Penyimpanan beku (cryopreservation) semen ayam Ghagus: pengaruh zat pengawet, pelarut, dan

suhu pencairan.

Abstrak

Penelitian ini mengevaluasi efek krioprotektan, pengencer semen, dan suhu pencairan selama
kriopreservasi semen ayam Ghagus. Empat percobaan yang berbeda dilakukan; Percobaan 1 -
semen dibekukan dengan menggunakan 6% dimethylacetamide (DMA) dan 2%
dimethylsulfoxide (DMSO) dalam pengencer Sasaki (SD) dan pengencer Lake and Ravie (LRD),
Percobaan 2 dan 3 - semen dibekukan dengan menggunakan 8% Ethylene Glycol (EG) dalam
SD, LRD dan Red Fowl Extender (RFE), Percobaan 4 - semen dikriopreservasi menggunakan
6% dimethylformamide (DMF) dalam SD, LRD dan Beltsville Poultry Semen Extender (BPSE).
Semen dibekukan dalam 0,5 ml sedotan Prancis. Pencairan dilakukan pada suhu 5°C selama 100
detik dalam air es pada Percobaan 1, 2 dan 4, sedangkan pada Percobaan 3 pencairan dilakukan
pada suhu 37°C selama 30 detik. Pasca motilitas sperma pencairan, sperma hidup dan persen
sperma utuh akrosom secara signifikan (P<0,05) lebih rendah pada sampel kriopreservasi di
semua percobaan. Tidak ada sel telur yang subur yang diperoleh dari sampel kriopreservasi pada
Percobaan 1 dan 2, kecuali untuk perlakuan RFE EG 8% yang memiliki tingkat kesuburan
0,83%. Pada Percobaan 3 dan 4, fertilitas tertinggi diperoleh pada perlakuan LRD masing-
masing 48,12 dan 30,89%. Kesimpulannya, dengan menggunakan krioprotektan EG (8%) dan
pencairan pada 37°C selama 30 detik, dan DMF (6%) menghasilkan tingkat kesuburan yang
dapat diterima pada ayam Ghagus.

Meskipun pengencer mempengaruhi parameter semen in vitro pasca pencairan, namun

kesuburannya tidak terpengaruh. Selain itu, hasil penelitian menunjukkan bahwa suhu pencairan
mungkin merupakan tahap kritis dalam protokol kriopreservasi.

1 PENDAHULUAN

Kriopreservasi semen merupakan suatu pendekatan untuk konservasi sumber daya genetik ex-
situ jangka panjang dengan efektivitas biaya dan kesederhanaan teknik (Silversides et al., 2012).
Kemampuan pembuahan dan viabilitas sperma yang dikriopreservasi berbeda antara jenis ayam

memerlukan standarisasi protokol kriopreservasi semen spesifik ras atau galur (Blesbois 2011;
Long 2006). Ghagus adalah jenis ayam asli India yang penting dengan saluran asli di negara
bagian Karnataka. Unggas ini berukuran sedang dengan kemampuan beranak dan sifat keibuan
yang baik (Haunshi et al., 2015). Upaya-upaya sedang dilakukan untuk konservasi ex-situ jenis
ayam ini.

Pengencer yang digunakan selama kriopreservasi semen pada dasarnya harus membantu
mempertahankan struktur dan kapasitas fungsional sperma selama dan setelah kriopreservasi.
Beberapa penelitian telah membandingkan efek pengencer/ekstrender selama kriopreservasi
semen ayam (Nabi dkk., 2016; Rakha dkk., 2016; Roushdy dkk., 2014; Shanmugam dan
Mahapatra, 2019). Selain komponen energi dan penyangga dalam pengencer yang digunakan
untuk kriopreservasi semen, zat-zat seperti polivinilpirolidon dan asam glutamat juga disertakan
untuk mendukung sperma selama prosedur kriopreservasi. Pengencer dengan komponen minimal
yang dapat mendukung sperma selama penyimpanan cairan mungkin tidak dapat digunakan
selama kriopreservasi (Shanmugam dan Mahapatra, 2019).

Krioprotektan yang digunakan untuk kriopreservasi semen dengan sendirinya sangat

mempengaruhi parameter semen pasca-pencairan dan kesuburan (Long, 2006). Gliserol
merupakan krioprotektan semen unggas yang paling tidak toksik dan efektif, namun konsentrasi
di atas 1% selama inseminasi menghasilkan efek kontrasepsi (Lake et al., 1980) sehingga perlu
dihilangkan sebelum inseminasi.

Berbagai krioprotektan lain seperti dimetilsulfoksida (DMSO), etilen glikol, dan yang termasuk
dalam kelompok amida seperti dimetilasetamida, dimetilformamida, dan metilasetamida
digunakan untuk kriopreservasi semen unggas dan semen dapat digunakan untuk inseminasi
tanpa menghilangkan krioprotektan.

Protokol kriopreservasi semen untuk mengawetkan jenis Ghagus tidak tersedia. Percobaan ini
bertujuan untuk mengembangkan protokol kriopreservasi semen untuk ayam Ghagus dan
mempelajari pengaruh berbagai krioprotektan, pengencer semen, dan suhu pencairan.

2 BAHAN DAN METODE

2.1. Unggas percobaan dan pemeliharaan

Percobaan dilakukan di peternakan unggas eksperimental di ICAR-D 56, Direktorat Penelitian

Unggas, Hyderabad, India. Unggas ditempatkan dalam kandang individu di dalam kandang
terbuka dan pakan dan air tersedia secara ad libitum selama periode percobaan. Penelitian ini
terdiri dari empat percobaan independen dan dilakukan setelah mendapat persetujuan dari
Komite Etika Hewan Institusional.

2.2 Prosedur eksperimen

Percobaan 1

Semen dari lima belas ayam jantan Ghagus (usia 32 minggu) dikumpulkan dengan pemijatan
perut (Burrows dan Quinn, 1937), ditampung dan digunakan untuk percobaan. Satu alikuot
semen yang terkumpul dievaluasi untuk mengetahui konsentrasi sperma, motilitas progresif,
sperma hidup dan sperma abnormal. Semen dibekukan dengan menggunakan 6% DMA dan 2%
DMSO dalam dua pengencer, pengencer Sasaki (D (+) - glukosa- 0,2 g, D (+) - trehalosa
dehidrat- 3,8 g, asam L-glutamat, garam monosodium- 1. 2 g, Kalium asetat- 0,3 g, Magnesium
asetat tetrahidrat- 0,08 g, Kalium sitrat monohidrat- 0,05 g, BES- 0,4 g, Bis-Tris- 0,4 g dalam
100 ml akuades, pH akhir 6,8; Sasaki et al, 2010) dan pengencer Lake and Ravie (LR) (natrium
glutamat 1,92 g, glukosa 0,8 g, magnesium asetat 4H2O 0,08 g, kalium asetat 0,5 g,
polivinilpirolidon [massa molekul relatif (Mr) = 10.000] 0,3 g dan akuades 100 ml, pH akhir
7,08, osmolalitas 343 mOsm/kg; Lake and Ravie, 1984). Semen yang telah dicampur dengan
krioprotektan dengan konsentrasi sperma akhir 2000 x 106/ml segera dimasukkan ke dalam
sedotan Perancis 0,5 ml dan ditutup dengan bubuk polivinil alkohol. Sedotan ditempatkan 4,5 cm
di atas nitrogen cair (LN2) di atas rakit styrofoam yang mengapung di atas LN2 dalam kotak
termokopel dan terpapar uap nitrogen selama 30 menit. Sedotan kemudian dimasukkan ke dalam
LN2 dan disimpan sampai digunakan lebih lanjut. Semen sedotan disimpan selama minimal
tujuh hari sebelum dievaluasi.

Evaluasi pasca-pencairan dan inseminasi semen dilakukan setelah pencairan pada suhu 5°C
selama 100 detik di dalam air es (Sasaki et al., 2010). Sampel dievaluasi pada tujuh kesempatan
yang berbeda untuk mengetahui motilitas sperma progresif, sperma hidup, sperma abnormal, dan
akrosom sperma utuh. Semen yang telah dicairkan diinseminasikan per vagina ke dalam ayam
Ghagus berumur 33 minggu (13 ekor/perlakuan) dengan dosis 200 juta sperma/0,1 ml volume.
Inseminasi diulang tiga kali dengan interval tiga hari. Semen yang baru ditampung dan
diinseminasi berfungsi sebagai kontrol. Telur dikumpulkan dari hari kedua dan seterusnya
setelah inseminasi pertama dan disimpan di ruang dingin (15°C) sampai inkubasi. Telur-telur
tersebut dibakar pada hari ke-18 inkubasi untuk melihat perkembangan embrio. Telur yang tidak
subur dipecahkan 86 untuk pemeriksaan dan konfirmasi tidak adanya pertumbuhan embrio. Hasil
daya tetas diperoleh pada hari ke-21 inkubasi.

Eksperimen 2

Semen sapi Ghagus (umur 41 minggu) dikriopreservasi seperti pada Eksperimen 1 dengan
sedikit modifikasi. Etilen glikol dengan konsentrasi akhir 8% digunakan sebagai krioprotektan
dan tiga pengencer semen yaitu pengencer Sasaki, pengencer Lake dan Ravie dan Red Fowl
Extender (RFE; Fruktosa - 1,15 g, Natrium glutamat - 2,1 g, Polivinilpirolidon - 0,6 g, Glisin -
0,2 g, Kalium asetat - 0,5 dalam 100 ml akuades, pH akhir 7, osmolalitas 380 mOsm/kg; Rakha
et al, 2016) dievaluasi. Air mani pasca pencairan dievaluasi pada enam kesempatan untuk
mengetahui motilitas sperma progresif, sperma hidup, sperma abnormal, dan akrosom sperma
utuh. Semen yang telah dicairkan diinseminasikan pada ayam Ghagus berumur 46 minggu (15
ekor/perlakuan) dengan dosis 200 juta sperma dalam volume 0,1 ml. Inseminasi diulang tiga kali
dengan interval empat hari. Inseminasi menggunakan semen segar berfungsi sebagai kontrol.
Telur pasca inseminasi diinkubasi dan data parameter fertilitas diperoleh seperti pada Percobaan
1.

Eksperimen 3
Pada percobaan ini, semen sapi Ghagus (usia 54 minggu) dikriopreservasi dan dievaluasi serupa
dengan Percobaan 2, kecuali bahwa sedotan semen dicairkan pada suhu 37°C selama 30 detik.
Semen yang telah dicairkan diinseminasikan ke dalam ayam Ghagus berumur 54 minggu (15
ekor/perlakuan) dengan dosis 200 juta sperma dalam volume 0,1 ml. Inseminasi diulang tiga kali
dengan interval empat hari. Telur pasca inseminasi diinkubasi dan data parameter fertilitas
diperoleh seperti pada Percobaan 1.

Percobaan 4

Semen Ghagus (umur 54 minggu) dikriopreservasi seperti pada Percobaan 1 dengan sedikit
modifikasi. Dimethylformamide dengan konsentrasi akhir 6% digunakan sebagai krioprotektan
dan tiga pengencer semen yaitu pengencer Sasaki, pengencer Lake and Ravie dan Beltsville
Poultry Semen Extender (BPSE; Fruktosa-0,3 g, Kalium sitrat-0,0384 g, Natrium glutamat-0.
5202 g, Magnesium klorida - 0,0204 g, di-Potasium hidrogen fosfat - 0,762 g, TES - 0,317 g,
Kalium di-hidrogen fosfat - 0,039 g, Natrium asetat - 0,258 g dalam 100 ml akuades, pH akhir
7,3, osmolalitas 330 mOsm/kg; Rakha et al, 2016) dievaluasi. Air mani pasca pencairan
dievaluasi pada enam kesempatan untuk mengetahui motilitas sperma progresif, sperma hidup,
sperma abnormal, dan asosom sperma utuh. Semen yang telah dicairkan diinseminasikan pada
ayam Ghagus berumur 57 minggu (20 ekor/perlakuan) dengan dosis 200 juta sperma dalam
volume 0,1 ml. Inseminasi diulang tiga kali dengan interval empat hari. Inseminasi
menggunakan semen segar sebagai kontrol. Pasca telur pasca inseminasi diinkubasi dan data
parameter fertilitas diperoleh seperti pada Percobaan 1.