Machine Translated by Google

Penelitian Virus 189 (2014) 136–146

Daftar isi tersedia di ScienceDirect

Penelitian Virus
jurnal h om ep usia: www.elsevier.com/loc/virusres

Virus nekrosis hipodermal dan hematopoietik menular dari Brazil:

Sequencing, analisis komparatif dan deteksi PCR
Douglas CD Silvaa, Allan RD Nunes a, Dárlio IA Teixeirac, João Paulo MS Lima b,d,
Daniel CF Lanzaa,ÿ
Aplikasi Laboratório de Biologia Molecular – LAPLIC, Departamento de Bioquímica, Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Natal, RN, Brazil b Laboratório
de Glicobiologia Molecular, Departamento de Bioquímica, Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Natal, Brazil c Escola Agrícola de
Jundiaí, Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Brasil
D
Programa de Pós-Graduac¸ ão em Bioquímica, Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Natal, RN, Brazil

info artikel abstrak

Sejarah artikel: Fragmen nukleotida 3739 dari virus nekrosis hipodermal dan hematopoietik menular (IHHNV) dari Brasil diamplifikasi dan diurutkan. Fragmen ini
Diterima 15 Januari 2014 berisi seluruh rangkaian pengkodean protein virus, 3 wilayah lengkap yang belum diterjemahkan (3 UTR) dan sebagian rangkaian 5 wilayah yang
Diterima dalam bentuk revisi 7 Mei 2014 belum diterjemahkan (5 UTR). Organisasi genom IHHNV mengungkapkan tiga domain pengkodean utama yang khas: ORF1 kiri tahun 2001 bp yang
Diterima 11 Mei 2014 mengkode NS1, ORF2 kiri (NS2) 1091 bp yang mengkode NS2 dan ORF3 kanan 990 bp yang mengkode VP.
Tersedia online 24 Mei 2014

Urutan nukleotida dan asam amino dari ketiga protein virus dibandingkan dengan urutan asam amino yang diduga dari virus yang dilaporkan dari
Kata kunci: wilayah berbeda. Perbandingan antar genom dari lokasi geografis yang berbeda mengungkapkan 31 wilayah nukleotida yang 100% serupa,
Nanisme udang
didistribusikan ke seluruh genom. Analisis struktur sekunder wilayah UTR menunjukkan wilayah dengan probabilitas tinggi membentuk jepit rambut,
Sindrom Bintik Putih
Penaeus stitlirostris densovirus yang mungkin terlibat dalam mekanisme replikasi virus. Selain itu, analisis kemungkinan maksimum menunjukkan bahwa IHHNV Brasil termasuk

Brevidensovirus dalam garis keturunan III, dalam kelompok IHHNV menular, dan dikelompokkan dengan isolat IHHNV dari Hawaii, Tiongkok, Taiwan, Vietnam, dan
Korea Selatan. PCR bersarang baru yang menargetkan wilayah nukleotida yang dilestarikan diusulkan untuk mendeteksi IHHNV.

© 2014 Elsevier BV Hak cipta dilindungi undang-undang.

1. Perkenalan
Infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus (IHHNV)
merupakan salah satu virus patogen pada udang penaeid yang paling
sering kambuh di dunia (Lightner, 2011; Vega-Heredia et al., 2012).
Penyakit IHHN dan agen penyebabnya, IHHNV, pertama kali dijelaskan
pada awal tahun 1980an, sebagai penyebab epizootik akut dan kematian
massal pada udang biru (Litopenaeus stylirostris) yang dibudidayakan di
sistem raceway super intensif di Hawaii, menyebabkan epi zootik akut dan
kematian massal. (Brock dkk., 1983; Lightner, 1983, 1988). Setelah
penemuannya, IHHNV ditemukan tersebar luas pada budidaya udang di
Amerika Utara, Selatan, dan Tengah, Karibia, dan Indo-Pasifik (Lightner,
2011; Vega-Heredia et al.,
ÿ Penulis koresponden di: Laboratório de Biologia Molecular Aplicada – LAPLIC, Departamento
de Bioquímica, Centro de Biociências, Universidade Federal do Rio Grande do Norte, CEP:
59072-970 Natal, RN, Brazil. Telp.: +55 84 3215 3416; faks: +55 84 3215 3415.
Alamat email: danielclanza@gmail.com,
daniel.lanza@cb.ufrn.br (DCF Lanza).
2012). Di Brazil, laporan resmi pertama mengenai kejadian IHHN terjadi
pada tahun 2009, di negara bagian Bahia dan penelitian selanjutnya telah
mengkonfirmasi keberadaan IHHNV di negara bagian lain di wilayah Timur
Laut Brazil (Trindade et al., 2009; Braz et al., 2009; Teixeira- Lopes dkk., 2011).
Prevalensi IHHNV juga telah dilaporkan di wilayah lain di dunia, seperti
Tiongkok, India, dan Australia. Analisis filogenetik menunjukkan bahwa
IHHNV Amerika diintroduksi dari Filipina (Tang et al., 2003; Krabsetsve et
al., 2004; Tang dan Lightner, 2006) dan bahwa IHHNV India berasal dari
Asia Tenggara (Rai et al., 2009).
Manifestasi khas dari penyakit yang disebabkan oleh IHHNV pada
Litope naeus vannamei meliputi retardasi pertumbuhan dan sindrom
deformitas kerdil, yang ditandai dengan kelainan bentuk kutikula seperti
mimbar yang bengkok, kutikula yang melepuh, kelainan pada perut, dan
antena nae yang keriting (Kalagayan dkk., 1991; Browdy dkk . ., 1993).
IHHNV menyebabkan tingkat kematian yang tinggi pada L. stylirostris
beberapa tahun setelah keadaan darurat, namun spesies ini telah menjadi
toleran terhadap infeksi (Morales Covarrubias et al., 1999; Tang dan
Lightner, 2002). Meskipun L. vannamei dan Penaeus monodon tidak
menunjukkan tingkat kematian yang signifikan akibat infeksi IHHNV,
kerugian ekonomi dan produksinya patut diperhatikan, terutama karena berkurangnya da

http://dx.doi.org/10.1016/j.virusres.2014.05.008
0168-1702/© 2014 Elsevier BV Hak cipta dilindungi undang-undang.
Machine Translated by Google

DCD Silva dkk. / Penelitian Virus 189 (2014) 136–146 137

pertumbuhan yang menghasilkan udang berukuran kecil pada saat panen (Bell dan Tabel 1

lebih ringan, 1984; Kalagayan dkk., 1991; Primavera dan Quinitio, Primer yang dirancang dalam penelitian ini untuk amplifikasi genom IHHNV.

2000). Nama primer Urutan primer (5 –3 ) Ukuran amplikon Tm (ÿC)

IHHNV diklasifikasikan sebagai Penaeus stylirostris densovirus (PstDNV) PF1 63.63
ATGTCAACGGACAGGTGTCAACACTG 662 hal
dalam keluarga Parvoviridae, sub-keluarga Densovirinae (Fauquet et al., PR1 AATAAAGTCGGGTTGTGTTCCGCTA 62.76
2005). Ini adalah virus udang penaeid terkecil, yang tidak berselubung PF2 GAAATAAAAGAACCAGAAACTCCA 606 pb 55.55
dan virion icosaedral dengan diameter rata-rata 22–23 nm dan mengandung PR2 TCATATATGGACATGGTCCGTCTA 58.42
PF3 ATATCAAGAGATGGATACTCTATCT 588 pb 53,95
DNA untai tunggal linier dengan panjang ÿ3,9 kb (Shike
PR3 TAAGAGATTTTCCTGTTCCTGT 54.73
dkk., 2000; Rai dkk., 2011; Kim dkk., 2012). genom IHHNV PF4 CCAACAACGACATCCCGTGTACCAG 63,88
638 hal
terdiri dari 3 bingkai bacaan terbuka besar, ORF kiri 1 dan PR4 TCGTCTTCATTATGTGCATCCCTCC 62.70
2 yang mengkodifikasi protein non struktural dan kanan OFR 3 itu PF5 ATCACCAGCGACGACTTCCTAGG 663 hal 63,90
PR5 CCAAATTGTTGGATTGGGTCTTCAT 60.28
mengkodifikasi protein kapsid virus (Mari et al., 1993; Shike et al.,
PF6 AAGGATACTACTGGACTACATAATC 415 pb 55.23
2000). Sampai saat ini, ada delapan rangkaian genom lengkap IHHNV PR6 GGAAGAAGTCGGCTTGTACTCT 59.77
tersedia di GenBank. Dua urutan sesuai dengan isolat dari PUTF1 GACGAGTGAAGAGGCTATTCCAAGT 594 hal 62.35
Benua Amerika, satu genom lengkap dari Hawaii (Aksesi No. AF218266; 3909 PUTR1 CTTGGAGAAATTCCCTGGCTGGAGT 64.56
bp), dan urutan pengkodean lengkap PUTF2 TTGGAAACCTAGTCTACCCAGC 574 hal 59.43
PUTR2 CAGAAACCGTTAACTTAATATGTGA 55.68
(CDS) dari isolat Meksiko (GenBank Accession No. AF273215;
3873 hal). Genom dan urutan pengkodean lengkap dari yang lain
belahan dunia seperti Cina, India, Korea, Vietnam, Taiwan,
Thailand, Filipina dan Indonesia juga tersedia. Dua rangkaian IHHNV terkait
tidak menular yang dirancang sebagai Tipe A dan Tipe B dirancang untuk penelitian ini dijelaskan pada Tabel 1. PCR dilakukan
terdeteksi di P. monodon. Tipe A ditemukan dalam sampel dari keluar dalam reaksi 20 L, mengandung ÿ1 g total DNA yang diekstraksi,
Madagaskar dan Australia dan Tipe B terdeteksi di Tanzania 5 pmol setiap primer, 4 mM MgCl2, 0,5 U DNA pol (Biotools),
(Tang dkk., 2003; Krabsetsve dkk., 2004; Tang dan Lightner, 2006). dan 200 M setiap dNTP. Amplifikasi dilakukan dengan menggunakan a
Tipe A dan B yang berhubungan dengan virus mengandung tiga ORF dan Life Touch Thermal Cycler TC-96 (BIOER) dan siklus berikut
elemen pengatur khas IHHNV dan menunjukkan perbedaan yang signifikan parameter: denaturasi awal pada 94 ÿC selama 3 menit, diikuti 40
bila dibandingkan dengan spesies menular (Tang et al., 2003; Tang siklus 94 ÿC selama 1 menit, 55 ÿC selama 1 menit, dan 72 ÿC selama 2 menit, dan
& Lightner, 2006). ekstensi terakhir pada suhu 72 ÿC selama 5 menit. Setelah amplifikasi, alikuot dari
Urutan terkait IHHNV dapat diintegrasikan ke dalam genom produk PCR dianalisis dalam pewarnaan gel agarosa 1,0 atau 1,5%.
P. monodon seperti yang dilaporkan sebelumnya pada sampel udang dari Afrika, dengan etidium bromida lalu difoto.
Australia dan India (Tang dan Lightner, 2006; Rai et al., 2009). Jatuh tempo Urutan genom dilakukan dari amplikon
Berdasarkan temuan ini, target baru untuk deteksi PCR telah dipilih dihasilkan menggunakan primer yang dijelaskan pada Tabel 1 dan parameter
Genom IHHNV, untuk menghindari wilayah virus terintegrasi ke dalam inang siklus berikut: pada 94 ÿC selama 3 menit, diikuti oleh 40 siklus
genom, atau untuk mendeteksi bagian terintegrasi dari genom virus 94 ÿC selama 1 menit, 59 ÿC selama 1 menit, dan 72 ÿC selama 2 menit, dan a
ke dalam genom inang (Tang et al., 2007; Rai et al., 2009). ekstensi akhir pada 72 ÿC selama 5 menit. Amplikon pengkodean dan
Dalam penelitian ini kami mengurutkan 3739 fragmen nukleotida dari IHHNV daerah nonkode dimurnikan dan diserahkan untuk diurutkan
Brasil yang terdeteksi pada sampel L. vannamei, dan menggunakan formulir plat Applied Biosystems® 3500 Genetic Analyzer, sesuai
membandingkan urutan ini dengan genom dan CDS yang tersedia di Gen Bank. dengan spesifikasi pabrikan. Semua amplikon
Setelah itu, urutan nukleotida dilestarikan dan diduga diurutkan setidaknya dua kali (maju dan mundur), dirakit menggunakan nilai
Struktur sekunder DNA dalam genom IHHNV diamati dan kualitas panggilan dasar dan divalidasi menggunakan yang telah ditentukan sebelumnya
hubungan filogenetik antar isolat IHHNV yang berbeda parameter perangkat lunak Geneious (Geneious versi 7.0 Biomat ters. Tersedia
wilayah geografis disimpulkan. Selain itu, PCR bersarang baru untuk dari http://www.geneious.com/) dan visual yang cermat
Deteksi IHHNV diusulkan. inspeksi.

2. Bahan-bahan dan metode-metode

2.3. Analisis urutan dan penyelarasan

2.1. Isolasi sampel dan ekstraksi DNA
Udang sub-dewasa L. vannamei (Boone, 1931) menjadi viral
gejala penyakit diambil sampelnya dari salah satu tambak udang yang berlokasi di
negara bagian Rio Grande do Norte, Brasil. Sampel dibersihkan
untuk menghindari kontaminasi eksternal dan disimpan dalam lemari pendingin
(ÿ20 ÿC), hingga ekstraksi DNA.
DNA diekstraksi dari 50 mg jaringan otot yang diekstraksi
dari ruas perut ketiga udang beku. Sampel jaringan dipotong dan segera
dipindahkan ke buffer yang berisi
proteinase K, sesuai dengan spesifikasi kit Jaringan NucleoSpin®.
Setelah pemurnian, DNA dielusi menggunakan buffer EB (5 mM Tris/HCl,
pH 8,5) dan diukur menggunakan Spektrofotometer NanoDrop 2000
(Ilmiah Thermo Fisher).
2.2. Deteksi dan pengurutan IHHNV Brasil
Pertama, IHHNV dideteksi menggunakan primer PF3 dan PR3 yang
dirancang khusus untuk penelitian ini. Semua urutan primer
Karakterisasi IHHNV Brazil dan analisis komparatif pertama dengan sekuens
lain yang tersedia di GenBank
dilakukan dengan menggunakan Basic Local Alignment Search Tool (BLAST)
(Altschul et al., 1997) dari Pusat Informasi Bioteknologi Nasional (NCBI).
Bingkai bacaan terbuka (ORF) adalah
ditentukan menggunakan perangkat lunak pencari ORF (http://www.ncbi.nlm.
nih.gov/gorf/gorf.html). Prediksi urutan asam amino dan analisis komparatif antara urutan
nukleotida dan asam amino
dilakukan dengan menggunakan perangkat lunak Geneious (ver. 7.0, Biomat
ters). Penyelarasan beberapa urutan dari pengkodean urutan IHHNV
dilakukan dengan menggunakan algoritma Muscle (Edgar, 2004) dengan
parameter default dalam paket perangkat lunak Jalview Versi 2.8
(Waterhouse dkk., 2009). Seluruh wilayah nukleotida dilestarikan
urutan diidentifikasi menggunakan program MEGA5 Versi 5.2
(Tamura et al., 2011) dan dikonfirmasi secara visual.
Struktur sekunder nukleotida diprediksi dan model Energi Bebas Minimum
(MFE) dihasilkan oleh RNAfold
(Gruber et al., 2008), menggunakan parameter DNA dan mengubah skala
parameter energi hingga suhu 28 ÿC.
Machine Translated by Google
138 DCD Silva dkk. / Penelitian Virus 189 (2014) 136–146
2.4. Analisis filogenetik
Pohon filogenetik dibangun dari penyelarasan sekuens IHHNV parsial yang
terdiri dari daerah pengkode ORF1, ORF2 dan ORF3, menggunakan program
MEGA5 Analisis Genetika Evolusioner Molekuler Versi 5.2 (Tamura et al., 2011).
Rekonstruksi filogenetik dilakukan dengan menggunakan metode diskrit kemungkinan
maksimum.
Model HKY (Hasegawa et al., 1985) dipilih setelah analisis model substitusi
nukleotida yang paling sesuai, menggunakan estimasi parameter gamma (+G). Uji
model dan rekonstruksi pohon filogenetik dilakukan dengan menggunakan
penghapusan menyeluruh untuk celah dan filter pertukaran cabang yang sangat
kuat. Panjang cabang horizontal sebanding dengan laju substitusi nukleotida, dan
angka yang ditunjukkan pada titik cabang menunjukkan 1000 nilai bootstrap, yang
menentukan indeks kepercayaan di dalam pohon.
2.5. PCR bersarang dan uji pengenceran serial
Total DNA yang diekstraksi dari sampel udang positif IHHNV dilakukan
pengenceran serial dengan faktor 5. Reaksi PCR pertama dilakukan menggunakan
primer PF3 dan PR3 dan 125 ng total DNA. Setelah reaksi pertama, masing-masing
dari tujuh produk reaksi digunakan sebagai templat dalam PCR bersarang, yang
menggunakan primer PF3 dan PR2. Parameter siklus berikut digunakan dalam dua
langkah: 94 ÿC selama 3 menit, diikuti oleh 40 siklus 94 ÿC selama 1 menit, 59 ÿC
selama 1 menit, dan 72 ÿC selama 2 menit, dan perpanjangan akhir pada 72 ÿC
selama 5 menit. Produk amplifikasi dianalisis pada gel agarosa yang diurutkan dari
pengenceran terendah hingga tertinggi. Kontrol positif yang mengandung total DNA
dari udang yang positif terhadap IHHNV dan kontrol negatif yang berisi total DNA
dari udang yang tidak terinfeksi dimasukkan pada langkah pertama dan kedua.
Kontrol positif tambahan menggunakan primer spesifik dekapoda yang
diprakonisasikan oleh OIE, (143F 5 -TGCCTTATCAGCTNTCGATTGTAG -3 dan
145R 5 - TTCAGNTTTGCAACCATACTTCCC-3 ) menghasilkan amplikon 848 bp
digunakan untuk memverifikasi kualitas DNA yang diekstraksi.
3. Hasil dan Pembahasan
3.1. Amplifikasi genom virus
Awalnya, 21 sekuens yang tersedia di GenBank (Tabel 2) yang sesuai dengan
genom lengkap atau sekuens pengkodean IHHNV diselaraskan. Seperangkat primer
yang dianil di daerah dengan variabilitas rendah yang diselingi dalam genom IHHNV
dirancang untuk memperkuat IHHNV Brasil. Setiap primer yang digunakan dan
masing-masing ukuran amplikon dan suhu leleh dirinci dalam Tabel 1. Setelah
amplifikasi, delapan amplikon yang dihasilkan diurutkan dan seluruh rangkaian
dirangkai dari daerah yang tumpang tindih di setiap amplikon.
3.2. Analisis asam nukleat dan organisasi genom IHHNV Brasil
Urutan IHHNV Brasil terdiri dari 3739 nt dan mencakup semua wilayah
pengkodean, bagian utama dari 5 UTR (kekurangan ÿ160 nukleotida pada ujung 5
yang tidak diurutkan dalam penelitian ini), dan seluruh wilayah 3 UTR. Urutannya
ditunjukkan pada Gambar 1 dan memiliki komposisi basa 36,7% A, 23,9% C, 18,8%
G dan 20,6% T dan kandungan G + C dan A+ T dihitung masing-masing menjadi
42,7% dan 57,3%. Urutan IHHNV Brasil memiliki 99,7% kesamaan dengan genom
dari Hawaii (Gen Bank Accession No. AF218266.2) dan 99,6% kesamaan dengan
genom IHHNV dari Taiwan dan Ekuador (GenBank Accession bernomor AY355306
dan AY362548, masing-masing). Kemiripan terendah, (85,7%) diamati pada isolat
Australia (GenBank Accession
EU675312). Nilai kesamaan asam nukleat tambahan dari rangkaian IHHNV Brasil
dengan rangkaian genom parsial dan lengkap lainnya yang dilaporkan sejauh ini
dirinci dalam Tabel 2. Urutan IHHNV Brasil sangat mirip (>99,2%) dengan rangkaian
yang dilaporkan sebagai anggota kelompok menular , termasuk isolat dari Taiwan
(AY355306), Ekuador AY362548, China (EF633688 dan JX258653), México
(AF273215) dan Korea Selatan (JN377975)
(Lightner, 2011; Kim dkk., 2011). Perbandingan isolat IHHNV Brazil dengan IHHNV
non-infeksius memberikan kemiripan sebesar 86,0% dengan sekuens Tipe A
(GenBank Accession No. DQ228358) dan 91,3% dengan sekuens Tipe B dari Afrika
Timur (GenBank Accession No.
AY124937).
Prediksi daerah pengkode IHHNV Brazil mengungkapkan tiga domain pengkode
utama khas yang diidentifikasi dalam isolat IHHNV lainnya: ORF1 tengah yang
mengkode protein nonstruktural 1 (NS1) tahun 2001 nt, ORF2 kiri yang mengkode
protein nonstruktural 2 (NS2 ) sebesar 1092 nt dan ORF3 kanan yang mengkode
protein de kapsid IHHNV (VP) sebesar 990 nt. ORF dan prediksi urutan asam
aminonya ditunjukkan pada Gambar 1. ORF2 dan ORF3 berada dalam kerangka
pembacaan yang sama dan ORF1 dimulai 57 nt setelah nukleotida pertama ORF2,
dalam kerangka pembacaan yang berbeda. Organisasi genom IHHNV Brasil
digambarkan pada Gambar. 2, yang menunjukkan wilayah UTR 5 dan 3 dan wilayah
pengkodean yang disusun oleh tiga ORF tipikal.
Fragmen 162 nt milik 5 UTR yang tidak diurutkan dalam penelitian ini diwakili oleh
sebuah persegi dengan garis putus-putus.
Pencarian wilayah nukleotida yang dilestarikan dalam genom IHHNV dilakukan
untuk mengidentifikasi kemungkinan lokasi stabilitas genom, yang sering dikaitkan
dengan infeksi virus dan proses replikasi pada virus yang berbeda (Wang et al.,
2009; Kraft et al., 2013; Pollom dkk., 2013). Wilayah ini juga ideal untuk penargetan
PCR terutama pada kasus seperti IHHNV yang memiliki varian yang banyak.
Penyelarasan urutan IHHNV berbeda yang tersedia di GenBank (Tabel 2), termasuk
isolat Brasil, mengungkapkan 31 wilayah dengan panjang setidaknya 14 nt, yang
100% dilestarikan di semua virus (Gbr. 1). Wilayah yang dilestarikan pertama dari
ujung 5 genom IHHNV dinamai sebagai wilayah yang dilestarikan 1 (CR1) dan
wilayah berikutnya yang diidentifikasi diberi nomor yang sesuai (Gbr. 1). Hanya 3
dari 31 kawasan konservasi yang teridentifikasi berada di luar kawasan pengkodean.
Menarik untuk dicatat bahwa beberapa wilayah yang dilestarikan berhubungan
dengan domain yang dilestarikan dari protein virus dan wilayah pengatur dalam
genom, sementara wilayah lainnya berada di wilayah yang tidak mengkode domain
protein terstruktur. Poin-poin ini dibahas dalam topik berikut.
3.3. ORF1 dan protein non struktural 1 (NS1)
ORF1 dimulai pada nukleotida 488 dan berakhir pada nukleotida 2488 pada
kodon TAA. Ini mengkodekan NS1 yang mengandung 666 asam amino dan berat
molekul 75.765 kDa. Kemiripan urutan nukleotida ORF1 dari IHHNV dari Brasil
dibandingkan dengan urutan ORF1 yang tersedia di GenBank diberikan pada Tabel
2. Seperti yang sebelumnya diamati pada virus dari lokasi geografis lain, IHHNV
NS1 Brasil berisi motif inisiator replikasi yang umum untuk semua parvovirus terletak
antara aa 258 dan 315, dan hamparan karakteristik urutan aa yang dilestarikan dari
domain pengikatan NTP dan helicase, dimiliki oleh semua parvovirus yang terletak
antara aa 480 dan 579 (Afanasiev et al., 1991; Boublik et al., 1994; Shike dkk.,
2000;Rai dkk., 2011). Motif inisiator replikasi dan domain pengikatan NTP/helicase
pada IHHNV NS1 Brazil menunjukkan identitas 100% dengan semua isolat IHHNV.
Perkiraan urutan asam amino NS1 dibandingkan dengan urutan asam amino
yang diperkirakan diprediksi dari urutan yang tersedia di Genbank dan kesamaannya
tercantum pada Tabel 2. Urutan asam amino NS1 dari IHHNV Brasil menunjukkan
kemiripan yang tinggi dengan Hawaii (AF218266.2) dan Taiwan (AY355306) isolat.
Urutan asam amino ORF1 yang diprediksi hanya menunjukkan dua ion pengganti
dibandingkan dengan isolat Hawaii: perubahan dari aspartat menjadi
Machine Translated by Google

DCD Silva dkk. / Penelitian Virus 189 (2014) 136–146 139

Gambar 1. Urutan nukleotida sebagian genom IHHNV Brasil. Urutan asam amino yang diduga ORF1, ORF2 dan ORF3 ditunjukkan di atas urutan. Kodon start dan stop kodon yang
diduga berhubungan dengan setiap ORF berwarna abu-abu. Sinyal inisiasi transkripsi yang diduga (CA) dan sinyal poliadenilasi (ATAAA) digarisbawahi. Wilayah promotor P61 dicetak
tebal. Kawasan yang dilestarikan (CR) disorot dengan warna hitam. CR3 dan CR26 masing-masing menyertakan kodon start ORF1 dan ORF3, dan CR30 menyertakan kodon stop
ORF3. Domain protein yang dilestarikan yang dikodekan oleh ORF1 dan ORF3 disorot dalam warna abu-abu, dalam urutan asam amino masing-masing.
Machine Translated by Google

140 DCD Silva dkk. / Penelitian Virus 189 (2014) 136–146

Gambar 1. (Lanjutan )

asparagin di posisi 168 dan 461. Perbandingan dengan isolat Taiwan
menunjukkan satu substitusi di lokasi 160, dari asparagin menjadi treonin, dan
substitusi dari aspartat menjadi asparagin di lokasi 168.
Urutan nukleotida ORF1 menyajikan 24 wilayah yang dilestarikan (CR3-
CR26) dan beberapa wilayah ini terdiri dari situs-situs yang diketahui penting
dalam replikasi virus (Gbr. 1). Menariknya, meskipun diharapkan, untuk dicatat
bahwa beberapa kawasan yang dikonservasi berhubungan dengan segmen di
mana terjadi tumpang tindih ORF, khususnya yang berada di sebelah kodon
awal. CR3 terletak di titik persimpangan antara ORF 1 dan 2, meliputi kodon
inisiasi NS1 dan
CR26 dimulai pada kodon awal protein kapsid. CR16 dan CR18 berada di
dalam wilayah pengkodean motif replikasi lingkaran bergulir I dan II dan CR23
dan CR24 sesuai dengan bagian urutan pengkodean domain NTP-biding dan
helicase. CR25 terdiri dari bagian dari satu wilayah promotor IHHNV, yang
dijelaskan oleh Dhar et al.(2001).
3.4. ORF2 dan protein non-struktural 2 (NS2)
ORF2 dimulai pada nukleotida 432 dan berakhir pada nukleotida 1523 pada
kodon TAG, dengan demikian, hanya 56 nukleotida pertama ORF2 yang tidak
tumpang tindih dengan ORF1. ORF2 mengkodekan protein yang mengandung
Machine Translated by Google

DCD Silva dkk. / Penelitian Virus 189 (2014) 136–146 141

Gambar 1. (Lanjutan )

363 residu asam amino, dan berat molekul 42.076 kDa. A
perbandingan nukleotida dan prediksi urutan asam amino
IHHNV NS2 Brasil dengan semua rangkaian prediksi NS2 lainnya
tersedia di GenBank ditunjukkan pada Tabel 2. Prediksi amino
urutan asam NS2 dari IHHNV Brasil hanya memiliki satu substitusi, dari arginin
menjadi lisin di situs 240, jika dibandingkan dengan
isolasi Hawaii. Pergantian yang sama di situs 240 dan lainnya dari
treonin menjadi prolin diamati ketika IHHNV ORF2 Brasil
dibandingkan dengan NS2 isolat Taiwan. ORF 1 dan 2 berbagi delapan belas
kawasan konservasi (CR3–CR20). Hingga saat ini belum ada informasinya
tentang fungsi NS2 dan tentang kemungkinan domain fungsional
dari protein ini.

Meja 2
Perbandingan sekuens nukleotida dan asam amino prediksi IHHNV Brasil dan sekuens IHHNV lainnya yang tersedia di GenBank.

Negara/isolasi GenBank no Identitas genom (%) Identitas nukleotida (%) Identitas asam amino (%)

ORF1 ORF2 ORF3 ORF1 ORF2 ORF3

Hawaii AF218266 99,7 99,7 99,7 99,7 99.6 99,5 99.4

Taiwan A AY355306 99,6 99,8 99,6 99,7 99,4 99,2 99,7
Taiwan C AY355308 99,6 99,8 99,6 99,6 99,4 99,2 99.4
Ekuador AY362548 99,6 99,8 99,7 99,4 99,4 99,5 98.8
Cina EF633688 99,5 99,6 99,5 99,7 99,3 99,2 99,7
Meksiko AF273215 99,4 99,6 99,6 99,3 99,1 99,5 98,5
Cina JX258653 99,1 99,5 99,5 99,5 99,1 98,9 99.1
Korea Selatana JN377975 99.3 99.4 99.4 99.3 99 98.9 98,5
Cina KF214742 99,3 99,3 99,1 99,1 98,4 97,8 98,5
Vietnam JX840067 98,6 99,4 99,1 99,2 98,4 98,6 98.2
Vietnam KC513422 95,8 96,7 97,3 95,5 96,3 95,9 96.7
Thailand AY362547 95,6 97 97,6 94,9 96,7 97 96.7
Taiwan B AY355307 95,6 96,7 97,4 95,2 96,6 96,4 97
Thailand AY102034 95,7 96,6 97,3 95,3 96,3 95,9 97
Vietnam JN616415 95.6 94.6 96.8 97.2 84.2 88.6 98.8
Vietnam KF031144 95,6 96.3 96,8 95,2 95.7 95,3 96.7
Australia GQ475529 95,3 95.1 97,5 95,5 97 96,2 97.3
Indiaa GQ411199 93.5 96.2 97 93.5 87.6 95.3 95.8
Afrika Timur AY124937 91,3 92,5 – 91,1 91,8 – 96.7
DQ228358 86,0 87,0 – 87,3 84,3 – 93.3
Madagaskar
Australia EU675312 85,7 87,5 89.3 87,2 69,5 86 93

a Genom lengkap.
Machine Translated by Google

142 DCD Silva dkk. / Penelitian Virus 189 (2014) 136–146

5'UTR ORF2 ORF3 3'UTR

|| ||
|1 432 488 | 1.523 2.430 2.488 | 3.419 | 3.739

ORF1

Gambar 2. Organisasi genom genom IHHNV Brasil. Untai Plus dari barisan 3739 nt yang diurutkan dalam penelitian ini diwakili oleh persegi panjang. Wilayah ORF1, ORF2 dan
ORF3 diwakili oleh kunci dan nukleotida pertama dan terakhir dari setiap ORF diwakili oleh angka. Wilayah yang belum diterjemahkan (UTR) ditampilkan dalam warna abu-abu.
Kotak bertitik sesuai dengan fragmen 5 UTR yang mungkin ada dalam genom IHHNV Brasil tetapi tidak diurutkan dalam penelitian ini.

3.5. ORF3 dan protein kapsid virus (VP)
ORF3 berada dalam kerangka pembacaan yang sama dengan ORF2: dimulai
pada nukletida 2430 dan berakhir pada nukleotida 3419 pada kodon TAA, dan
memiliki wilayah 59 nukleotida yang tumpang tindih dengan ujung ORF1.
Ini mengkodekan protein kapsid virus dari 329 asam amino, sesuai dengan berat
molekul 37.429 kDa. Tingkat kesamaan antara nukleotida dan urutan asam amino
yang diprediksi dari IHHNV VP Brasil dan semua urutan koresponden IHHNV lainnya
yang tersedia di GenBank ditunjukkan pada Tabel 2. Urutan asam amino dari IHHNV
VP Brasil identik dengan VP dari isolat Cina dan berbeda dari
VP dari Hawaii dan Taiwan melakukan isolasi hanya dengan substitusi dari asparagin
menjadi glutamat pada posisi 44.
Mungkin, VP adalah protein unik yang menyusun sisi tutup IHHNV, dan fitur ini
tidak ditemukan pada parvovirus lain. Struktur protein VP diselesaikan dengan
kristalografi sinar-X dan menunjukkan delapan elemen sekunder parvoviral yang
dilestarikan yang membentuk motif barel “jelly roll”, serupa dengan yang ditemukan
pada banyak virus icosahed ral, termasuk parvovirus lainnya (Kaufmann et al.,
2010 ) .
Unsur-unsur sekunder yang dilestarikan ini disorot dalam urutan asam amino yang
ditunjukkan pada Gambar. 1. Menarik untuk dicatat bahwa hanya CR27, dari 5 CR
yang diidentifikasi dalam ORF3, yang sesuai dengan unsur sekunder yang dilestarikan.

Gambar 3. Urutan daerah UTR, representasi braket struktur sekunder dan model energi bebas minimum (MFE) dari 5 hairpin UTR. Urutan 5 dan 3 UTR isolat IHHNV Hawaii
(GenBank Accession No. AF218266.2) dianalisis menggunakan perangkat lunak RNAfold. (A) Tanda kurung di bawah urutan nukleotida menunjukkan pasangan basa dan titik
menunjukkan daerah yang tidak berpasangan dalam struktur sekunder DNA. Jepit rambut dengan kemungkinan kemunculan tertinggi disorot dalam warna abu-abu dan wilayah
yang dilestarikan disorot dalam warna hitam. Urutan 77 nt yang diulang pada ujung 5 dan 3 digarisbawahi. (B) Model MFE dihitung menggunakan 154 nukleotida pertama yang
sesuai dengan 5 ujung untai plus isolat Hawaii. (C) Model MFE dihitung menggunakan urutan nukleotida 154 koresponden dari untai minus isolat Hawaii. Struktur B dan C diwarnai
menurut probabilitas pasangan basa. Warna merah menandakan probabilitas tinggi dan ungu menandakan probabilitas rendah suatu basa tertentu berpasangan atau tidak. Untuk
wilayah yang tidak berpasangan, warna menunjukkan kemungkinan tidak berpasangan. (Untuk interpretasi referensi warna dalam legenda gambar ini, pembaca dirujuk ke artikel versi web.)
Machine Translated by Google

DCD Silva dkk. / Penelitian Virus 189 (2014) 136–146 143

Brasil_IHHNV

JX258653.1_China
35
76 KF214742.1_China
39 JN377975.1_Corea Selatan
56 AY362548.1_Ekuador
Silsilah III
59 JX840067.1_Vietnam

AF218266.2_Hawaii

100 AY355308.1_Taiwan
55 EF633688.1_China

100 AF273215.1_Meksiko

GQ411199.1_India

AY362547.1_Thailand
99
JN616415.1_Vietnam
85
KC513422.1_Vietnam Silsilah II
100 48
AY102034.1_Thailand
77
AY355307.1_Taiwan B
80
KF031144.1_Vietnam

GQ475529.1_Australia Silsilah Saya

AY124937.1_Afrika Timur

EU675312.1_Australia
100 DQ228358.1_Madagaskar

0,02

Gambar 4. Pohon pylogenetika strain IHHNV berdasarkan genom parsial yang terdiri dari daerah pengkode ORF1, ORF2 dan ORF3. Hubungan filogenetik diperkirakan dengan
metode kemungkinan maksimum menggunakan program MEGA. Strain IHHNV yang menular dibagi menjadi tiga garis keturunan, dan IHHNV Brazil dikelompokkan dalam garis
keturunan III (panah hitam). Angka menunjukkan persentase dukungan bootstrap dari 1000 ulangan.

struktur di VP, mengingat struktur kristal yang dijelaskan oleh Kaufmann et
al., 2010. Analisis yang lebih cermat menunjukkan bahwa sebagian besar
wilayah CR berada di dalam loop VP yang dalam banyak kasus merupakan
wilayah tidak terstruktur atau dinamis. Daerah ini tidak mengkodekan
daerah terstruktur dari protein, namun tunduk pada tekanan seleksi yang
sama atau lebih besar dari daerah terstruktur. Mungkin, tidak adanya
struktur protein yang kaku mendorong konservasi urutan nukleotida dalam
beberapa cara.
3.6. wilayah UTR
Urutan nukleotida 5 UTR dari IHHNV Brazil, mengandung 431 nukleotida,
lebih sedikit 162 nukleotida jika dibandingkan dengan 5 UTR dari isolat
Hawaii. UTR 3 dari isolat Brazil menunjukkan 320 nukleotida, delapan
nukleotida tidak ada pada ujung 3 jika dibandingkan dengan 3 UTR isolat
Hawaii. Terlepas dari daerah yang tidak ada pada IHHNV Brazil, perbedaan
antara daerah UTR dari virus Brazil dan Hawaii adalah transisi dari guanin
ke ade sembilan di situs 151 di 5 UTR dan transisi dari adenin ke guanin
di situs 27 di 3 UTR. 5 UTR dan 3 UTR dari isolat IHHNV Brasil yang
disajikan di sini mungkin tidak lengkap, karena elemen khas yang dilaporkan
sebelumnya seperti kotak TATA, daerah palindromik, dan elemen pengatur
lainnya, yang diamati pada nukleotida pertama dari 5 UTR tidak terdeteksi
(Shike dkk . ., 2000;Rai dkk., 2011).
Karena kemiripannya yang tinggi dengan rangkaian IHHNV Brasil,
rangkaian 5 UTR dan 3 UTR lengkap dari isolat Hawaii digunakan untuk
mencari struktur sekunder, yang diperlukan untuk replikasi jepit rambut
yang diamati pada parvovirus (Tattersall dan Ward, 1976; Cotmore dan
Tattersall, 2006 ; Li dkk., 2012). Menganalisis model energi bebas minimum
(MFE) dari untai plus, beberapa daerah yang berpotensi membentuk jepit
rambut di daerah UTR diidentifikasi, seperti yang ditunjukkan dalam
representasi braket pada Gambar 3A. Skor probabilitas pasangan basa
tertinggi diamati pada jepit rambut pohon di dalam rangkaian 5 UTR, yang
pertama, dari 5 ekstremitas, yang terdiri dari wilayah nukleotida 62–96,
yang kedua wilayah dari nukleotida 293–320, dan yang terakhir terdiri dari
wilayah dari nukleotida 386–412 (Gbr. 3A). Pemeriksaan yang lebih detail
menunjukkan adanya sequence yang berulang, terletak pada 77 nt pertama
dari 5 UTR dan pada 77 nt terakhir dari 3 wilayah UTR, dengan orientasi
yang sama.
di kedua ekstremitas (Gbr. 3A wilayah yang digarisbawahi). Menariknya,
dengan menganalisis urutan berulang ini yang menyatu dengan 77
nukleotida berikutnya dari wilayah 5 UTR, dimungkinkan untuk mendeteksi
jepit rambut dengan probabilitas atau kejadian tinggi yang ditunjukkan
pada Gambar 3B. Jepit rambut ini lebih mungkin terjadi ketika urutan untai
minus yang sesuai digunakan untuk menghasilkan model MFE (Gbr. 3C).
Parvovirus yang menghadirkan 5 UTR dan 3 UTR ujung yang berbeda,
seperti virus kecil pada tikus, secara selektif merangkum untaian yang tidak
masuk akal sehubungan dengan transkripsi (Tattersall dan Ward, 1976;
Cotmore dan Tattersall, 2006). Prediksi jepit rambut ini dapat menjadi titik
awal untuk lebih memahami mekanisme replikasi IHHNV.
Tiga CR diidentifikasi dalam UTR: CR1 dan CR2 terletak di wilayah 5
UTR dan CR31 terletak di 3 UTR, seperti yang ditunjukkan pada Gambar.
1 dan 3A. CR31 berada dalam urutan berulang dan merupakan salah satu
kawasan konservasi terbesar yang teridentifikasi, dengan 30 nt.
3.7. Analisis filogenetik
Pohon filogenetik dibangun berdasarkan penyelarasan urutan IHHNV
pengkode nukleotida yang tersedia di GenBank, termasuk IHHNV Brasil
(Gbr. 4). Pohon kemungkinan maksimum menunjukkan bahwa IHHNV
dapat dibagi menjadi dua kelompok besar, satu kelompok sesuai dengan
kelompok isolat yang menghasilkan infeksi dan kelompok IHHNV lainnya
yang tidak mematikan, sesuai dengan yang dijelaskan sebelumnya oleh
(Kim et al., 2012 ) . Demikian pula, hasil kami mendukung pembagian
kelompok infeksi IHHNV dalam tiga kelompok usia yang berbeda. Garis
keturunan III terdiri dari virus JX258653.1, KF214742.1, JN377975.1,
AY362548.1, JX840067.1, AY355308.1, EF633688.1, AF273215.1 dan
isolat IHHNV Brazil. Garis keturunan II disusun oleh strain GQ411199.1,
AY362547.1, JN616415.1, KC513422.1, AY102034.1, AY355307.1,
KF031144.1, dan garis keturunan I disusun secara unik oleh strain
GQ475529.1 dari Australia .
Pembagian ini didukung oleh nilai bootstrap yang sangat tinggi, dan
menunjukkan potensi perbedaan genetik antar garis keturunan. Kelompok
tidak menular terdiri dari isolat dari Australia (EU675312.1) dan Madagaskar
(DQ228358.1).
Ketiga garis keturunan yang teridentifikasi tidak terbatas pada wilayah
geografis tertentu, dan lebih dari satu garis keturunan dapat muncul di
wilayah yang sama. Pengamatan ini menguatkan dengan beberapa penelitian itu
Machine Translated by Google

144 DCD Silva dkk. / Penelitian Virus 189 (2014) 136–146

Gambar 5. Deteksi PCR ke IHHNV semi-bersarang. Primer PF3/PR3 digunakan pada PCR pertama dan PF3/PR2 pada PCR bersarang. (A) Langkah PCR pertama, menggunakan cetakan DNA yang
dimasukkan ke dalam pengenceran serial dengan faktor 5. Jalur 1, reaksi dengan cetakan murni; jalur 2–7, reaksi menggunakan templat dimasukkan ke dalam pengenceran serial progresif dengan faktor
5 (jalur 2 = pengenceran terendah; jalur 7 = pengenceran tertinggi). Amplikon yang diharapkan pada langkah pertama memiliki 588 bp. (B) Reaksi bertingkat menggunakan produk reaksi langkah pertama
sebagai templat. Jalur 1, PCR bersarang menggunakan produk reaksi 1 langkah pertama sebagai template; jalur 2–7, PCR bersarang masing-masing menggunakan produk reaksi 2–7 dari langkah
pertama sebagai templat. Fragmen 153 bp menunjukkan hasil positif. M, tangga DNA; N, kontrol negatif; P, kontrol positif. (C) Kontrol kualitas DNA menggunakan primer spesifik dekapoda. DP, sampel
DNA udang yang digunakan sebagai kontrol positif; DN, sampel DNA udang digunakan sebagai kontrol negatif.

menunjukkan bahwa perdagangan hewan ternak merupakan salah satu cara
utama penyebaran virus (Lightner, 1988, 2011). Strain dari Afrika Timur
(AY124937.1) dan Australia (GQ475529.1) masih dapat mempertahankan ciri-
ciri IHHNV primitif. Sebagaimana ditunjukkan oleh variasi kecil dalam ukuran
cabang dalam setiap garis keturunan, peristiwa diferensiasi besar mungkin
terjadi sebelum virus menyebar ke seluruh dunia.
3.8. Deteksi IHHNV menggunakan nested PCR
Protokol PCR semi bersarang baru untuk deteksi IHHNV dengan
sensitivitas tinggi dan biaya rendah telah dikembangkan, menggunakan
primer yang merespons daerah dengan sedikit variabilitas genetik yang
mengkode motif inisiator replikasi dan domain pengikatan NTP dan helicase
di NS1. Protokol baru ini terdiri dari serangkaian primer pohon PF3, PR3 dan
PR2 (juga digunakan untuk pengurutan genom, ditunjukkan pada Tabel 1)
yang digunakan dalam dua reaksi PCR berikutnya. Pada reaksi pertama
primer PF3 dan PR3 digunakan dan amplikon 588 bp dihasilkan. Pada reaksi
kedua primer PF3 digunakan dengan primer PR2, yang sejajar dengan daerah
internal amplikon yang dihasilkan pada reaksi pertama. Reaksi bersarang
menghasilkan amplikon 153 bp. Strategi ini memungkinkan peningkatan
sensitivitas pengujian secara signifikan, sesuai dengan yang ditunjukkan
oleh pengenceran serial pada Gambar 5.
PCR bersarang meningkatkan sensitivitas tes setidaknya 5 kali dan
memungkinkan visualisasi yang jelas dari hasil positif dalam reaksi yang
dilakukan dengan menggunakan 5 ng total DNA sebagai templat ( Gbr. 5B).
Pengembangan penanda molekuler untuk mendeteksi IHHNV sangatlah
kompleks. Tingkat rata-rata substitusi nukleotida untuk IHHNV tinggi dan
sebanding dengan yang dilaporkan untuk virus RNA (Robles Sikisaka et al.,
2010). Selain itu, seperti yang diamati di sini dan dalam penelitian sebelumnya,
garis keturunan IHHNV tidak terbatas pada wilayah tertentu (Tang
Machine Translated by Google

DCD Silva dkk. / Penelitian Virus 189 (2014) 136–146 145

Tabel 3 Ucapan Terima Kasih

Beberapa primer yang digunakan untuk identifikasi IHHNV tersedia sejauh ini.

Nama primer Urutan primer 5 - 3a Referensi Kami mengucapkan terima kasih kepada CAPES dan FAPERN atas dukungan
finansial dan perusahaan Camanor yang menyediakan sampel udang yang digunakan
IHHNV392F GGGCGAACCAGAATCACTTA Tang dkk. (2000)
IHHNV392R ATCCGGAGGAATCTGATGTG dalam penelitian ini.
77012F ATCGGTGCACTACTCGGA OIE (2000)
77353R TCGTACTGGCTGTTCATC
389F CGGAACACAACCCGACTTTA OIE (2003) Referensi
389R GGCCAAGACCAAAAATACGAA
IHHNV309F TCCAACACTTAGTCAAAACCAA Tang dkk. (2007)
Afanasiev, BN, Galyov, EE, Buchatsky, LP, Kozlov, YV, 1991. Urutan nukleotida dan organisasi
IHHNV309R TGTCTGCTACGATGATTATCCA
genom virus densonukleosis Aedes . Virologi 185, 323–336.
IHHNV648F GAACGGCTTTCGTATTTTGG Rai dkk. (2009) Altschul, SF, Madden, TL, Schäffer, AA, Zhang, J., Zhang, Z., Miller, W., Lipman, DJ, 1997.
IHHNV648R AGCGTAGGACTTGCCGATTA
Gapped BLAST dan PSI - BLAST : program pencarian database protein generasi baru .
IHHNVF ATGTGCGCCGATTCAACAAG Tang dan Lightner Asam Nukleat Res. 25, 3389–3402.
IHHNVR1 CTAAGTGACGCGCGGACAATA (2002) Bell, TA, Lightner, DV, 1984. Virus IHHN : studi infektivitas dan patogenisitas pada Penaeus
IHHNV721F CTACTGCCTCTGCAACGAG Tang dan Lightner stylirostris dan Penaeus vannamei. Budidaya Perairan 38, 185–194.
IHHNV2860R GTGGGTCTGGTCCACTTGAT (2002) Boublik, Y. , Jousset, FX, Bergoin, M., 1994. Urutan nukleotida lengkap dan organisasi genom
IHHN3065F GACGACGAAGAATGGACAGA Tang dkk. (2003) Aedes albopictus parvovirus (AaPV) patogen untuk larva Aedes aegypti . Virologi 200, 752–
IHHN3065R TGCCTGGGTAGCTGGTATGTATA 763.
77012F ATCGGTGCACTACTGGGA Nunan dkk. (2000) Braz, RFS, Oliveira, CPR, Reis, LG, Martins, PCC, Penjualan, MP, Meissner, RV, 2009.
2553R CGGACAATATCCCTGACT Prevalensi virus nekrosis hipodermal dan hematopoietik menular ( IHHNV) pada Penaeus
I2814F vannamei yang dibudidayakan di timur laut Brasil. Budidaya Perairan 288, 143–146.
TAATGAAGACGAAGAACACGCCGAAGG Yang dkk. (2007)
Brock, JA, Lightner, DV, Bell, TA, 1983. Tinjauan terhadap empat penyakit virus (BP, MBV, BMN,
I3516R TGGGTAGACTAGGTTTCCAAGGGATGGTT
dan IHHNV) pada udang penaeid dengan referensi khusus untuk signifikansi klinis , diagnosis
a Basis yang digarisbawahi menunjukkan situs polimorfik. dan pengendalian dalam budidaya udang . Dalam: Prosiding Internasional ke -71 . Dewan
Eksplorasi Laut , CM 1983/Gen:10 / 1–18 .
Browdy, CL, Holloway, JD, King, CO, Stokes, IKLAN, Hopkins, JS, Sandifer, PA, 1993.
Virus IHHN dan kultur intensif Penaeus vannamei: pengaruh kepadatan penebaran dan nilai
tukar air . J. Biol Krustasea . 13, 87–94.
dan Lightner, 2002; Tang dkk., 2003). Selanjutnya, fragmen IHHNV disisipkan Cotmore, SF, Tattersall, P., 2006. Replikasi DNA Parvovirus . Dalam: DePamphilis, M.
(Ed.), Replikasi DNA dan Penyakit Manusia . Pers Laboratorium Cold Spring Harbor , Cold
dalam genom P. monodon yang dikumpulkan di Australia, Afrika dan India
Spring Harbor, NY, hlm.593–608 .
(Krabsetsve et al., 2004; Tang dan Lightner, 2006). Dhar, AK, Roux, MM, Klimpel, KR, 2001. Deteksi dan kuantifikasi virus nekrosis hipodermal dan
Semua faktor ini membenarkan perlunya pengembangan lanjutan dari primer hematopoietik menular serta virus bintik putih pada udang menggunakan PCR kuantitatif
spesifik, untuk menghindari hasil positif palsu dan negatif palsu. Primer yang waktu nyata dan kimia hijau SYBR . J.Klin . Mikrobiol. 39, 2835–2845.

direkomendasikan oleh Organisasi Kesehatan Hewan Dunia dapat memperkuat
rangkaian terkait IHHNV yang terdapat pada P. monodon, yang telah
terintegrasi ke dalam genom udang, sehingga menunjukkan hasil positif palsu
(Tang et al., 2006).
Beberapa primer untuk deteksi IHHNV telah dipublikasikan, termasuk primer
yang memungkinkan untuk mendeteksi urutan virus yang diintegrasikan ke
dalam genom udang (Tabel 3). Banyak dari bilangan prima ini yang efektif
untuk membedakan varian IHHNV, namun sebagian besar berlokasi di wilayah
yang memiliki situs polimorfik dalam genom, seperti yang ditunjukkan pada Tabel 3.
Tergantung pada lokasinya (kedekatan dengan wilayah 3), ketidakcocokan
dapat menurunkan efisiensi PCR atau menyebabkan penghambatan amplifikasi
sepenuhnya. Mempertimbangkan semua poin ini, sistem yang disajikan di sini
menawarkan dua keuntungan utama. Yang pertama adalah bahwa primer
dirancang untuk menyelaraskan wilayah yang mengkode domain protein NS1
virus yang dilestarikan, sehingga meningkatkan peluang untuk mendeteksi
varian virus dalam jumlah terbesar. Yang kedua adalah penggunaan primer
pohon dan peningkatan suhu anil primer yang digunakan dalam reaksi
bersarang menjadikan metode ini lebih sensitif tanpa kehilangan spesifisitas
reaksi.
Singkatnya, isolat IHHNV Brazil sangat mirip dengan isolat Hawaii, dan
berkerabat dekat dengan garis keturunan yang terdiri dari varian IHHNV yang
menular. Beberapa daerah nukleotida yang dilestarikan yang diidentifikasi
dalam genom IHHNV berhubungan dengan situs gen pengatur yang diduga
atau daerah yang mengkode domain protein yang dilestarikan. Namun dalam
beberapa kasus, konservasi suatu wilayah tertentu tidak dapat dikorelasikan
dengan fungsi biologisnya. Wilayah UTR menunjukkan segmen yang
berpotensi membentuk jepit rambut, dan urutan berulang 77 nt diamati pada
ekstremitas genom IHHNV. Tanpa diduga, sebuah jepit rambut yang diduga
berada di wilayah 5 UTR dari untai IHHNV positif terdeteksi, dan dapat menjadi
kandidat lokasi replikasi virus awal. Selain itu, protokol PCR bersarang baru
yang menggunakan primer pohon efisien untuk mendeteksi IHHNV dengan
sensitivitas tinggi. Hasil ini penting untuk mengarahkan penelitian lebih lanjut
tentang variabilitas genetik IHHNV dan untuk memandu desain penanda baru
untuk mendeteksi variannya, serta untuk pemahaman komprehensif tentang
regulasi gen dan mekanisme replikasi yang ada dalam keluarga virus ini.
Edgar, RC, 2004. OTOT: penyelarasan beberapa urutan dengan akurasi tinggi dan throughput
tinggi . Asam Nukleat Res. 32, 1792–1797.
Fauquet, CM, Mayo, MA, Maniloff, J., Desselberger, U., Ball, LA, 2005. Onomi Pajak Virus .
Laporan Kedelapan Komite Internasional Taksonomi Virus . _
Elsevier, Amsterdam.
Gruber, AR, Lorenz, R., Bernhart , SH, Neuböck, R., Hofacker, IL, 2008. Situs web Vienna RNA .
Asam Nukleat Res. 36 ( masalah Server Web ), W70–W74.
Hasegawa, M. , Kishino, H., Yano, T., 1985. Penanggalan pemisahan manusia -kera berdasarkan
jam molekul DNA mitokondria . J.Mol . berevolusi. 22, 160–174.
Kalagayan, G., Godin, D., Kanna, R., Hagino, G., Sweeny, J., Wyban, J., Brock, J., 1991.
Virus IHHN sebagai faktor etiologi dalam sindrom kelainan bentuk kerdil pada remaja Penaeus
vannamei yang dibudidayakan di Hawaii. J. Kultus Akuakultur Dunia . sosial. 22, 235–243.
Kaufmann , B., Bowman, VD, Li, Y., Szelei, J.,Waddell, PJ, Tijssen, P., Rossmann, MG, 2010.
Struktur Penaeus stylirostris densovirus , patogen udang . J.Virol . 84, 11289–11296.
Kim, JH, Choresca Jr., CH, Shin, SP, Han, JE, Jun, JW, Han, SY, Park, SC, 2011.
Deteksi virus nekrosis hipodermal dan hematopoietik menular ( IHHNV) pada udang
Litopenaeus vannamei yang dibudidayakan di Korea Selatan . Budidaya Perairan 313, 161–
164.
Kim , JH, Kim, HK, Nguyen, VG, Park, BK, Choresca, CH, Shin, SP, Han, JE, Jun, JW, Park, SC,
2012. Urutan genom virus nekrosis hipodermal dan hematopoietik menular ( IHHNV ) KLV -
2010-01 berasal dari wabah Korea pertama pada budidaya Litopenaeus vannamei.
Lengkungan. virus. 157, 369–373.
Krabsetsve , K., Cullen, BR, Owens, L., 2004. Penemuan kembali strain virus nekrosis hipodermal
dan hematopoietik menular di Australia . Dis. air. Organisasi. 61, 153–158.
Kraft, JJ, Treder, K., Peterson, MS, Miller,WA, 2013. Pelipatan yang bergantung pada kation dari 3
elemen terjemahan yang tidak bergantung pada tutup memfasilitasi interaksi rangkaian 17-
nukleotida yang dilestarikan dengan eIF4G. Asam Nukleat Res. 41, 3398–3413.
Li, L., Cotmore, SF, Tattersall, P., 2012. Telinga jepit rambut ujung kiri parvoviral sangat penting
selama infeksi untuk membentuk templat transkripsi intranuklear yang fungsional dan untuk
enkapsidasi genom keturunan yang efisien . J.Virol . 87, 10501–10514.
Lightner, DV, 1983. Penyakit udang penaeid budidaya . Dalam: McVey, JP (Ed.), Buku Panduan
Budidaya Laut CRC . Budidaya Krustasea , vol. 1. CRC Press, Boca Raton, FL, AS , hlm.289–
320 .
Lightner, DV, 1988. Penyakit udang penaeid dan udang budidaya . Dalam: Sinder mann, CJ,
Lightner, DV (Eds.), Diagnosis dan Pengendalian Penyakit di Budidaya Laut Amerika Utara .
Elsevier, Amsterdam, Belanda , hlm.8–127 .
Lightner, DV, 2011. Penyakit virus pada udang budidaya di Belahan Barat ( Amerika): tinjauan.
J.Invertebrata . jalan. 106, 110–130.
Mari , J., Bonami, JR, Lightner, DV, 1993. Kloning parsial genom virus nekrosis hipodermal dan
hematopoietik menular , parvovirus patogen yang tidak biasa untuk udang penaeid ; diagnosis
penyakit menggunakan probe tertentu .
J.Jenderal Virol . 74, 2637–2643.
Morales- Covarrubias , MS, Nunan, LM, Lightner, DV, Mota- Urbina , JC, Garza Aguirre, MC,
Chavez-Sanchez, MC, 1999. Prevalensi IHHNV pada induk liar Penaeus stylirostris dari hulu
Teluk California , Meksiko . J.
air. animasi. Kesehatan 11, 296–301.
Machine Translated by Google
146 DCD Silva dkk. / Penelitian Virus 189 (2014) 136–146
Nunan , LM, Poulos, BT , Lightner, DV, 2000. Penggunaan reaksi berantai polimerase
untuk mendeteksi virus nekrosis hipodermal dan hematopoietik menular pada udang
penaeid . Maret Bioteknologi. 2, 319–328.
OIE, 2000. Manual Diagnostik Penyakit Hewan Akuatik , edisi ke-3 . Kantor Interna
nasional des Epizooties, Paris.
OIE, 2003. Manual Uji Diagnostik Hewan Akuatik , edisi ke-4 . Kantor Interna
nasional des Epizooties, Paris.
Pollom, E., Dang, KK, Potter, EL, Gorelick, RJ, Burch, CL , Weeks, KM, Swanstrom, R., 2013.
Perbandingan struktur RNA genom SIV dan HIV - 1 mengungkapkan dampak evolusi urutan pada
konservasi dan motif struktural yang tidak dilestarikan . Patologi PLoS ..
Primavera, JH, Quinitio, ET, 2000. Sindrom Runt-Deformity pada harimau raksasa yang dibudidayakan
udang Penaeus monodon. J. Crustac. biologi. 20, 796–802.
Rai, P., Pradeep, B., Safeena, MP, Karunasagar, I., Karunasagar, I., 2009. Kehadiran simultan virus
nekrosis hipodermal dan hematopoietik menular ( IHHNV ) dan urutan terkait virus Tipe A di
Penaeus monodon dari India . Budidaya Perairan 295, 168–174.
Rai , P., Safeena, MP, Karunasagar, I., Karunasagar, I., 2011. Urutan asam nukleat lengkap Penaeus
stylirostris densovirus (PstDNV) dari India. Res Virus . 158, 37–45.
Robles-Sikisaka, R., Bohonak, AJ, McClenaghan Jr., LR, Dhar, AK, 2010. Tanda tangan genetik dari
ekspansi cepat IHHNV ( virus nekrosis hipodermal dan hematopoietik menular ) pada populasi
udang penaeus liar. PLoS SATU 5 (7), e11799.
Shike, H., Dhar, AK, Burns, JC, Shimizu , C., Jousset, FX, Klimpel, KR, Bergoin, M., 2000.
Virus nekrosis hipodermal dan hematopoietik udang yang menular berhubungan
dengan brevidensovirus nyamuk . Virologi 277, 167–177.
Tamura, K., Peterson, D., Peterson, N., Stecher, G., Nei, M., Kumar, S., 2011. MEGA5 : analisis
genetika evolusi molekuler menggunakan metode kemungkinan maksimum , jarak evolusi , dan
kekikiran maksimum . mol. biologi. berevolusi. 28, 2731–2739.
Tang, KFJ, Durand, SV, Putih, BL, Redman, RM, Pantoja, CR, Lightner, DV, 2000.
Postlarva dan remaja dari galur Penaeus stylirostris terpilih resisten terhadap infeksi virus
hipodermal dan nekrosis hematopoietik yang menular . Budidaya Perairan 190, 203–210.
Tang, KFJ, Lightner, DV, 2002. Variasi urutan yang rendah antara isolat virus nekrosis hipodermal dan
hematopoietik menular (IHHNV) yang berasal dari Hawaii dan Amerika . Dis. air. Organ. 49, 93–
97.
Tang, KFJ, Poulos, BT, Wang, J., Redman, RM, Shih, HH, Lightner, DV, 2003.
Variasi geografis antara isolat virus nekrosis hipodermal dan hematopoietik menular
( IHHNV) dan karakteristik infeksinya . Dis.Aquat. Organ. 53, 91–99.
Tang , KFJ , Lightner, DV, 2006. Urutan terkait virus nekrosis hipodermal dan hematopoietik
menular (IHHNV) dalam genom udang windu Penaeus monodon dari Afrika dan
Australia. Res Virus . 118, 185–191.
Tang , KFJ, Navarro, SA, Lightner, DV, 2007. Uji PCR untuk membedakan antara virus nekrosis
hipodermal dan hematopoietik menular ( IHHNV) dan rangkaian terkait virus dalam genom
Penaeus monodon. Dis. air. Organisasi. 74, 165–170.
Tattersall, P., Ward, DC, 1976. Model jepit rambut bergulir untuk replikasi parvovirus
dan DNA kromosom linier . Alam 263, 106–109.
Teixeira-Lopes, MA, Vieira-Girão, PRN, Freire, JEC, Rocha, Í.RCB, Costa, FH
F., Baptista, GR, 2011. Koinfeksi alami dengan virus nekrosis hipodermal dan hematopoietik
menular (IHHNV) dan virus myonecrosis menular (IMNV) di Litopenaeus vannamei di Brasil .
Budidaya Perairan, 212–216.
Trindade, IMS, Ribas, JRL, Mendonc¸ a, FF, Santos, SCH, Leal, RF, 2009. Primeiro registro oficial do
vírus da necrose hipodérmica hematopoiética infecciosa dos camarões no Brasil.
Vega-Heredia, S., Mendoza-Cano, F., Sánchez-Paz, A., 2012. Virus hipoder mal menular dan nekrosis
hematopoietik : tinjauan singkat tentang apa yang kita lakukan dan tidak ketahui . Lintas batas.
Muncul. Dis. 59, 95–105.
Wang,YE, Li,B., Carlson,JM, Streeck, H., Gladden,AD, Goodman,R., Schneidewind, A., Power, KA,
Toth, I., Frahm, N., Alter, G. , Brander, C., Carrington, M., Walker, BD, Altfeld, M., Heckerman, D.,
Allen, TM, 2009. Alel pelindung kelas I HLA yang membatasi CD8 + fase akut Respons sel T
dikaitkan dengan mutasi pelepasan virus yang terletak di wilayah yang sangat dilestarikan dari
human immunodeficiency virus tipe 1. J. Virol. 83, 1845–1855.
Waterhouse, AM, Procter, JB, Martin, DMA, Clamp, M., Barton, GJ, 2009. Jalview Version2 – editor
penyelarasan beberapa urutan dan meja kerja analisis . Format Bioin 25 (9), 1189–1191.
Yang, B., Song,XL, Huang, J., Shi, CY, Liu, L., 2007. Bukti adanya virus nekrosis hipodermal dan
hematopoietik menular pada udang penaeid yang dibudidayakan di Cina. Mikrobiol Dokter
Hewan . 120, 63–70.