
4) Amati koloni mikroba yang terbentuk.
5) Dokumentasikan dan catat ciri-cirinya berdasarkan karakter yang diamati.

14
 ACARA II

KARAKTERISASI MORFOLOGI KOLONI DAN SEL MIKROBIA DENGAN

PENGECATAN

A. Sub Acara 1 : Karakterisasi Morfologi Koloni Mikrobia

1. Tujuan
a. Mahasiswa mampu mengenal berbagai parameter karakterisasi morfologi koloni
mikroba.
b. Mahasiswa mampu melakukan karakterisasi morfologi koloni mikroba.

2. Pendahuluan
Dalam penelitian mikrobiologi, seringkali harus dilakukan karakterisasi mikrobia
yang akan digunakan. Karakterisasi berfungsi untuk mengenali sifat-sifat fisik maupun
kimiawi dari suatu organisme dengan tujuan mampu menentukan jenis organisme
tersebut. Karakterisasi dalam dunia mikrobiologi dibagi atas karakterisasi morfologi
koloni dan morfologi sel. Koloni merupakan kumpulan massa sel yang terbentuk dari 1
sel mikrobia dan memiliki karakteristik kenampakan yang khas. Spesies mikroba yang
berbeda akan menunjukkan kenampakan koloni yang berbeda pula. Karakteristik yang
dapat diamati pada koloni antara lain: bentuk, ukuran, elevasi, margin, karakteristik optik,
warna pigmen, dan tekstur. Pengamatan karakteristik koloni tersebut umumnya dilakukan
pada media agar plate. Beberapa karakteristik tertentu juga dapat diamati pada media agar
miring dan media cair.

Gambar 7. Beberapa kenampakan morfologi koloni mikrobia pada media agar plate
(Brock, 2015)

15
 Parameter karakteristik koloni pada agar plate meliputi:

a. Bentuk: Circular, irregular, filamentous, atau rhizoid

b. Elevasi: Raised, convex, flat, umbonate, atau crateriform
c. Margin (tepian): Entire, undulate, filiform, curled, atau lobate
d. Karakteristik optik: opaque (mengkilat), translucent (buram), transparent (tembus
pandang)
e. Pigmentasi: beberapa mikrobia memiliki pigmen yang bervariasi, ada yang merah,
pink, cokelat, kuning, hijau, bahkan hitam.

Gambar 8. Ilustrasi bentuk-bentuk morfologi koloni mikrobia

Parameter pengamatan morfologi koloni pada kapang/jamur sedikit berbeda dibandingkan

dengan bakteri. Kenampakan koloni kapang

3. Alat dan Bahan

Sama seperti praktikum sebelumnya (inokulasi dan isolasi mikrobia)

4. Cara Kerja
a. Amati karakter koloni mikroba hasil isolasi pada sub acara sebelumnya.
b. Masukkan tiap parameter ke dalam tabel pengamatan pada hasil (tabel 1).
16
5. Hasil
Tabel 2. Hasil pengamatan morfologi koloni mikrobia
Gambar Karakteristik Karakteristik Pigmen Bentuk Elevasi Bentuk
optik permukaan koloni tepian

6. Pembahasan
a. Jelaskan manfaat karakterisasi mikrobia!
b. Jelaskan jenis-jenis karakterisasi mikrobia secara lengkap!

17
B. Sub Acara 2 : Pengecatan Gram Sel Bakteri
1. Tujuan
Untuk mengetahui morfologi sel bakteri dan sifat sel bakteri (Gram positif atau Gram
negatif)

2. Pendahuluan
Selain pengamatan secara makroskopis, dalam penelitian mikrobia juga sering
dilakukan pengamatan mikroskopis. Pengamatan mikroskopis ini bertujuan untuk
mengetahui karakteristik sel mikrobia yang diamati, seperti bentuk sel. Mikrobia
mempunyai bentuk sel yang beraneka ragam tergantung jenisnya. Ada yang berbentuk
batang, bulat, bahkan spiral. Sebelum diamati, mikrobia harus diberikan perlakuan
pengecatan terlebih dahulu. Fungsi pengecatan disini adalah untuk memberikan kontras
antara sel mikrobia dengan lapang pandang sekitarnya, sehingga sel akan tampak lebih
jelas. Ada beberapa jenis pengecatan mikrobia, salah satunya yang paling sering
digunakan adalah pengecatan Gram, suatu metode yang ditemukan oleh Hans Christian
Gram pada tahun 1884. Pengecatan Gram termasuk ke dalam pengecatan diferensial yang
dapat membedakan antara bakteri gram positif dan bakteri gram negatif. Perbedaan antara
bakteri gram positif dan gram negatif terletak pada komposisi dinding sel bakteri.

Tabel 3. Perbedaan dinding sel bakteri gram positif dan negatif

Jenis Komposisi dinding sel Contoh bakteri
gram Peptidoglikan LPS* Asam teikoat
Positif Ada (Tebal) Tidak ada Ada Bacillus subtilis

Negatif Ada (Tipis) Ada Tidak ada Escherichia coli

Keterangan: *LPS : lipopolisakarida (ikatan lemak dengan karbohidrat)

Pengecatan gram melalui 4 tahapan:

a. Pemberian Gram A (Kristal violet) untuk memberikan warna ungu pada dinding sel

18
 b. Gram B (iodin) untuk menguatkan warna kristal violet dengan membentuk kompleks
kristal violet-iodin (KV-I)
c. Gram C (alkohol), sebagai peluntur kompleks KV-I pada bakteri gram negatif. Hal
ini karena alkohol akan melarutkan LPS, sehingga permeabilitas dinding sel
terganggu dan warna ungu dari gram A terlepas. Sedangkan pada gram positif,
pemberian alkohol justru membuat pori-pori dinding sel mengecil, sehingga
kompleks KV-I terperangkap dan sel tetap berwarna ungu.
d. Gram D (safranin), bertujuan mewarnai dinding sel gram negatif yang warnanya telah
luntur, sehingga dinding sel gram negatif akan berwarna merah.

3. Alat dan Bahan

Alat: Bahan:
a. Tabung reksi a. Media Nutrien Agar (NA)
b. Kaca preparat b. Cat Gram (Gram A, B, C, dan D)
c. Ose c. Bakteri Bacillus subtilis
d. Mikroskop d. Bakteri Escherichia coli
e. Bunsen e. Akuades steril
f. Pipet tetes f. Alkohol

4. Cara kerja
a. Pengecatan dari isolat agar miring
1) Hari pertama: pindahkan 1 ose bakteri dari isolat agar miring stok ke agar
miring yang baru, inkubasi 24 jam pada suhu 37oC.
2) Hari kedua: ambil 2-3 ose akuades steril, teteskan di atas kaca preparat yang
telah dibersihkan.
3) Ambil 1 ose biakan dari agar miring, letakkan di atas tetesan akuades steril pada
preparat. Ratakan searah jarum jam dari dalam keluar. Keringanginkan sambil
sesekali dilewatkan di atas api untuk fiksasi agar sel bakteri menempel pada kaca
preparat.

19
 4) Tetesi dengan gram A, diamkan selama 1 menit dan bilas dengan air mengalir.
Keringanginkan.
5) Tetesi dengan gram B, diamkan selama 1 menit dan bilas dengan air mengalir.
Keringanginkan.
6) Tetesi dengan gram C, diamkan selama 30 detik dan bilas dengan air mengalir.
Keringanginkan.
7) Tetesi dengan gram D, diamkan selama 2 menit dan bilas dengan air mengalir.
Keringanginkan.
8) Amati di bawah mikroskop dengan perbesaran 1000x
9) Amati warna serta bentuk sel yang tampak. Gambar dan dokumentasikan!

b. Pengamatan dari isolat media cair

1. Hari pertama: pindahkan 1 ose bakteri dari isolat agar miring stok ke 5 ml media
cair dalam tabung reaksi, inkubasi 24 jam pada suhu 37oC.
2. Hari kedua: Ambil 2-3 ose bakteri dari media cair. Ratakan di atas kaca preparat
yang telah dibersihkan.
3. Lakukan pengecatan gram seperti pada poin a diatas.
4. Amati warna serta bentuk sel yang tampak. Gambar dan dokumentasikan!

5. Hasil Pengamatan
Tabel 4. Hasil pengamatan morfologi sel bakteri
Jenis Gambar Bentuk sel Warna sel Sifat gram
bakteri

20
C. Sub Acara 3: Pengecatan Sederhana Fungi
1. Tujuan
a. Mahasiswa mampu melakukan pengecatan pada bakteri dan fungi (kapang dan
khamir)
b. Mahasiswa mampu melakukan pengamatan preparat bakteri dan fungi secara
mikroskopis
c. Untuk mengetahui bentuk sel bakteri dan fungi melalui pengecatan sederhana.

2. Pendahuluan
Selain pengecatan Gram, mikrobia juga dapat diamati secara mikroskopis dengan
pengecatan sederhana (simple staining). Pewarnaan sederhana merupakan suatu teknik
pewarnaan menggunakan zat warna tunggal yang menghasilkan warna yang kontras
dengan latar belakangnya. Beberapa pengecatan sederhana yang umum digunakan adalah
metilen blue, karbolfuchsin, kristal violet dan safranin.
Pengecatan sederhana dapat diaplikasikan baik pada bakteri maupun fungi (kapang
dan khamir). Bakteri merupakan organisme prokariotik (pro: sebelum, dan karyon: inti),
yang berarti sel yang belum memiliki nucleus (inti sel) atau tidak memiliki membrane inti
yang memisahkan materi genetic di inti sel dengan bagian sel lainnya. Sedangkan fungi
merupakan organisme eukariotik (memiliki membrane inti sel), seperti hewan dan
tumbuhan. Fungi yang dalam keseharian kita sebut jamur sebenarnya memiliki banyak
jenis dengan beranekaragam bentuk, baik secara makroskopis (dapat dilihat dengan mata
telanjang), maupun yang mikroskopis. Ada khamir/yeast yang merupakan fungi uniseluler
seperti bakteri (bersel satu). Contohnya adalah Saccharomyces cereviceae yang banyak
dimanfaatkan dalam industri roti, tape dan alkohol (wine). S. cereviceae berkembangbiak
dengan tunas.
Kebanyakan fungi adalah multiseluler, membentuk suatu jaringan filament yang
disebut hifa. Fungi pembentuk hifa umumnya disebut sebagai kapang (molds). Hifa-hifa
tersebut tumbuh bersamaan membentuk miselium yang terlihat secara makroskopis. Dari
miselium tumbuh hifa aerial yang tampak seperti serat kapas, dan terdapat konidia pada

21
 ujungnya. Konidia merupakan spora aseksual dan umumnya memiliki pigmen (hitam,
hijau, merah, kuning, atau coklat). Contoh kapang yang banyak dimanfaatkan dalam
industri pangan adalah Aspergillus wentii dalam pembuatan kecap dan Rhizopus oryzae
dalam pembuatan tempe.

Gambar 9. Struktur mikroskopis kapang (Brock, 2015)

3. Alat dan Bahan

Alat: Bahan:
a. Tabung reksi a. Media Potato Dextrose Agar (PDA)
b. Kaca preparat b. Metilen blue
c. Ose c. Gliserol
d. Mikroskop d. Isolat kapang dan yeast Saccharomyces
e. Bunsen cereviceae
f. Pipet tetes e. Alkohol

4. Cara kerja
a. Letakkan 1 tetes gliserol di atas kaca preparat
b. Ambil 1 ose isolat yeast/kapang dan letakkan pada tetesan gliserol tersebut
c. Teteskan metilen blue hingga menutupi sampel.
d. Tutup dengan coverglass secara hati-hati agar tidak terbentuk gelembung udara.
e. Amati di bawah mikroskop dengan perbesaran 400x.
f. Amati bentuk bagian-bagian mikroskopis kapang yang tampak.

22
 g. Gambar dan dokumentasikan!

5. Hasil Pengamatan
Tabel 5. Hasil pengamatan mikroskopis kapang
Jenis kapang Gambar Bagian-bagian sel dan fungsinya

6. Pembahasan
a. Sebutkan dan jelaskan jenis-jenis pengecatan mikrobia!
b. Jelaskan fungsi tiap tahap pengecatan sederhana!
c. Sebutkan bagian-bagian sel kapang dan fungsinya!

23
 ACARA 3

PENGARUH BAHAN KIMIA, LOGAM DAN SINAR UV TERHADAP PERTUMBUHAN

MIKROBIA (UJI SENSITIVITAS)

A. Sub Acara 1 : Pengaruh Desinfektan terhadap Pertumbuhan Mikrobia (Uji

Sensitivitas Mikrobia terhadap Desinfektan)
1. Tujuan
Mengetahui pengaruh desinfektan terhadap pertumbuhan mikrobia

2. Pendahuluan
Pengendalian mikroorganisme sangat penting dilakukan terutama dalam bidang
medis dan industri pangan. Terdapat beberapa cara dalam kontrol mikroorganisme, yakni
secara kimia maupun fisika. Bahan kimia, baik alami maupun sintetik yang dapat
membunuh atau menghambat pertumbuhan mikrobia disebut agen antimikrobia. Agen
yang mampu membunuh bakteri/fungi disebut bakterisidal/fungisidal, sedangkan agen
yang hanya dapat menghambat pertumbuhan disebut bakteristatik/fungistatik.
Salah satu cara untuk menentukan daya agen antimikrobia adalah dengan metode
difusi disk (disc diffusion) menggunakan agar plate atau dikenal dengan metode Kirby
Bauer. Dalam metode ini digunakan disk atau kertas saring (Whatmann) yang direndam
dalam larutan agen antimikrobia lalu diletakkan di atas agar plate yang telah ditanami
mikroba. Keberadaan zona jernih yang terbentuk di sekitar disk menunjukkan kemampuan
larutan tersebut dalam menghambat mikrobia.

Gambar 10. Metode difusi disk

24
 Terdapat beberapa istilah bahan kimia yang mampu menjadi agen antimikrobia.
Sterilan merupakan bahan kimia yang mampu membunuh semua mikroorganisme,
termasuk endospora. Sterilan kimia digunakan untuk dekontaminasi atau sterilisasi
dimana tidak memungkinkan dilakukan sterilisasi dengan panas atau radiasi (sterilisasi
fisika). Desinfektan merupakan bahan kimia yang mampu membunuh mikroorganisme,
namun tidak mampu membunuh endospora dan digunakan pada benda (tidak hidup).
Contohnya untuk desinfeksi lantai, meja, dan sebagainya. Antiseptik adalah bahan kimia
yang dapat membunuh atau menghambat pertumbuhan mikroorganisme, namun tidak
toksik bagi hewan dan manusia karena penggunaannya dikhususkan bagi permukaan
jaringan hidup. Beberapa antiseptik tertentu juga dapat digunakan sebagai desinfektan,
contohnya adalah etanol.

3. Alat dan Bahan

Alat : Bahan :
a. Erlenmeyer a. Nutrient Broth (NB)
b. Petridish b. Nutrient Agar (NA)
c. Tabung Reaksi c. Biakan bakteri Escherichia coli
d. Cottonbud d. Biakan bakteri Bacillus subtilis
e. Bunsen e. Alkohol 75%
f. Pinset f. Iodine
g. Inkubator g. Formalin
h. Kertas saring Whatmann

4. Cara Kerja
a. Hari pertama : Tuang NA yang masih cair ke dalam petridish steril. Tunggu hingga
memadat.
b. Pindahkan biakan E. coli dan B. subtilis dari media NA miring ke 5 ml NaCl 0,9%
dalam tabung reaksi secara aseptis, sedikit demi sedikit hingga kekeruhan sama
dengan standar Mc. Farland 0,5.

25
 c. Celupkan salah satu ujung cottonbud ke dalam biakan NaCl secara aseptis dan
goreskan ke permukaan media NA dalam petridish secara berulang hingga merata.
d. Inkubasi pada suhu 37oC selama 15 menit.
e. Celupkan kertas saring berbentuk lingkaran (diameter 6 mm) ke dalam cairan
desinfektan (alkohol/iodine/formalin) selama ± 30 detik agar cairan meresap, tiriskan.
f. Letakkan kertas saring tersebut di atas permukaan biakan NA plate. Inkubasi pada
suhu 37oC selama 24 jam.
g. Hari kedua: Amati adanya zona jernih (zona radikal di sekeliling kertas saring)
h. Ukur diameter zona jernih yang terbentuk menggunakan jangka sorong/penggaris.
Diameter total dikurangi dengan diameter kertas saring (6 mm). Lakukan pengukuran
sebanyak 3 kali, lalu hitung rata-ratanya.
i. Dokumentasikan hasil yang didapatkan.

5. Hasil
Tabel 6. Hasil pengamatan zona jernih pada uji desinfektan
Jenis Diameter zona jernih (tanpa kertas Rerata zona radikal
desinfektan saring)
Alkohol 75% 1. Ulangan 1: 1. Ulangan 1:
2. Ulangan 2: 2. Ulangan 2:
3. Ulangan 3: 3. Ulangan 3:

Iodine 1. Ulangan 1: 1. Ulangan 1:

2. Ulangan 2: 2. Ulangan 2:
3. Ulangan 3: 3. Ulangan 3:

Formalin 1. Ulangan 1: 1. Ulangan 1:

2. Ulangan 2: 2. Ulangan 2:
3. Ulangan 3: 3. Ulangan 3:

6. Pembahasan
1. Jelaskan mengapa terbentuk zona jernih di sekeliling kertas saring.
2. Jelaskan mekanisme desinfektan tersebut dalam menghambat pertumbuhan mikrobia
3. Apabila tidak terbentuk zona jernih, jelaskan kemungkinan penyebabnya!

26
B. Sub Acara 2: Pengaruh Logam terhadap Pertumbuhan Mikrobia (Uji
Sensitivitas Mikrobia terhadap Logam)
1. Tujuan
Mengetahui pengaruh logam terhadap pertumbuhan mikrobia

2. Pendahuluan
Ion logam berat seperti merkuri, perak, arsenic, zinc, dan tembaga telah lama
digunakan sebagai agen antimikrobia. Kemampuan logam dalam menghambat aktivitas
mikroba disebabkan karena kemampuan oligodinamik. Apabila sebuah koin yang
mengandung logam diatas diletakkan pada biakan bakteri pada petridish, sejumlah kecil
logam tersebut akan berdifusi dari koin dan menghambat pertumbuhan bakteri tersebut. Ion
logam berat tersebut akan mendenaturasi/merusak protein seluler pada bakteri.
Larutan perak nitrat telah digunakan sebagai antiseptik bagi bayi yang baru lahir untuk
mencegah infeksi mata yang kemungkinan didapatkan dari proses kelahiran. Saat ini,
penggunaan perak nitrat telah digantikan oleh antibiotik. Kini dikembangkan pula pakaian
yang dilapisi ion perak dalam penggunaan di rumah sakit untuk mencegah infeksi bakteri.
Beberapa wadah plastik penyimpan makanan juga telah dimodifikasi dengan lapisan
nanopartikel perak untuk menjaga makanan tetap segar.

3. Alat dan Bahan

Alat : Bahan :
a. Erlenmeyer a. Nutrient Broth (NB)
b. Petridish b. Nutrient Agar (NA)
c. Tabung Reaksi c. Biakan bakteri Escherichia coli
d. Cottonbud d. Biakan bakteri Bacillus subtilis
e. Bunsen e. Alkohol 75%
f. Pinset
g. Inkubator
h. Koin logam

27
4. Cara Kerja
1. Hari pertama : Tuang NA yang masih cair ke dalam petridish steril. Tunggu hingga
memadat.
2. Pindahkan biakan E. coli dan B. subtilis dari media NA miring ke 5 ml NaCl 0,9%
dalam tabung reaksi secara aseptis, sedikit demi sedikit hingga kekeruhan sama dengan
standar Mc. Farland 0,5.
3. Celupkan salah satu ujung cottonbud ke dalam biakan NaCl secara aseptis dan goreskan
ke permukaan media NA dalam petridish secara berulang hingga merata. Inkubasi pada
suhu 37oC selama 15 menit.
4. Masukkan koin logam ke dalam alkohol 75% selama 1 menit, ambil dengan pinset dan
keringkan dengan dilewatkan di atas api.
5. Masukkan koin logam tersebut ke dalam akuades steril selama 1 menit, ambil dengan
pinset dan kering anginkan serta sesekali dilewatkan di atas api. Tunggu sejenak hingga
dingin.
6. Letakkan koin logam tersebut di atas permukaan biakan NA plate. Inkubasi pada suhu
37oC selama 24 jam.
7. Hari kedua : Amati adanya zona jernih (zona radikal di sekeliling koin logam)
8. Ukur diameter zona jernih yang terbentuk menggunakan jangka sorong/penggaris.
Diameter total dikurangi dengan diameter kertas saring logam. Lakukan pengukuran
sebanyak 3 kali, lalu hitung rata-ratanya.
a. Dokumentasikan hasil yang didapatkan.

9. Hasil
Tabel 7. Hasil pengamatan zona jernih pada uji oligodinamik logam
Jenis logam Diameter zona jernih (tanpa Rerata zona radikal (mm)
diameter logam) (mm)
1. Ulangan 1: 1. Ulangan 1:
2. Ulangan 2: 2. Ulangan 2:
3. Ulangan 3: 3. Ulangan 3:

1. Ulangan 1: 1. Ulangan 1:
2. Ulangan 2: 2. Ulangan 2:
3. Ulangan 3: 3. Ulangan 3:

28
C. Sub Acara 3: Pengaruh Sinar UV terhadap Pertumbuhan Mikrobia (Uji
Sensitivitas Mikrobia terhadap Sinar UV)
1. Tujuan
Mengetahui pengaruh sinar UV terhadap pertumbuhan mikrobia

2. Pendahuluan
Salah satu pengendalian mikroorganisme secara fisika adalah irradiasi, baik radiasi
ionik maupun non-ionik. Sinar ultraviolet (UV) merupakan radiasi non-ionik yang umum
digunakan di area preparasi industri makanan, ruang operasi serta laboratorium kultur
jaringan yang berfungsi untuk mencegah kontaminasi. Sinar UV memiliki panjang
gelombang antara 1 nm hingga 380 nm, dimana dimulainya cahaya/spektrum tampak dan
memiliki daya tembus yang sangat lemah, hanya mampu menembus lapisan gelas yang
tipis. Sinar UV dapat mendenaturasi (merusak) susunan DNA maupun protein, sehingga
berbahaya bagi manusia bila terkena paparan langsung (terutama bagi kulit dan mata).
Radiasi ionik seperti sinar gamma dan sinar X (X-ray) memiliki panjang gelombang
lebih pendek (kurang dari 1 nm) dan energi yang lebih besar, sehingga memiliki daya
tembus yang lebih besar. Radiasi sinar gamma juga digunakan sebagai sterilan dalam
preservasi industri makanan sekaligus mampu menghambat proses
pematangan/pembusukan. Namun, penggunaan radiasi sinar gamma dalam produksi
makanan banyak mendapat pertentangan dalam hal keamanan konsumen karena diduga
meninggalkan jejak radioaktif pada produk.

3. Alat dan Bahan

Alat: Bahan :
1. Erlenmeyer 1. Nutrient Broth (NB)
2. Petridish 2. Nutrient Agar (NA)
3. Tabung reaksi 3. Biakan bakteri Escherichia coli
4. Cottonbud 4. Biakan bakteri Bacillus subtilis
5. Bunsen dan Pinset 5. Alkohol 75%
6. Inkubator

29
4. Cara Kerja
1. Hari pertama : Tuang NA yang masih cair ke dalam petridish steril. Tunggu hingga
memadat.
2. Pindahkan biakan E. coli dan B. subtilis dari media NA miring ke 5 ml NaCl 0,9%
dalam tabung reaksi secara aseptis, sedikit demi sedikit hingga kekeruhan sama
dengan standar Mc. Farland 0,5.
3. Celupkan salah satu ujung cottonbud ke dalam biakan NaCl secara aseptis dan
goreskan ke permukaan media NA dalam petridish secara berulang hingga merata.
Inkubasi pada suhu 37oC selama 15 menit.
4. Sterilkan area di dalam LAF dengan menyalakan UV selama 15 menit.
5. Ambil NA plate tersebut dari inkubator, masukkan ke dalam Laminar Air Flow (LAF)
dalam posisi tutup petri terbuka dan nyalakan kembali UV selama 15 menit.
6. Masukkan NA plate kembali ke dalam inkubator, inkubasi selama 24 jam suhu 37oC.
7. Hari kedua : Amati pertumbuhan mikrobia, bandingkan dengan control (tanpa
dipaparkan sinar UV).
8. Dokumentasikan hasil yang didapatkan.

9. Hasil
Tabel 8. Hasil pengamatan uji pengaruh sinar UV
Jenis Bakteri Hasil Pertumbuhan (tumbuh/tidak tumbuh)
Kontrol (tanpa UV) Perlakuan UV
Bacillus subtilis
Escherichia coli

10. Pembahasan
1. Jelaskan mekanisme sinar UV dalam menghambat pertumbuhan mikrobia
2. Apabila tidak terdapat perbedaan dengan kontrol, jelaskan kemungkinan
penyebabnya!

30
 ACARA 4

KINETIKA PERTUMBUHAN MIKROBIA

A. TUJUAN PRAKTIKUM
1. Memahami fase-fase pertumbuhan mikrobia
2. Memahami faktor-faktor yang berpengaruh terhadap pertumbuhan mikrobia
3. Mampu menghitung jumlah mikrobia secara langsung maupun tidak langsung.

B. DASAR TEORI
Dalam mikrobiologi, pertumbuhan merupakan pertambahan jumlah sel. Mikrobia,
terutama bakteri berkembang dengan cara membelah diri (pembelahan biner/binary fission).
Sel tunggal membelah menjadi 2 sel, masing-masing sel membelah lagi sehingga total
menghasilkan 4 sel, dari 4 sel menjadi 8 sel, begitu seterusnya.

Masing-masing mikroba memiliki waktu generasi (g) yang berbeda. Waktu generasi
adalah waktu yang diperlukan untuk satu kali pembelahan biner. Sebagai contoh, dalam
kondisi optimal bakteri Escherichia coli memiliki waktu generasi 20 menit. Ini artinya setiap
20 menit, bakteri ini membelah diri. Waktu generasi bervariasi tergantung nutrisi yang
tersedia, genetik spesies, umur biakan, maupun faktor lingkungan yang meliputi suhu, pH,
kelembaban, dan sebagainya.

Pengukuran pertumbuhan bakteri dapat dilakukan menggunakan cara langsung maupun

tidak langsung. Pengukuran secara langsung antara lain dengan menghitung jumlah sel bakteri
dengan kamar hitung (Petroff Hausser Chamber) dan pengukuran berat kering. Pengukuran
secara tidak langsung antara lain dengan metode turbiditas (kekeruhan) dan metode serial
dilusi. Pada pengukuran turbiditas, kamar hitung, dan berat kering, baik sel hidup maupun
yang sudah mati ikut terhitung (total count). Sedangkan pada serial dilusi, hanya bakteri hidup
yang dihitung (viable count).

31
Fase pertumbuhan mikrobia terdiri dari:
1. Fase lag, yaitu fase adaptasi atau penyesuaian terhadap medium pertumbuhan. Dalam
fase ini tidak terjadi pertambahan jumlah sel.
2. Fase log/eksponensial, pada fase ini sel membelah dengan kecepatan konstan dan
terjadi pertambahan jumlah sel 2 kali lipat tiap generasi. Laju pertumbuhan lebih cepat
dari laju kematian sel.
3. Fase stasioner, selama fase ini laju pertumbuhan sama dengan laju kematian,
mengakibatkan jumlah sel tetap/konstan.
4. Fase kematian, nutrisi dalam medium mulai menipis, laju kematian lebih cepat dari
laju pertumbuhan, jumlah sel hidup menurun.

Gambar 11. Kurva pertumbuhan mikrobia (Prescott, 2002)

Pada pengukuran turbiditas, semakin banyak jumlah sel bakteri dalam media akan
semakin keruh, mengakibatkan optical density (OD) semakin tinggi. Umumnya digunakan
panjang gelombang antara 480 nm - 660 nm.
Adapun laju peningkatan jumlah sel pada fase eksponensial dapat diketahui dengan
rumus:
Nt = No x 2n
Dimana:
No = Jumlah sel pada waktu awal (t = 0)
Nt = Jumlah sel pada waktu t (biasanya dalam jam)

32
 n = Jumlah generasi selama fase eksponensial.
Waktu generasi (g) merupakan waktu untuk 1 kali pembelahan biner, dinyatakan dalam
persamaan g = t/n, adapun t adalah waktu pertumbuhan selama fase eksponensial.

Persamaan di atas juga dapat dinyatakan dengan persamaan logaritma:

Nt = No x 2n
Log Nt = log No + n log 2
Log Nt – log No = n log 2
n = log Nt – log No
2
= log Nt – log No
2
= 3,3 x (log Nt – log No)

Gambar 12. Prosedur serial dilusi (viable count) (Brock, 2015)

33
 Dalam praktikum kinetika pertumbuhan mikrobia kali ini, akan dilakukan 2 metode, yakni
metode turbiditas (total count) dan serial dilusi (viable counts).

C. Alat dan Bahan

Alat : Bahan :
1. Erlenmeyer 250 ml 1. Media Nutrient Broth (NB)
2. Tabung reaksi 2. Media Nutrient Agar (NA)
3. Petridish 3. Biakan E. coli/B.subtilis
4. Pipet ukur 4. Akuades steril
5. Inkubator 5. Alkohol 75%
6. Spektrofotometer
7. Kuvet
8. Ohse
9. Bunsen

34
D. Cara Kerja
1. Hari ke-1: Pindahkan 1 ose biakan E. coli/B. subtilis dari NA miring ke dalam tabung
reaksi berisi 5 ml NB secara aseptik. Inkubasi dalam suhu 37oC selama 24 jam.
2. Hari ke-2: Tuang biakan NB tersebut ke dalam 250 ml NB steril dalam Erlenmeyer secara
aseptik, homogenkan.
3. Ambil biakan dari Erlenmeyer sebanyak 1 ml menggunakan pipet ukur steril, letakkan
dalam kuvet (sampel jam ke-0)
4. Ukur optical density/absorbansi menggunakan spektrofotometer dengan panjang
gelombang (λ) 600 nm. Catat hasil yang didapatkan!
Catatan: Larutan blangko yang digunakan adalah media NB murni tanpa biakan.
5. Ambil 1 ml biakan dari Erlenmeyer menggunakan pipet ukur steril, letakkan dalam
petridish.
6. Tuang petridish yang telah berisi biakan tersebut dengan NA yang masih cair (dengan suhu
yang tidak terlalu panas), kemudian padatkan (metode pour plate).
7. Inkubasi NA plate tersebut pada suhu 37oC selama 24 jam.
8. Simpan biakan dalam Erlenmeyer di inkubator shaker suhu 37oC.
9. Hari ke-3, 4, dan 5: Ulang pengukuran spektrofotometer dan inokulasi pada media NA
plate untuk jam ke-24, 48, dan 72.
Catatan: untuk jam ke 24, 48, dan 72, perhitungan koloni bakteri menggunakan sampel
yang telah diencerkan hingga pengenceran 10-3 menggunakan akuades steril. Caranya:
a. Satu ml biakan dalam Erlenmeyer dipindahkan ke 9 ml akuades steril dalam tabung
reaksi 1 (pengenceran 10-1), homogenkan.
b. Satu ml sampel dari tabung 1 dipindahkan ke 9 ml akuades steril dalam tabung 2
(pengenceran 10-2), homogenkan.
c. Satu ml sampel dari tabung 2 dipindahkan ke 9 ml akuades steril dalam tabung 3
(pengenceran 10-3), homogenkan.
d. Ambil 1 ml sampel dari tabung 3, masukkan di petridish steril. Tuangi dengan NA
yang masih cair. Padatkan dan inkubasi pada suhu 37oC selama 24 jam.
10. Amati dan hitung koloni yang terbentuk pada NA plate!
11. Kalibrasikan sehingga diperoleh nilai jumlah sel bakteri/ml atau colony forming units (cfu)
 12. Catat dan buat kurva pertumbuhan bakteri berdasarkan optical density yang didapatkan,
dengan sumbu X berupa waktu inkubasi, dan sumbu Y berupa nilai optical density!
13. Hitung waktu generasi bakteri berdasarkan jumlah koloni (viable count) yang didapatkan!
Jumlah koloni yang dipakai adalah hasil hitung koloni pada hari kedua (perkiraan fase
eksponensial)
14. Jangan lupa dokumentasi!

E. HASIL
1. Hasil optical density dan jumlah koloni
Tabel 9. Hasil pengamatan optical density dan jumlah koloni mikrobia
Jenis Hasil optical density dan jumlah koloni* (cfu) (pada jam ke-)
Bakteri
0 24 48 72

OD koloni OD koloni OD koloni OD koloni

E. coli

B. subtilis

* Lengkapi dengan perhitungan koloni

2. Hasil kurva pertumbuhan bakteri

3. Hasil waktu generasi bakteri (lengkapi dengan perhitungannya!)

36
 DAFTAR PUSTAKA

Hogg, Stuart. 2005. Essential Microbiology. John Wiley & Sons, Ltd. England.
Madigan, M.T., John M.M., Kelly S.B., Daniel H.B., and David A.S. 2015. Brock Biology of
Microorganisms, 14th. Ed. Pearson Education, Inc.
Prescott, L.M., Harley, and Klein. 2002. Microbiology, 5th Edition. The McGraw-Hill Companies.
Soetarto, A. Endang Sutariningsih. 2014. Buku Praktikum Mikrobiologi Industri. Universitas
Gadjah Mada.
Tortora, Gerard J., Berdell R. Funke, Christine L. Case. 2010. Microbiology: an Introduction. 10th
Edition. USA.

37