PRAKTIKUM LABORATORIUM REKAYASA HAYATI-I

Kultur Pucuk In Vitro Skala Bioreaktor

Oleh:
Kelompok 01
Ketua Kelompok :
Nynsca Shalsabila S I P 11216012
Anggota Kelompok :
Albert Setiawan 11215005
Minarti Eka Putriani 11216001
Peter Xandya Rudyan 11216002
Sagita Sukma Kristiani 11216011

Dosen : Dr. Erly Mawarni

Khairul Hadi.B, S.T., M.T.
Asisten : M. Farid Mahfuzh Abrar
Tanggal Percobaan : 25 September 2018 – 21 November 2018
Tanggal Pengumpulan: 26 November 2018

LABORATORIUM REKAYASA HAYATI

PROGRAM STUDI REKAYASA HAYATI
SEKOLAH ILMU DAN TEKNOLOGI HAYATI
INSTITUT TEKNOLOGI BANDUNG
2018
 LEMBAR PENILAIAN DAN PENGESAHAN

Komponen Nilai Maksimal Nilai

Judul dan 10
Pendahuluan
Metodologi 20
Hasil dan 50
Pembahasan
Simpulan dan 10
Saran
Format 10
Total 100

Laporan Praktikum Modul Kultur Pucuk In Vitro Skala Bioreaktor

sebagai syarat untuk memenuhi rangkaian Praktikum Laboratorium
Rekayasa Hayati-I dalam menempuh studi tingkat sarjana di Program Studi
Rekayasa Hayati Institut Teknologi Bandung

Jatinangor, 26 November 2018

Diperiksa oleh,
Asisten Praktikum

M. Farid Mahfuzh Abrar

NIM. 11215041
Mengetahui dan menyetujui,
Dosen Pengampu Dosen Pengampu

Dr. Erly Mawarni Khairul Hadi.B, S.T., M.T.

NIP.196210051988022001 Nopeg. 11811064
 DAFTAR ISI

DAFTAR ISI .................................................................................................................. i

DAFTAR GAMBAR .................................................................................................. iii

DAFTAR TABEL ....................................................................................................... iv

DAFTAR LAMPIRAN ............................................................................................... v

RINGKASAN .............................................................................................................. vi

BAB I PENDAHULUAN .......................................................................................... 1

1.1 Latar Belakang .............................................................................. 1

1.2 Tujuan ........................................................................................... 2
BAB II TINJAUAN PUSTAKA ................................................................................ 3

2.1. Tembakau (Nicotiana tabacum).................................................... 3

2.2. Kultur Pucuk In Vitro .................................................................... 5
2.3. Bioreaktor...................................................................................... 7
2.4. Faktor yang Mempengaruhi Kultur Skala Bioreaktor................. 11
2.4.1. Aerasi .............................................................................. 11

2.4.2. Konsentrasi Glukosa pada Medium ................................ 11

2.4.3. Zat Pengatur Tumbuh ...................................................... 11

2.4.4. Penentuan Desain Proses ................................................. 12

2.4.5. Mixing ............................................................................. 12

2.4.6. Metode Kultivasi ............................................................. 13

2.4.7. Jenis Bioreaktor ............................................................... 13

2.5. Medium Murashige-Skoog ......................................................... 13

BAB III METODOLOGI .......................................................................................... 15

3.1 Alat dan Bahan ............................................................................ 15

3.2 Langkah Kerja ............................................................................. 16
3.2.1 Multiplikasi Pucuk Tembakau ........................................ 16

i
 3.2.2 Pembuatan Medium Kultur pada Bioreaktor .................. 16

3.2.3 Sterilisasi Alat dan Medium ............................................ 17

3.2.4 Pemindahan Pucuk ke Bioreaktor ................................... 17

3.2.5 Kultur In Vitro dalam Bioreaktor .................................... 17

3.2.6 Pengukuran Biomassa Pucuk .......................................... 18

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN ............................................................... 19

4.1 Pengaruh Laju Alir terhadap Pertumbuhan Kultur Pucuk

Nicotiana tabaccum .................................................................... 19
4.2 Kontaminasi pada Kultur Pucuk Nicotiana tabaccum Skala
Bioreaktor.................................................................................... 23
BAB V PENUTUP ..................................................................................................... 26

5.1 Kesimpulan ................................................................................. 26

5.2 Saran ............................................................................................ 26
DAFTAR PUSTAKA ................................................................................................ 27

LAMPIRAN ................................................................................................................ 31

ii
 DAFTAR GAMBAR

Gambar 2.1 Konfigurasi bioreaktor pada kultur sel a) Stirred tank bioreactor, b)
Bubble column reactor, c) Air-lift reactor ......................................... 8
Gambar 2.2 Jenis flow regime pada bubble column bioreactor ............................ 10
Gambar 3.1 Rangkaian alat ................................................................................... 16
Gambar 4.1 Biomassa basah kultur Nicotiana tabacum ....................................... 19
Gambar 4.2 Nekrosis dan browning pada kultur pucuk ........................................ 25

iii
 DAFTAR TABEL

Tabel 3.1 Alat dan Bahan ...................................................................................... 15

iv
 DAFTAR LAMPIRAN

Lampiran A Cara Pengolahan Data ...................................................................... 32

Lampiran B Data Mentah ...................................................................................... 35
Lampiran C Dokumentasi ..................................................................................... 36

v
 RINGKASAN

Nicotiana tabacum atau tembakau merupakan tumbuhan berdaun yang sering

dibudidayakan secara komersil dan dapat tumbuh optimal pada suhu 23,5
derajat Celcius, intensitas cahaya pada 59400 Lux dan pH 5,5-6,2. Kultur
jaringan tumbuhan merupakan salah satu cara untuk perbanyakan biomassa
tanaman. Pada percobaan ini, perbanyakan tanaman secara in vitro dilakukan
dengan tahapan seleksi tanaman induk, persiapan medium kultur aseptik dan
perbanyakan pucuk yang digunakan untuk pertumbuhan skala bioreaktor.
Bioreaktor yang digunakan pada percobaan ini adalah bubble column
bioreactor yang memiliki sparger yang memiliki peran sebagai pengaduk
medium kultur. Terdapat beberapa faktor yang memengaruhi kultur skala
bioreaktor yaitu aerasi dengan konsentrasi O2 terlarut yang optimum,
konsentrasi glukosa yang cukup sebagai sumber nutrisi, metode kultivasi, jenis
bioreaktor, dan zat pengatur tumbuh yang cukup untuk menginduksi pucuk,
penentuan desain proses yang baik, dan pengadukan yang baik untuk
mendistribusikan sel, nutrien dan produk. Medium yang digunakan pada kultur
skala bioreaktor ini adalah medium Murashige-Skoog yang memiliki
kandungan nitrat, kalium, dan amonium yang tinggi serta hara anorganik
dengan jumlah yang layak untuk memenuhi kebutuhan banyak sel tanaman
dalam kultur.
Kultur skala bioreaktor dilakukan pada menggunakan delapan bioreaktor yang
dengan laju alir kurang dari 1 L/menit dan lebih dari 1 L/menit yang diambil
sampel pada minggu pertama dan minggu kedua. Pertumbuhan kultur pucuk in
vitro pada bioreaktor lebih baik pada laju alir udara kurang dari 1 L/menit
dengan perolehan biomassa akhir sebesar 5,93 gram. Kontaminasi yang terjadi
pada beberapa kultur dapat disebabkan oleh pertumbuhan bakteri dan jamur
yang dapat dicegah dengan penambahan antibiotik.

vi
 BAB I
PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Tanaman Tembakau (Nicotiana tabacum) adalah tanaman yang
banyak dibutuhkan dalam industri obat-obatan, karena tembakau dapat
menghasilkan senyawa alkaloid dan terpenoid yang bermanfaat untuk
kesehatan (Nugroho & Verpoorte, 2002). Permintaan tembakau dalam industri
kesehatan sangat besar, namun kultivasi tembakau secara alami tidak
menghasilkan produktivitas yang maksimal. Hal ini disebabkan oleh ketahanan
dan germinasi biji tembakau yang kurang baik, sehingga diperlukan pemilihan
bibit tembakau yang baik menggunakan kultur pucuk in-vitro (Dave et al.,
2003).
Setelah tahapan perbanyakan pucuk secara in vitro, diperlukan tahapan
scale-up untuk meningkatkan produktivitas kultur tersebut. Salah satu metode
scale-up adalah dengan menggunakan bioreaktor. Bioreaktor sederhana yang
umumnya digunakan untuk kultivasi kultur organ tanaman adalah air-lift
bioreaktor. Keuntungan menggunakan air-lift bioreaktor adalah minimnya
shear stress dari bioreaktor dan produktivitas biomassa yang dihasilkan tinggi
(Ziv, 2005).
Proses metabolisme yang terjadi di dalam bioreaktor bergantung pada
suplai oksigen. Suplai oksigen pada bioreaktor dipengaruhi oleh laju alir udara
yang masuk ke dalam bioreaktor. Laju aliran udara perlu ditentukan agar
transfer massa oksigen pada bioreaktor tinggi, selain itu laju aliran udara
berpengaruh terhadap pencampuran medium dalam bioreaktor (Lopes et al,
2013).
Kultur pucuk in vitro skala bioreaktor dapat digunakan untuk
meningkatkan biomassa dan metabolit sekunder pada tanaman. Aplikasi kultur
in vitro dalam bioreaktor dalam keilmuan rekayasa hayati adalah produksi
cichoric acid dari tanaman Echinacea purpurea dengan menggunakan air-lift

1
 bioreaktor. Selain itu, air-lift bioreaktor juga dapat digunakan untuk
meningkatkan biomassa kultur hairy roots Panax ginseng (Stiles & Liu, 2013).

1.2 Tujuan
Percobaan kultur pucuk in vitro Nicotiana tabaccum ini dilakukan
dengan tujuan :
1. Pengaruh laju aliran udara terhadap pertumbuhan kultur pucuk
Nicotiana tabaccum.

2
 BAB II
TINJAUAN PUSTAKA

2.1. Tembakau (Nicotiana tabacum)

Nicotiana tabacum adalah tembakau budidaya dengan taksonomi
sebagai berikut (Dasuki, 1991):
Kingdom : Plantae
Divisi : Magnoliophyta
Subdivisi : Magnoliopsida
Kelas : Asteridae
Ordo : Solanales
Famili : Solanaceae
Genus : Nicotiana
Spesies : Nicotiana tabacum
Pertama kali diperkenalkan oleh penduduk asli benua Amerika kepada
Christopher Columbus. N. tabacum merupakan tumbuhan berdaun yang sering
dibudidayakan secara komersil untuk diproses menjadi tembakau rokok dan
menjadi tumbuhan yang paling sering ditumbuhkan dari genus Nicotiana. N.
tabacum awalnya berasal dari bagian tropis dan subtropis benua Amerika
(sekitar Amerika Selatan dan Tengah) yang merupakan hasil hibridisasi N.
tomentosiformis dan N. sylvestris (Nan & Timko, 2001).
N. tabacum dapat tumbuh sekitar satu sampai dua meter dengan daun
yang dapat tumbuh sampai 50 cm pada bagian bawahnya serta makin mengecil
ukurannya semakin ke atas, dan bunga dengan panjang lima sampai enam
sentimeter serta diameter lima milimeter. Selain itu, seluruh bagian tumbuhan
tembakau mengandung nikotin, kecuali bijinya, dan konsentrasi nikotin ini
akan bertambah semakin berumurnya tembakau. Konsentrasi nikotin
dipengaruhi oleh faktor seperti suhu, tekanan udara, kelembaban lingkungan,
dan jenis tanah, sama seperti faktor yang memengaruhi pertumbuhan tembakau
(Datiles & Rodriguez, 2014).

3
 Suhu berkaitan erat dengan pertumbuhan dan perkembangan dari
tumbuhan (Sunoj et al., 2016). Hal ini terbukti juga terjadi pada tembakau
karena menurut Yang et al. (2018), tumbuhan tembakau tumbuh dengan
optimal pada rentang suhu 18,5 sampai 28,5 derajat celcius dan puncak
keoptimalan pertumbuhan tembakau berada pada 23,5 derajat
celcius,sedangkan kondisi di luar rentang suhu tersebut akan menghambat
pertumbuhan daun tembakau. Secara umum, pada suhu di atas 28,5 derajat
celcius, tembakau akan lebih cepat berbunga tetapi lebih cepat mengalami
penuaan (senescence), sedangkan saat di bawah 18.5 derajat celcius, hal
sebaliknya akan terjadi.
Selain suhu, kondisi cahaya juga memengaruhi pertumbuhan dan
perkembangan tumbuhan, karena cahaya yang lebih banyak akan meningkatkan
laju fotosintesis dan pembentukan gula oleh tumbuhan yang sangat penting
dalam pertumbuhan akar dan tunas (Thaler & Pages, 1996). Berdasarkan
penelitian yang dilakukan Nagel et al. (2006), tembakau juga sangat
dipengaruhi oleh intensitas cahaya lingkungannya. Menurut Nagel et al.,
semakin tinggi intensitas cahaya yang diterima tembakau, pertumbuhannya
akan semakin tinggi, dapat dilihat dari akar tembakau yang tumbuh 20% lebih
besar pada kondisi 16200 lux dibandingkan pada kondisi 3240 lux. Tetapi,
menurut Miyake et al. (2009), tembakau yang berada pada kondisi intensitas
cahaya di atas 59400 lux tidak menunjukkan hasil pertumbuhan yang berbeda
dengan intensitas cahaya sekitar 59400 lux, yang berarti pengaruh intensitas
cahaya terhadap pertumbuhan tembakau memuncak pada 59400 lux.
Kemudian, pH termasuk salah satu faktor utama yang memengaruhi
pertumbuhan tembakau. pH tidak hanya memengaruhi laju pertumbuhan
tembakau, tetapi juga kualitas dan banyaknya daun tembakau yang tumbuh
(Ryding et al, 1987). pH optimal untuk mendapat tembakau dengan kualitas
lebih tinggi berbeda-beda bergantung pada iklim daerah tempat tembakau
tersebut tumbuh, sebagai contoh: di Amerika Serikat, pH optimal bagi
pertumbuhan tembakau adalah 6,0 - 6,4, sedangkan di India berada pada

4
 rentang pH 7,5 - 8,5 (Guan et al., 2007). Menurut Hermiyanto et al. (2016),
tembakau memiliki rentang pH 5,5 - 6,2 untuk pertumbuhan yang optimal.

2.2. Kultur Pucuk In Vitro

Kultur jaringan tumbuhan merupakan salah satu cara untuk
perbanyakan biomassa tanaman untuk penyediaan bibit maupun untuk produksi
metabolit sekunder. Tipe kultur yang dapat dilakukan untuk perbanyakan
jaringan tumbuhan, yaitu kultur pucuk dan kultur embrio. Sedangkan, untuk
produksi metabolit sekunder yaitu kultur kalus, kultur akar dan kultur sel secara
in vitro.
Perbanyakan tanaman secara in vitro (kultur jaringan tanaman) adalah
sebuah kegiatan menjaga dan menumbuhkan jaringan (kalus, sel, protoplas) dan
organ tanaman (daun, tunas pucuk/lateral, batang, akar dan embrio) pada
kondisi aseptik (Hartmann et al., 1997; George et al., 2007). Teknik ini
digunakan untuk berbagai tujuan seperti: memperbanyak tanaman,
memodifikasi genotype tanaman, memproduksi biomasa dan metabolit
sekunder, mempelajari patologi tanaman, konservasi plasma nutfah dan
penelitian-penelitian ilmiah lainnya. Teknik ini juga telah diaplikasikan pada
berbagai jenis tanaman, baik tanaman semusim maupun menahun, tanaman
herbaceous maupun berkayu. Aplikasi perbanyakan tanaman secara in vitro ini
memiliki kelebihan dan kelemahan (Suryowinoto, 1996; Hartmann et al., 1997;
George et al., 2007).

Kelebihan perbanyakan tanaman secara in vitro, diantaranya:

● Menggunakan potongan-potongan kecil dari bagian tanaman (daun,
tunas, batang, akar, kalus, sel) untuk menghasilkan tanaman baru yang
utuh.
● Membutuhkan ruang yang kecil, energi dan tenaga yang lebih efisien
untuk menjaga, menumbuhkan dan meningkatkan jumlah tanaman
● Karena perbanyakan tanaman dilakukan dalam kondisi aseptik, bebas dari
pathogen, maka saat kultur tanaman berhasil dilakukan tidak akan terjadi

5
 kehilangan tanaman karena serangan penyakit dan tanaman yang
dihasilkan dari kultur jaringan (pada kondisi tertentu) juga bebas dari
bakteri, jamur dan mikroorganisme pengganggu yang lain.
● Dengan metode khusus (kultur meristem), teknik ini dapat digunakan
untuk menghasilkan tanaman yang bebas dari virus.
● Faktor-faktor yang berpengaruh terhadap pertumbuhan vegetatif tanaman,
seperti: nutrisi (media), konsentrasi zat pengatur pertumbuhan (ZPT),
kadar gula, cahaya, temperatur, kelembaban, dll. lebih mudah diatur.
● Dapat diaplikasikan pada berbagai jenis tanaman yang memiliki
pertumbuhan yang lambat dan sulit diperbanyak secara vegetatif.
● Produksi tanaman menggunakan teknik ini dapat dilakukan sepanjang
tahun tanpa tergantung oleh perubahan musim.
● Dapat menyimpan tanaman hasil perbanyakan dalam waktu yang lama

Kelemahan perbanyakan tanaman secara in vitro:

● Membutuhkan keterampilan yang memadai, peralatan, bahan dan biaya
yang mahal, serta sarana pendukung yang mencukupi,
● Membutuhkan metode yang khusus dan optimum untuk menunjang
keberhasilan aplikasinya pada tiap spesies dan tanaman,
● Meski dapat menghasilkan tanaman dalam jumlah yang banyak dari
bagian kecil tanaman, pada kondisi tertentu dapat menghasilkan adanya
penyimpangan karakter-karakter tanaman (undesirable characteristics)
dan kelainan genetik (genetic abberant),
● Mengingat tanaman hasil kultur in vitro terbiasa tumbuh pada medium
yang cukup dengan sumber karbon, kelembaban yang tinggi dan memiliki
kemampuan fotosintesis yang rendah, maka untuk memindahkan tanaman
dari kondisi in vitro ke kondisi ex vitro diperlukan proses aklimatisasi dan
adaptasi agar tanaman tidak mudah mati akibat kehilangan air dan dapat
tumbuh normal pada kondisi ex vitro.

6
 Tahapan dalam perbanyakan tanaman secara in vitro dibagi dalam 5
tahapan, yaitu: (1) seleksi tanaman induk dan persiapannya, (2) kultur aseptik,
(3) perbanyakan/penggandaan propagule (kalus/tunas/embrio), (4) pengakaran
dan (5) aklimatisasi plantlets. Dari ke-5 tahapan tersebut, kultur aseptik
merupakan tahapan paling kritikal dan sulit dalam perbanyakan tanaman secara
in vitro. Selanjutnya dalam perbanyakan tanaman secara in vitro, tidak semua
jenis tanaman memerlukan ke-5 tahapan tersebut. Pada tanaman tertentu
(krisan, anyelir) tahap pengakaran tidak diperlukan.
Keberhasilan perbanyakan tanaman tanaman secara in vitro
dipengaruhi oleh beberapa faktor, diantaranya: genotipe tanaman; jenis, asal
dan umur eksplan; media, zat pengatur tumbuh (ZPT), sumber karbon, bahan
aditif, cahaya, suhu, kelembaban, dll. (Debergh dan Zimmerman, 1991;
Hartmann et al., 1997; George et al., 2007). Selain itu, keberhasilan kultur
jaringan tanaman juga dipengaruhi oleh tersedianya sumber tanaman dan
eksplan yang cukup.

2.3. Bioreaktor
Bioreaktor adalah bejana dengan lingkungan steril yang diisi dengan
nutrisi cair atau aliran air masuk dan keluar air atau udara yang didesain untuk
kultur intensif agar didapat kesempatan maksimal untuk monitor dan kontrol
terhadap kondisi mikro lingkungan seperti agitasi, aerasi, suhu, dan oksigen
terlarut, pH, dan lain-lain. Terdapat tiga jenis sistem kultur yaitu bioreaktor
yang memproduksi biomassa (sel, organogenesis, embriogenesis propagula
sebagai hasil akhir), bioreaktor yang menghasilkan metabolit dan enzim, serta
bioreaktor yang menggunakan biotransformasi secara eksogenous untuk
penambahan metabolit yang dapat digunakan sebagai prekursor jalur
metabolisme . Bioreaktor juga dapat diklasifikasikan berdasarkan metode
agitasi dan pembentukan tabung (vessel) yaitu bioreaktor agitasi mekanik
seperti stirred tank bioreactor, rotating drum bioreactor, spin filter bioreactor
dan bioreaktor dengan agitasi pneumatik dan tanpa agitasi seperti simple

7
aeration bioreactor, bubble column bioreactor, air-lift bioreactor, balloon type
bubble bioreactor-BTBB (Paek et al, 2005).

Gambar 2.1 Konfigurasi bioreaktor pada kultur sel a) Stirred tank bioreactor, b)
Bubble column reactor, c) Air-lift reactor
(Sumber : Georgiev, 2014)

Stirred tank bioreactor dapat memiliki laju perpindahan massa dan

panas yang tinggi serta memiliki pengadukan yang baik. Kecepatan
pengadukan, jenis pengadukan, banyaknya pengaduk, dan laju alir merupakan
hal terpenting pada bioreaktor ini. Impeller memiliki tiga peran penting yaitu
suspensi padatan, pengadukan, dan disolusi oksigen atmosfer menjadi fase
aqueous dan memaksimalkan pertemuan antara fase gas dengan aqueous
(Garcia-Ochoa & Gomez, 2009).
Spin filter tank adalah bioreaktor dengan kabel pemutar yang tidak
bergantung pada filtrasi agar retensi sel terjadi. Bagian utama dari bioreaktor ini
adalah wire cage dan agitation shaft. Bagian bawah cage dibuat padat dan
bagian sisi terbuat dari wire screen dengan besar screen 25-60 mikrometer
dengan ukuran sel sekitar 10-15 mikrometer. Medium segar dapat ditambahkan
secara kontinu pada bagian luar draft tube dan cairan hasil kultur dikeluarkan
dari dalam bioreaktor dengan laju yang sama. Pada kondisi optimal, alat ini
tidak berperan sebagai filter dan tidak terbentuk lumpur. Retensi sel tidak dapat
terjadi karena terdapat gaya sentrifugal yang dihasilkan gerakan berputar Cage.
Retensi dapat terjadi apabila partikel memiliki angka Reynold yang tinggi pada
bagan dinding bioreaktor atau terbentuk boundary laminar pada permukaan

8
 datar. Bioreaktor ini sangat efektif untuk kultivasi sel skala besar pada kondisi
optimal tertentu (Vardar-Sukan & Sukan, 2012).
Bubble column dan airlift bioreactor adalah bioreaktor dengan agitasi
secara pneumatik dan bioproses akan terjadi apabila terdapat antara kontak gas
dengan cairan. Gas memiliki peran kontak cairan sehingga transfer massa
seperti absorption atau desorption terjadi. Selain itu, gas diperlukan untuk
menghasilkan energi melalui ekspansi gas dan bubble buoyancy untuk
pengadukan cairan. Gas disalurkan melalui sparger pada bagian bawah
bioreaktor, buoyancy gas yang bergerak menuju bagian atas menghasilkan
pengadukan (Martinez & Silva, 2013). Perbedaaan utama kedua bioreaktor
ini adalah karakteristik aliran cairan. Pada bioreaktor airlift, aliran udara teratur
berpola siklik seperti loop berawal dari bagian atas menuju bagian bawah.
Bioreaktor airlift memiliki inner draft tube untuk meningkatkan kualitas
sirkulasi. Sirkulasi cairan terjadi karena melalui empat bagian yang berbeda
yaitu riser, downcomer, pemisah gas, dan bagian bawah. Beberapa kelebihan
bioereaktor airlift adalah konsumsi energi yang rendah, sederhana tanpa ada
bagian yang bergerak, transfer massa dan panas yang tinggi serta distribusi
regangan yang seragam (Martinez & Silva, 2013).
Konsumsi energi yang rendah sangat menguntungkan apabila
diaplikasikan pada skala besar sehingga biaya pengoperasian dapat ditekan.
Shear homogen sangat penting bagi proses biologis yang sensitif terhadap
shear. Regangan terbesar terjadi pada pengaduk dan menurun seiring dengan
menjauhnya dari tabung sehingga menghasilkan gradien regangan yang dapat
merusak sel hewan atau tumbuhan. Bentuk bioreaktor yang sederhana tanpa
shaft dapat mengurangi kemungkinan kontaminasi. Lingkungan yang steril
sangat krusial bagi pertumbuhan organisme, kontaminasi yang terjadi dapat
mengurangi kualitas produk, menghasilkan limbah, dan menambah biaya
operasi (Martinez & Silva, 2013).
Bubble column bioreactor tergolong dalam kelas reaktor multifase yang
terdiri dari tiga jenis yaitu trickle bed reactor, fluidized bed reactor, dan bubble
column reactor. Bubble column reactor berbentuk bejana silinder dengan

9
distributor gas pada bagian bawah bejana. Ketika fase padatan terbentuk, reaktor
ini disebut slurry bubble column reactor. Reaktor ini digunakan sebagai tempat
proses kimia seperti oksidasi, klorinasi, alkilasi, polimerasi, dan hidrogenasi saat
pembentukan bahan bakar sintetik melalui proses konversi proses biokimia seperti
fermentasi.
Bioreaktor ini memiliki desain diameter bejana yang besar untuk suplai
gas dalam jumlah besar. Terdapat dua jenis mode operasi yaitu mode kontinyu
dan semibatch. Mode kontinyu memiliki aliran gas dan suspensi disuplai pada
kolom dan suspensi yang dihasilkan reaktor akan didaur ulang untuk digunakan
kembali. Kecepatan superfisial cairan dijaga agar lebih lambat daripada kecepatan
superfisial gas. Sedangkan mode semibatch suspensi stasioner, tidak ada cairan
yang disuplai, dan gas disuplai masuk dari bagian bawah kolom.
Karakteristik dinamika fluida pada memiliki efek signifikan pada operasi
dan performa bubble column bioreactor. Terdapat tiga flow regime yaitu regime
homogen (bubbly flow), heterogen (churn-turbulent) dan slug flow. Selain itu
terdapat foaming yang sering terjadi pada bubble column bioreactor.

Gambar 2.2 Jenis flow regime pada bubble column bioreactor

Bubbly flow regime atau homogenous flow regime terjadi pada

kecepatan superfisial gas sangat rendah, kira-kira kurang dari 5 cm/s pada
kolom semibatch. Jenis laju alir ini memiliki gelembung yang kecil dengan
ukuran yang sama. Churn-turbulent regime atau heterogenous regime terjadi
pada laju alir gas superfisial yang lebih tinggi (lebih besar dari 5 cm/s pada

10
 kolom batch). Laju alir ini merupakan bentuk terganggu dari sistem homogen
gas-cairan karena terbentuk peningkatan laju alir turbulen pada resirkulasi
aliran yang membentuk ukuran gelembung yang tidak sama pada waktu yang
sempit. Slug flow dapat terjadi pada laju alir tinggi karena terbentuknya
sumbatan ketika gelembung besar terbentuk pada diameter kolom 15 cm
(Kantarci et al, 2005).

2.4. Faktor yang Mempengaruhi Kultur Skala Bioreaktor

Faktor-faktor yang mempengaruhi kultur skala bioreaktor antara lain
adalah sebagai berikut.
2.4.1. Aerasi
Pertumbuhan kultur dalam bioreaktor dipengaruhi oleh aerasi pada
suatu bioreaktor. Di dalam bioreaktor air-lift terdapat fasa gas dan fasa cair.
Menurut penelitian yang dilakukan oleh Akita dan Takayama pada tahun 1994,
pertumbuhan kultur di dalam bioreaktor akan terhambat jika kultur terlalu lama
terendam di dalam bioreaktor, karena hanya ada sedikit O2 yang terlarut pada
fasa cair. Sedangkan gas O2 dan gas lainnya paling banyak terkandung pada
fasa gas, sehingga kultur perlu terekspos pada fasa gasa bioreaktor.

2.4.2. Konsentrasi Glukosa pada Medium

Pertumbuhan dan pertambahan biomassa dipengaruhi juga oleh
konsentrasi glukosa (monosakarida). Glukosa berfungsi dalam pembentukan
polisakarida pada biomassa tanaman. Namun, glukosa yang berlebihan pada
medium dapat menghambat pertambahan biomassa tanaman dan berkurangnya
jumlah klorofil pada daun. Selain itu juga, glukosa dapat menghambat
pecahnya sel embrio, serta meningkatkan proses embriogenensis somatik
(untuk sumber gula) (Ziv, 2005).

2.4.3. Zat Pengatur Tumbuh

Kultur tumbuhan dalam bioreaktor dipengaruhi oleh zat pengatur
tumbuh yang ditambahkan ke dalam medium Murashige dan Skoog. Adanya

11
 zat pengatur tumbuh di dalam medium cair pada bioreaktor lebih efektif, bila
dibandingkan dengan medium agar. Hal ini disebabkan karena adanya kontak
langsung zat pengatur tumbuh dengan sel tumbuhan dan agregatnya (Ziv,
2005).
Zat pengatur tumbuh berfungsi untuk menginduksi pucuk pada kultur
tanaman. Induksi pucuk pada kultur bioreaktor dapat dilakukan dengan
menambahkan hormon sitokinin dalam jumlah yang tinggi untuk menghambat
biosintesis dari giberelin, karena giberelin menghambat kerja sitokinin dalam
pertumbuhan di jaringan meristematik. (Ziv, 1990).

2.4.4. Penentuan Desain Proses

Bioteknologi tumbuhan memerlukan penelitian multidisiplin untuk
menentukan morfologi dan komposisi jaringan, perpindahan massa dan aliran
dalam bioreaktor, kinetika pertumbuhan sel dan pembentukan produk, stabilitas
genetik, pengendalian lingkungan mikro dan makro dari bioreaktor, implikasi
desain bioreaktor untuk proses hilir, dan potensial untuk produksi skala besar.
Pententuan desain ditujukan untuk memperoleh produktivitas tinggi (g
produk/hari), yield produk tinggi (g produk/g substrat), dan konsentrasi produk
tinggi (g produk/L) dengan pemilihan media dan pengaturan kondisi operasi
bioreaktor yang tepat (Sajc et al., 2000).

2.4.5. Mixing
Mixing diperlukan untuk mendistribusikan sel, nutrien, dan produk
pada fasa liquid. Mixing biasanya dilakukan dengan sparging, agitasi mekanik,
atau gabungan keduanya untuk menjaga konsentrasi seragam dari parameter
kimiawi (misalnya pH, gas, dan nutrien) pada fasa bulk dan meningkatkan laju
transfer masa. Pada kultur in vitro, morfogenesis dari jaringan terekayasa
dipengaruhi oleh faktor eksogenetik seperti aliran dan mixing dalam beberapa
hal, (1) efek hidrodinamik langsung pada bentuk dan fungsi sel, dan perubahan
yang diinduksi oleh aliran dalam laju transfer massa pada nutrien dan metabolit.

12
 Besarnya gaya hidrodinamik yang digunakan untuk proses mixing
harus kecil sehingga tidak menyebabkan kematian sel, namun cukup untuk
menstimulasi fungsi sel. Pada bioreaktor well-mixed, efek hidrodinamik
disebabkan oleh fluktuasi laju cairan dan tekanan yang berhubungan dengan
disipasi viskositas dari laju turbulen (Sajc et al., 2000).

2.4.6. Metode Kultivasi

Metode kultivasi yang digunakan berpengaruh terhadap dinamika
suatu kultur. Kultivasi batch dikarakterisasi sebagai keadaan lingkungan yang
terus menerus berubah, dan dapat memproduksi metabolit yang berhubungan
dengan berbagai pola kinetika. Batch digunakan untuk menentukan kondisi
agar produktivitas maksimum. Steady-state dapat menghasilkan produksi
volume tinggi dan produk pendukung pertumbuhan bernilai rendah. Continuous
flow merupakan sistem kultivasi fleksibel, recycle sel dapat menyebabkan
kultur sel terimobilisasi dan dapat menghasilkan produksi dari senyawa yang
tidak berhubungan dengan pertumbuhan (Sajc et al., 2000).

2.4.7. Jenis Bioreaktor

Jenis dan desain bioreaktor dapat mempengaruhi beberapa faktor
dalam kultur, yaitu pertumbuhan sel dan pembentukan produk, analisis dan
modeling dari dinamika kultur, dan penelitian terkait aliran, mixing, dan
transfer massa antar fasa (Sajc et al., 2000)

2.5. Medium Murashige-Skoog

Salah satu faktor yang mempengaruhi kultur in vitro adalah
penggunaan medium kultur. Berbagai komposisi medium kultur telah
diformulasikan untuk mengoptimalkan pertumbuhan dan perkembangan
tanaman (Yusnita, 2003). Media tanam pada kultur in vitro berisi kombinasi
dari asam amino esensial, garam-garam organik, vitamin, larutan buffer, dan
glukosa atau sumber karbon (Ryugo, 1988). Media tanam kultur dapat berupa
medium cair atau padat, tergantung jenis eksplan (Rahardja & Wahyu, 2003).

13
 Medium MS (Murashige dan Skoog) merupakan salah satu jenis media
kultur yang paling sering digunakan pada kultur in vitro. Medium MS terdiri
atas unsur makro dan mikro yang menunjang pertumbuhan serta bahan
tambahan seperti vitamin dan zat pengatur tumbuh (ZPT). Medium MS sering
digunakan karena cocok untuk berbagai jenis tanaman. Medium MS memiliki
kandungan nitrat, kalium, dan amonium yang tinggi serta hara anorganik
dengan jumlah yang layak untuk memenuhi kebutuhan banyak sel tanaman
dalam kultur (Razdan, 2003). Medium ini seringkali digunakan sebagai media
dasar untuk kombinasi dan modifikasi konsentrasi medium.

14
 BAB III
METODOLOGI

3.1 Alat dan Bahan

Alat dan bahan yang digunakan dalam percobaan Kultur Pucuk In
Vitro Skala Bioreaktor ini adalah
Tabel 3.1 Alat dan Bahan

Alat Bahan
Bubble column bioreactor (1) Kultur pucuk tembakau in vitro (2,54 g)
Flowmeter (1) Medium MS half strength (250 mL)
Pompa (1) NAA (186,21 µg)
Rak penyangga bioreaktor (1) BAP (222,25 µg)
Cawan petri (1) Kapas (100 g)
Scalpel (1) Alkohol 70% (250 mL)
Pinset (1) Akuades (1 L)
Autoclave (1) Kertas reuse (1 pak)
Laminar air flow cabinet (1) Kertas saring (1)
Gelas ukur 250 mL (1) Karet gelang (20)
Corong kaca (1) Plastik tahan panas (1 pak)
Batang pengaduk (1) Alumunium foil (1 pak)
Selang silikon (1) Plastic wrap (1 pak)
Splitter (1)
Botol foam trap (1)
Penjepit kertas (2)
Oven (1)
Neraca analitik (1)
Sparger (1)

15
 Adapun rangkaian alat yang digunakan sebagai berikut :

Gambar 3.1 Rangkaian alat

3.2 Langkah Kerja
3.2.1 Multiplikasi Pucuk Tembakau
Alat, bahan, medium agar dan kultur pucuk untuk proses subkultur
disiapkan dalam laminar air flow cabinet. Botol kultur dibuka menggunakan
blade lalu kultur pucuk diambil menggunakan pinset. Kultur pucuk
ditempatkan pada cawan petri steril, pengambilan dilakukan menggunakan
pinset dan dikerjakan di dekat api. Pucuk yang telah disimpan pada cawan petri
dipindahkan pada medium baru. Kultur pucuk baru ditempatkan pada ruang
kultur untuk kultivasi selama 3 minggu.

3.2.2 Pembuatan Medium Kultur pada Bioreaktor

Alat dan bahan untuk pembuatan medium kultur disiapkan. Zat
pengatur tumbuh NAA dan BAP diambil menggunakan mikropipet, lalu
dipindahkan kedalam gelas ukur 500 ml dan ditambahkan akuades hingga 500
ml. Campuran medium dan zat pengatur tumbuh tersebut kemudian
dipindahkan ke dalam gelas kimia 1 L dan ditambahkan medium MS sebanyak
2,2 gram, kemudian diaduk dengan batang pengaduk. Sebanyak 500 ml
akuades ditambahkan kembali ke dalam gelas kimia tersebut, sehingga volume

16
 totalnya 1L. Langkah tersebut diulangi sehingga diperoleh total medium kultur
sebanyak 2L. Medium kultur tersebut kemudian diambil sebanyak 250 ml
untuk masing-masing kelompok.

3.2.3 Sterilisasi Alat dan Medium

Bioreaktor, pinset, scalpel, cawan petri, penjepit kertas, dan klem
bioreaktor dibungkus menggunakan kertas reuse terlebih dahulu. Setelah
dibungkus dengan kertas, peralatan tersebut dibungkus lagi menggunakan
plastik tahan panas dan diikat dengan menggunakan karet gelang. Medium MS
yang sudah dibuat, diletakkan ke dalam labu erlenmeyer 250 mL. Labu tersebut
kemudian ditutup dengan alumunium foil dan plastic wrap. Setelah itu labu
tersebut dibungkus oleh plastik tahan panas dan diikat dengan karet gelang.
Kemudian, Peralatan-peralatan dan medium tersebut dimasukkan ke dalam
autoclave selama 2 jam untuk disterilisasi. Setelah proses autoclave selesai,
peralatan tersebut diangkat dari autoclave, kemudian peralatan yang sudah
disterilisasi diletakkan pada rak penyimpanan.

3.2.4 Pemindahan Pucuk ke Bioreaktor

Botol kultur dibuka, kemudian pucuk diambil menggunakan pinset dan
disimpan dalam cawan petri. Kultur pucuk kemudian ditimbang sebanyak 2,5
gram. Bioreaktor dirangkai dan medium dimasukkan dalam bioreaktor. Setelah
itu, kultur dimasukkan dalam bioreaktor dan tutup bioreaktor direkatkan
menggunakan biofilm, plastic wrap, dan klem bioreaktor. Bioreaktor yang telah
disusun kemudian disimpan pada penyangga bioreaktor.

3.2.5 Kultur In Vitro dalam Bioreaktor

Foam trap dibuat dengan memasukkan kapas yang telah diberi alkohol
ke dalam botol kaca. Kapas dalam botol diatur agar tidak terlalu padat sehingga
udara bisa dialirkan. Setelah kapas dimasukkan, tutup botol yang telah
dilengkapi pipa dipasang kemudian pipa dilapisi dengan plastic wrap. Setelah

17
 foam trap dibuat, bioreaktor dirangkai sesuai Gambar 2.1. Setelah itu,
flowmeter dibuka hingga kapasitas maksimum kemudian penjepit kertas pada
bagian bawah bioreaktor dibuka dan laju udara diatur pada 1 L/menit.

3.2.6 Pengukuran Biomassa Pucuk

Rangkaian bioreaktor dilepaskan. Medium disaring menggunakan
kertas saring agar didapat pucuk hasil kultur skala bioreaktor. Berat basah
pucuk ditimbang menggunakan timbangan kasar.

18
 BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Pengaruh Laju Alir terhadap Pertumbuhan Kultur Pucuk Nicotiana

tabaccum
Pucuk Nicotiana tabacum yang dihasilkan dari kultur in vitro
ditumbuhkan dalam bioreaktor bubble column dengan dua laju alir yang
berbeda, yaitu laju alir <1 L /menit dan >1 L/menit dilengkapi dengan sparger.
Hasil dari percobaan ditunjukkan pada Gambar 4.1.

Gambar 4.1 Biomassa basah kultur Nicotiana tabacum

Transfer massa CO2 dari udara ke kultur difasilitasi oleh bubbling

udara dalam kultur, bubbling juga menyebabkan adanya pengadukan dalam
kultur. Hal tersebut mempengaruhi transfer massa dari nutrien melalui
membran sel dan distribusi cahaya melalui siklus gelap/terang dalam reaktor.
Namun, sensitivitas sel terhadap shear force merupakan faktor yang harus
dipertimbangkan dalam pengukuran (Rocha et al., 2003). Respon kultur
terhadap shear force bermacam-macam, misalnya penurunan laju pertumbuhan,

19
hilangnya kemampuan kultur untuk tumbuh, dan penurunan aktivitas
mitokondrial (Dunlop et al., 1994; Wongsamuth & Doran, 1997).
Berdasarkan Gambar 4.1, kultur Nicotiana tabacum yang ditumbuhkan
pada laju alir <1L/ menit mengalami pertambahan massa yang lebih tinggi
dibandingkan kultur yang ditumbuhkan pada laju alir >1L/menit. Hal ini
disebabkan karena adanya respon sublitik yang dipicu oleh shear force pada
kultur. Sel tanaman memiliki sensitivitas tertentu terhadap shear stress karena
dinding selnya yang kaku serta vakuola yang relatif besar sehingga adanya
shear stress saat pengadukan dapat menurunkan viabilitas sel (Joshi et al.,
1996).
Sel Nicotiana tabacum dalam bioreaktor dapat mengalami kerusakan
dan deformasi pada awal pertumbuhannya (Ho et al., 1995). Sel pada bioreaktor
bubble column mengalami penempelan pada gelembung yang muncul. Pada
laju alir tinggi, sel mengalami shear yang cukup signifikan pada medium,
namun mengalami shear dan turbulensi terbesar pada permukaan. Hal ini
disebabkan energi besar saat pelepasan sel dari gelembung. Sebagian sel tetap
ada pada permukaan film gelembung, sehingga pada saat gelembung pecah sel
tersebut bergerak dengan laju tinggi dan mengalami shear hingga terlepas
secara tangensial. Ukuran gelembung kecil dan frekuensi bubbling yang tinggi
dapat meningkatkan kerusakan sel pada permukaan medium karena disipasi
energi yang lebih tinggi (Hua et al., 1993).
Kultur Nicotiana tabacum pada laju >1L tetap mengalami
pertumbuhan sampai minggu kedua meskipun selnya mengalami kerusakan
akibat shear force. Hal ini disebabkan karena sel Nicotiana tabacum hanya
memiliki sensitivitas tinggi terhadap shear stress dalam waktu yang singkat
(sekitar 5 jam), namun memiliki toleransi pada paparan shear stress yang lama
(Scragg, 1995).
Pada salah satu kultur dengan laju alir <1 L/menit terdapat kultur yang
mengalami pertumbuhan yang lebih pesat daripada tumbuhan lainnya.
Tumbuhan tersebut membentuk sebuah gumpalan berwarna hijau tua dengan
pucuk yang tumbuh di sekeliling gumpalan tersebut. Tumbuhan tersebut tidak

20
terindikasi mengalami kontaminasi karena medium tidak berubah warna
maupun menjadi beraroma. Tumbuhan yang dimaksud mengalami
pertumbuhan kalus seperti terjadi pada penelitian Parveen dan Shahzad (2011).
Eksplan yang digunakan pada penelitian tersebut menghasilkan kalus yang
mengalami organogenesis.
Laju alir yang tinggi dapat menghambat pertumbuhan. Laju aerasi
optimal tergantung pada jenis dan ukuran reaktor yang digunakan.
Pertumbuhan terhambat bukan karena over-oxygenation atau keracunan akan
oksigen yang berlebih. Campuran gas pada konsentrasi oksigen rendah
memiliki efek penghambatan yang sama pada pertumbuhan kultur. Tingkat laju
shear dapat ditemukan pada bubble column bioreactor karena aliran gelembung
dapat diestimasikan sebagai kecepatan alir cairan dibagi setengah diameter
kolom.
Kadar karbon dioksida terlarut pada laju aerasi tinggi lebih tinggi
daripada aerasi rendah. Keberadaan CO2 pada kultur Nicotiana tabacum juga
dapat memengaruhi pertumbuhan dengan memicu perkembangan fotosintesis
pada kultur sel tanaman dan dapat memengaruhi metabolisme sekunder. Suplai
CO2 eksogen pada kultur pada aerasi tinggi dapat menurunkan dampak
penghambatan pertumbuhan walaupun pemberian CO2 eksogen yang berlebih
dapat kembali menghambat pertumbuhan. Kultur tumbuhan sangat sensitif
terhadap penambahan konsentrasi CO2 karena pertumbuhan dapat terganggu
pada konsentrasi tinggi atau rendah. Konsentrasi CO2 optimum harus diketahui
agar pertumbuhan pertumbuhan dapat terjadi pada kondisi optimum (Hegarty et
al, 1986) .
Reaksi biokonversi medium pada sistem in vitro dapat mengacu pada
neraca massa di bawah ini dengan pertumbuhan Nicotiana tabacum dapat
diasumsikan menyerupai biomassa Atropa belladona (CH1,27O0,45N0,45 )
(Saterbak et al, 2007).
0,39C12H22O11+ 0,23NH4NO3 + 3,43O2 → CH1,27O0,45N0,45 +4,07H2O +
3,64CO2
Berdasarkan perhitungan neraca massa, biomassa pucuk pada laju alir kurang

21
dari 1 L/menit menghasilkan pertambahan massa sebesar 3,43 gram. Biomassa
tersebut dihasilkan dari 17,09 gram sukrosa, 2,36 gram amonium nitrat, dan
3,43 gram oksigen. Sedangkan pada laju alir lebih dari 1 L/menit, biomassa
mengalami pertambahan sebanyak 0,83 gram. Biomassa tersebut dihasilkan
dari konversi 4,14 gram sukrosa, 0,57 gram amonium nitrat, dan 3,4 gram
oksigen.
Jumlah oksigen pada bioreaktor dipengaruhi oleh laju aliran udara,
semakin cepat laju aliran udara, maka jumlah oksigen yang ditransfer ke dalam
bioreaktor akan semakin tinggi (Lopes et al, 2013). Menurut penelitian
yang dilakukan oleh Gao dan Lee pada tahun 1992, semakin tinggi laju aliran
udara maka laju pertumbuhan tembakau semakin tinggi. Kadar oksigen yang
tinggi membantu meningkatkan aktivitas enzim, sehingga proses metabolisme
menjadi lebih optimal.
Namun hasil percobaan yang dilakukan oleh praktikan bertolak
belakang dengan penelitian yang dilakukan oleh Gao dan Lee pada tahun 1992.
Pada laju aliran yang lebih tinggi, pertambahan biomassa yang dihasilkan lebih
sedikit. Hal ini dapat disebabkan pada laju aliran yang lebih tinggi, proses
foaming lebih mudah terjadi terutama jika kolom pada bioreaktor tidak cukup
tinggi. Foaming pada bioreaktor dapat menyebabkan sel tumbuhan menjadi
pecah atau rusak, sehingga sel tersebut tidak dapat melakukan aktivitas
metabolisme secara optimal (Gao & Lee, 1992; Vardar-Sukan, 1992).
Sukrosa yang ditambahkan pada medium kultur berfungsi untuk energi
dan biosintesis metabolit sekunder. Pada konsentrasi tertentu, sukrosa akan
diserap dan diakumulasi menjadi biomassa oleh tanaman. Penyerapan sukrosa
oleh tanaman juga dipengaruhi oleh pH pada medium, sukrosa akan terserap
optimal pada pH 4-5. Sehingga ketika penyerapan sukrosa optimal, biomassa
dapat dihasilkan dalam jumlah yang optimal juga (Manuhara et al., 2015).
Nitrogen pada medium kultur bioreaktor dibutuhkan oleh tanaman
untuk sintesis biomassa dan metabolit sekunder. Sumber nitrogen pada medium
MS adalah ammonium dan nitrat. Nitrat yang diserap oleh tanaman digunakan
untuk meningkatkan biomassa. Perbandingan antara nitrat dengan ammonium

22
 yang baik untuk pertumbuhan biomassa adalah 10:20. Selain itu, perbandingan
antara nitrat dan ammonium yang baik juga dapat mengoptimalkan kandungan
metabolit sekunder seperti fenol (Park et al., 2015).

4.2 Kontaminasi pada Kultur Pucuk Nicotiana tabaccum Skala

Bioreaktor
Pada percobaan ini, dilakukan perbanyakan pucuk Nicotiana tabacum
dengan kultur in vitro agar pucuk yang digunakan dalam kultur skala bioreaktor
merupakan kultur yang tumbuh dalam keadaan aseptik. Subkultur dilakukan
dengan mengambil bagian pucuk kultur untuk multiplikasi pucuk. Namun, pada
percobaan ini daun dan bagian batang diambil juga dalam kultur in vitro. Kultur
in vitro menggunakan bagian batang dan daun merupakan bagian awal dari
inisiasi multiplikasi dan harus dilakukan satu tahap subkultur lagi agar didapat
pucuk hasil multiplikasi.
Pada proses subkultur, terdapat beberapa eksplan yang mengalami
kontaminasi yang ditunjukkan dengan munculnya mikroba berwarna putih atau
hitam pada botol kultur. Proses subkultur merupakan sumber kontaminasi
dengan 5-15% kontaminan dapat bertambah tiap kali subkultur dilakukan.
Kontaminasi mikroba dapat terjadi karena eksplan, medium tumbuh, peralatan
dan tangan praktikan yang tidak steril (Msogoya et al, 2012).
Media tumbuh kultur in vitro pucuk yang memiliki sumber nutrisi
tinggi dapat memicu pertumbuhan mikroba. Mikroba ini dapat berkompetisi
dengan kultur untuk mendapatkan nutrisi dan beberapa dapat memproduksi
fitotoksin yang menyebabkan nekrosis dan proliferasi. Kontaminan mikroba
yang sering terdapat pada kultur in vitro adalah bakteri seperti Pseudomonas
syringae, Bacillus licheniformis, Bacillus subtilis, Cornebacterium sp. dan
Erwinia spp. Selain itu fungi seperti Alterneria tenius, Aspergillus niger,
Aspergillus fumigatus dan Fusarium culmorum dapat menjadi sumber
kontaminan pada subkultur (Msogoya et al, 2012).

23
 Pada percobaan yang telah dilakukan, terjadi kontaminasi pada kultur.
Kontaminasi yang terjadi berupa warna medium yang berubah dari bening
menjadi pink. Mikroorganisme yang mungkin menyebabkan kontaminasi
adalah bakteri gram negatif yang berpigmen pink misalnya (Methylobacterium
mesophilicum). Salah satu cara pencegahan terjadinya kontaminasi bakteri ini
adalah dengan cara menambahkan antibiotik seperti gentamicin, rifampicin,
kanamicin, dan lain-lain (Chanprame et al., 1996).
Kontaminasi medium menjadi warna merah muda dan berbau mungkin
dapat disebabkan juga oleh jamur. Jamur tersebut dapat berasal dari udara di
laboratorium atau filter udara laminar air flow yang kotor. Jamur yang dapat
menyebabkan warna medium menjadi warna merah muda dan berbbau adalah
Rhodotorula sp. atau yang biasa disebut pink yeast. Jamur tersebut merupakan
kontaminan umum yang berada pada udara di dalam gedung (Leifert &
Woodward, 1998).
Selain kontaminasi medium menjadi merah muda, medium juga
menunjukan kontaminasi dengan perubahan warna menjadi keruh dan berbau.
Kontaminasi tersebut disebabkan oleh bakteri yang berasal dari kulit manusia.
Bakteri yang mungkin menyebabkan kontaminasi tersebut adalah
Staphylococcus epidermis dan Lactobacillus acidophilus. Kontaminasi oleh
bakteri dapat terjadi pada saat proses subkultur pada tanaman atau pemindahan
tanaman ke dalam bioreaktor. (Leifert et al., 1989).

4.3 Nekrosis dan Browning pada Kultur Pucuk In Vitro Nicotiana

tabacum Skala Bioreaktor
Pada percobaan kultur pucuk in vitro menggunakan bioreaktor terdapat
beberapa fenomena yang ditemukan pada kultur tembakau yaitu nekrosis dan
browning., fenomena tersebut dapat dilihat pada Gambar 4.2. Penyebab dari
adanya nekrosis dan browning pada kultur pucuk adalah teroksidasinya
senyawa polifenol yang berasal dari permukaan tanaman yang dipotong pada
saat subkultur ke medium kultur. Nekrosis dan browning juga disebabkan oleh
reaksi enzimatis, yaitu oleh enzim polifenol oksidase dan fenilalanin lyase

24
peroksidase yang mengkatalis pembentukan senyawa polifenol (Babaei et al,
2013).

Gambar 4.2 Nekrosis dan browning pada kultur pucuk

Nekrosis pada kultur tembakau juga dipengaruhi oleh laju transpirasi

udara pada bioreaktor. Bioreaktor yang digunakan pada praktikum disegel
menggunakan parafilm yang menutup ruang terbuka untuk dilakukannya proses
transpirasi, sehingga proses transpirasi tanaman menjadi terhambat. Laju
transpirasi yang terhambat pada tanaman dapat menyebabkan berkurangnya
aliran nutrisi ke jaringan meristematik, jaringan tersebut akan kekurangan
nutrisi dan menjadi rentan terhadap pertumbuhan nekrosis (Bairu et al., 2009).
Selain itu, nekrosis pada kultur dalam bioreaktor juga dapat disebabkan oleh
tingginya cekaman lingkungan dan sel tidak memiliki waktu untuk merespon
cekaman tersebut. Cekaman tinggi dapat disebabkan oleh adanya agitasi yang
kuat dan sparging udara yang dibutuhkan untuk suplai oksigen (Cotter & Al-
Rubeai, 1995).

25
 BAB V
PENUTUP

5.1 Kesimpulan
Pada percobaan Kultur Pucuk In Vitro Skala Bioreaktor dapat diambil
kesimpulan yaitu pertumbuhan kultur pucuk in vitro pada bioreaktor lebih baik
pada laju alir udara kurang dari 1 L/menit dengan perolehan biomassa akhir
sebesar 5,93 gram.

5.2 Saran
Pada percobaan Kultur Pucuk In Vitro Skala Bioreaktor terdapat
beberapa kekurangan yang dapat diperbaiki, adapun saran yang dapat berguna
untuk memperbaiki kekurangan tersebut yaitu :
1. Multiplikasi kultur pucuk perlu dilakukan pada suhu, pH, dan intensitas
cahaya optimum agar pertumbuhan dapat terjadi secara optimal.
2. Laju aliran udara optimum perlu diteliti lebih lanjut agar kultur skala
bioreaktor dapat memberikan hasil optimal.
3. Kondisi aseptik pada alat maupun sekitar kultur perlu dijaga untuk
meminimalisir kontaminasi pada kultur.

26
 DAFTAR PUSTAKA

Akita, M., & Takayama, S. (1994). Induction and development of potato tubers in
a jar fermentor. Plant Cell Tissue Organ Culture, 36(2):177-182.
Babaei, N., Abdullah, N. A. P., Saleh, G., & Abdullah, T. L. (2013). Control of
contamination and explant browning in Curculigo latifolia in vitro
cultures. Journal of Medicinal Plants Research, 7(8), 448-454.
Bairu, M. W., Stirk, W. A., Van Standen, J. (2009). Factors contributing to in
vitro shoot-tip necrosis and their physiological interactions. Plant Cell,
Tissue and Organ Culture, 98(3), 239-248.
Chanprame, S., Todd, J.J., & Widholm, J.M. (1996). Prevention of pink-
pigmented methylotrophic bacteria (Methylobacterium mesophilicum)
contamination of plant tissue. Plant Cell Reports, 16 : 222-225.
Cotter, T. G., & Al-Rubeai, M. (1995). Cell death (apoptosis) in cell culture
systems. TibTech,13: 294-300.
Dave, A. Bilochi, G., & Purohit, S. D. (2003). Scaling up production and field
performance of micropropagated medicinal herb ‘Safed Musli’
(Chlorophytum borivilianum). In vitro Cellular and Developmental
Biology, 39(4):419-424.
Dasuki, U. A. (1991). Sistematika Tumbuhan Tinggi. Bandung : Penerbit ITB.
Dunlop, E. H., Namdev, P. K., & Rosenberg, M. Z. (1994). Effect of Fluid Shear
Forces on Plant Cell Suspensions. Chemical Engineering Science, 49(14):
2263-2276).
Gao, J., & Lee, J. M. (1992). Effect of oxygen supply on the suspension culture of
genetically modified tobacco cells. Biotechnology Progress, 8(4), 285–
290.
Garcia-Ochoa, F. & Gomez, E. Bioreactor scale-up and oxygen transfer rate in
microbial processes: an overview. Biotechnology Advances, 27(2):153-
176.
Hegarty, P.K., Smart, N.J., Scragg, A. H., & Fowler, M. W. (1986). The aeration
of Catharanthus roseus L. G. Don suspension cultures in airlift

27
 bioreactors: the inhibitory effect at high aeration rates on culture growth.
Journal of Experimental Biology, 37(185) : 1911-1920.
Ho, C., Henderson, K. A., & Rorrer, L. G. (1995). Cell Damage and Oxygen
Mass Transfer during Cultivation of Nicotiana tabacum in a Stirred-Tank
Bioreactor. Biotechnology Progress, 11: 140-145.
Hua, J., Erickson, L. E., Yiin, T., & Giasgow, L. A. (1993). A Review of the
Effects of Shear and Interfacial Phenomena on Cell Viability. Critical
Reviews in Biotechnology, 13(4): 305-328.
Joshi, J. S., Elias, C. B., & Patole, M. S. (1996). Role of Hydrodynamic Shear in
the Cultivation of Animal, Plant, and Microbial Cells. Chemical
Engineering Journal, 62: 121-141.
Kantarci, N., Borak, F. & Ulgen, K. O. Bubble column reactors. Process
Biochemistry 40 : 2263-2283.
Leifert, C., Waites, W. M., & Nicholas, J. R. (1989). Bacterial contaminants of
micropropagated plant cultures. Journal of Applied Bacteriology, 67(4),
353–361.
Leifert, C., & Woodward, S. (1998). Laboratory contamination management : the
requirement for microbiological quality assurance. Plant Cell, Tissue and
Organ Culture, 52(1-2), 83-88.
Lopes, M., Mota, M., Belo, L. (2013). Oxygen mass transfer rate in a pressurized
lab-scale stirred bioreactor. Chemical Engineering & Technology, 36(10):
1779-1784.
Manuhara, Y. S. W., Kristanti, A. N., Utami, E. D. W., & Yachya, A. (2015).
Effect of sucrose and potassium nitrate on biomass and saponin content of
Talinum paniculatum Gaertn. hairy root in balloon-type bubble bioreactor.
Asian Pacific Journal of Tropical Biomedicine, 5(12), 1027-1032.
Msogoya, T., Kanyagha, H., Mutigitu, J., Kulebelwa, M. & Mamiro, D. (2012).
Identification and management of microbial contaminants of banana in
vitro cultures. Journal of Applied Biosciences, 55 : 3987 : 3994.
Nugroho, L. H., & Verpoorte, R. (2002). Secondary metabolism in tobacco. Plant
Cell, Tissue and Organ Culture, 68(2): 105-125.

28
Park, J.-A., Park, B.-J., Kim, A.-H., Park, S.-Y., & Paek, K.-Y. (2015). Airlift
bioreactor system and nitrogen sources for biomass and antioxidant
compound production from in vitro culture of Vitis flexuosa plantlets.
Horticulture, Environment, and Biotechnology, 56(3), 358–365.
Paek, K. Y., Chakrabarty, D., & Hahn, E. J. (2005). Application of bioreactor
systems for large scale production of horticultural and medicinal plants.
Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 81: 287–300.
Parveen, S., & Shahzad, A. (2011). A micropropagation protocol for Cassia
angustifolia Vahl. from root explants. Acta Physiol Plant, 33 : 789-796.
Rahardja, P. C. & Wahyu, W. (2003). Aneka Cara Memperbanyak Tanaman.
Jakarta: Agromedia Pustaka.
Razdan, M. K. (2003). Introduction to Plant Tissue Culture (2nd ed.). Enfield:
Science Publishers.
Rocha, J. M. S., Garcia, J. E. C., & Henriques, M. H. F. (2003). Growth aspects of
the marine microalga Nannochloropsis gaditana. Biomolecular
Engineeering,20 :237-242.
Ryugo, K. (1988). Fruit Culture: Its Science and Art. New York: John Wiley and
Sons.
Sajc, L., Grusbisic, D., & Vunjak-Novacovic, G. (2000). Bioreactors for plant
engineering: an outlook for further research. Biochemical Engineering
Journal, 4(2): 89-99.
Saterbak, A., San, K-Y., McIntire, L. V. (2007). Bioengineering Fundamentals.
New Jersey : Pearson Prentice Hall.
Scragg, A. H. (1995). The Problems Associated with High Biomass Levels in
Plant Cell Suspensions. Plant Cell, Tissue, and Organ Culture, 43: 163-
170.
Stiles, A. R., & Liu, C.,-Z. (2013). Hairy root culture : Bioreactor design and
process intensification. Advances in Biochemical
Engineering/Biotechnology, 134(1), 91-114.
Vardar-Sukan, F. (1992). Recent Advances in Biotechnology. New York City :
Springer, 113-146.

29
Wongsamuth, R., & Doran, P. M. (1997). The Filtration Properties of Atropa
belladona Plant Cell Suspensions: Effect of Hydrodynamic Shear and
Elevated Carbon Dioxide Levels on Culture and Filtration Parameters.
Journal of Technology and Biotechnology, 69: 15-26.
Yusnita. (2003). Kultur Jaringan Cara Memperbanyak Tanaman Secara Efisien.
Jakarta: Agromedia Pustaka.
Ziv, M. (1990). Morphogenesis of gladiolus buds in bioreactors - implication for
scaled-up propagation of geophytes. In Nijkamp, H. J. J., van der Plas, L.
H. W., & van Aatrijk, J (Eds.), Progress in Plant Cellular and Molecular
Biology. Dordrecht : Kluwer Academic Publishers.
Ziv, M. (2005). Simple bioreactors for mass propagation of plants. Plant Cell,
Tissue, and Organ Culture, 81(3): 277-285.

30
LAMPIRAN

31
 Lampiran A Cara Pengolahan Data

A.1 Cara Mengolah Data Biomassa Pucuk

Data yang diperoleh pada praktikum ini dengan laju alir kurang dari 1
L/menit disajikan pada tabel A.1.

Tabel A.1 Keterangan tabel

Laju Titik Biomassa awal Biomassa saat t

Aerasi Pengamatan (gram) pengamatan (gram)
(L/menit) (minggu ke-)

>1 1 2,5 3,25

>1 1 2,5 3,25

>1 2 2,5 8,67

>1 2 2,5 3,19

Nilai rata-rata biomassa didapatkan kultur pucuk dengan

menggunakan rumus A.1.

(A.1)
Rata - rata Biomassa = (3,25 + 3,25)/ 2 = 3,25 g

Dengan begitu, nilai rata-rata biomassa pada minggu ke-1 dengan laju aerasi
kurang dari 1 L/menit didapatkan sebesar 3,25 gram. Hal yang sama dilakukan
untuk pengamatan pada minggu kedua untuk laju aerasi kurang dari 1 L/menit
dan lebih dari 1 L/menit sehingga didapatkan data yang disajikan pada Tabel
A.2.

32
 Tabel A. 2 Hasil pengolahan data kultur pucuk Nicotiana tabaccum

Laju Aerasi Titik pengamatan Biomassa

(L/menit) (minggu ke-) (gram)

<1 0 2,5

1 3,25

2 5,93

>1 0 2,5

1 3,08

2 3,3

A.2 Cara Mengolah Data Neraca Massa Pucuk Nicotiana tabaccum

Neraca massa pucuk Nicotiana tabaccum dapat dihitung menggunakan
persamaan reaksi yang didapat dari Saterbak et al. pada tahun 2007. Neraca
massa dihitung dengan menggunakan perbandingan koefisien antara molekul-
molekul yang bersangkutan. Informasi yang dapat didapatkan untuk
menghitung neraca massa adalah pertambahan biomassa pucuk, yaitu sebesar
3,43 gram untuk laju alir kurang dari 1 L/menit dan 0,83 gram untuk laju alir
lebih dari 1 L/menit.
0,39C12H22O11+ 0,23NH4NO3 + 3,43 O2 → CH1,27O0,45N0,45 +4,07H2O +
3,64CO2
Mol biomassa pucuk (CH1,27O0,45N0,45) dihitung dengan menggunakan
persamaan sebagai berikut
𝑚𝑎𝑠𝑠𝑎 𝑝𝑢𝑐𝑢𝑘
𝑚𝑜𝑙 𝑏𝑖𝑜𝑚𝑎𝑠𝑠𝑎 = (A.2)
𝑀𝑟 𝑝𝑢𝑐𝑢𝑘

3,43 𝑔
𝑚𝑜𝑙 𝑏𝑖𝑜𝑚𝑎𝑠𝑠𝑎 =
26,77 𝑔/𝑚𝑜𝑙

33
 𝑚𝑜𝑙 𝑏𝑖𝑜𝑚𝑎𝑠𝑠𝑎 = 0.128 𝑚𝑜𝑙
Kemudian mol O2 dapat dihitung melalui perbandingan koefisien antara molekul
biomassa dengan molekul O2. Mol dari molekul lain juga dapat dihitung dengan
perbandingan koefisien.
𝑘𝑜𝑒𝑓𝑖𝑠𝑖𝑒𝑛 𝑜𝑘𝑠𝑖𝑔𝑒𝑛
𝑚𝑜𝑙 𝑜𝑘𝑠𝑖𝑔𝑒𝑛 = 𝑚𝑜𝑙 𝑏𝑖𝑜𝑚𝑎𝑠𝑠𝑎 × 𝑘𝑜𝑒𝑓𝑖𝑠𝑖𝑒𝑛 𝑏𝑖𝑜𝑚𝑎𝑠𝑠𝑎 (A.3)

3,43
𝑚𝑜𝑙 𝑜𝑘𝑠𝑖𝑔𝑒𝑛 = 0,128 𝑚𝑜𝑙 ×
1
𝑚𝑜𝑙 𝑜𝑘𝑠𝑖𝑔𝑒𝑛 = 0,439 𝑚𝑜𝑙
Setelah mol dari masing-masing molekul dihitung, massa dari setiap molekul
dihitung dengan menggunakan persamaan sebagai berikut.
𝑚𝑎𝑠𝑠𝑎 𝑜𝑘𝑠𝑖𝑔𝑒𝑛 = 𝑚𝑜𝑙 𝑜𝑘𝑠𝑖𝑔𝑒𝑛 × 𝑀𝑟 𝑜𝑘𝑠𝑖𝑔𝑒𝑛 (A.4)
𝑚𝑎𝑠𝑠𝑎 𝑜𝑘𝑠𝑖𝑔𝑒𝑛 = 0,439 𝑚𝑜𝑙 × 32 𝑔/𝑚𝑜𝑙
𝑚𝑎𝑠𝑠𝑎 𝑜𝑘𝑠𝑖𝑔𝑒𝑛 = 14,04 𝑔𝑟𝑎𝑚
Hasil perhitungan neraca massa pucuk Nicotiana tabaccum dapat dilihat pada
Tabel A.3
Tabel A.3 Hasil perhitungan neraca massa pucuk Nicotiana tabaccum

Laju Sukro Ammoniu Oksig Mass Air Karbon

Alir sa m Nitrat en a (g) Dioksida
(L/meni (g) (g) (g) Pucu (g)
t)
k
(g)

<1 17,09 2,36 14,05 3,43 9,3 20,52

9

>1 4,14 0,57 3,4 0,83 2,2 4,96

7

34
 Lampiran B Data Mentah

B.1 Data Mentah Pengamatan Kultur Pucuk Nicotiana tabaccum

Laju Titik Biomassa awal Biomassa saat t

Aerasi Pengamatan (gram) pengamatan (gram)
(mL/men (minggu ke-)
it)

<1 1 2,5 3,25

<1 1 2,5 3,25

<1 2 2,5 8,67

<1 2 2,5 3,19

>1 1 2,5 3,08

>1 1 2,5 3,08

>1 2 2,5 3,90

>1 2 2,5 2,76

35
 Lampiran C Dokumentasi

Gambar C.1 Kultur skala bioreaktor kelompok 1, 2, dan 3 pada minggu ke-0

Gambar C.2 Kultur skala bioreaktor kelompok 4, 5, 6, 7 dan 8 pada minggu ke-
0

36
Gambar C.3 Kontaminasi pada kultur skala bioreaktor kelompok 1

Gambar C.3 Kultur skala bioreaktor kelompok 1 pada minggu ke-2

37
38