Machine Translated by Google

Biologia 69/7: 870—879, 2014

Bagian Botani DOI: 10.2478/
s11756-014-0382-8

Protokol yang andal dan efisien untuk induksi akar rambut di

Agastache foeniculum

Elnaz Nourozi, Bahman Hosseini* & Abbas Hassani

Departemen Hortikultura, Fakultas Pertanian, Universitas Urmia, Urmia, Iran; email: b.hosseini@urmia.ac.ir

Abstrak: Sistem kultur akar berbulu adalah alat yang berharga untuk mempelajari karakteristik ekspresi gen, fungsi gen, biologi
akar, sifat biokimia dan jalur biosintesis metabolit sekunder. Dalam penelitian ini, akar rambut dibentuk pada Anise hisop (Agastache
foeniculum) melalui Agrobacterium rhizogenes. Tiga galur Agrobacterium rhizogenes (A4, A7 dan 9435), digunakan untuk induksi
akar rambut pada empat eksplan (hipokotil, kotiledon, daun berumur satu bulan dan daun berumur lima bulan) dari Anise hisop.
Frekuensi transformasi tertinggi dicapai menggunakan galur A4 pada daun berumur satu bulan (51,1%). Keadaan transgenik dari
garis akar rambut dikonfirmasi dengan metode PCR (Polymerase chain reaction). Analisis kromatografi cair kinerja tinggi
mengungkapkan bahwa produksi asam rosmarinic (RA) pada transformasi akar A. foeniculum hampir 4 kali lipat lebih tinggi
daripada akar non-transformasi. Dalam percobaan terpisah, akar rambut diperoleh dari daun berumur satu bulan yang diinokulasi
dengan strain A4, ditumbuhkan dalam media cair dan pengaruh konsentrasi asam salisilat yang berbeda (0,0, 0,01, 0,1 dan 1 mM)
dan kitosan (0,50 , 100 dan 150 mg Lÿ1) (sebagai elisitor) dan sukrosa (20, 30, 40 dan 50 g Lÿ1) pada pertumbuhan akar rambut
dievaluasi. Hasil penelitian menunjukkan bahwa 30 g Lÿ1 sukrosa dan 100 mg Lÿ1kitosan meningkatkan biomassa kultur akar
rambut dan pemberian asam salisilat menurunkan pertumbuhan akar rambut dibandingkan dengan akar kontrol.

Kata kunci: Agastache foeniculums; Agrobacterium rhizogenes; pendatangan; akar berbulu; konsentrasi sukrosa

pengantar

Adas hisop (Agastache foeniculum) adalah tanaman herba

abadi, milik keluarga Lamiaceae.
Asal tanaman ini telah dilaporkan di Amerika Selatan. Minyak
atsiri A. foeniculum digunakan dalam industri makanan,
farmasi, kosmetik - sanitasi dan es krim. Adas hisop juga
digunakan dalam pengobatan tradisional untuk mengobati
penyakit paru-paru dan batuk (Omid baigi 2007). A. foeniculum
memiliki banyak konstituen yang berguna termasuk
monoterpen dan fenil propanoid. Asam ros marinic, asam
chlorogenic, rutin, apigenin dan galangin, adalah senyawa
fenolik yang berbeda dari Adas hisop dengan banyak sifat Gambar 1. Struktur kimia asam rosmarinic.
farmakologis. Aktivitas antioksidan bergantung pada polifenol
total, yang diukur 98,6 mg gÿ1 dalam Agastache foeniculum
(Matei 2012), 98,2 mg gÿ1 dalam Allium sativum (Egh dami yang ditemukan pada tumbuhan famili Lamiaceae (Fesen et
et al. 2011) dan 31,25 mg gÿ1 dalam Mentha arvensis al. 1993).
(Choudhary et al. 2011). Kultur sel tumbuhan dikenal sebagai alternatif
metode untuk proses pertanian dan menghasilkan senyawa
Asam Rosmarinic (RA) adalah senyawa fenolik dan fitokimia yang berharga. Kultur akar rambut dalam sistem
diproduksi di akar Agastache foeniculum) bebas hormon bersifat stabil dan memiliki tingkat produksi
Gambar 1). RA telah menunjukkan aktivitas antioksidan, anti yang tinggi (Hu & Du 2006). Pertumbuhan yang cepat, waktu
virus, anti mikroba, anti alergi, anti inflamasi dan anti kanker. penggandaan yang rendah, perawatan yang mudah dan
Itu juga memiliki tindakan fisiologis yang menjanjikan terkait kemampuan untuk mensintesis berbagai macam senyawa
dengan kinerja kognitif seperti pencegahan penyakit kimia, adalah beberapa keunggulan yang menjadikan akar
Alzheimer, pengobatan penyakit ginjal, perlindungan kardio rambut sebagai sumber penting untuk produksi metabolit
dan pencegahan kemoterapi kanker. sekunder. Transformasi genetik oleh Agrobacterium rhizogenes adalah sua

*
Penulis yang sesuai

c Institut Botani 2014, Akademi Ilmu Pengetahuan Slovakia

Machine Translated by Google
Induksi akar berbulu di Agastache foeniculum
metode yang efektif untuk meningkatkan akumulasi metabolit
sekunder pada sel tumbuhan (Gangopadhyay et al. 2010).
A. rhizogenes adalah bakteri tanah gram negatif. Fragmen T-
DNA pada plasmid Ri (root inducing plasmid) pada bakteri ini
mengandung gen rol yang mengkode enzim yang terlibat
dalam biosintesis auksin dan cy tokinin dan bertanggung
jawab dalam pembentukan akar rambut (Christy & Braun
2005). Integrasi wilayah ini dalam genom inang menghasilkan
induksi akar berbulu (Kayser & Quax 2007). Produk gen rol
yang berbeda memiliki efek yang berbeda pada target yang
sama (Aoki 2004). Lebih jauh lagi, gen rol mempengaruhi
pertumbuhan dan perkembangan akar transgenik dan
menginduksi sintesis metabolit sekunder dengan mengaktifkan
transkripsi gen (Ono et al. 2011). Penciptaan fenotipe akar
berbulu pada tanaman transgenik mungkin merupakan hasil
dari aksi sinergis gen rol (Lemcke & Schmulling 1998).
Pembentukan akar rambut dari sel yang terinfeksi lebih
mungkin diatur oleh rolA, rolB dan rolC, di antaranya, lokus
rolB memainkan peran paling penting dalam induksi akar
rambut (Cardarelli et al. 1987). Tingkat ekspresi rolB yang
tepat tampaknya diperlukan untuk pertumbuhan aktif akar
rambut karena tingkat ekspresi yang tinggi atau rendah
berkorelasi dengan gangguan pertumbuhan akar rambut
(Palazon et al. 1997; Gorgiev et al. 2007). Gen rolC memiliki
efek stimulasi pada metabolisme sekunder, sedangkan gen
rolD merangsang pertumbuhan akar dan rolA mengkode
protein yang diduga berperan sebagai faktor transkripsi dan
berimplikasi pada metabolisme giberelin (Palazon et al.
1997). Strain dan umur A. rhi zogenes, jenis eksplan dan
komposisi media merupakan beberapa faktor yang efektif
dalam induksi kultur akar rambut (Luo et al. 2004). Banyak
penelitian telah menunjukkan bahwa berbagai jaringan
tanaman memiliki respons yang berbeda terhadap
transformasi dengan strain A. rhizogenes yang berbeda
(Pirian et al. 2012; Sharafi et al. 2013; Samadi et al. 2013).
Sumber karbon dan konsentrasinya merupakan
beberapa faktor yang efektif dalam pertumbuhan akar rambut
(Morgan et al. 2000). Sharafi et al. (2013) melaporkan adanya
efek stimulasi sukrosa terhadap peningkatan biomassa akar
rambut Papaver bracteatum.
Penggunaan elisitor biotik dan abiotik adalah com
strategi mon yang digunakan untuk meningkatkan laju
pertumbuhan dan produksi metabolit sekunder pada sistem
akar rambut (Soleimani et al. 2012). Elisitor adalah komposisi
yang tidak hanya menghasilkan akumulasi phy toalexins
pada tumbuhan, tetapi juga memunculkan jalur yang
berhubungan dengan respon defensif, menghasilkan sintesis
metabolit sekunder pada tumbuhan. Mereka diklasifikasikan
dalam dua kelompok: elisitor abiotik (agen mineral, kimia dan
fisik) dan elisitor biotik (agen dengan asal tanaman atau
patogen) (Yoshikawa et al. 1978). Asam salisilat (SA) dan
kitosan merupakan elisitor abiotik. SA adalah senyawa fenolik
yang diproduksi di jalur fenilpropanoid pada tanaman. SA
adalah salah satu molekul efektif dalam jalur pensinyalan
stres. Perannya dalam ketahanan tanaman terhadap patogen
dan agen stressor lainnya telah diketahui dengan baik. Selain
itu, menambahkan SA dalam media kultur dapat mengaktifkan
gen pertahanan pada tanaman. Lebih-lebih lagi,
871
SA menghambat biosintesis etilen dan menginduksi senyawa
yang berbeda pada tanaman (Ahmadian et al. 2010). Chi
tosan adalah turunan deasetilasi kitin yang diekstraksi dari
dinding sel jamur, kerangka luar krustasea, kutikula serangga
dan beberapa ganggang (Sanford & Hutchings 1987).
Pengaruh konsentrasi asam salisilat yang berbeda pada
tingkat pertumbuhan akar rambut di Artemisia dubia diperiksa;
peningkatan konsentrasi asam salisilat menurunkan laju
pertumbuhan akar rambut (Ali et al. 2012).
Perlakuan kitosan dan asam jasmonat meningkatkan
bobot segar dan kering akar rambut Artemisia annua L.
(Soleimani et al. 2012). Pada Plumbago rosea, kitosan
menunjukkan pengaruh positif terhadap bobot segar sel dan
jumlah akumulasi plumbagin tertinggi (Komariah et al. 2002).
Sepengetahuan kami, ini adalah laporan pertama
tentang transformasi genetik A. foeniculum. Strain A.
rhizogenes yang berbeda dan empat jenis eksplan dievaluasi
untuk induksi akar rambut pada A. foeniculum. Efek
konsentrasi sukrosa, asam salisilat dan kitosan yang berbeda
juga dievaluasi untuk meningkatkan laju pertumbuhan akar
rambut.
Bahan dan metode
Kultur Benih dan Persiapan Eksplan
Benih A. foeniculum diperoleh dari tanaman yang ditanam di lahan
penelitian departemen hortikultura, Universitas Urmia, Iran. Benih
disterilisasi permukaan menggunakan etanol 70% selama 1 menit
dan natrium hipoklorit 2,5% selama 10 menit. Benih steril
dikulturkan pada media MS (Murashige & Skoog 1962) yang
mengandung 7 g Lÿ1 agar. Kultur dipelihara dalam ruang
pertumbuhan pada suhu 25ÿ C dan 16/8 jam (terang/gelap) untuk
perkecambahan. Hipokotil, kotiledon, daun berumur satu bulan
dan lima bulan disiapkan sebagai eksplan untuk transformasi.
Persiapan strain A. rhizogenes dan transformasi tanaman A4, A7
dan 9435 strain A. rhizogenes, disediakan oleh bank mikroba di
Institut Nasional Rekayasa Genetika dan Bioteknologi, Teheran,
Iran, digunakan. Klon tunggal dari galur bakteri ditumbuhkan
dalam media Luria-Bertani (LB) (Bertani 1952) yang mengandung
50 mg Lÿ1 rifampisin, pada suhu 28ÿC selama 48 jam pada
pengocok putar (180 rpm) dalam kondisi gelap. Bakteri
dikumpulkan dari media cair dengan sentrifugasi (3000 rpm)
selama 10 menit dan pelet bakteri disuspensikan kembali dalam
media cair MS (media infeksi Agrobacterium) yang mengandung
50 mg Lÿ1 sukrosa, pH = 5,5. Sebelum menggunakan suspensi
bakteri untuk inokulasi, konsentrasinya diatur pada OD600= 0,4–
0,5.
Eksplan yang berbeda, hipokotil, kotiledon, daun A.
foeniculum berumur satu bulan dan lima bulan disiapkan untuk
kultivasi bersama dengan galur gen A. rhizo yang berbeda.
Eksplan dilukai secara acak dan diinokulasi oleh strain bakteri
yang berbeda selama 5 menit. Eksplan dikeringkan menggunakan
kertas saring steril untuk menghilangkan bakteri yang berlebihan.
Eksplan yang diinokulasi dipindahkan ke agar (7 g Lÿ1) sehingga
media MS yang dilidahkan untuk kokultivasi dalam kondisi gelap
pada suhu 25ÿ C selama 48 jam. Selain itu, beberapa eksplan
direndam dalam air suling steril dan dikultur dengan cara yang
sama seperti sampel kontrol. Setelah 2 hari, eksplan dibilas dengan steril
Machine Translated by Google
872
air suling yang mengandung 200 mg Lÿ1 cefotaxime untuk
menghilangkan bakteri dari eksplan. Eksplan dipindahkan ke
media MS yang dilengkapi dengan 200 mg Lÿ1 cefo taxime, 30
g Lÿ1 sukrosa dan 7 g Lÿ1 agar. Setelah munculnya akar berbulu,
mereka dipisahkan dari jaringan eksplan dan disubkultur setiap
minggu ke media bebas hormon MS dan diinkubasi pada suhu
25ÿ C dalam kondisi gelap. Konsentrasi Ce fotaxime menurun
secara bertahap dan akhirnya dihilangkan dari media kultur
setelah 2 bulan cul
mendatang Frekuensi transformasi dihitung dengan jumlah
tusukan yang menunjukkan munculnya akar rambut/jumlah total
tusukan yang diinokulasi dan DAI (hari munculnya akar rambut
setelah infeksi bakteri) dicatat.
Pembentukan akar berbulu
Strain dan eksplan terbaik berturut-turut adalah strain A4 dan
daun berumur satu bulan. Mereka digunakan untuk menilai efek
elisitor pada pertumbuhan akar rambut. Akar berbulu diperoleh
dari daun berumur satu bulan, diinokulasi dengan strain A4,
setelah 2 bulan ko-kultur pada media MS padat, dan dipindahkan
ke labu Erlenmeyer 250 mL yang berisi 50 mL cairan 1/2 MS (MS
setengah kekuatan). ) dengan 30 g Lÿ1 sukrosa dan diletakkan
di atas pengocok putar (100 rpm) pada 25 ± 2ÿ C dalam gelap
untuk proliferasi akar rambut.
Analisis reaksi berantai polimerase
DNA genomik dari akar rambut yang ditransformasikan dan akar
yang tidak ditransformasikan (0,5 g FW), diisolasi dengan metode
CTAB (Khan et al. 2007). Analisis PCR digunakan untuk
menyelidiki keberadaan gen rolB pada akar rambut. Urutan
primer untuk mengamplifikasi fragmen 780 bp dari gen rolB
adalah, F: 5'-TGGATCCCAAATTGCTATTCCACGA-3' dan R: 5'-
TTAGGCTTCTTTCTTCAGGTTTACTGCAGC-3'.
DNA yang diamplifikasi dianalisis dengan pewarnaan dengan
etidium bromida setelah elektroforesis gel agarosa 1% (b/v).
Ekstraksi asam rosmarinic
Akar A. foeniculum yang telah mengalami transformasi dan non-
transformasi setelah panen dikeringkan dengan oven 45ÿ C
selama 1 hari. Kemudian, kira-kira 0,5 g jaringan kering
diserbukkan dan dipindahkan ke dalam tabung, 5 ml larutan
ekstraksi (2,5 mL metanol dan 2,5 mL air) ditambahkan ke masing- laju transformasi dan frekuensi induksi akar rambut sangat
masing tabung. Sampel ditempatkan di ultrasonator (art:
Eurosonic4D – Eu ronda company – Italy) untuk menghancurkan
sel dengan gelombang suara dan senyawa campuran dengan
larutan ekstraksi selama 20 menit. Sampel disentrifugasi (2000 rpm) selama 10 menit.
Kemudian, 25 µL ekstrak digunakan untuk menentukan kadar
asam ros marinic.
Menentukan jumlah asam rosmarinic
Kromatografi cair kinerja tinggi (HPLC) digunakan untuk
penentuan kandungan asam rosmarinic. Sistem kromatografi
yang digunakan dalam penelitian ini adalah sistem HPLC seri
Agilent/1100 dengan DAD, model G1315B (USA), dengan kolom
fase balik C18 (4,6 × 250 mm) pada suhu kamar.
Fase gerak (larutan B) adalah asetonitril / 5% asam asetat (7: 3
v/v) dengan gradien linier 50% larutan B hingga 30% larutan dan
ekstrak yang diperoleh dari akar yang ditransformasikan dan
akar yang tidak ditransformasikan diinjeksikan ke dalam alat. .
Asam Rosmarinic terdeteksi pada 254 nm. Penyimpanan
waktu asam rosmarinic adalah 5,34 menit. Puncak kromatografi
dikonfirmasi oleh waktu retensi dan spektrum UV yang terkait
dengan standar referensi. Waktu retensi puncak yang diperoleh
dengan standar asam rosmarinic digunakan untuk mengidentifikasi
puncak yang sesuai dari ekstrak akar.
E. Nourozi dkk.
Perlakuan akar berbulu dalam media cair
Dalam percobaan terpisah, efek konsentrasi sukrosa yang
berbeda (20, 30, 40 dan 50 g Lÿ1) pada laju pertumbuhan akar
berbulu dievaluasi. Kira-kira 2 g akar rambut diinkubasi dalam
labu Erlenmeyer 250 mL berisi 50 mL media 1/2 MS cair selama
3 bulan di atas pengocok putar (100 rpm) pada suhu 25ÿ C. Berat
segar dan kering akar diukur.
Selain itu, efek konsentrasi asam salisilat dan kitosan yang
berbeda sebagai elisitor terhadap pembentukan dan laju
pertumbuhan kultur akar rambut diselidiki. Larutan berair asam
salisilat (0,01, 0,1 dan 1 mM) disterilkan dengan filter dengan
filter Millipore 0,45 µM dan kemudian ditambahkan ke media
kultur. Kitosan (50, 100 dan 150 mg Lÿ1) dilarutkan dalam asam
asetat pada suhu 60ÿ C selama 10 menit (kandungan akhir 2%,
v/v), kemudian campuran diencerkan dengan air deionisasi,
disesuaikan dengan pH = 5,5, kemudian disterilkan dengan
autoklaf dan ditambahkan ke media kultur.
Media cair 1/2 MS digunakan pada semua perlakuan sebagai
sampel kontrol. Setelah 3 bulan, akar dikumpulkan dan diukur
biomassanya (berat segar dan kering).
Analisis statistik
Percobaan didasarkan pada rancangan acak lengkap dengan 3
ulangan per perlakuan. Eksperimen DAI dilakukan dalam susunan
faktorial berdasarkan Rancangan Acak Lengkap (RAK) dengan
dua faktor (strain dan jenis eksplan) dan tiga kali ulangan.
Analisis varians (ANOVA, analisis satu arah) dilakukan dengan
menggunakan SAS 9.1 (SAS Institute, Cary, North Carolina,
USA) untuk mendeteksi signifikansi perbedaan antara rata-rata
perlakuan dan rata-rata dibandingkan menggunakan uji Duncan
pada 5 % tingkat probabilitas.
hasil dan Diskusi
Pengaruh strain bakteri dan jenis eksplan Hasil
penelitian menunjukkan bahwa semua strain A. rhizogenes
yang digunakan dalam percobaan memiliki kemampuan
induksi akar rambut pada A. foeniculum (Gbr. 2). Namun,
tergantung pada strain A. rhizogenes dan tipe eksplan yang
diaplikasikan. Daun berumur satu bulan merupakan jenis
eksplan yang paling baik untuk ditransformasi oleh masing-
masing galur gen A. rhizo. Tingkat induksi akar berbulu
tertinggi (51,1 %) diperoleh pada eksplan daun berumur
satu bulan oleh galur A4, sedangkan galur 9435 menginduksi
akar berbulu hanya pada 6,66% dari eksplan daun berumur
lima bulan. Eksplan hipokotil menunjukkan nekrosis dengan
tingkat induksi akar rambut yang rendah. Selain itu, akar
rambut tidak teramati pada eksplan kontrol (Gbr. 3).
Banyak penelitian telah menunjukkan bahwa strain A.
rhizogenes dan jenis eksplan memiliki dampak yang
signifikan terhadap induksi akar rambut (Danphitsanuparn et al.
2012; Soleimani dkk. 2012; Pirian et al. 2012). Persentase
transformasi yang tinggi pada daun berumur satu bulan
mungkin disebabkan sensitivitasnya yang lebih tinggi
terhadap bakteri dibandingkan dengan jenis eksplan lain
dan sensitivitas ini bergantung pada keadaan fisiologis
jaringan (Pawar & Matheshwari 2003). Efek kunci gen rol
pada inaktivasi jalur jalur auksin dan sitoknin telah dilaporkan
menjadi alasan perbedaan
Machine Translated by Google

Induksi akar berbulu di Agastache foeniculum 873

Gambar 2. Transformasi A. rhizogenes-mediated dari A. foeniculum.a– Bibit A. foeniculum in vitro berkecambah dari biji; b – Kultur daun berumur
satu bulan pada media MS setelah inokulasi dengan bakteri; c – Inisiasi dan pertumbuhan akar berbulu dalam media MS bebas fitohormon
setelah 2 minggu kultur bersama; d – Akar rambut berkembang dengan baik setelah 2 bulan sub-kultur pada media yang sama yang mengandung
200 mg Lÿ1 cefotaxime.

Gambar 3. Perbandingan kemampuan berbagai strain A. rhizogenes untuk induksi akar rambut pada eksplan A. foeniculum yang berbeda.
Frekuensi transformasi dihitung sebagai: jumlah eksplan yang menunjukkan akar berbulu/jumlah total eksplan yang diinokulasi. Garis vertikal
mewakili SE.
Machine Translated by Google

874 E. Nourozi dkk.

Gambar 4. Perbandingan hari munculnya akar rambut setelah infeksi bakteri (DAI) pada eksplan A. foeniculum. A – Pengaruh jenis strain A. rhizogenes
pada DAI; B – Pengaruh jenis eksplan A. foeniculum pada DAI. Data diperoleh sebagai rata-rata dari tiga ulangan.
Huruf yang berbeda menunjukkan perbedaan yang signifikan secara statistik pada P ÿ 0,05, sebagaimana ditentukan oleh uji jarak berganda Duncan. Garis
vertikal mewakili SE.

antara jumlah eksplan transgenik dalam tanaman (Hamill
1993).
Perbedaan induksi akar rambut antar strain dapat
disebabkan oleh perbedaan virulensi berbagai strain A.
rhizogenes (Porter 1991). Pada Artemisia annua L.
persentase pembentukan akar tertinggi (75,6%) diamati
pada bibit berumur 2 minggu dengan menggunakan strain
AR15834 A. rhizogenes (Soleimani et al. 2012). Induksi
akar berbulu pada eksplan daun, batang dan akar
Portulaca oleracea oleh strain A. rhizogenes yang
berbeda (AR15834, A4, 9435 dan C318) menunjukkan
bahwa tingkat transgenik tertinggi diperoleh pada eksplan
daun yang diinokulasi dengan strain AR15834 (Pirian et
al. 2012). Dalam Papaver bractea tum, lima galur (A4,
ATCC15834, LBA9402, MSU440 dan A13) dan tiga
eksplan (hipokotil, daun dan pucuk yang dipotong)
diperiksa. Hasil menunjukkan bahwa frekuensi
transformasi tertinggi dicapai dengan menggunakan galur
LBA9402 pada pucuk yang dipotong (Sharafi et al. 2013).
Selain itu, jumlah hari setelah inokulasi (DAI)
munculnya akar rambut dicatat. Berbulu
akar muncul setelah 2-3 minggu kultur dalam media
seleksi. Rata-rata DAI kurang dari 8 pada A4 dan 10 pada
9435 galur. Eksplan daun berumur satu bulan
menunjukkan DAI rendah (11 hari). Di sisi lain, eksplan
hipokotil menunjukkan nekrosis (Gbr. 4). Cao dkk. (2009)
dalam meneliti DAI untuk menentukan genotipe terbaik
untuk inokulasi dengan strain K599 dari A. rhizogenes
dalam sistem transformasi akar rambut kedelai.
Memperoleh DAI pendek sangat penting karena
menghasilkan penghematan ruang dan waktu (Cao et al.
2009; Weber dan Bodanese Zanettini 2011).
Hasil keseluruhan menunjukkan bahwa strain A4
Agrobac terium rhizogenes berhasil menginduksi akar
berbulu pada eksplan daun A. foeniculum berumur satu bulan.
Produksi asam rosmarinic pada akar rambut
Analisis HPLC memastikan adanya RA pada sampel
yang diuji menurut waktu retensi yang sama yaitu 5,34
menit sebagai standar. Jumlah RA tertinggi (213,42 µg
gÿ1 berat kering) dihasilkan pada transformasi akar (Gbr.
5); tingkatnya hampir 4 kali lipat lebih tinggi dari
kandungan RA pada akar yang tidak ditransformasi
Machine Translated by Google
Induksi akar berbulu di Agastache foeniculum
Gambar 5. Kandungan asam rosmarinic kultur akar rambut A. foeniculum yang ditumbuhkan pada media 1/2 MS. Nilai mewakili rata-rata ±
SD dari tiga pengukuran independen.
(52,28 µg gÿ1 berat kering) pada kondisi yang sama (Gbr. 6).
Produksi asam rosmarinic dalam kultur akar rambut
diamati oleh Lee et al. (2008) dalam Agastache rugsa dan
oleh Lee di al. (2010) dalam Nepeta cataria L.
Banyak penelitian telah menunjukkan bahwa pertumbuhan
akar rambut dan produksi metabolit bergantung pada ekspresi
gen 'rol' (Bulgakov 2008). Baru-baru ini, efek penghambatan
peran A. rhizogenes telah ditunjukkan pada produksi asam
rosmarinic (Bulgakov et al. 2005).
Gen rol dapat mengaktifkan ekspresi gen pertahanan dan
dengan demikian produksi metabolit sekunder (produksi phy
toalexin) dalam sel tanaman (Bulgakov 2008). Kemampuan
sintesis metabolit sekunder pada akar rambut jauh lebih
tinggi daripada akar liar dan produksi sekunder. metabolit
dari akar berbulu lebih stabil dibandingkan jenis kultur sel
lainnya (Guillun et al. 2006).
Analisis PCR
Metode PCR dapat digunakan secara sederhana untuk
mendeteksi urutan T-DNA pada putative transformants
(Palazon et al. 2003b). Ri plasmid adalah alat diagnostik yang digunakan
875
untuk mengkonfirmasi integrasi T-DNA ke dalam genom
inang (Soleimani et al. 2012). Gen rolB sangat penting untuk
induksi akar rambut (Samadi et al.
2012). Pada penelitian ini, integrasi T-DNA gen A. rhizo Ri
plasmid ke dalam genom A. foeniculum dikonfirmasi dengan
analisis PCR menggunakan primer spesifik untuk rolB.
Elektroforesis gel agarosa 1% mengungkapkan adanya pita
780 bp dalam produksi akar berbulu tetapi tidak ada amplikon
seperti itu yang diamati pada sampel akar yang tidak
ditransformasi (kontrol negatif). Plasmid A. rhizogenes
digunakan sebagai kontrol positif (Gbr. 7).
Pengaruh konsentrasi sukrosa pada laju pertumbuhan akar
rambut Kultur akar rambut in vitro membutuhkan pasokan
sumber karbon untuk memenuhi kebutuhan energi. Hasil
penelitian ini mengungkapkan bahwa konsentrasi sukrosa
dapat mempengaruhi laju pertumbuhan akar rambut. Tingkat
pertumbuhan akar rambut meningkat dengan meningkatkan
konsentrasi sukrosa hingga 30 g Lÿ1. Namun, konsentrasi
lebih tinggi dari 30 g Lÿ1 sukrosa mengurangi pertumbuhan
garis akar rambut (Gbr. 8). Tingkat pertumbuhan akar rambut
biasanya tinggi tetapi beberapa faktor
Machine Translated by Google

876 E. Nourozi dkk.

Gambar 6. Kandungan asam rosmarinic akar A. foeniculum yang tidak tertransformasi, ditumbuhkan pada media 1/2 MS. Nilai mewakili rata-rata
± SD dari tiga pengukuran independen.

tor mampu mengubah laju pertumbuhan akar rambut.

Dengan demikian, dalam kultur akar rambut Papaver
bracteatum, laju pertumbuhan akar rambut berkurang
pada konsentrasi 30 g Lÿ1 sukrosa yang lebih tinggi dan
lebih rendah (Sharafi et al. 2013). Optimalisasi senyawa
medium sering meningkatkan laju pertumbuhan akar
rambut dan akumulasi metabolit sekunder. Penerapan
media yang dimodifikasi umumnya diperlukan, bahwa
perubahan tersebut umumnya pada sumber karbon,
nitrogen dan fosfor (Bensaddek et al. 2008). Konsentrasi
sukrosa yang tinggi sangat mengurangi tingkat
pertumbuhan akar rambut spesies Psoralea yang
mungkin disebabkan oleh tekanan osmotik (Nguyen et
al. 1992). Selain itu, percobaan yang dilakukan pada
Angelica gigas Nakai, untuk menyelidiki efek dari
berbagai konsentrasi sukrosa (10, 20, 30, 40, 50 g Lÿ1),
menunjukkan bahwa pertumbuhan meningkat hingga 40 Gambar 7. Amplifikasi PCR gen rolB pada akar rambut A. foeniculum.
g Lÿ1 konsentrasi sukrosa dan peningkatan lebih lanjut Lane M – Penanda ukuran molekul (1 kb tangga Fermen tase); jalur
dari konsentrasi di atas 50 g Lÿ1 menurunkan laju 1–9 – Akar berbulu transgenik diinduksi pada kotiledon, daun berumur
satu bulan dan eksplan daun berumur lima bulan yang terinfeksi oleh
pertumbuhan (Xu et al. 2009). Putalun dkk. (2006)
strain A. rhizogenes; jalur C – Akar yang tidak tertransformasi sebagai
melaporkan bahwa laju pertumbuhan akar berbulu Senna kontrol negatif; jalur P – Ri plasmid dari strain A. rhizogenes sebagai
alata meningkat pada kondisi gelap pada media 1/2 MS yangkontrol
mengandung
positif. 50 g Lÿ1 sukrosa.
Machine Translated by Google
Induksi akar berbulu di Agastache foeniculum
Gambar 8. Pengaruh konsentrasi sukrosa yang berbeda (20–50 g Lÿ1) pada
berat segar dan kering akar rambut pada eksplan daun A. foeniculum berumur
satu bulan yang diinokulasi dengan A. rhizogenes A4. Data disajikan sebagai
rata-rata tiga ulangan. Huruf yang berbeda menunjukkan perbedaan yang
signifikan secara statistik pada P ÿ 0,05, sebagaimana ditentukan oleh uji
jarak berganda Duncan. Garis vertikal mewakili SE yang dikirim.
Gambar 9. Pengaruh SA terhadap laju pertumbuhan akar berbulu pada A.
foenicu lum. Berat segar (g) dan berat kering (g) setelah elisitasi dengan SA.
Setiap nilai adalah rata-rata dari 3 ulangan. Huruf yang berbeda menunjukkan
perbedaan yang signifikan secara statistik pada P ÿ 0,05, sebagaimana
ditentukan oleh uji jarak berganda Duncan. Garis vertikal mewakili SE yang
dikirim.
Pertumbuhan dan elisitasi kultur akar rambut
Investigasi efek konsentrasi asam salisilat dan kitosan
yang berbeda pada laju pertumbuhan akar rambut A.
foeniculum menunjukkan bahwa aplikasi asam salisilat
mengurangi pertumbuhan akar rambut dibandingkan
dengan eksplan kontrol. Berat segar dan kering akar
berbulu menurun tajam dalam 1 mM SA (Gbr. 9).
877
Gambar 10. Pengaruh konsentrasi kitosan terhadap laju pertumbuhan akar
rambut A. foeniculum. Berat segar (g) dan berat kering (g) setelah elisitasi
dengan kitosan. Setiap nilai adalah rata-rata dari 3 ulangan.
Huruf yang berbeda menunjukkan perbedaan yang signifikan secara statistik
pada P ÿ 0,05, sebagaimana ditentukan oleh uji jarak berganda Duncan.
Garis vertikal mewakili SE.
Di antara berbagai konsentrasi kitosan (0, 50, 100,
150 mg Lÿ1), konsentrasi 100 mg Lÿ1 meningkatkan
berat segar (9,03 g) dan berat kering (0,81 g) akar
rambut (Gbr. 10 dan 11).
Pengaruh elisitasi tergantung pada jenis elisitor,
kondisi lingkungan, konsentrasi elisitor dan interaksi
antara elisitor dan sel tanaman (Smetanska 2008).
Dalam studi saat ini, pengurangan biomassa khas rambut
akar diamati setelah perlakuan dengan konsentrasi SA
yang berbeda. Hasil serupa telah dilaporkan, sebelumnya.
Aplikasi SA pada Stemona sp., menurunkan pertumbuhan
akar rambut pada semua konsentrasi (0,1, 0,3, 0,5 dan
1 mM), terutama pada konsentrasi 1 mM (Chichana dan
Dheer anupattana 2012). Semua konsentrasi (100, 200,
300, 500 mg Lÿ1) SA memiliki efek negatif terhadap
pertumbuhan akar rambut kail Stemona curtisii
(Chotikadacha narong et al. 2011). Dalam percobaan
induksi akar rambut di Artemisia dubia, membandingkan
tiga konsentrasi SA yang berbeda (0,138, 1,38 dan 13,8
mg Lÿ1), konsentrasi 0,138 mg Lÿ1SA menunjukkan
respon pertumbuhan tertinggi dan dengan meningkatkan
konsentrasi SA , laju pertumbuhan akar rambut berkurang
(Ali et al. 2012). Efek dari asam salisilat, asam jasmonat,
chi tosan dan dinding sel jamur pada pertumbuhan dan
akumulasi asam rosmarinic di akar rambut Ocimum
basilicum diperiksa oleh Bais et al. (2002), hasil penelitian
menunjukkan bahwa akar rambut yang diberi perlakuan
dengan asam salisilat, asam jasmonat dan kitosan
secara bertahap menunjukkan status nekrotik dan
biomassanya menurun dibandingkan dengan sampel
kontrol. Menurut hasil, efek dari berbagai konsentrasi SA
pada laju pertumbuhan akar rambut berbeda karena
perannya dalam jalur pensinyalan seluler. Pada
konsentrasi rendah, SA adalah
Machine Translated by Google
878
Fig. 11. Akar berbulu yang dipanen. A – A. foeniculum akar berbulu tanpa menggunakan elisitor; B – Sebuah klon akar berbulu yang dihasilkan dengan kitosan
100 mg Lÿ1 .
berguna untuk pensinyalan sel tetapi konsentrasinya yang tinggi
dapat menyebabkan gangguan pertumbuhan (Ahmadian et al.
2010). Konsentrasi SA yang tinggi menyebabkan stres dan
kerusakan parah pada jaringan akar serta menghambat
pertumbuhan dan menurunkan metabolisme sel (Ahmadian et al. 2010).Aoki S. 2004. Kebangkitan gen leluhur: analisis fungsional dan evolusi gen Ng
Kitosan adalah elisitor lain yang digunakan dalam percobaan
ini. Menurut hasil, penambahan kitosan ke media kultur
Bais H.P., Walker T.S., Schweizer H.P. & Vivanco J.M. 2002.
meningkatkan laju pertumbuhan akar rambut. Secara khusus,
biomassa akar paling tinggi dengan adanya 100 mg Lÿ1 kitosan.
Chitosan adalah promotor pertumbuhan pada beberapa spesies
Bensaddek L., Villarreal ML & Fliniaux MA 2008. Induksi dan pertumbuhan
tanaman dan turunannya adalah elisitor alami untuk respon
defensif pada tanaman (San ford & Hutchings 1987). Demikian
pula kehadiran chi tosan meningkatkan laju pertumbuhan akar
rambut Hyoscyamus muti cus (Sevonetal. 1992). Peningkatan
konsentrasi kitosan, peningkatan pertumbuhan akar berbulu Witha
nia somnifera L., dan pertumbuhan akar lebih tinggi pada kitosan
150 mg Lÿ1 (Doma et al. 2012).
Namun, penambahan kitosan menghambat pertumbuhan akar dan
produksi ginsenosides dalam kultur akar rambut Panax ginseng
(Palazon et al. 2003). Hasil ini menunjukkan bahwa kitosan
merespon secara berbeda pada kultur tanaman yang berbeda.
Konsentrasi kitosan yang tinggi dapat merusak sel dengan
meningkatkan permeabilitas membran sel (Jin et al. 1999).
Hasil kami menunjukkan bahwa pembentukan akar rambut
pada A. foeniculum sangat dipengaruhi oleh jenis eksplan dan
strain bakteri. Untuk produksi akar rambut yang optimal, kultur
harus ditanam dalam media basal MS bebas fitohormon dengan
30 g Lÿ1 sukrosa dan 100 mg Lÿ1 kitosan. Dimungkinkan untuk
menghasilkan garis akar yang berubah dengan kandungan RA
yang jauh lebih tinggi daripada akar tanaman A. foeniculum yang
tumbuh di lapangan. Untuk induksi akar rambut, perlu dilakukan
banyak eksperimen pada berbagai spesies tanaman dan
mempelajari pengaruh lingkungan, pemilihan media terbaik dan
kondisi kultur.
Referensi
Ahmadian N., Sharifi M., Karimi F. & Rahnema H. 2010. Perbandingan
produksi alkaloid tropane pada akar rambut dan
E. Nourozi dkk.
bibit di Atropa belladonna L. pengaruh asam salisilat. Ira nian J. Plant
Biol. 1: 63–76.
Ali M., Kiani BH, Mannan A., Ismail T. & Mirza B. 2012. Peningkatan produksi
artemisinin dengan kultur akar rambut Artemisia dubia. J.Med. Tanaman
Res. 6: 1619–1622.
rol yang ditransfer dari Agrobacterium ke Nicotiana. J.tanaman. Res. 117:
329–37.
Elisitasi spesifik akar dan aktivitas antimikroba asam ros marinic dalam
kultur busuk berbulu Ocimum basilicum. Fisik Tumbuhan. Biokimia. 40:
983–995.
akar rambut untuk produksi senyawa obat. Elektron. J.Integr. Biosci. 3: 2–
9.
Bertani G. 1952. Studi tentang lisogenesis. I. Mode pembebasan fag oleh
Escherichia coli lisogenik. J.Bakteriol. 62: 293– 300.
Bulgakov P. 2008. Fungsi gen rol dalam metabolisme sekunder tanaman.
Biotek. Lanjut 23 (4): 318–324.
Bulgakov VP, Veselova MV & Tchernoded GK 2005. Dalam efek
penghambatan gen rolC Agrobacterium rhizogenes pada produksi
rabdosiin dan RA di Eritrichium sericeum dan Lithospermum erythrorhizon
mengubah kultur sel.
Tanaman. 221: 471–478.
Cao D., Hou W., Lagu S., Sun H., Wu C., Gao Y. & Han T. 2009.
Penilaian kondisi yang mempengaruhi Agrobacterium rhizogenes –
transformasi kedelai yang dimediasi. Sel tanaman. Tis. Org.
Kultus. 96: 45–52.
Cardarelli M., Mariotti D. & Pomponi M. 1987. Gen Agrobacterium rhizogenes
TDNA mampu menginduksi hairy root phe notype. Mol. Jenderal Genet.
209: 475–480.
Chichana N. & Dheeranupattana S. 2012. Pengaruh metil jas monat dan
asam salisilat terhadap produksi alkaloid dari kultur in vitro Stemona sp.
Antar. J. Biosci. Biokimia. Bioinformasi. 2: 146–150.
Choudhary RK, Saroha AE & Swarnkar PL 2011. Aktivitas pemulungan radikal
fenolik dan flavonoid di beberapa tanaman obat di India. J. Farmasi. Res.
4: 712–713.
Christey MC & Braun RH 2005. Produksi kultur akar rambut dan tanaman
transgenik oleh Agrobacterium rhizogenes – transformasi termediasi.
Metode. Mol. Biol. 286: 47–60.
Chtikadachanarong k., Dheeranupattana S., Jatisatienr A., Wangkarn S.,
Mungkornasawakul P., Pyne SG, Ung AT
& Sastraruju T. 2011. Pengaruh asam salisilat terhadap produksi alkaloid
dengan kultur akar Stemona curisii Hook. FJ
Biol. Sains. 3: 322–325.
Danphitsanuparn P., Boonsnongcheep P., Boribonkaset T., Chin tapakorn Y.
& Prathanturarug S. 2012. Pengaruh strain Agrobac terium rhizogenes
dan parameter lain terhadap produksi isoflavonoid pada akar rambut
Pueraria condollei Grah.
Sel tanaman. Tis. Org. Kultus. 111: 315–322.
Machine Translated by Google
Induksi akar berbulu di Agastache foeniculum
Doma M., Abhayankar G., Reddy VD & Kavikishor PB 2012.
Karbohidrat dan elisitor ditingkatkan dengan anolied (withaferin A dan
withanolide A) akumulasi kultur akar rambut Withania somnifera (L).
Indian. J.Exp. Biol. 50: 484–490.
Eghdami A., Hashemi Sohi SM, Eradatmand Asli D. & Housh mandfar A.
2011. Aktivitas antioksidan dari ekstrak metanolin dan hidroalkohol
tanaman bawang putih. Lanjut Mengepung. Biol. 5: 1575–1578.
Fesen MR, Kohn KW, Leteutre F. & Pommier Y. 1993. Inhibitor integrase
human immunodeficiency virus. Proses
Natl. Acad. Tahu AS 90: 507–511.
Gangopadhyay M., Chakraborty D. & Bhattacharyya S. 2010.
Regenerasi tanaman transformasi dari akar rambut Plumbago indica.
Sel tanaman. Tis. Org. Kultus. 120: 109–114.
Gorgiev M., Pavlov A. & Bley T. 2007. Tanaman jenis akar rambut sistem in
vitro sebagai sumber zat bioaktif. Aplikasi Bio mikro. Bioteknologi. 74:
1175–1185.
Guillun S., Tremouillaux–Guiller J., Pati PK, Rideau M. & Gan ten P. 2006.
Penelitian akar rambut: skenario terkini dan prospek menarik. Kur.
Opin. Tanaman Biol. 9: 341–346.
Hamill JD 1993.Perubahan metabolisme auksin dan cytikinin tanaman
tingkat tinggi akibat ekspresi gen spesifik dari bakteri patogen. ulasan”.
Aust. J. Tumbuhan Physiol. 20: 405–423.
Hu ZB & Du M. 2006. Akar rambut dan penerapannya dalam rekayasa
genetika tanaman. J.Integr. Tanaman Biol. 48:121–127.
Jin JH, Shin JH, Kim JH & Lee HJ 1999. Pengaruh penghilangan kitosan
dan komponen media pada produksi pewarna thraquinone dalam kultur
sel Madder (Rubia akane Nakaki). Bioteknologi. Bioproses. Eng. 4:
300–304.
Kayser O. & Quax WG 2007. Bioteknologi Tanaman Obat.
Vol.1, WILEY-VCH Verlag GmbH & Co., Weinheim, 604 hlm.
Khan S., Irfan QM, Kamaluddin AT & Abdin MZ 2007.
Protokol untuk isolasi DNA genom dari akar tanaman obat kering dan
segar yang cocok untuk RAPD dan restriksi pencernaan. Af. J.
Bioteknologi. 6: 175–178.
Komariah P., Naga Amrutha R., Kavi Kishor PB & Ramakr ishna SV 2002.
Elicitor meningkatkan produksi plumbagin dalam kultur suspensi Enzim
Plumbago rosea L.. Mikroba.
Tek. 31: 634–639.
Lee SY, Lee Ch.Y., Eom SH, Kim YK, Park N. & Park SU
2010. Produksi asam rosmarinic dari transformasi kultur akar Nepeta
cataria L. Sci. Res. Esai. 5 (10): 1122–
1126.
Lee SY, Xu H., Kim YK & Park SU 2008. Produksi asam rosmarinic dalam
kultur akar rambut Agastache rugosa Kuntze.
Dunia J. Mikroba. Bioteknologi. 24: 969–972.
Lemcke K. & Schmulling T. 1998. Gain of function assay mengidentifikasi
gen non rol dari Agrobacterium rhizogenes TLDNA yang mengubah
morfogenesis tanaman atau sensitivitas hormon. Tanaman. J.15 : 423–
433.
Luo C., Peng Z. & Pu L. 2004. Transformasi tanaman obat yang dimediasi
oleh Agrobacterium rhizogenes. Bioteknologi. 14: 58–61.
Matei CF 2012. Penelitian tentang biologi dan teknologi tanaman spesies
Agastache foeniculum (Pursh) Kuntze pada kondisi dataran
Transylvania. Disertasi, Universitas Ilmu Pertanian dan Kedokteran
Hewan Fakultas Pertanian Cluj–Napoca.
Morgan JA, Bamey CS, Penn AH & Shnks JV 2000. Pengaruh media buffer
terhadap pertumbuhan dan produksi alkaloid akar berbulu Catharanthus
roseus. Aplikasi Mikrobiol. Bioteknologi. 53: 205–210.
Murashige T. & Skoog F. 1962. Media yang direvisi untuk pertumbuhan
cepat dan bioassay dengan kultur jaringan Tembakau. Fisik.
Tanaman. 15: 473–497.
879
Nguyen C., Bourgaud F., Forlot P. & Guckert A. 1992. Pendirian kultur akar
berbulu spesies Psoralea. Tanaman. Sel.
Rep.11 : 424–427 .
Omidbaigi R. 2007. Produksi dan Pengolahan Tanaman Obat. Astane Quds,
Mashhed, 424 hal.
Ono NN & Tain L. 2011. Banyaknya kultur akar berbulu: kemungkinan yang
subur. Tanaman Sci. 180: 439–446.
Palazon J., Cusido RM, Bontill M., Mallol A., Moyano E., Morales C. & Pinol
MT 2003a. Elisitasi berbagai Panax ginseng mengubah fenotipe akar
untuk produksi gin senoside yang lebih baik. Fisik Tumbuhan. Biokimia.
41: 1019–1025.
Palazon J., Cusido RM, Roig C. & Pinol MT 1997. Pengaruh gen rol dari
Agrobacterium rhizogenes TL-DNA pada produksi nikotin dalam kultur
akar tembakau. Tanaman. Fisik. Bioch.
35: 155–162.
Palazon J., Mallol A., Eibl R., Lettenbauer C., Cusido RM
& Pinol MT 2003b. Pertumbuhan dan produksi ginsenosida dalam kultur
akar berbulu Panax ginseng menggunakan bioreaktor baru.
Tanaman. Dengan. 69: 344–349.
Pawar PK & Matheshwari VL 2003. Agrobacterium rhizogenes memediasi
induksi akar rambut pada dua keluarga penting secara medis. India J.
Biotechnol. 3: 414–417.
Pirian K., Piri Kh. & Ghiyasvand T. 2012. Induksi akar rambut dari Protulaca
oleracea menggunakan Agrobacterium rhizogenes untuk produksi
noradenaline. Int. Res. J.Appl. Dasar. Sains. 3:
642–649.
Porter JR 1991. Kisaran inang dan implikasi klaim oleh Agrobacterium
rhizogenes. Kritik. Pdt Tanaman Sci. 10: 387–421.
Putalun W., Pimmeuangkao S., De-Eknamkul W., Tanaka H. & Shoyama Y.
2006. Produksi Sennosida A dan B oleh akar rambut Senna alata (L.)
Roxb. Z. Ilmu Pengetahuan Alam. C.Biosci. 61: 367–371.
Samadi A., Carapetian J., Heidary R., Gafari M. & Hssanzadeh A. 2012.
Induksi akar rambut pada Linum mucronatum ssp. mucronatum
merupakan pabrik produksi lignan anti tumor. Bukan.
Bot. Kebun sayur Agrobot Ayat 40: 125–131 .
Sanford RA & Hutchings GP 1987. Kitosan-aplikasi komersial biopolimer
kationik alami, hlm. 363–376.
Dalam: Rapalma M. (ed.) Polisakarida Industri. Rekayasa Genetika,
Hubungan dan Aplikasi Struktur/Properti, Am sterdum, Belanda.
Sevon N., Hiltunen R. & Oksman–Caldentey KM 1992. Chi tosan
meningkatkan kandungan hyoscyamine dalam kultur akar berbulu
Hyoscyamus muticus. Farmasi. Pharmacol. Lett. 2: 96–99.
Sharafi A., Hashemisohi H., Mousavi A., Azadi P., Razavi Kh.
& Otang Nuti V. 2013. Protokol yang andal dan efisien untuk
menginduksi akar rambut pada Papaver bracteatum. Sel tanaman. Tis.
Org. Sekte 113: 1–9.
Smetanska I. 2008. Produksi Metabolit Sekunder Menggunakan Kultur Sel
Tumbuhan. Lanjut Biokimia. Eng. Bioteknologi. 111: 187– 228.
Soleimani T., Keyhanfer M., Piri KH & Hsanloo T. 2012. Mor phological
evaluasi akar berbulu diinduksi di Artemisia annua L. dan menyelidiki
efek elisitasi pada produksi biomassa akar berbulu. Internasional J.Agri.
Res & Wahyu 2: 1005–1013.
Weber RLM & Bodanese-Zanettini MH 2011. Induksi Akar Rambut
Transgenik pada Genotipe Kedelai dengan Transformasi Agrobac
terium rhizogenes-mediated. Pesqui. Pecu agro. Bra. 46: 1070–1075.
Yoshikawa M. 1978. Beragam mode aksi elisator phytoalexin biotik dan
abiotik. Alam. 275: 546–547.
Xu H., Park JH, Kim YK, Park N., Lee SY & Un S. 2009.
Optimalisasi pertumbuhan dan produksi pyranocoumarins pada kultur
akar rambut Angelica gigas Nakai. J.Med. Tanaman.
Res. 3: 978–981.
Diterima 16 September 2013
Diterima 27 Maret 2014