ISOLASI SENYAWA METABOLIT SEKUNDER DARI FRAKSI ETIL

ASETAT EKSTRAK UMBI SINGKONG (Manihot esculenta Crantz) var.

Sao pedro petro

SKRIPSI

EUIS GITA ANISSA KUSMAHANDI

062116056

PROGRAM STUDI KIMIA

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
UNIVERSITAS PAKUAN
BOGOR
2020
 LEMBAR PENGESAHAN

SKRIPSI

Judul Penelitian : “Isolasi senyawa metabolit sekunder dari fraksi etil asetat
ekstrak umbi singkong (Manihot esculenta Crantz) var. Sao
pedro petro”

Nama : Euis Gita Anissa Kusmahandi

Npm : 062116056

Progam Studi : Kimia

Telah diperiksa dan disetujui

Bogor, Juli 2020

Menyetujui,

Pembimbing II Pembimbing I

Siti Warnasih, M.Si Diana Widiastuti, M.Phil

i
 KATA PENGANTAR

Puji syukur penulis panjatkan kehadirat Allah SWT, karena atas semua
rahmat dan hidayah-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan penulisan skripsi
yang berjudul “Isolasi senyawa metabolit sekunder dari fraksi etil asetat
ekstrak umbi singkong (Manihot esculenta Crantz) var. Sao pedro petro”
sesuai waktu yang telah direncakan. Dalam penyusunan makalah skripsi ini
penulis mengucapkan banyak terima kasih kepada pihak-pihak yang telah banyak
membantu terlaksananya penelitian ini.
1. Ibu Dr. Prasetyorini, M.S selaku Dekan FMIPA Universitas Pakuan Bogor.
2. Ibu Ade Heri Mulyati, M.Si., selaku Ketua Program Studi Kimia FMIPA
Universitas Pakuan Bogor.
3. Ibu Diana Widiastuti, M.Phil dan Ibu Siti Warnasih, M.Si, selaku
Pembimbing yang telah banyak memberikan arahan dan bimbingan baik saat
penelitian maupun penulisan laporan ini.
4. Seluruh dosen FMIPA Universitas Pakuan Bogor atas ilmu yang telah
diberikan dan seluruh staf Tata Usaha FMIPA Universitas Pakuan Bogor atas
segala kemudahan dan bantuan yang telah diberikan.
5. Seluruh tim Lab Sentral Universitas Padjajaran, Bapak Supriatno Salam, M.Si
dan Kang Wiro yang telah membimbing selama penelitian dan juga
penulisan.
6. Mamah, bapak, adek, keluarga serta kerabat yang memberikan doa, motivasi
dan dukungannya baik moril maupun materi sehingga penulis bisa
menyelesaikan skripsi ini.
7. Sahabat seperjuangan Deyana, Wida, Ayuni, Latri dan teman-teman angkatan
2016 yang telah banyak membantu dan memberikan semangat serta segala
macam bantuan saat penelitian dan juga penulisan makalah ini
8. Rekan-rekan di HIMASKA dan IKAHIMKI yang selalu memberi semangat
dan juga dukungannya kepada penulis
9. Sahabat terbaik Eno, Ami, Ismar, Mega, Opy, Upiq dan Adi yang selalu
memberikan semangat tanpa henti kepada penulis

ii
 Makalah ini belum sempurna, terbuka kritik dan saran untuk perbaikan di
waktu yang akan datang. Semoga makalah ini bermanfaat umumnya bagi semua
kalangan khususnya bagi civitas akademika.

Bogor, Juli 2020

Penulis

iii
Euis Gita Anissa Kusmahandi. 062116056. “ISOLASI SENYAWA
METABOLIT SEKUNDER DARI FRAKSI ETIL ASETAT EKSTRAK
UMBI SINGKONG (Manihot esculenta Crantz) var. Sao pedro petro”
dibawah bimbingan Diana Widiastuti, M.Phil. dan Siti Warnasih, M.Si.

RINGKASAN

Singkong merupakan tanaman akar yang menjadi salah satu komoditi

pangan yang banyak ditemukan di provinsi Jawa Barat. Singkong dapat pula
digunakan sebagai bahan baku pangan fungsional, karena mengandung senyawa
aktif yang berkhasiat seperti anti hipertensi, antioksidan, anti alergi, anti depresi,
anti kanker dan anti inflamasi, akan tetapi penelitian mengenai zat aktif dalam
singkong ini masih belum banyak dilakukan. Penelitian ini bertujuan untuk
mengidentifikasi senyawa metabolit sekunder pada fraksi aktif etil asetat umbi
singkong (Manihot esculenta Crantz) var. Sao pedro petro.
Metode yang dilakukan pada penelitian ini dibagi menjadi empat tahapan,
tahapan pertama yaitu persiapan simplisia dan maserasi, dimana umbi singkong
yang telah bersih di maserasi menggunakan etanol 96%. Tahapan kedua yaitu,
fraksinasi dan ekstraksi dengan dipartisi menggunakan n-heksana yang kemudian
residunya dipartisi kembali menggunakan larutan etil asetat sehingga
menghasilkan fraksi etil asetat. Tahapan ketiga yaitu, isolasi fraksi etil asetat
menggunakan kromatografi kolom dan kromatografi lapis tipis yang akan
menghasilkan isolasi senyawa murni. Tahapan keempat yaitu, karakterisasi hasil
isolasi murni dengan berbagai instrumen, diantaranya yaitu menggunakan
Nuclear Magnetic Resonance (NMR), Spektrometri Inframerah, dan Spektroskopi
Massa.
Hasil penelitian menunjukkan bahwa pada fraksi etil asetat umbi singkong
(Manihot esculenta Crantz) var. Sao pedro petro terdapat senyawa aktif metabolit
sekunder yang teridentifikasi. Hasil spektrum MS menunjukkan puncak ion
molekul atau fragmen [M+Na]+ pada 286,066 m/z yang merupakan bobot molekul
dari senyawa C11H21NO6 atau senyawa lotaustralin. Hasil pada spektrum IR
terdapat pita regangan 3379,11 cm-1 merupakan daerah serapan gugus hidroksil (‒
OH) yang ditandai pula melandainya pita regangan pada spektrum. Kemudian
terdapat pita regangan 2931,13 cm-1 yang merupakan daerah serapan gugus metin
(CH). Selanjutnya terdapat pita regangan 2242,31 cm-1 yang merupakan daerah
serapan C ≡N. Kemudian terdapat pita regangan 1645,74 yang merupakan daerah
serapan gugus alkena (C¿C). Hasil perbandingan data NMR yang didapat dengan
penelitian Akgul (2004), hasil H-NMR, C-NMR, dan DEPT dinyatakan bahwa
struktur senyawa yang terbentuk merupakan senyawa lotaustralin. Senyawa
lotaustralin merupakan senyawa sianogenik glukosida yang umum terdapat pada
umbi singkong.

Kata Kunci : Umbi singkong (Manihot esculenta Crantz) var. Sao pedro petro,
Fraksi etil asetat, Senyawa Lotaustralin.

iv
Euis Gita Anissa Kusmahandi. 062116056. “Isolation of Secondary Metabolitic
Compounds From Ethyl Acetate Fraction of cassava roots (Manihot esculenta
Crantz) var. Sao pedro petro” supervised by Diana Widiastuti, M.Phil. and Siti
Warnasih, M.Si.

SUMMARY

Cassava is a root crop which is one of the food commodities that are
found in the province of West Java. Cassava can also be used as a functional food
raw material, because it contains active compounds that are efficacious such as
anti-hypertension, antioxidants, anti-allergic, anti-depression, anti-cancer and
anti-inflammatory, but research on active substances in cassava is still not much
done. This study aims to identify secondary metabolites in the active fraction of
ethyl acetate cassava tubers (Manihot esculenta Crantz) var. Sao pedro petro.
The method used in this study is divided into four stages, the first stage is
the preparation of simplicia and maceration, where cassava tubers that have been
cleaned are macerated using ethanol 96%. The second stage is fractionation and
extraction by being partitioned using n-hexane and then the residue is
repartitioned using ethyl acetate solution to produce ethyl acetate fraction. The
third stage is isolation of ethyl acetate fraction using column chromatography
and thin layer chromatography which will produce pure compound isolation. The
fourth stage is the characterization of pure isolation results with various
instruments, including using Nuclear Magnetic Resonance (NMR), Infrared
Spectrometry, and Mass Spectroscopy.
The results showed that in the ethyl acetate fraction of cassava tubers
(Manihot esculenta Crantz) var. Sao pedro petro is an active compound of
secondary metabolites that are identified. The results of the MS spectrum show
the peak of the molecular ion or fragment [M + Na] + at 286,066 m / z which is
the molecular weight of the compound C11H21NO6 or lotaustralin compound. The
result of IR spectrum is that the strain band 3379.11 cm -1 is the absorption area of
the hydroxyl group (OH) which is also marked by the stretching of the band on
the spectrum. Then there is the stretch band 2931.13 cm -1 which is the absorption
area of the metin group (CH). Furthermore, there is a stretch band of 2242.31
cm-1 which is the absorption area of C ≡N. Then there is the stretch band 1645.74
which is the absorption area of the alkene group (C = C). The results of
comparison of NMR data obtained by the research of Akgul (2004), the results of
1
H-NMR, 13C-NMR, and DEPT stated that the structure of the compound formed
was lotaustralin compound. Lotaustralin compound is a cyanogen glucoside
compound which is a common type found in cassava tubers.

Keywords : Cassava (Manihot esculenta Crantz) var. Sao pedro petro, Ethyl
acetate fraction, Lotaustralin compound.

v
 DAFTAR ISI
LEMBAR PENGESAHAN ............................................................................. i
KATA PENGANTAR ...................................................................................... ii
RINGKASAN ................................................................................................... iii
SUMMARY ...................................................................................................... iv
DAFTAR ISI ..................................................................................................... vi
DAFTAR GAMBAR......................................................................................... viii
DAFTAR TABEL.............................................................................................. ix
DAFTAR LAMPIRAN .................................................................................... x
BAB I PENDAHULUAN................................................................................. 1
1.1 Latar belakang .............................................................................................. 1
1.2 Tujuan Penelitian ......................................................................................... 2
1.3 Manfaat Penelitian ....................................................................................... 2
1.4 Hipotesis ....................................................................................................... 2
BAB II TINJAUAN PUSTAKA....................................................................... 3
2.1 Singkong....................................................................................................... 3
2.2 Kandungan Metabolit Sekunder.................................................................... 4
2.2.1 Flavonoid.................................................................................................... 4
2.2.2 Terpenoid................................................................................................... 6
2.2.3 Fenolik........................................................................................................ 8
2.2.4 Alkaloid...................................................................................................... 9
2.2.5 Steroid........................................................................................................ 10
2.2.6 Tanin.......................................................................................................... 11
2.3 Aktifitas Biologis pada tanaman genus Manihot.......................................... 12
2.4 Karakterisasi Senyawa Murni....................................................................... 13
2.4.1 Nuclear Magnetic Resonance (NMR)........................................................ 13
2.4.2 Spektrometri Inframerah............................................................................ 15
2.4.3 Spektroskopi Massa................................................................................... 16
BAB III BAHAN DAN METODE.................................................................. 18
3.1 Waktu dan Tempat Pelaksanaan................................................................... 18
3.2 Alat dan Bahan.............................................................................................. 18

vi
3.3 Metode Penelitian.......................................................................................... 18
3.3.1 Persiapan Simplisia Uji.............................................................................. 18
3.3.2 Ekstraksi Umbi Singkong.......................................................................... 19
3.3.3 Isolasi Hasil Ekstraksi Umbi Singkong Fraksi Etil Asetat......................... 19
3.3.4 Karakterisasi Senyawa Murni.................................................................... 20
3.3.4.1 Spektroskopi Massa................................................................................ 20
3.3.4.2 Spektrometri Inframerah......................................................................... 21
3.3.4.3 Nuclear Magnetic Resonance (NMR)..................................................... 21
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN.......................................................... 22
4.1 Hasil Ekstraksi dan Fraksinasi Umbi Singkong............................................ 22
4.2 Hasil Isolasi Ekstrak Umbi Singkong Fraksi Etil Asetat.............................. 23
4.3 Hasil Karakterisasi Senyawa Murni.............................................................. 26
4.3.1 Hasil Spektroskopi Massa.......................................................................... 26
4.3.2 Hasil Spektrometri Inframerah................................................................... 27
4.3.3 Hasil Spektroskopi NMR........................................................................... 28
BAB V KESIMPULAN DAN SARAN............................................................ 32
5.1 Kesimpulan................................................................................................... 32
5.2 Saran.............................................................................................................. 32
DAFTAR PUSTAKA........................................................................................ 33
LAMPIRAN....................................................................................................... 38

vii
 DAFTAR GAMBAR

Gambar 1. Umbi Singkong................................................................................. 3

Gambar 2. Struktur senyawa turunan flavonoid dari tanaman genus Manihot... 6
Gambar 3. Struktur senyawa turunan terpenoid dari tanaman genus Manihot... 7
Gambar 4. Struktur senyawa turunan fenolik dari tanaman genus Manihot ...... 9
Gambar 5. Struktur senyawa turunan alkaloid dari tanaman Family
Euphorbiaceae................................................................................... 10

Gambar 6. Struktur senyawa turunan steroid pada tanaman genus Manihot...... 11

Gambar 7. Struktur senyawa turunan tanin dari tanaman Family
Euphorbiaceae................................................................................... 12

Gambar 8. Skema Kerja Nuclear Magnetic Resonance...................................... 14

Gambar 9. Skema Kerja Spektrometri Inframerah............................................. 15
Gambar 10. Skema Kerja Spektroskopi Massa................................................... 17
Gambar 11. Hasil KLT 16 Fraksi Etil Asetat...................................................... 24
Gambar 12. Hasil KLT Isolat murni .................................................................. 25
Gambar 13. Spektrum Massa Senyawa Murni EA 13........................................ 26
Gambar 14. Spektrum HR-TOF-MS Senyawa Murni EA 13............................. 27
Gambar 15. Spektrum IR Senyawa Murni EA 13............................................... 27
Gambar 16. Spektrum 1H-NMR Senyawa Murni EA 13.................................... 28
Gambar 17. Spektrum 13C-NMR Senyawa Murni EA 13................................... 29
Gambar 18. Spektrum DEPT Senyawa Murni EA 13......................................... 30
Gambar 19. Struktur Senyawa Lotaustralin........................................................ 31

viii
 DAFTAR TABEL

Tabel 1. Profil fitokimia tanaman genus Manihot.............................................. 4

Tabel 2. Distribusi senyawa flavonoid pada tanaman genus Manihot............... 5
Tabel 3. Distribusi senyawa fenolik pada tanaman genus Manihot.................... 8
Tabel 4. Bioaktivitas dari tanaman genus Manihot............................................. 13
Tabel 5. Hasil rendemen ekstrak etanol, n-heksana, dan etil asetat umbi
Singkong............................................................................................... 23

Tabel 6. Data fraksi dan eluennya....................................................................... 24

Tabel 7. Hasil isolat dari fraksi EA A sampai G................................................. 25
Tabel 8. Tabel perbandingan senyawa murni EA 13 dan Senyawa
lotaustralin............................................................................................ 30

ix
 DAFTAR LAMPIRAN

Lampiran 1. Skema Kerja Penelitian.................................................................. 39

Lampiran 2. Skema Kerja Persiapan Simplisia Uji............................................. 40
Lampiran 3. Skema Kerja Ekstraksi Dan Faksinasi Umbi Singkong................. 40
Lampiran 4. Skema Kerja Isolasi Dan Identifikasi............................................. 41
Lampiran 5. Perhitungan Rendemen Fraksi........................................................ 45
Lampiran 6. Penentuan Perbandingan Eluen...................................................... 45
Lampiran 7. Hasil identifikasi spektra NMR, IR, dan MS.................................. 45
Lampiran 8. Dokumentasi Penelitian.................................................................. 47

x
 BAB I
PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang
Singkong merupakan tanaman akar yang menjadi salah satu komoditi pangan
yang banyak ditemukan di provinsi Jawa Barat. Secara umum singkong dapat
digunakan untuk mengobati demam, sakit kepala, diare, meningkatkan nafsu
makan, luka bernanah, luka barukena panas (Haryanto 2009). Singkong dapat pula
digunakan sebagai bahan baku pangan fungsional, karena mengandung senyawa
aktif yang berkhasiat seperti anti hipertensi, antioksidan, anti alergi, anti depresi,
anti kanker dan anti inflamasi, akan tetapi penelitian mengenai zat aktif dalam
singkong ini masih belum banyak dilakukan.
Widiastuti et al,.2018 meneliti 3 varietas umbi singkong yaitu Adira, Karikil,
dan Sao pedro petro, dihasilkan ekstrak umbi singkong Sao Pedro Petro dari
ekstrak etanol dalam suhu ruang, kemudian di partisi dengan n-heksan, etil asetat,
dan butanol, pada fraksi n-heksan memiliki nilai IC50 sebesar 15,847 µg/ml
dimana berpotensial sebagai zat aktif sitotoksik untuk menghambat pertumbuhan
sel kanker P388 Murine Leukimia. Pada fraksi etil asetat di dapat data nilai IC 50
sebesar 39,900 µg/ml. Pada varietas Adira-2 memiliki nilai IC50 77,956 µg/ml
pada n-heksana, 85,758 µg/ml pada etil asetat dan 73,544 µg/ml pada butanol.
Kemudian pada varietas Karikil di dapat data nilai IC50 57,587 µg/ml pada fraksi
n-heksana, 85,355 µg/ml pada etil asetat, dan 50,166 µg/ml pada fraksi butanol.
Dari ketiga singkong yang dijadikan sampel, Sao Pedro Petro merupakan
singkong yang memiliki nilai sebagai zat aktif yang berpotensial sebagai
sitotoksik.
Persentase penghambatan pada fraksi n-butanol memiliki penghambatan
terbaik yaitu dengan nilai IC50 sebesar 1,073 µg/ml, kemudian n-heksan 4,72
µg/ml, etanol 6,652 µg/ml, dan fraksi air sebesar 9,498 µg/ml. Hasil uji sitotoksik
pada sel kanker hela, membuktikan bahwa ekstrak umbi singkong (Manihot
esculenta Crantz) var. Sao pedro petro di fraksi butanol dan n-heksana berpotensi
sebagai antikanker (Widiastuti et al,.2019).
Widiastuti et al,.2019 mengisolasi hasil dari ekstrak umbi singkong (Manihot
esculenta Crantz) var. Sao pedro petro dengan etanol dan di partisi dengan n-

1
 2

heksana, etil asetat, dan n-butanol menggunakan kromatografi kolom dengan

silika gel 60 secara elusi gradien yang kemudian di cek menggunakan
spektroskopi UV, IR, NMR, dan MS berhasil menemukan senyawa aktif
flavonoid dari hasil fraksi n-butanol, yaitu quarcetin-3-O-rutinoside. Dimana
senyawa tersebut merupakan senyawa yang berpotensial sebagai zat aktif
sitotoksik untuk menghambat pertumbuhan sel kanker P388 Murine Leukimia.
Sementara untuk isolasi dari fraksi etil asetat belum diuji lebih lanjut senyawa
aktif apa yang bisa ditemukan, dapat dilihat dari kemungkinan hasil penelitian
Widiastuti (2018) pada fraksi etil asetat nilai IC50 sebesar 39,900 µg/ml dimana
dapat berpotensial sebagai zat aktif sitotoksik.
Penelitian ini dilakukan untuk menentukan senyawa aktif dari hasil isolasi
umbi singkong (Manihot esculenta Crantz) var. Sao pedro petro fraksi etil asetat.
Pemurnian senyawa aktif dilakukan menggunakan kromatografi kolom yang
menghasilkan senyawa murni, selanjutnya senyawa murni yang dihasilkan
diidentifikasi struktur senyawa aktif menggunakan Nuclear Magnetic Resonance
(NMR), Spektrometri Inframerah, dan Spektroskopi Massa.
1.2 Tujuan
Penelitian ini bertujuan untuk mengidentifikasi senyawa
metabolit sekunder dari fraksi aktif etil asetat ekstrak umbi singkong (Manihot
esculanta Crantz) var. Sao pedro petro.
1.3 Manfaat Penelitian
Dengan diketahuinya senyawa metabolit sekunder dari fraksi aktif etil asetat
pada umbi singkong dapat dimanfaatkan sebagai zat aktif antikanker.
1.4 Hipotesis
Terdapat senyawa metabolit sekunder dari fraksi aktif etil asetat pada ekstrak
umbi singkong varietas Sao pedro petro.
 BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
2.1 Singkong
Singkong (Manihot esculenta Crantz) merupakan salah satu sumber
karbohidrat lokal Indonesia yang menduduki urutan ketiga terbesar setelah padi
dan jagung. Tanaman tersebut merupakan bahan baku yang paling potensial untuk
diolah menjadi tepung. Singkong segar mempunyai komposisi kimiawi kadar air
sekitar 60%, pati 35%, serat kasar 2,5%, kadar protein 1%, kadar lemak 0,5%,
kadar abu 1% dan merupakan sumber karbohidrat juga serat pakan, namun sedikit
kandungan proteinnya (Prabawati, 2011).
Menurut Bargumono (2013), dalam sistematika (taksonomi) tanaman
ketela pohon jenis ini diklasifikasikan sebagai berikut:
Kingdom : Plantae
Subkingdom : Tracheobionta
Super Division : Spermatophyta
Division : Magnoliophyta
Class : Magnoliopsida
Sub Class : Rosidae
Ordo : Euphorbiales
Family : Euphorbiaceae
Genus : Manihot
Species : Manihot esculenta crantz

Gambar 1. Umbi Tanaman Singkong

3
 4

2.2 Kandungan Metabolit Sekunder

Metabolit sekunder merupakan senyawa yang disintetis oleh tumbuhan,
mikrobia atau hewan melalui proses biosintetis untuk menunjang kehidupan yang
sifatnya tidak vital yang memiliki aktifitas biologi dan farmakologi (Saifudin,
2014). Menurut Robinson (1991) alasan lain melakukan fitokimia adalah untuk
menentukan ciri senyawa aktif penyebab efek racun atau efek yang bermanfaat,
yang ditunjukan oleh ekstrak tumbuhan kasar bila diuji dengan sistem biologis.
Pada beberapa literatur, menunjukkan profil fitokimia pada (Manihot esculenta
Crantz) menunjukkan adanya flavonoid, alkaloid, tanin, phenol, triterpenoid.
Tabel 1. Profil fitokimia tanaman genus Manihot
Golongan Bagian
No Spesies Asal Pustaka
Senyawa Tanaman
1 Flavonoid Batang Indonesia Rashaet al., 2014
2 Tanin
3 Manihot Phenol Batang Filipina Cesar et al., 2011

escluenta Chaturvedula et al.,

4 Triterpenoid Batang Brazil
Crantz 2003

5 Alkaloid Daun Indonesia Hasim et al., 2016

6 Fenolik

2.2.1 Flavonoid
Senyawa flavonoid merupakan kumpulan senyawa polifenol dengan
aktivitas antioksidan yang cukup tinggi. Flavonoid tersusun dari 15 atom karbon
yang memiliki struktur C6-C3-C6. Senyawa ini meiliki ikatan gula yang disebut
glikosida. Senyawa induk atau senyawa utama nya disebut aglikon yang berikatan
dengan berbagai gula dan sangat mudah terhidrolisis atau mudah terlepas dari
gugus gulanya (Hernani dan Rahardjo, 2006; Vermerris, W. and Nicholson, R.
2006) Senyawa turunan flavonoid berhasil diisolasi dari tanaman genus Manihot.
Distribusi senyawa yang telah diisolasi dari tanaman genus Manihot di
tunjukkan pada tabel 2.
 5

Tabel 2. Distribusi senyawa flavonoid pada tanaman genus Manihot

Nama Senyawa Spesies Bagian Asal Pustaka
tanaman
Quercetin 3- Manihot Daun India Sankara et
rhamnosylglucoside (1) utilissima Pohl. al., 1971
= ( M. esculenta
Crantz.)
(+)-Catechin (2)
(+)-Gallocatechin (3) Manihot Akar Inggris Buschmann
esculenta et al., 2000
(+)-Catechin gallate a(4)
Quercetin 3-O-
glucopyranoside (5)
Myricetin 3-O-rutinoside
(6)
Robinin (7) Manihot Daun Cina Tao et al.,
esculenta 2019
Crantz
Rutin (8)
Ishorhamnetin-3-O-
rutinoside (9)

(1) (2) (3)

(4) (5) (6)

 6

(7) (8) (9)

Gambar 2 . Struktur senyawa turunan flavonoid dari tanaman genus

Manihot (Buschmann et al., 2000; Tao et al., 2019)

2.2.2 Terpenoid
Senyawa terpen, pada awalnya merupakan suatu golongan senyawa yang
hanya terdiri dari atom C dan H, dengan perbandingan 5 : 8 dengan rumus empiris
C5H8 (unit isoprena), yang bergabung secara head to tail (kepala ekor). Oleh sebab
itu senyawa terpen lazim disebut isoprenoid. Terpen dapat mengandung dua, tiga
atau lebih suatu isoprena. Molekul-molekulnya dapat berupa rantai terbuka atau
siklik. Senyawa tersebut dapat mengandung ikatan rangkap, gugus hidroksil,
gugus karbonil atau gugus fungsional lain. Struktur mirip yang mengandung
unsur-unsur lain disamping C dan H disebut terpenoid. Dewasa ini baik terpen
maupun terpenoid dikelompokkan sebagai senyawa terpenoid (isoprenoid).
Senyawa turunan terpenoid berhasil diisolasi dari tanaman genus manihot.
Distribusi senyawa yang telah diisolasi dari tanaman genus Manihot bagian
batang menurut Pan et al (2015) terdapat beberapa senyawa yaitu, ergosterol
peroxide (10), β-sitosterol 3-O-β-D-glucopyranoside (11), E)-coniferaldehyde
(12), 7-O-ethylguaiacylglycerol (13), Indolal (14), 8-oxo-pinoresinol (15),
pinoresinol (16), Syringaresinol (17), Maesculentin A (18), Maesculentin B (19).
 7

(10) (11)

(12) (13) (14)

(15) (16) (17)

(18) (19)

Gambar 3. Struktur senyawa turunan terpenoid dari tanaman genus Manihot

(Wang et al., 2013; Pan et al., 2015; Mir et al., 2009)
 8

2.2.3 Fenolik
Senyawa Fenolik adalah senyawa yang memiliki satu atau lebih gugus
hidroksil yang menempel pada cincin aromatik. Senyawa fenolik terbentuk dari
jalur metabolisme asam sikimat dan fenil propanoid (Proestos, Sereli, dan
Komaitis, 2006). Senyawa fenolik dari tanaman mempunyai beberapa efek, yaitu
antioksidan, antiinflamasi, antiproliferasi, antimutagenik, antimikrobial,
antikarsinogenik, dan pencegahan terhadap penyakit jantung (Ghosh dan Konishi,
2007).
Senyawa turunan fenolik berhasil diisolasi dari tanaman genus Manihot.
Distribusi senyawa yang telah diisolasi dari tanaman genus Manihot di tunjukkan
pada tabel 3.
Tabel 3. Distribusi senyawa fenolik pada tanaman genus Manihot
Nama Senyawa Spesies Bagian Asal Pustaka
tanaman
Rutin (20)
Kaempferol 3’-O- Manihot utilissima Daun Nigeria Ola et al.,
rutinoside (21) Pohl 2009
Ferulic acid (22)
Amentoflavone (23)
ent-beyerane (24)
ent-pimarane (25) Manihot esculenta Akar Philiphine Sakai et
al., 1986
ent-atisane (26)
ent-kaurane (27)

(20) (21) (22)

 9

(23) (24) (25)

(26) (27)

Gambar 4. Struktur senyawa turunan fenolik dari tanaman genus Manihot

(Sakai, et al. 1986; Ola et al., 2009)

2.2.4 Alkaloid
Harborne dan Turner (1984) mengungkapkan bahwa tidak satupun definisi
alkaloid yang memuaskan, tetapi umumnya alkaloid adalah senyawa metabolit
sekunder yang bersifat basa yang mengandung satu atau lebih atom nitrogen
biasanya dalam cincin heterosiklik dan bersifat aktif biologis menonjol. Alkaloid
menurut Wintersteindan Tirer didefinisikan sebagai senyawa yang bersifat basa,
mengandung atom nitrogen berasal dari tumbuhan dan hewan. Distribusi senyawa
alkaloid pada tanaman genus Manihot dan family Euphorbiaceae yang telah
diisolasi menurut Gupta et al., 2011 pada batang Jatropha curcas (Family
Euphorbiaceae) terdapat senyawa alkaloid atherospermidine (JC1) (28).
 10

(28)
Gambar 5. Struktur senyawa turunan alkaloid dari tanaman Family
Euphorbiaceae (Gupta et al., 2011)

2.2.5 Steroid
Steroid merupakan terpenoid lipid yang dikenal dengan empat cincin
kerangka dasar karbon yang menyatu. Struktur senyawanya pun cukup beragam.
Perbedaan tersebut disebabkan karena adanya gugus fungsi teroksidasi yang
terikat pada cincin dan terjadinya oksidasi cincin karbonya (Samejo et al., 2013).
Berdasarkan sumbernya steroid dibedakan atas steroid sisntetis dan alami. Steroid
sintetis yang umum digunakan adalah glukokortikosteroid, estrogen,
metilprednisolon, kortikosteroid, androgen, squalamine dan hydrocortisone.
Senyawa ini juga digunakan untuk pengobatan penyakit akibat kelebihan atau
kekurangan hormon, penyakit berbahaya serta penyakit lainnya seperti radang
sendi dan alergi (Bhawani et al., 2011). Distribusi senyawa steroid pada tanaman
Manihot esculenta menurut Sakai et al., 1986 pada bagian akar terdapat senyawa
Stigmasterol (29), Campesterol (30), Cholesterol (31), β-Sitosterol (32),
Campest-4-en-3-one (33), Stigmasta-4-en-3-one (34), Stigmasta-4,22-dien-3-one
(35), Stigmasta-4,6-dien-3-one (36).

(29) (30) (31)

 11

(32) (33) (34)

(35) (36)
Gambar 6. Struktur senyawa turunan steroid pada tanaman genus Manihot (Sakai
et al., 1986)

2.2.6 Tanin
Tanin merupakan salah satu senyawa metabolit sekunder yang terdapat
pada tanaman dan disintesis olehtanaman (Jayanegara dan Sofyan, 2008). Tanin
merupakan senyawa yang mempunyai berat molekul 500-3000 dan mengandung
sejumlah besar gugus hidroksi fenolik yang memungkinkan membentuk ikatan
silang yang efektif dengan protein dan molekul- molekul lain seperti polisakarida,
asam amino, asam lemak dan asam nukleat (Fahey dan Berger,1988).
Tanin dibagi menjadi dua kelompok yaitu tanin yang mudah terhidrolisis
dan tanin terkondensasi. Tanin yang mudah terhidrolisis merupakan polimer gallic
dan ellagic acid yang berikatan ester dengan sebuah molekul gula, sedangkan
tanin terkondensasi merupakan polimer senyawa flavonoid dengan ikatan karbon-
karbon berupa cathecin dan gallocathecin (Patra dan Saxena, 2010).
Distribusi senyawa tanin pada tanaman genus Manihot spesies Euphorbia
heterophylla L (Family Euphorbiaceae) yang telah diisolasi dari bagian daunnya
yaitu Dehydroellagitannins geraniin (37), Phyllantusiin D (38), 1,2,3,4,6-penta-
O-galloyl-β-Dglucopyranoside (39) (Yoshida et al., 1992).
 12



(37) (38) (39)

Gambar 7. Struktur senyawa turunan tanin pada tanaman Family Euphorbiaceae

(Yoshida et al., 1992)

2.3 Aktifitas Biologis pada tanaman genus Manihot

Tanaman genus Manihot merupakan kelompok tanaman yang memiliki
beberapa senyawa yang bermanfaat bagi kehidupan. Salah satunya bermanfaat
untuk aktivitas biologi. Liangcheng et al., 1995 menyatakan bahwa isolasi
umbi singkong memiliki kandungan senyawa bioaktif glukosida sianogenik
yang terdiri dari linamarin 93% (2-β-D- glucopyranosyloxy-2-
methylpropanenitrile) dan lotaustralin 7% (2R)-2- β -D-glucopyranosyloxy-2-
methylbutyronitrile) yang dapat digunakan untuk terapi pengobatan kanker.
Nisa (2013) melaporkan bahwa pada daun Singkong (Manihot esculenta)
memiliki kandungan protein, vitamin C, flavonoid, saponin, tannin dan
triterpenoid. Quarenghi MV et al., 2000 juga melaporkan senyawa rutin di dalam
isolat daun singkong merupakan senyawa fenolik utama yang memiliki aktivitas
sebagai antibakteri.
 13

Tabel 4. Bioaktivitas dari tanaman genus Manihot

Spesies Bagian Bioaktivitas Asal Pustaka

Tanaman
M.esculenta Daun Antioksidan Indonesia Hasim et al.,
2016
M.esculenta Daun Antioksidan Indonesia Yuslinda et
al,. 2012
M.esculenta Daun Antibakteri Indonesia Basitet al.,2006

M.esculenta Daun Antibakteri Cina Quarenghi MV

et al., 2000
M.esculenta Daun Antikanker Indonesia Rizky et
al.,2017
M.esculenta Daun Antikanker Indonesia Yusuf et al.,
2006
M.esculenta Daun Antikanker Afrika Idibie et al.,
Selatan 2006
M.esculenta Daun Antibakteri Indonesia Indah et al.,
2017
M.esculenta Daun Antibakteri Indonesia Cik Mutia et
al.,2017
E. cyparissias Batang Antioksidan Serbia Milan et.,
al.2014

2.4 Karakterisasi Senyawa Murni

Pada karakterisasi senyawa murni senyawa organik, biasanya dilakukan

menggunakan beberapa alat instrumen spektroskopi. Seperti NMR, MS, dan IR.

2.4.1 Nuclear Magnetic Resonance (NMR)

Nuclear Magnetic Resonance (NMR) penerapannya tidak terbatas dari

senyawa organik yang sederhana tetapi hingga ke biopolimer yang sangat
komplek seperti protein dan asam nukleat. NMR berhubungan dengan sifat
 14

magnet dari inti atom. Spektroskopi NMR didasarkan pada penerapan gelombang
radio oleh inti tertentu dalam molekul organik, bila molekul ini berada dalam
magnet yang sangat kuat dan homogen. Mempelajari molekul senyawa organik
secara spektroskopi resonansi magnet inti akan memperoleh gambaran perbedaan
sifat magnet dari berbagai inti yang ada dan untuk menduga letak inti tersebut
dalam molekul. Dari spektra resonansi magnet inti proton (RMP atau H-NMR),
akan diperoleh informasi tentang jenis hidrogen, jumlah hidrogen dan lingkungan
hidrogen dalam suatu senyawa begitu halnya dengan spektra resonansi magnet inti
karbon (RMC atau C-NMR). (Supratman, 2010)

Gambar 8. Skema Kerja Nuclear Magnetic Resonance

Inti-inti atom unsur-unsur dapat dikelompokkan sebagai mempunyai spin
atau tidak mempunyai spin. Suatu inti berspin akan menimbulkan medan magnet
kecil, yang ditunjukkan oleh suatu momen magnet nuklir, berupa suatu vektor.
Setiap inti (hidrogen atau karbon) mempunyai perbedaan momen magnetnya
dengan momentum angularnya, karena setiap inti mempunyai perbedaan muatan
dan massa.

Pada recorder NMR di hasilkan spektrum NMR, yaitu grafik dari

banyaknya energi yang diserap versus kuat magnet. Jika kedua medan tersebut (B o
dan Bupf) berlawanan satu terhadap yang lainnya, maka diperlukan Bo yang lebih
besar untuk membawa inti tersebut dalam resonansi. Dalam hal ini, proton atau
karbon tersebut dikatakan terperisai (shielded) atau diamagnetik dan serapannya
terletak diatas medan (upfield) dalam spektrum NMR. Jika kedua medan tersebut
searah, diperlukan Bo yang lebih rendah untuk membawa inti ke dalam resonansi.
Proton atau karbon tersebut dikatakan tak terperisai (deshielded) atau
 15

paramagnetik dan serapannya muncul dibawah medan (downfield) dalam

spektrum NMR. (Supratman,2010)

2.4.2 Spektrometri Inframerah

Spektrum inframerah suatu molekul adalah hasil transisi antara tingkat
energi getaran (vibes) atau osilasi (oscillation), dengan cara serupa dengan dua
bola yang terikat oleh suatu pegas. Bila molekul menyerap radiasi inframerah,
energi yang diserap menyebabkan kenaikan dalam amplitudo getaran atom-atom
yang terikat itu. Jadi molekul ini berada dalam keadaan vibrasi tereksitasi, yaitu
energi yang diserap ini akan dibuang dalam bentuk panas bila molekul itu kembali
ke keadaan dasar. Panjang gelombang eksak dari absorpsi oleh suatu tipe ikatan,
bergantung pada macam getaran dari ikatan tersebut. Oleh karena itu, tipe ikatan
yang berlainan, menyerap radiasi inframerah pada panjang gelombang yang
berlainan. Dengan demikian spektrometri inframerah dapat digunakan untuk
mengidentifikasi adanya gugus fungsi dalam suatu molekul. Banyaknya energi
yang diserap juga beraneka ragam dari ikatan ke ikatan. Ini disebabkan sebagian
oleh perubahan momen dipol pada saat energi diserap. Ikatan nonpolar
menyebabkan absorpsi lemah, sementara dengan ikatan polar menunjukkan
absorpsi yang lebih kuat. (Supratman, 2010)

Gambar 9. Skema kerja Spektrometri Inframerah

Cahaya tampak terdiri dari beberapa range frekuensi elektromagnetik yang

berbeda dimana setiap frekuensi bisa dilihat sebagai warna yang berbeda. Radiasi
inframerah juga mengandung beberapa range frekuensi tetapi tidak dapat dilihat
oleh mata. Pengukuran pada spektrum inframerah dilakukan pada daerah cahaya
inframerah tengah (mid-infrared) yaitu pada panjang gelombang 2.5 - 50 μm atau
 16

bilangan gelombang 4000 - 200 cm-1. Energi yang dihasilkan oleh radiasi ini
akan menyebabkan vibrasi atau getaran pada molekul. Pita absorbsi inframerah
sangat khas dan spesifik untuk setiap tipe ikatan kimia atau gugus fungsi. Metoda
ini sangat berguna untuk mengidentifikasi senyawa organik dan organometalik.
Sebagai sumber cahaya yang umum digunakan adalah lampu tungsten, Narnst
glowers, atau glowbars. Dispersi spektrofotometer inframerah menggunakan
monokromator, yang berfungsi untuk menyeleksi panjang gelombang.
(Dachriyanus, 2004)

2.4.3 Spektroskopi Massa

Dalam sebuah spektrometer, suatu sampel dalam keadaan gas dengan
elektron berenergi cukup untuk mengalahkan potensial ionisai pertama senyawa
tersebut (potensial ionisasi kebanyakan senyawa organik antara 185-300
kkal/mol). Tabrakan antara sebuah molekul organik dan salah satu elektron
berenergi tinggi menyebabkan lepasnya sebuah elektron dari molekul itu dan
terbentuknya suatu ion organik. Ion organik yang dihasilkan oleh penembakan
elektron berenergi tinggi tersebut tidak stabil dan pecah menjadi fragmen kecil,
baik berbentuk radikal bebas maupun ion-ion lain. Dalam sebuah spektrometer
massa yang khas, fragmen yang bermuatan positif ini akan dideteksi. Spektrum
massa adalah alur kelimpahan jumlah relatif fragmen bermuatan positif berlainan
versus massa permuatan (m/z atau m/e) dari fragmen-fragmen tersebut. Muatan
ion dari kebanyakan partikel yang dideteksi dalam suatu spektrometer massa
adalah +1; maka nilai m/z sama dengan massa molekulnya (M). Bagaimana suatu
molekul atau ion pecah menjadi fragmen-fragmennya bergantung pada kerangka
karbon dan gugus fungsional yang ada. Oleh karena itu, struktur dan massa
fragmen memberikan petunjak mengenai struktur molekulinduknya. Juga
seringkali untuk menentukan bobot molekul suatu senyawa dari spektrum
massanya. (Supratman, 2010)
 17

Gambar 10. Skema kerja Spektroskopi Massa

Jika suatu benda yang bergerak lurus diberi tenaga dari luar, maka
gerakannya tidak akan lurus lagi seperti biasanya karena akan terjadi defleksi atau
perubahan arah. Besarnya perubahan arah ini tergantung dari massa benda yang
bergerak itu. Jika kita mengetahui besar benda yang bergerak, kecepatannya, dan
jumlah tenaga luar yang diberikan; maka kita bisa menghitung massa benda
tersebut. Makin besar perubahan arah gerak, makin ringan benda tersebut. Prinsip
ini bisa diaplikasikan dalam menentukan massa suatu molekul. Gerakan suatu
atom atau molekul bisa didefleksikan oleh medan magnet. Agar bisa dipengaruhi
oleh medan magnet maka atom atau molekul ini harus diubah menjadi bentuk ion.
Partikel yang bermuatan dapat dipengaruhi oleh medan magnet sedangkan yang
tidak bermuatan tidak dipengaruhi. (Dachriyanus, 2004)
 BAB III
BAHAN DAN METODE

3.1 Waktu dan Tempat Pelaksanaan

Penelitian ini dilakukan dari bulan Agustus 2019 hingga Februari 2020.
Tempat penelitian di Laboratorium Penelitian Fakultas Matematika dan Ilmu
Pengetahuan Alam Universitas Pakuan, Bogor, Laboratorium Kimia Organik
Bahan Alam, Lab Sentral Universitas Padjadjaran, Bandung, dan Lembaga Ilmu
Pengetahuan Indonesia (LIPI), Serpong.
3.2 Alat dan Bahan
Alat-alat yang digunakan antara lain: corong pisah 500ml, evaporator, pipa
kapiler, pipet tetes, pipet volume, labu alas bulat, neraca, piala gelas 1000 ml, gelas
ukur 1000 ml, gelas ukur 100 ml, labu kocok 250 ml, labu didih, toples, vial, sonikasi,
corong , kromatografi vakum cair, kromatografi kolom, pinset, kromatografi lapis
tipis (KLT), sinar UV, chamber, statif, Nuclear Magnetic Resonance (NMR),
Spektrometri Inframerah, dan Spektroskopi Massa.
Bahan-bahan yang digunakan antara lain: Umbi singkong Var. Sao Pedro
Petro (Manihot escluenta Crantz), n-heksana, etil asetat, kloroform, aseton, n-
butanol, metanol, dan metilena klorida (MTC), silika gel G 60, silika gel 70-230
mesh, silika gel 230-400 mesh, Plat silika gel GF 254 (0,25 mm) dan ODS, Pereaksi
penampak noda asam sulfat 10% dalam etanol, vanilin sulfat 75% dalam etanol
dan reagen ehrlich’s.
3.3 Metode Penelitian
Penelitian ini melalui berbagai tahapan yaitu diawali dengan sampling
singkong di daerah Desa Cibereum Kecamatan Cisaruan Kabupaten Bogor Jawa
Barat. Kemudian dilakukan ekstraksi, fraksinasi menggunakan 3 fraksi yaitu,
fraksi n-heksana, fraksi etil asetat, dan fraksi n-butanol, dan isolasi umbi singkong
Var. Sao Pedro Petro yang kemudian di cek dengan menggunakan instrumen
Nuclear Magnetic Resonance (NMR), Spektrometri Inframerah, dan Spektroskopi
Massa.
3.3.1 Persiapan Simplisia Uji

18
 19

Umbi singkong sebanyak 115 kg dikupas dan dibersihkan dengan dicuci,

kemudian dihaluskan. Singkong yang sudah halus kemudian dimaserasi dengan
menambahkan etanol teknis 96% dengan perbandingan 1:1. Maserasi dilakukan
selama 3 x 24 jam. Campuran singkong halus dengan etanol hasil maserasi tsb
disaring, kemudian hasil daari maserasi tersebut dipekatkan dengan rotary
evaporator pada suhu 40◦C. Hasil dari ekstrak kemudian dimasukkan ke dalam
vial dan ditimbang.
3.3.2 Ekstraksi dan Fraksinasi Umbi Singkong
Hasil maserasi yang sudah dipekatkan merupakan ekstrak etanol,
kemudian dilarutkan dengan air dengan perbandingan 1:1 (v/b). Selanjutnya
dilakukan partisi di dalam corong pisah dengan menambahkan n-heksana
kemudian didiamkan sampai terpisah menjadi 2 fase, fase air dan fase n-heksana,
dilakukan sebanyak 3x sampai hasil pemisahan fase n-heksana menjadi bening
kemudian di pekatkan pada rotary evaporator dan jadilah fraksi n-heksana. Hasil
fraksi dimasukkan ke vial dan ditimbang.
Kemudian hasil residu di partisi dengan Etil asetat hingga terbentuk 2 fasa
juga yaitu, fasa air dan fasa etil asetat, dilakukan dengan perbandingan yang sama
beberapa kali sampai fasa etil asetat menjadi bening, kemudian fasa etil asetat
dipekatkan dengan rotary evaporator sampai mengental, hasilnya merupakan
fraksi etil asetat, dimasukkan ke vial dan ditimbang.
3.3.3 Isolasi Hasil Ekstraksi Umbi Singkong Fraksi Etil Asetat
Dari hasil ekstraksi yang menghasilkan fraksi Etil asetat, kemudian
dilakukan isolasi untuk mendapatkan senyawa metabolit sekunder yang terdapat
dalam umbi singkong. Isolasi dilakukan menggunakan kromatografi kolom.
Metode kromatografi pertama yang dilakukan yaitu pemisahan menggunakan
kromatografi kolom gradien dengan berbagai eluen, Dimulai dari etil asetat : n-
heksana (5:5) (6:4) (7:3) (8:2) (9:1) (10:0), Etil asetat : metanol (9:1) (8:2) (7:3)
(6:4) (5:5) (4:6) (3:7) (2:8) (1:9), dan metanol 100%. Dengan volume sebanyak
300mL pada tiap perbandingan eluen, menghasilkan 16 fraksi yang kemudian
dipekatkan pada Rotary evaporator dan dicek hasilnya pada KLT. Selanjutnya
dilakukan kromatografi kolom isokratis atau gradien kembali dengan memilih
berbagai macam eluen, dengan cara melihat hasil KLT dari hasil ekstraksi fraksi,
 20

pertama menggunakan eluen n-heksana : etil asetat karena dipilih eluen dari yang
paling non polar terlebih dahulu untuk mengetahui eluen yang cocok digunakan
yang dapat menarik dan memisahkan senyawa yang ada pada sampel, karena
kebanyakan metabolit sekunder merupakan senyawa non polar, digunakan eluen
n-heksana : Etil asetat menggunakan perbandingan (5:5 ; 4:6 ; 3:7 ; 2:8 ; 1:9; 0:1)
dilanjutkan menggunakan eluen Etil asetat : Metanol dengan perbandingan (9:1 ;
8:2 ; 7:3 ; 6:4 ; 5:5 ; 4:6 ; 3:7 ; 2:8 ; 1:9 ; 0:1) sebanyak 300 ml di setiap
perbandingannya. Dimana didalam kromatografi kolom digunakan silika gel 60.
Sebanyak 16 fraksi hasil isolat dari kromatografi kolom gradien yang pertama
dipekatkan kembali dengan menggunakan rotary evaporator, kemudian di cek
dengan menggunakan KLT dengan eluen yang sama yaitu n-heksana : Etil asetat.
Selanjutnya hasil isolat tersebut di kromatografi kolom kembali dengan
kromatografi kolom yang lebih kecil ukurannya dan menggunakan 2 silika gel
dengan nomor yang berbeda yaitu 7734 dan 9385. Setelah di dapat hasil isolat,
kemudian di cek dengan menggunakan kromatografi lapis tipis untuk dilihat noda
dari isolat tersebut, apabila hasil isolat masih belum murni, maka dilakukan
kembali kromatografi kolom dengan eluen yang berbeda. Senyawa murni ditandai
dengan hanya ada 1 noda pada hasil KLT.
3.3.4 Karakterisasi Senyawa Murni
Hasil isolasi kromatografi kolom yang telah murni, kemudian
dikarakterisasi menggunakan berbagai alat spektroskopi untuk mengidentifikasi
senyawa murni yang terkandung. Pada penelitian ini, isolat murni dicek
menggunakan beberapa alat spektroskopi, diantaranya sebagai berikut.
3.3.4.1 Spektroskopi Massa
Sampel dimasukkan, diuapkan, dan diumpankan dalam suatu aliran yang
berkesinambungan ke dalam kamar pengionan. Kamar pengionan (juga instrumen
keseluruhan) dijaga agar tetap dalam keadaan vakum untuk meminimalkan
tabrakan dan reaksi antara radikal, molekul udara, dan lain-lain. Di dalam kamar
ini, sampel melewati suatu aliran elektron berenergi tinggi yang menyebabkan
ionisasi beberapa molekul sampel menjadi ion-ion molekul. Setelah terbentuk,
sebuah ion molekul dapat mengalami fragmentasi dan penataan ulang. Proses-
proses ini berjalan sangat cepat (10-10 – 10-6 detik). Dalam beberapa hal, ion
 21

molekul terlalu pendek usianya sehingga tidak dapat dideteksi, dan hanya produk-
produk fragmentasinya yang menunjukkan puncak.
3.3.4.2 Spektrometer Inframerah
Kemudian hasil isolat murni tersebut juga dilakukan pengecekkan dengan
menggunakan spektrometer IR sebagai data pendukung, dimana bertujuan untuk
mengetahui informasi gugus fungsi pada senyawa organik.
Jika suatu frekuensi tertentu dari radiasi inframerah dilewatkan pada
sampel suatu senyawa organik maka akan terjadi penyerapan frekuensi oleh
senyawa tersebut. Bubuk Kbr dan sedikit kristal dihaluskan menggunakan mortar
hingga halus, kemudian sampel dimasukkan ke dalam holder. Jika alat telah ready
sampel lalu dimasukan kedalam alat dan mulai dideteksi. Melalui detektor sampel
akan dideteksi frekuensi IR dari tiap senyawa.
3.3.4.3 Nuclear Magnetic Resonance (NMR)
Hasil isolat yang didapat dengan menggunakan kromatografi kolom
kemudian di cek menggunakan NMR, dimana bertujuan untuk mengetahui
informasi tentang struktur senyawa secara keseluruhan.
Isolat murni dilarutkan dengan aseton-d6 lalu diinjeksikan pada tabung
NMR. Medan magnet yang digunakan sebesar 500 MHz untuk proton, 125 MHz
untuk carbon, dan 135 MHz untuk DEPT. Yang kemudian akan memunculkan
spektrum sampel dengan pergeseran karbon dan hidrogen yang telah terbaca.
 BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN

Isolasi ekstrak umbi singkong (Manihot esculenta Crantz) var. Sao pedro
petro fraksi etil asetat bertujuan untuk mengidentifikasi senyawa aktif metabolit
sekunder. Dimana 115kg umbi singkong dilakukan maserasi dimana maserasi
dipilih agar meminimalisir kerusakan pada komponen, kemudian hasil dari
maserat yang diperoleh sebanyak 1575,4 gram dilakukan fraksinasi dengan n-
heksana dan etil asetat yang kemudian didapat hasil fraksinasi dari fraksi etil
asetat sebanyak 7,0043 gram dengan rendemen 0,0061%. Hasil tersebut kemudian
dilakukan pemisahan dengan teknik kromatografi untuk mendapatkan isolat
murni. Setelah mendapatkan isolat murni yang diindikasikan senyawa aktif, isolat
dikarakterisasi dengan berbagai metode spektroskopi NMR, IR, dan MS. Hasil
dari penelitian ini membuktikan bahwa senyawa aktif metabolit sekunder dapat
dielusidasi berdasarkan hasil karakterisasi yang didapat dari berbagai metode
spektroskopi.
4.1 Hasil Ekstraksi dan Fraksinasi Umbi Singkong
Ekstraksi umbi singkong (Manihot esculenta Crantz) var. Sao pedro petro
dilakukan secara maserasi dan partisi. Maserasi bertujuan untuk menghindari
terjadinya kerusakan komponen senyawa organik didalamnya. Umbi singkong
dicuci hingga bersih bertujuan untuk menghilangkan pengotor, kemudian
dipotong-potong dan dihaluskan untuk mempermudah pelarut menarik senyawa
aktif pada umbi singkong tersebut. Maserasi dilakukan menggunakan etanol 96%
dengan perbandingan (1:1). Maserat atau ekstrak kental etanol yang diperoleh
yaitu 1575,4 gram dengan nilai rendemen 1,37%. Ekstrak kental etanol kemudian
dilakukan fraksinasi yaitu dipartisi dengan ekstraksi cair-cair menggunakan
pelarut n-heksana-air (1 : 1). Penggunaan pelarut n-heksana agar senyawa aktif
non polar dapat terdistribusi, sehingga ekstrak kental n-heksana diperoleh
sebanyak 11,0238 gram dengan nilai rendemen 0,0096%. Fraksi air yang tersisa
dipartisi kembali dengan menggunakan pelarut etil asetat (1 : 1). Penggunaan
pelarut etil asetat agar senyawa aktif semi polar dapat terdistribusi, sehingga
ekstrak kental etil asetat yang diperoleh sebanyak 7,0043 gram dengan nilai

22
 23

rendemen 0,0061%. Hasil rendemen masing-masing esktrak disajikan dalam tabel

5.
Tabel 5. Hasil rendemen ekstrak etanol, n-heksana, dan etil asetat umbi singkong
Ekstrak Kental (g) Rendemen (%)
Ekstrak Etanol 1575,4 1,37
Fraksi n-heksana 11,0238 0,0096
Fraksi Etil asetat 7,0043 0,0061

Berdasarkan hasil rendemen, senyawa yang terdapat pada ekstrak etanol

lebih banyak yaitu 1,37 %. Hal ini memungkinkan lebih banyak senyawa yang
terdistribusi pada ekstrak etanol dari pada senyawa yang lain. Hasil rendemen
ekstrak n-heksana lebih besar dari pada etil asetat yaitu sebanyak 0,0096%.
Sementara hasil rendemen ekstrak etil asetat didapat yang paling sedikit yaitu
0,0061%. Hal ini memungkinkan bahwa senyawa aktifnya lebih banyak yang
polar dan semi polar dari pada senyawa non polar.
4.2 Hasil Isolasi Ekstrak Umbi Singkong Fraksi Etil Asetat
Isolasi ekstrak umbi singkong yang pertama dilakukan dengan
menggunakan metode pemisahan kromatografi kolom gradien dengan
menggunakan eluen etil asetat : n-heksana (5:5) (6:4) (7:3) (8:2) (9:1) (10:0), Etil
asetat : metanol (9:1) (8:2) (7:3) (6:4) (5:5) (4:6) (3:7) (2:8) (1:9), dan metanol
100%. Dengan volume sebanyak 300mL pada tiap perbandingan eluen,
menghasilkan 16 fraksi yang kemudian dipekatkan pada Rotary evaporator dan
dicek hasilnya pada KLT. Isolasi pada kromatografi kolom dilakukan untuk
memisahkan senyawa berdasarkan tingkat kepolarannya dengan teknik pemisahan
menggunakan fase diam dan fase gerak. Pada fraksi Etil Asetat (EA) dihasilkan
16 fraksi. Yaitu Fraksi 1-16 dengan hasil KLT sebagai berikut :

Sinar UV 254nm Sinar UV 365nm

Noda fraksi 1-8

 24

Noda fraksi 9-16 Noda fraksi 1-8 Noda fraksi 9-16

Gambar 11. Hasil KLT 16 Fraksi Etil asetat
Dari hasil KLT ke 16 fraksi tersebut menggunakan eluen n-heksana : etil
asetat (1:1), dapat dilihat bahwa ada beberapa fraksi yang memiliki noda sama,
sehingga dapat dianggap bahwa senyawa yang terkandung pada fraksi tersebut
merupakan senyawa aktif yang sama. Maka dari itu, dibuat beberapa
penggabungan fraksi menjadi seperti pada tabel dibawah ini :
Tabel 6. Data Fraksi dan Eluennya
Fraksi EA Nomor Fraksi Eluen
A 1-2 Hex : MTC (7:3)
B 3 Hex : EA (8:2)
C 4 Hex : EA (7:3)
D 5 MTC : EA (gradien)
E 6-7 MTC : EA (gradien)
F 8 Hex : EA (1:9)
G 9a Hex : EA (gradien)

Kemudian dilakukan pemisahan menggunakan kromatografi kolom pada

masing-masing fraksi tersebut, menggunakan eluen yang sudah ditentukan, yang
dapat dilihat dari hasil KLT sebelumnya. Dari hasil isolasi menggunakan
kromatografi kolom tersebut, dari setiap fraksi menghasilkan isolat rata-rata
hingga lebih dari 100 vial yang ditampung dalam vial kecil. Karna dari setiap
fraksi dilakukan pemisahan dengan eluen sebanyak yang sesuai dengan
perhitungan dan perkiraan banyaknya senyawa yang terlihat pada hasil KLT
sebelum fraksi tersebut dilakukan kromatografi kolom. Berikut data hasil
banyaknya vial dan isolat dari fraksi A-G yang ditampilkan dalam tabel 7.
Tabel 7. Hasil isolat dari fraksi EA A-G
Fraksi EA Eluen (mL) Jumlah Vial
A 500 243
B 150 85
C 300 108
D 255 80
E 105 21
F 400 265
G 500 317
 25

Kemudian hasil isolat tersebut di cek kembali menggunakan KLT dengan

perbandingan eluen dari eluen pada saat dilakukan kromatografi kolomnya.
Apabila terdapat hasil kolom isokratik ataupun gradien yang belum murni, dapat
dilakukan pengulangan pemisahannya dengan menggunakan kromatografi kolom,
tetapi dibedakan pada saat penggunaan eluen. Pada fraksi A menghabiskan
banyak eluen karna dilakukan pengulangan pemisahan kembali, hingga akhirnya
mendapatkan isolat murni. Pada fraksi F, terdapat pengulangan pemisahan karna
pada saat pemisahan pertama belum murni, dan isolat yang didapatkan berupa
kristal putih, sehingga diputuskan untuk dilakukan pengulangan pemisahan, yang
kemudian diberi kode sampel F1 pada hasil pengulangannya. Dari berbagai fraksi
tersebut di dapat beberapa senyawa murni yang diamati dari hasil KLT,
diantaranya :

Fraksi A Fraksi B Fraksi C

Fraksi F Fraksi F1

Gambar 12. Hasil KLT Isolat murni

Dapat dilihat dari hasil KLT, bahwa jika pada plat KLT hanya
menunjukkan 1 totol noda, maka dapat diidentifikasi bahwa isolat tersebut
merupakan senyawa murni yang kemudian dapat di karakterisasi menggunakan
berbagai spektroskopi.

4.3 Hasil Karakterisasi Senyawa Murni

 26

Spektroskopi merupakan metode yang paling andal dalam penentuan

rumus molekul atau elusidasi struktur senyawaan organik. Penentuan rumus
molekul masih digunakan cara klasik melalui analisis elementer (elemental
analysis) yang akan memberikan data tentang jenis unsur dan perbandingan mol
atom-atom unsur penyusun molekul. Berdasarkan data tersebut maka dapat
disusun rumus empiris. Hasil isolat yang telah teridentifikasi senyawa murni dari
hasil KLT, kemudian dikarakterisasi menggunakan beberapa instrumen, hasil
isolat murni yang berhasil dicek dan diidentifikasi menggunakan Spektroskopi
Massa yaitu sampel dari Fraksi F1 EA dengan kode sampel EA 13 dan memiliki
bobot sebanyak 60,2 mg larut dalam metanol. Hasil karakterisasi menggunakan
beberapa instrumen diantaranya sebagai berikut:

4.3.1 Hasil Spektroskopi Massa

Hasil isolat murni yang berhasil dicek dan diidentifikasi menggunakan
Spektroskopi Massa yaitu sampel dari Fraksi F1 EA dengan kode sampel EA 13
dan memiliki bobot sebanyak 60,2 mg larut dalam metanol, spektoskopi massa
berguna untuk menunjukkan berat molekul suatu senyawa, data spektrum MS
terlihat pada gambar :

Gambar 13. Spektrum Massa Senyawa Murni EA 13

Pada spektrum menunjukkan terdapat 6 peak yang muncul, diantaranya
175,128; 265,154; 286,066; 288,367; 381,102; dan 425,183 m/z. Peak yang
muncul menunjukkan senyawa aktif yang terdapat pada sampel, waktu retensi
yang dihasilkan setiap peak berbeda karna merupakan senyawa yang berbeda.
Pada salah satu peak menunjukkan senyawa yang telah berhasil diisolasi dan
 27

menunjukkan puncak ion molekul atau fragmen [M+Na]+ pada 286,066 m/z dari
kalkulasi berat molekul sebenarnya yaitu 262,27 m/z yang merupakan bobot
molekul dari senyawa C11H21NO6 atau senyawa lotaustralin, didukung
berdasarkan hasil data HR-TOF-MS. Berikut data hasil HR-TOF-MS sampel
Fraksi F1 kode sampel EA13 :

286,066 m/z

Gambar 14. Spektrum HR-TOF-MS senyawa murni EA 13

4.3.2 Hasil Spektroskopi Inframerah
Hasil isolat murni yang berhasil dicek dan diidentifikasi menggunakan
Spektroskopi Inframerah yaitu sampel dari Fraksi F1 EA dengan kode sampel EA
13, spektoskopi Inframerah berguna untuk menunjukkan gugus fungsi suatu
senyawa, dimana data atau spektrum IR yaitu :

C¿C
C ≡N
CH
OH

Gambar 15. Spektrum IR senyawa murni EA 13

Pada spektrum diatas terdapat beberapa beberapa pita regangan yang
menunjukan gugus fungsi dari suatu senyawa. Dimana pada pita regangan 3379,11 cm-1
merupakan daerah serapan gugus hidroksil (‒OH) yang ditandai pula melandainya pita
regangan pada spektrum. Kemudian terdapat pita regangan 2931,13 cm -1 yang
 28

merupakan daerah serapan gugus metin (CH). Selanjutnya terdapat pita regangan
2242,31 cm-1 yang merupakan daerah serapan C ≡N. Kemudian terdapat pita regangan
1645,74 cm-1 yang merupakan daerah serapan gugus alkena (C¿C).

4.3.3 Hasil Spektroskopi NMR

Hasil isolat murni yang di identifikasi menggunakan NMR dan di elusidasi
yaitu Fraksi F1 dengan kode sampel EA 13 memiliki bobot sebanyak 60,2 mg
larut dalam metanol. NMR dapat mengidentifikasi struktur keseluruhan suatu
senyawa, pada penelitian ini data yang digunakan untuk mengidentifikasi sampel
senyawa murni dapat dilihat dari hasil spektrum 1H-NMR, 13C-NMR, dan DEPT.
Berdasarkan hasil data spektrum 1H-NMR senyawa murni Fraksi F1 Kode
sampel EA 13 (500 MHz larut dalam metanol) menunjukkan adanya proton dalam
suatu struktur molekul. Data yang dihasilkan berupa pergeseran kimia yang dapat
membantu mengidentifikasi suatu senyawa. Berdasarkan data yang didapat,
terdapat 2 proton yang terdapat pada pergeseran kimia (δ H) = 1,64 (s, 1H) dan
1,63 (s, 1H) yang mengindikasikan adanya gugus metil (CH3). Kemudian terdapat
2 proton yang terdapat pada pergeseran kimia (δ H) = 3,66 (t, 3H) dan 1,93 (t, 2H)
yang mengindikasikan adanya gugus etil (CH2). Selanjutnya, terdapat 5 proton
yang terdapat pada pergeseran kimia (δH) = 4,78 (s, 1H), 3,39 (d, 2H), 3,37 (s,
2H), 3,16 (d, 2H), dan 3,32 (d, 2H) yang mengindikasikan adanya gugus metin
(CH). Hasil tersebut dapat dibuktikan dari hasil data spektrum berikut ini :
 29

Gambar 16. Spektrum 1H-NMR senyawa murni EA 13

Selanjutnya, berdasarkan hasil data spektrum C-NMR senyawa murni

13

Fraksi F1 Kode sampel EA 13 (125 MHz larut dalam Metanol) menunjukkan

adanya carbon dalam suatu struktur molekul. Data yang dihasilkan juga berupa
pergeseran kimia yang dapat membantu mengidentifikasi struktur senyawa kimia.
Data hasil identifikasi sampel EA 13, terdapat 2 carbon yang terdapat pada
pergeseran kimia (δC) = 27,19 (q) dan 7,57 (q) yang mengindikasikan adanya
gugus metil (CH3). Kemudian terdapat 2 carbon yang terdapat pada pergeseran
kimia (δC) = 61,23 (t) dan 33,51 (t) yang mengindikasikan adanya gugus etil
(CH2). Selanjutnya, terdapat 5 carbon yang terdapat pada pergeseran kimia (δ C) =
99,84 (d), 76,62 (d), 76,55 (d), 73,41 (d), dan 71,36 (d) yang mengindikasikan
adanya gugus metin (CH). Kemudian, terdapat 2 carbon pada pergeseran kimia
(δC) = 120,88 (s) dan 74,96 (s) yang mengindikasikan adanya C quarterner (Cq).
Hasil tersebut dapat dibuktikan dari data 13C-NMR berikut :

Gambar 17. Spektrum 13C-NMR senyawa murni EA 13

Kemudian, berdasarkan hasil data spektrum DEPT senyawa murni Fraksi
F1 Kode sampel EA 13 (135 MHz larut dalam metanol) menunjukkan adanya
signal yang berasal dari inti karbon kuartener, CH, CH 2, dan CH3 dalam suatu
struktur molekul. Data yang dihasilkan juga berupa pergeseran kimia yang dapat
membantu mengidentifikasi struktur senyawa kimia. Dari data hasil spektrum
DEPT, dapat diketahui bahwa terdapat 2 signal positif dari metil (CH 3), kemudian
 30

terdapat 1 sinyal positif dari etil (CH 2), dan yang terakhir terdapat 5 sinyal positif
yang terindikasi dari metin (CH), dan 2 sinyal C quartener yang tidak terbaca pada
DEPT namun terdapat pada carbon. Data tersebut dapat dibuktikan dari hasil
spektrum DEPT berikut :

Gambar 18. Spektrum DEPT senyawa murni EA 13

Berdasarkan hasil elusidasi dari keseluruhan spektrum NMR yang didapat,
dapat diindikasikan, senyawa yang didapat bukanlah senyawa baru, melainkan
senyawa yang sudah biasa ditemukan di singkong, yaitu senyawa lotaustralin. Hal
tersebut diperkuat dari perbandingan data pergeseran kimia dari senyawa
lotaustralin yang sudah ada seperti yang di dapat oleh Akgul (2004) dalam isolasi
akar Rhodia Rosea. Perbandingan pergeseran kimia data spektrum NMRnya dapat
dilihat sebagai berikut :
Tabel 8. Tabel perbandingan senyawa murni EA 13 dan Senyawa
lotaustralin
Senyawa Murni EA 13 Senyawa Lotaustralin (akgul, 2004)
No C-NMR
13 1
H-NMR 13
C-NMR 1
H-NMR
1 120,88 s 121,55
2 74,96 s 76,68
3 27,19 q 1,64 (1H, s) 25,02 1,64 (3H, s)
4 33,51 t 1,93 (2H, d) 35,16 1,90 (2H, m)
5 7,57 q 1,63 (1H, s) 9,10 1,12 (6H, dd)
1` 99,84 d 4,78 (1H, s) 101,21 4,60 (1H, d)
2` 73,41 d 3,17 (2H, d) 75,18 3,25 (2H, t)
3` 76,62 d 3,39 (2H, d) 78,44 3,32 (6H, m)
4` 71,36 d 3,32 (2H, d) 71,79 3,32 (6H, m)
 31

5` 76,55 d 3,37 (1H, s) 78,39 3,40 (6H, m)

6` 61,23 t 3,66 (3H, t) 63,04 3,66 (2H, d)

Dari perbandingan data diatas, dapat dilihat kesamaannya, bahwa

pergeseran senyawa kimia pada sampel EA 13 sama dengan pergeseran senyawa
kimia Lotaustralin yang sudah diidentifikasi pada akar Rhodia rosea. Menurut
Akgul (2004), dari hasil data MS,IR, dan NMR dapat ditentukan struktur senyawa
kimianya sebagai berikut :

Gambar 19. Struktur Senyawa Lotaustralin

Senyawa lotaustralin merupakan senyawa glukosida sianogenik yang
sudah pernah ditemukan pada umbi singkong maupun akar tanaman Rhodia rosea
(akar emas). Lotaustralin merupakan senyawa glukosida sianogenik yang
merupakan turunan dari isoleucin (peifan, 2002). Rasio lotaustralin pada daun dan
umbi singkong sekitar 93:7 (de bruijn, 1973), sehingga sangat wajar apabila
senyawa lotaustralin yang berhasil diisolasi dan diidentifikasi. Senyawa
lotaustralin memiliki memiliki rumus molekul C11H21NO6 dan memiliki nama
IUPAC (R)-2-methyl-2((2S,3S,4S,5S)-3,4,5-trihydroxy-6-(hydroxymethyl)-
tetrahydro-2H-pyran-2 yloxy) butanenitrile. Senyawa lotaustralin memiliki
bioaktivitas glukosida sianogenik yang dapat digunakan sebagai antikanker
(Liangcheng et al., 1995)
 BAB V
KESIMPULAN DAN SARAN

5.1 Kesimpulan
Kesimpulan yang diperoleh dari penelitian ini adalah :
1. Pada fraksi Etil asetat umbi singkong (Manihot esculenta crantz) var. Sao
pedro petro terbukti terdapat senyawa metabolit sekunder.
2. Senyawa murni Fraksi F1 kode sampel EA 13 merupakan senyawa
lotaustralin yang diidentifikasi berdasarkan data hasil elusidasi spektroskopi
MS, IR, dan NMR. Senyawa lotaustralin merupakan senyawa golongan
glukosida sianogenik yang memiliki bioaktivitas sebagai antikanker.
5.2 Saran
Berdasarkan hasil penelitian, maka penulis dapat memberi saran yaitu:
1. Perlu dilakukannya uji fitokimia sebelum melakukan isolasi agar di dapatkan
hasil atau perkiraan senyawa yang lebih jelas.
2. Memiliki target senyawa yang diisolasi, sehingga pada saat penelitian dapat
lebih fokus dan tidak melebar dalam pekerjaannya.
3. Pada saat isolasi dan karakterisasi perlu dilakukan dengan simplisia yang
lebih banyak sehingga didapat senyawa murni yang lebih banyak juga.

32
 DAFTAR PUSTAKA

Akgul, Y., Ferreira, D., Abourashed, E., & Khan, I. 2004. Lotaustralin from
Rhodiola rosea roots. Fitoterapia, 75(6): 612-614.

Bargumono, H.M. dan Wongsowijaya, Suyadi. 2013. 9 Umbi Utama Sebagai

Pangan Alternatif Nasional. Yogyakarta: Leutika prio.

Basit, A., Sari, R., Luliana, S. 2006. Optimasi Aktivitas Antibakteri Rutin Daun
Singkong (Manihot esculenta Crantz)-Gentamisin Sulfat Terhadap Bakteri
Staphylococcus aureus. Pontianak: Prodi Farmasi, Fakultas Kedokteran,
Universitas Tanjungpura.

Bhawani, S.A., Sulaiman, O., Hashim, R., dan Ibrahim, M.N.M. 2011. Thinlayer
chromatographic analysis of steroids. Trop J Pharm Res. 9: 301-313.

Blagbrough Ian S., Soad A.L. Bayoumi, Michael G. Rowan, John R. Beeching.
2010. Cassava: An appraisal of its phytochemistry and its biotechnological
prospects. Phytochemistry. 71: 1940–1951

Bradbury, J. H., Egan, S. V and Lynch, M.J (1991). Analysis of cyanide in

cassava using acid hydrolysis of cyanogenic glucosides. Journal of Science
Food and Agiculture. 55: 277-290.

Budiyono, P. R.. 2017. Uji Toksisitas Ekstrak Daun Singkong (Manihot esculenta
Crantz) Terhadap Larva Artemia salina Leach dengan Metode Brine Shrimp
Lethality Test. Skripsi Jurusan Biologi FMIPA Universitas Negeri
Semarang.

Buschmann, H., Reilly, K., Rodriguez, M.X., Tohme, J., Beeching, J.R., 2000.
Hydrogen peroxide and flavan-3-ols in storage roots of cassava (Manihot
esculenta Crantz) during postharvest deterioration. J. Agric. Food. Chem.
48: 5522–5529

Cesar N. Tsumbu et. al. 2011. Antioxidant and Antiradical Activities of Manihot
esculenta Crantz (Euphorbiaceae) Leaves and Other Selected Tropical
Green Vegetables Investigated on Lipoperoxidation and Phorbol-12-
myristate-13-acetate (PMA) Activated Monocytes. Nutrient September.
3(9): 818-38.

Chaturvedula, Jennifer K. S., Stan Malone., Jan H Wisse, Marga CM, and David
G. I. 2003. New Cytotoxic Triterpene Acids from Aboveground parts of
Manihot Esculenta from the Suriname rainforest. Planta medica. 69(3): 271-
274.

Culbert, M. (1983). What the Medical Establishment Won’t Tell You That Could
Save Your Life. Virginia Beach: Donning Co In: Griffin, G.E. World
Without Cancer (1997) 24.

33
 34

David W. Armstrong, Stanley M. Martin, Hiroshi Yamazaki, 1983. “Production

of Ethyl Acetate from Dilute Ethanol Solutions by Candida
utilis”,Biologicaland Bioengineering, XXVI

De Bruijn, G. H. (1973). A study of cyanogenic character of cassava. In: B.

Nestel and R. MacIntyre Ed., chronic cassava toxicity, proceedings of an
interdisciplinary workshop.29-30 January London, IDRC, Ottawa
IDRCOIOe, 43-48.

D. Widiastuti, A.H. Mulyati, E. Herlina, S. Warnasih, Triastinurmiatiningsing dan

U. Supratman. 2018. Cytotoxic Effects of Cassava (Manihot esculeta
Crantz), Adira-2, Karikil and Sao Pedro Petro Varieties against P-388
Murine Leukemia Cells. Res. J. of Chemistry and Environment. 22: 206-
208.

D. Widiastuti, Supriatno Salam, Desi Haneti, Ronny Lesmana, Mohamad Azlan

Nafiah dan Unang Supratman. 2019. Flavonoid from the Sao Pedro Petro of
tubers of cassava (Manihot esculenta Crantz). Res. J. Chem. Environ.
23(12).

D. Widiastuti, Supriatno Salam, Desi Haneti, Ronny Lesmana, dan Unang

Supratman. 2019. Cytotoxic Activity from the Tuber of Cassava (Manihot
esculenta Crantz) Against Servical Hela Cancer Lines. International
Journal of Recent Technology and Engineering (IJRTE). 8: 2277-3878.

Elias, M., Bala, N. and Sudhakaran, P. R. (1997). Catabolism of linamarin in

cassava (Manihot escalenta Crantz). Plant Science. 126: 155-162.

Fahey, G. C., & L. L. Berger. 1988. Carbohydrate nutrition of ruminants. In :

D.C Chruch (Ed.). Digestive Phisiology and Nutrition of Ruminants. The
Ruminant Animal. New Jersey: Prentice Hall Eglewood Cliifs.

Ghosh, D., dan Konishi, T., 2007, Anthocyanins and Anthocyanin-Rich Extract :
Role in Diabetes and Eye Function. Asia Pac, J. Clin Nutr. 16(2), 200-208.

Gupta Dipankar Das, Md. Enamul Haque, Md. Nahidul Islam, Shafiqur Rahman,
A.K.M. Mahbub Hasan and Baigid Alam Shibib. 2011. Alkaloid and Steroid
from the Stem Bark of Jatropha curcas (Euphorbiaceae). Pharm. Sci. 10(1):
9-11

Hapsari. Mira Amala; Pramashinta. Alice. 2013. Pembuatan Bioetanol dari

Singkong Karet (Manihot Glaziovii) untuk Bahab Bakar Kompor Rumah
Tangga Sebagai Upaya Mempercepat Koversi Minyak Tanah Ke Bahan
Bakar Nabati. Jurnal Tenologi Kimia dan Industri Universitas Diponegoro
Semarang. Vol 2 No 2 hal 240-245

Harborne,J.B dan Turner,B.L. 1984. Plantchemosystematic. London: Academic

Press.
 35

Hartati, I., Kurniasari, L., dan Yulianto ME. 2008. Inaktivasi Enzimatis Pada
Produksi Linamarin Dari Daun Singkong Sebagai Senyawa Anti
Neoplastik. Semarang: Jurusan Teknik Kimia Fakultas Teknik Universitas
Wahid Hasyim.

Haryanto. 2009. Ensiklopedia Tanaman Obat Indonesia. Yogyakarta: Palmall.

Hasim, Falah, S., dan Dewi L.,K. 2016. Effect of Boiled Cassava Leaves
(Manihot esculenta Crantz) on Total Phenolic, Flavonoid and its
Antioxidant Activity. Jurnal Current Biochemistry. 3(3): 116-127.

Hernani dan Rahardjo, M. 2006. Tanaman Berkhasiat Antioksidan. Jakarta:

Penebar Swadaya.

Howeler. R.H. 2012. The Cassava Handbook. A reference Manual based on the
Asian regional Cassava Training Course, held in Thailand. Thailand: CIAT
Cassava Office for Asia.

Jayanegara, A. dan A. Sofyan. 2008. Penentuan aktivitas biologis tanin beberapa

hijauan secara in vitro menggunakan ’hohenheim gas test’ dengan polietilen
glikol sebagai determinan. Media Peternakan. 31(1): 44-52.

Liangcheng, D., Mpoko, B., Birger, L. M. dan Barbara, A. H. 1995. “The

Biosynthesis of Cyanogenic Glucosides in Roots of Cassava”. Journal of
Phytochemistry. 2(39): 323-326.

Milan, S. S., dan Nenad, M. Z., 2014. Antioxidant activity and concentration of
secondary metabolites in the plant parts of Euphorbia cyparissias L.
Kragujevac J. Sci. 36: 121-128.

Ola Salawu Sule, Giaccherini Catia, Innocenti Marzia, Vincieri Franco Francesco,
Akindahunsi Akintunde Afolabi, dan Mulinacci Nadia. 2009.
HPLC/DAD/MS characterisation and analysis of flavonoids and cynnamoil
derivatives in four Nigerian green-leafy vegetables. Journal of Food
Chemistry. 115: 1568–1574.

Ola Sule Salawua, Marzia Innocentib, Catia Giaccherinib, Afolabi Akintunde

Akindahunsia, dan Nadia Mulinacci. 2008. Phenolic Profiles of Four
Processed Tropical Green Leafy Vegetables Commonly Used as Food.
Natural Product Communications. 3(12): 2043-2048.

Pan Ya-Mei, Tao Zou, Yong-Ju Chen, Jian-Yong Chen, Xiao Ding, Yu Zhang,
Xiao-Jiang Hao, dan Hong-Ping He. 2015. Two new pentacyclic
triterpenoids from the stems of Manihot esculenta. Journal of
Phytochemsitry. 12: 273-276

Patra, A., Jha, S., Murthy, P.N., Manik, dan Sharone, A. 2010. Isolation and
characterization of stigmast-5-en-3β-ol (β-sitosterol) from the leaves of
Hygrophila spinosa T. Anders. Int. J. of Pharma Sci. and Res. 1(2): 95-100.
 36

Peifen, C. J., Lukas, A. M., Alfred, W.,Suzanne, P., Martha, A., John, P., Seung,
Y and Peter, D. K. 2004. Metacyc: a multiorganism database of metabolic
pathways and enzymes. Nucleic Acids Research. 32: 3-5.

Prabawati, S. 2011. Inovasi Pengolahan Singkong Meningkatkan Pendapatan dan

Diverifikasi Pangan. Balai Besar Penilitian dan Pengembangan Pascapanen
Pertanian. Bogor. Edisi 4-10 Mei 2011 No. 3404 Tahun XLI.

Proestos, C., Sereli, D., dan Komaitis, M. 2006. Determination of Phenolic

Compounds in Aromatic Plants by RP-HPLC and GC-MS. J. Food Sci. 95:
44-52.

Rasha saad, Loshini A, Jiyauddin K, Hamid K, Eddy Yusuf, and Fadil Asmani.
2014. Phytochemical Screening and Antibacterial Activity of Five
Malaysian Medicinal Plants. BJPR. 4(17): 2019-2032.

Robinson, T. 1991. Kandungan Organik Tumbuhan Tingkat Tinggi. Bandung:

ITB.

Sakai, T., Nakagawa, Y., 1988. Diterpenic stress metabolites from Cassava roots.
Phytochemistry. 27: 3769–3779.

Sakai, T., Nakagawa, Y., Uritani, I., Data, E.S., 1986. Occurrence of various kinds
of metabolites in physiologically and microbially damaged cassava
(Manihot esculenta Crantz) roots. Agric. Biol. Chem. 50: 2905–2907.

Samejo, M,Q., Memon, S., Bhanger, M.I., dan Khan, K. M., 2013, Isolation and
characterization of steroids from Calligonum polygonoides. J. Pharmacy
Res. 6: 346-349.

Sankara Subramanian, S., S. Nagatwan, N. Sulochana. 1971. Euphorbiaceae

Flavonoids Of Some Euphorbiaceous Plants. Phytochemistry. England:
Pergamon Press. 1971.

Suprapti, M. Lies. 2005. Teknologi Pengolahan Pangan Tepung Tapioka,

Pembuatan dan Pemanfaatannya. Yogyakarta: Kanisius.

Supratman unang. 2010. Elusidasi Struktur Senyawa Organik. Bandung: Widya

Padjajaran.

Tao Haiteng, Bo Cui, Hongxia Zhang, Alaa El-Din Bekhit, and Feijei Lu. 2019.
Identification and characterization of flavonoids compounds in cassava
leaves (Manihot esculenta Crantz) by HPLC/FTIR-MS. International
Journal of Food Propertie. 22(1): 1134-1145.

Yang Shu-Ying, Yan-Min Zhao, Zhen-Lin Li, Qi-Yan Zou, Shi-Hui Qian. 2018.
Flavonoid from Flowers of Abelmochus Manihot. Chemistry of Natural
Compounds. 54(2): 257-260.
 37

Yoshida T, Itoh H, Matsunaga S, Tanaka R, Okuda T. 1992. Tannins and related

polyphenols of euphorbiaceous plants. IX. Hydrolyzable tannins with 1C4
glucose core from Phyllanthus flexuosus Muell. Arg. Chem Pharm Bull.
40(1):53-60.
LAMPIRAN

38
 39

Lampiran 1. Skema Kerja Penelitian

Umbi Singkong M. Esculenta C. varietas Sao Pedro

tro
 Dibersihkan dan di blender hingga halus
 Dimaserasi dengan etanol 96% berulang 3x24
jam hingga tak berwarna dan disaring
 Dipekatkan dengan rotary evaporator dengan
suhu ± 40˚C

Ekstrak pekat Etanol

 Dilarutkan dengan air 1:1

 Diekstraksi dengan n-heksana pada
suhu ruang
 Dipekatkan dengan rotary
evaporator dengan suhu ± 40˚C

Ekstrak pekat n-heksana Residu

 Diekstraksi dengan
Etil asetat
 Dipekatkan pada
Ekstrak n-heksana aktif suhu 40˚C

Dipisahkan dan
Ekstrak pekat Etil asetat Residu
dimurnikan dengan
metode kromatografi

Isolat Murni Ekstak Etil asetat aktif

Dipisahkan dan dimurnikan

dengan berbagai metode
kromatografi

Isolat Murni

Senyawa aktif terkarakterisasi

Dikarakterisasi dengan NMR, IR, MS
 40

Lampiran 2. Skema Kerja Persiapan Simplisia Uji

Umbi singkong asal Cisarua Kab Bogor sebanyak 5Kg di kupas dan
dibersihkan

Singkong yang sudah bersih kemudian di potong-potong dan kemudian

di haluskan
Lampiran 3. Skema Kerja Ekstraksi dan Fraksinasi Umbi Singkong

Singkong yang sudah halus di Maserasi selama 3x24 jam dengan etanol
96% menggunakan perbandingan 1 : 1

Residu hasil Maserasi dipekatkan menggunakan Rotary Evaporator

pada suhu 40ºC

Hasil residu yang sudah dipekatkan kemudian dilarutkan dengan air

suling dengan perbandingan 1 : 1

Partisi dengan pelarut n-heksana pada perbandingan 1 : 1, dilakukan

menggunakan corong pisah hingga terbentuk 2 lapisan

Residu di partisi kembali dengan pelarut Etil asetat perbandingan 1 : 1

Filtrat hasil partisi diambil lalu dipekatkan di Rotary Evaporator ,

kemudian dimasukkan ke vial dan ditimbang.
 41

Lampiran 4. Skema Kerja Isolasi dan Identifikasi

a. Pemisahan menggunakan Kromatografi Kolom

Sampel hasil ekstraksi yang sudah ditimbang kemudian di imprect

dengan silika gel 7734 dengan perbandingan 1 : 1

Dilakukan secara gradien dengan eluen n-heksana : Etil asetat

menggunakan perbandingan; (5:5 ; 4:6 ; 3:7 ; 2:8 ; 1:9; 0:1)
dilanjutkan menggunakan eluen EtOAc : Metanol dengan
perbandingan (9:1 ; 8:2 ; 7:3 ; 6:4 ; 5:5 ; 4:6 ; 3:7 ; 2:8 ; 1:9 ; 0:1)
sebanyak 300mL, eluen ditambahkan secara bertahap

Hasil kolom ditampung dalam botol, didapat 16 fraksi yang

kemudian dipekatkan menggunakan Rotary Evaporator sampai
cukup dalam vial.

Dari ke 16 fraksi yang dihasilkan kemudian dilakukan isolasi

kembali menggunakan kromatografi kolom dengan menggunakan
berbagai perbandingan eluen, kemudian hasilnya ditampung dalam
vial kecil untuk kemudian di cek menggunakan KLT
 42

b. Isolasi kromatografi kolom

FRAKSI ETIL
ASETAT

• Di cek Kromatografi Lapis Tipis

EA EA EA EA EA EA EA
EA 1 EA 2 EA 3 EA 4 EA 5 EA 6 EA 7 EA 8 EA 9
10 11 12 13 14 15 16

EA EA EA EA EA EA
A EA E EA F EA I EA J
B C D G H

• Kromatografi kolom
Eluen yang digunakan : • Kromatografi Lapis Tipis
• n-heksana : etil asetat
• Etil asetat : Metanol
• Etil asetat : MTC Isolat Murni
• Etil asetat : kloroform
• n-heksana : etil asetat : MTC
 43

c. Penentuan fasa gerak dengan Kromatografi Lapis Tipis

Ekstrak filtrat ditotolkan pada plat KLT yang telah disiapkan

Dielusi dalam chamber dengan eluen yang sesuai dengan eluen

pada pelaksanaan Kromatografi Kolom, yaitu n-heksana : Etil
asetat dengan berbagai perbandingan

Di cek menggunakan sinar UV pada panjang gelombang 254 nm

dan 365 nm

Plat KLT disemprot dengan H2SO4 dan kemudian dibakar diatas

Hot Plate, kemudian diamati.

d. Karakterisasi Senyawa Murni

Hasil Isolasi yang sudah murni

Di cek menggunakan alat instrumen Nuclear Magnetic Resonance

(NMR), Spektrometer Inframerah, dan Spektroskopi Massa

Senyawa terkarakterisasi
 44

Lampiran 5. Perhitungan Rendemen Fraksi

berat ekstrak kental

Rendemen = × 100 %
berat umbi segar

1575,4 gr
Rendemen Ekstrak Etanol = × 100 % = 1,37 %
115000 gr
11,0238 gr
Rendemen fraksi n-heksana= × 100 % = 0,0096%
115000 gr
7,0043 gr
Rendemen fraksi etil asetat= × 100 % = 0,0061%
115000 gr

Lampiran 6. Penentuan Perbandingan Eluen

2
EA=π r t
22
Etil Asetat = .(2,5)2 .20 = 392,857 (banyaknya eluen yang dipakai saat
7
Kromatografi Kolom gradien)

Lampiran 7. Hasil identifikasi spektra NMR, IR, dan MS

 Hasil Spektrum Massa Senyawa Murni EA 13
 45

 Hasil Spektrum IR Senyawa Murni EA 13

 Spektrum HR-TOF-MS Senyawa Murni EA 13

 Hasil Spektrum 1H-NMR Senyawa Murni EA 13

 46

 Hasil Spektrum 13C-NMR Senyawa Murni EA 13

 Hasil Spektrum DEPT Senyawa Murni EA 13

 47

Lampiran 9. Dokumentasi Penelitian

(Imprect sampel) (Kromatografi kolom) (KLT di bawah sinar UV

254)

(KLT dibawah Sinar UV 365) (KK Per-Fraksi) (Hasil KLT senyawa murni)

(Isolat senyawa murni yang siap di karakterisasi)