LAPORAN PRAKTIKUM PENYAKIT VIRAL

Identifikasi Avian Influenza dan Newcastle Disease

Oleh :
Kelompok 2

Arif Sofyan Aziz B04150008

Resti Puspitaningsih B04150011
Yaomil Ashar B04150012
Neli Nabila B04150013
Khonsa’ B04150014
Falih Prenata Saukhan B04150015
Irda Khaeriyah B04150017
Lim Chun Keat B04158020
Crystal Chang B04158023
Malarvily Vasu B04158025

ILMU PENYAKIT HEWAN DAN KESEHATAN MASYARAKAT

VETERINER
FAKULTAS KEDOKTERAN HEWAN
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
2018
 PENDAHULUAN

Latar Belakang

Penyakit Newcastle disease (ND) dan penyakit flu burung atau Avian
Influenza (AI) di Indonesia telah mewabah hampir diseluruh daerah. Kedua
penyakit tersebut dikelompokkan dalam penyakit menular strategis (Kementan
2013) yang dapat mengancam usaha peternakan serta menimbulkan kerugian yang
sangat besar (Sudarisman 2009). Kejadian penyakit bersifat akut sampai kronis dan
menyerang semua jenis unggas. Pada penyakit ND ayam merupakan unggas paling
peka dibandingkan dengan unggas jenis lainnya (Abdelrahman et al. 2013).
Sedangkan penyakit AI dapat menyerang unggas maupun mamalia termasuk
manusia (Boyce et al. 2008) sehingga disebut sebagai zoonsis.
Penyakit ND disebabkan oleh Avian Paramyxovirus type-1 (APMV), genus
Avulavirus famili Paramyxoviridae, merupakan virus RNA dengan genom serat
tunggal (single stranded) dan polaritas negatif. Famili Paramyxoviridae berbentuk
pleomorfik, biasanya berbentuk bulat dengan diameter 100-500 nm, namun adapula
yang berbentuk filamen dan beramplop. Terdapat sembilan serotype dari avian
Paramyxovirus yaitu APMV-1 sampai APMV-9 (OIE 2002). Berdasarkan tingkat
virulensinya, virus ND dikelompokkan menjadi tiga patotype yaitu; lentogenik
adalah strain virus yang virulensinya kurang, mesogenik adalah strain virus dengan
virulensinya sedang, dan velogenik adalah strain virus ganas. Strain velogenik
dibagi menjadi dua bentuk, bentuk neurotrofik dengan gangguan saraf dan kelainan
pada sistem pernafasan, dan bentuk vicerotrofik yang ditandai dengan kelainan
pada sistem pencernaan (Aldous dan Alexander 2001). Penyebaran virus ini dapat
terjadi secara kontak langsung dari unggas terinfeksi ke unggas sehat lainnya dan
melalui feses yang dieskresikan oleh unggas yang terinfeksi (Kencana et al. 2012).
Gejala klinis non-spesifik yang ditunjukkan oleh ND meliputi; depresi, bulu
rontok, sulit bernafas dengan mulut terbuka, hipertermia, anoreksia, lesu dan
hipotermia sebelum kematian (Cortney et al. 2013). Kerugian akibat penyakit ND
disebabkan karena angka kesakitan (morbiditas) maupun angka kematian
(mortalitas) pada ternak unggas yang sangat tinggi. Mortalitas maupun morbiditas
dapat mencapai 50-100% akibat infeksi VND strain velogenik terutama pada
kelompok ayam yang peka 50% pada strain mesogenik, dan 30% pada infeksi virus
strain velogenik (Tabbu 2000).Tingkat morbiditas dan mortalitas yang tinggi pada
virus ND mengakibatkan diperlukan konfirmasi uji untuk meneguhkan diagnonis
penyakit ND untuk segera diberikan pengobatan dan pencegahan penyebaran virus
yang dapat merugikan industri peternakan.
Avian influenza (Ai) atau flu burung disebabkan oleh virus tipe A, subtipe
H5N1 yang dapat menyebabkan penyakit penyakit influenza pada hewan piaraan
seperti unggas dan mamalia termasuk manusia. Berdasarkan tingkat infeksi virus
AI dapat dikelompokkan atas dua infeksi, yaitu highly pathogenic avian influenza
(HPAI) dan low pathogeniv avian influenza (LPAI). Highly pahogenic avian
infuenza merupakan infeksi yang sangat patogen yang dapat menyebabkan angka
kematian sampai 100%. Unggas yang terinfeksi HPAI biasanya akan mati secara
mendadak tanpa menunjukkan gejala klinis. Gejala yang sering terlihat yaitu
depresi, lemah dan koma. Gejala depresi dapat ditandai dengan bulu kasar, nafsu
makan menurun, diare, gerakan lambat, dan produksi telur menurun. Infeksi HPAI
umumnya disebabkan oleh AI sub tipe H5 dan H7 (Tabbu 2000). Sedangkan pada
infeksi LPAI dicirikan dengan infeksi yang ringan. Kasus yang disertai dengan
kontaminasi oleh agen infeksi patogen yang lain dapat menyebabkan LPAi berubah
patogenitasnya dan tingkat mortalitasnya semakin tinggi (Akoso 2006).
Penyakit ND dan Ai dapat menginfeksi unggas secara bersamaan.
Pemunculam kasus ND dan Ai tidak dapat diduga bahkan sangat sulit dibedakan
karena mempunyai gejala klinis yang sangat mirip. Kedua penyakit tersebut juga
bersifat endemik di Indonesia. Kedua penyakit ini dapat dicegah dengan biosecurity
dan vaksinasi. Deteksi infeksi AI dan ND dapat menggunakan RT-PCR yang
memiliki sensitivitas dan spesifitas pengujian.

Tujuan

Tujuan praktikum ini adalah mengetahui teknik identifikasi gen patogen

Avian Influenza dan Newcastle Disease dengan teknik molekuler RT-PCR.

TINJAUAN PUSTAKA

Avian Influenza

Virus influenza merupakan virus RNA termasuk dalam famili

Orthomyxoviridae. Asam nukleat virus ini beruntai tunggal, terdiri dari 8 segmen
gen yang mengkode sekitar 11 jenis protein. Virus influenza mempunyai
selubung/simpai yang terdiri dari kompleks protein dan karbohidrat. Virus ini
mempunyai tonjolan (spikes) yang digunakan untuk menempel pada reseptor yang
spesifik pada sel-sel hospesnya pada saat menginfeksi sel. Terdapat 2 jenis spikes
yaitu yang mengandung hemaglutinin (HA) dan yang mengandung neuraminidase
(NA), yang terletak dibagian terluar dari virion (Horimoto T, Kawaoka Y. 2001).
Virus influenza mempunyai 4 jenis antigen yang terdiri dari protein
nukleokapsid (NP), Hemaglutinin (HA). Neuraminidase (NA), dan protein matriks
(MP). Berdasarkan jenis antigen NP dan MP, virus influenza digolongkan dalam
virus influenza A, B, dan C. (Horimoto T, Kawaoka Y. 2001). Virus Influenza A
sangat penting dalam bidang kesehatan karena sangat patogen baik bagi manusia,
dan binatang, yang menyebabkan angka kesakitan dan kematian yang tinggi, di
seluruh dunia. Virus influenza A ini dapat menyebabkan pandemi karena mudahnya
mereka bermutasi, baik berupa antigenic drift ataupun antigenic shift sehingga
membentuk varian-varian baru yang lebih patogen. Terdapat 15 jenis subtipe HA
dan 9 jenis subtipe NA. Dari berbagai penelitan seroprevalensi secara
epidemiologis menunjukkan bahwa beberapa subtipe virus influenza A telah
menyebabkan wabah pandemi antara lain H7N7 (1977), H3N2 (1968), H2N2 (1957),
H1N1 (1918), H3N8 (1900), dan H2N2 (1889) (Yuen 2005).
Virus influenza B adalah jenis virus yang hanya menyerang manusia,
sedangkan virus influenza C, jarang ditemukan walaupun dapat menyebabkan
infeksi pada manusia dan binatang. Jenis virus influenza B dan C jarang sekali atau
tidak menyebabkan wabah pandemis (Horimoto 2001). Penderita yang terinfeksi
H5N1 pada umumnya dilakukan pemeriksaan spesimen klinik berupa swab
tenggorokan dan cairan nasal. Untuk uji konfirmasi terhadap infeksi virus H5N1,
harus dilakukan pemeriksaan dengan cara : mengisolasi virus, deteksi genom H5N1
dengan metode Polymerase Chain Reaction (PCR) menggunakan sepasang primer
spesifik, tes imunoflouresensi terhadap antigen menggunakan monoklonal antibodi
terhadap H5, pemeriksaan adanya peningkatan titer antibodi terhadap H5N1, dan
pemeriksaan dengan metode western blotting terhadap H5-spesifik. (Beigel JH
et.al. 2005; WHO 2005).
Polymerase Chain Reaction (PCR) merupakan teknik in vitro yang
digunakan untuk melakukan replikasi atau amplifikasi bagian spesifik dari berjuta
lipatan DNA hanya dalam beberapa jam .Ide awal PCR diemukan pada tahun 1983
oleh Kary Mullis untuk menjawab pertanyaan genetika saat itu, yakni bagaimana
cara memperbanyak untaian DNA yang diinginkan. Metode PCR ini pada awalnya
sangat lambat, mahal, dan tidak presisi, namun seiring perkembangannya kini PCR
memiliki berbagai keunggulan sehingga banyak digunakan utamanya dalam bidang
biologi molekuler (Broll 2010).
Prinsip PCR membutuhkan beberapa substansi sebagai bahan baku, yakni
primer, DNA target atau DNA sampel, enzim polimerase, dNTP, kation divalen
seperti magnesium klorida, dan buffer (umumnya menggunakan buffer Tris).
Primer merupakan oligonukleotida yang komplemen terhadap DNA target
berjumlah dua buah atau sepasang. Enzim polimerase merupakan enzim yang
berperan dalam proses sintesis atau pemanjangan untaian DNA baru, umumnya
menggunakan enzim Taq Polimerase. dNTP merupakan molekul bahan baku
pembentuk untaian DNA baru, terdiri atas dATP, dTTP, dGTP, dan dCTP.
Magnesium klorida menyediakan molekul Mg2+ yang berfungsi sebagai kofaktor
enzim polimerase. Buffer yang digunakan dalam PCR umumnya adalah Tris-
HCl.Proses PCR secara umum berlangsung dalam tiga tahap, yakni tahap
denaturasi, tahap penempelan, dan tahap pemanjangan (Loeffelholz 2006).
Dalam proses PCR, denaturasi awal dilakukan sebelum enzim taq
polimerase ditambahkan ke dalam tabung reaksi. Denaturasi DNA merupakan
proses pembukaan DNA untai ganda menjadi DNA untai tunggal. Ini biasanya
berlangsung sekitar 3 menit, untuk meyakinkan bahwa molekul DNA terdenaturasi
menjadi DNA untai tunggal. Denaturasi yang tidak lengkap mengakibatkan DNA
mengalami renaturasi (membentuk DNA untai ganda lagi) secara cepat, dan ini
mengakibatkan gagalnya proses PCR. Adapun waktu denaturasi yang terlalu lama
dapat mengurangi aktifitas enzim Taq polymerase. Aktifitas enzim tersebut
mempunyai waktu paruh lebih dari 2 jam, 40 menit, 5 menit masing-masing pada
suhu 92,5 oC, 95 oC dan 97,5 oC.
Kriteria yang umum digunakan untuk merancang primer yang baik adalah
bahwa primer sebaiknya berukuran 18 – 25 basa, mengandung 50 – 60 % G+C dan
untuk kedua primer tersebut sebaiknya sama. Sekuens DNA dalam masing-masing
primer itu sendiri juga sebaiknya tidak saling berkomplemen, karena hal ini akan
mengakibatkan terbentuknya struktur sekunder pada primer tersebut dan
mengurangi efisiensi PCR. Waktu annealing yang biasa digunakan dalam PCR
adalah 30 – 45 detik. Semakin panjang ukuran primer, semakin tinggi
temperaturnya. Kisaran temperatur penempelan yang digunakan adalah antara 36
o
C sampai dengan 72 oC, namun suhu yang biasa dilakukan itu adalah antara 50 –
60 oC.
Selama pemanjangan primer Taq polymerase memulai aktivitasnya
memperpanjang DNA primer dari ujung 3’. Kecepatan penyusunan nukleotida oleh
enzim tersebut pada suhu 72oC diperkirakan 35 – 100 nukleotida/detik, bergantung
pada buffer, pH, konsentrasi garam dan molekul DNA target. Sehingga untuk
produk PCR dengan panjang 2000 pasang basa, waktu 1 menit sudah lebih dari
cukup untuk tahap perpanjangan primer ini. Biasanya diakhir siklus PCR waktu
yang digunakan untuk tahap ini diperpanjang sampai 5 menit sehingga seluruh
produk PCR diharapkan terbentuk DNA untai ganda (Yusuf 2010).

Newcastle Disease

Virus Newcastle mempengaruhi spesies unggas liar dan domestik tetapi

tingkat keparahannya bervariasi antara jenis yang berbeda. Penyakit Newcastle
ditemukan dielahan dunia. Tergantung pada ketegangan dan tanda klinisnya, virus
NCD dikelompokkan menjadi empat fenotip. Mereka adalah NDV neurotropik
velogenik yang mempengaruhi saraf dan viskturotropik velogenik yang
mempengaruhi organ visceral penyebab mesogenik adalah keparahan sedang dan
lenterogenik yang merupakan bagian dari virus kastil baru. Penyakit Newcastle
pertama kali mendengarkan pada tahun 1926 di pulau Jawa oleh Kranveld. Penyakit
ini berasal dari kota Tyne, Inggris dan diberi nama penyakit Ranikhet di Asia dan
India. Seperti yang dipublikasikan oleh Spradbrow dan Aleksander, yang pada saat
yang sama dan berikutnya tahun di bagian lain Asia (India, Filipina, Korea). Pada
tahun 1930 itu juga disebut sebagai virus yang sama dengan yang berbeda. Penyakit
newcastle dapat mempengaruhi banyak spesies burung. Unggas unggas, lebih dari
230 spesies dari lebih dari 230 spesies yang ditemukan rentan terhadap infeksi alam
atau eksperimental dengan burung paramyxovirus. Ayam terutama definisi oleh
penyakit Newcastle. Kalkun dan merpati, itik, angsa, dan burung beo dan cormoran
liar juga dapat mengembangkan penyakit umum, namun tanda-tanda klinis jarang
di angsa dan bebek. Pada manusia dan infeksi hewan pengerat telah diberitahukan.
NCD kurang memiliki kepentingan zoonotik dan dapat menyebabkan
konjungtivitis. Dalam semua jenis strain virus NCD virulen domestik telah
ditemukan. Virus Serotipe NCD virulen tinggi tidak umum untuk burung liar
bermigrasi.
Salah satu faktor utama yang menentukan patogenisitas virus NCD adalah
bahwa ia memiliki kemampuan untuk memasang dan menembus sel tuan rumah.
Untuk memulai infeksi virus dua glikoprotein haemagglutinin neuraminidase (HN)
dan protein fusi (F) diperlukan untuk mengekspos sebagai tonjolan pada permukaan
amplop virion. Virus dapat bertahan hidup selama beberapa minggu di semua
bangkai burung yang terinfeksi akut atau dalam telur dan relatif stabil dan dapat
ditularkan secara mekanis dari bahan yang terinfeksi melalui pergerakan peralatan
dan personil. Virus adalah naungan di semua ekskresi dan sekresi. Virus NCD
mudah ditularkan pada fomites. Virus ini dapat bertahan untuk jangka waktu yang
lama pada kulit telur dan terutama di kotoran, dibandingkan dengan permukaan
anorganik (kertas saring).
Isolat virus NCD berbeda di sana strain virulensi dan tropisme jaringan
mereka pada ayam.Ketahanan lingkungan dari virus ini sangat bervariasi, karena
dapat dipengaruhi oleh banyak faktor seperti suhu, kelembaban, agen
menangguhkan dan paparan cahaya, serta teknik yang digunakan untuk mendeteksi
virus. Satu penelitian melaporkan bahwa APMV-1 bertahan hingga 7 hari di musim
panas di rumah unggas yang tercemar dan tidak bersih, selama 14 hari di musim
semi, dan 30 hari selama musim dingin. Kelompok lain melaporkan isolasi virus
hingga 16 hari setelah depopulasi kawanan yang tidak divaksinasi. Namun, satu
studi menemukan bahwa APMV-1 tetap layak hingga 255 hari di kandang ayam,
pada suhu sekitar -11 °C (12 °F) hingga 36 ° C (97 °F). Pada 23-29 °C (73-84 °F),
APMV-1 dilaporkan bertahan hidup dalam kotoran terkontaminasi selama 10
hingga 14 hari, dan pada 20 °C (68 °F) di tanah selama 22 hari. Virus juga telah
pulih dari cacing tanah selama 4 hingga 18 hari dan dari air danau yang
terkontaminasi secara eksperimental selama 11 hingga 19 tahun
Sampel yang tepat untuk diagnosis pada penyakit Newcastle meliputi:
sampel jaringan (trakea, paru-paru, limpa, palatum lunak, kolon, bursa dan otak)
penyihir penting untuk heropatologi dan penyeka kloaka, uso-hidung penyeka dan
sampel Serum. Sampel darah biasanya dikumpulkan dari vena sayap. Ketika sampel
baru dikumpulkan paru-paru dan limpa itu harus dibungkus dalam plastik dan
ditempatkan ke dalam kotak dingin dengan es. Untuk melakukan uji serologis,
sampel yang terkontaminasi atau terkontaminasi tidak boleh digunakan karena akan
memberikan hasil yang tidak nyata. Virus adalah obligat parasit intraseluler yang
membutuhkan sel hidup untuk bereplikasi. Sel-sel budidaya, telur dan hewan
laboratorium dapat digunakan untuk isolasi virus. Untuk mendiagnosis infeksi virus
infeksi APM-1 dalam telur embrio atau kultur sel berfungsi sebagai penting untuk
isolasi virus. Suntikan Cloacal dan Trakea merupakan contoh yang baik untuk
isolasi virus NCDV. Sampel dari feses segar juga dapat digunakan sebagai
alternatif. Sampel yang dikumpulkan harus diangkut pada pH 7,0-7,4 dalam buffer
saline isotonik fosfat (PBS), yang mengandung obat antimikroba dan protein media.
Konsentrasi antibiotik yang lebih tinggi harus digunakan ketika sampel
yang terkumpul berasal dari ayam yang dicurigai.sentrifugasi sampel dari feses atau
jaringan selama 10 menit pada suhu 25 °C untuk mendapatkan sampel supernatan
dan mengukur 0,2 ml sampel dan diinokulasikan ke dalam rongga allantoic telur
unggas SPF berembrio dari inkubasi 9-11 hari kemudian menetaskan selama 4-7
hari pada 35-37 °C. Jika tes memberi hasil positif embroynasi telur akan mati.
Akhirnya semua telur tetap inkubasi harus anak sampai 4 °C dan lakukan untuk tes
haemagglutination (HA).Dengan tidak adanya vaksinasi, kehadiran antibodi
spesifik terhadap virus ND tidak selalu bahwa ia menderita penyakit pada saat
pengambilan sampel, tetapi menunjukkan bahwa burung tersebut telah terinfeksi
oleh virus pada suatu waktu. Dalam prakteknya, titer antibodi yang tinggi
merupakan indikasi dari infeksi baru-baru ini. NDV dapat digunakan sebagai
antigen dalam berbagai tes serologis. Meskipun banyak tes serologis dapat
digunakan untuk mendeteksi antibodi dalam serum, mereka memberikan sedikit
informasi tentang strain NDV yang menginfeksi.
Dua metode digunakan untuk mengukur titer antibodi uji haemagglutination
inhibition (HI) dan tes immunosorbent enzyme-linked (ELISA). Penggunaan yang
paling umum dan menunjukkan hasil yang akurat adalah tes haemagglutination
inhibition (HI). Untuk kedua tes ini, diperlukan untuk mengumpulkan sampel darah
dari ayam dan harus diambil dari vena sayap. Tes haemagglutination inhibition (HI)
digunakan paling luas dalam serologi ND kegunaannya dalam diagnosis tergantung
pada status kekebalan vaksin burung yang akan diuji dan pada kondisi penyakit
yang ada. HI dilakukan berdasarkan pada prinsip bahwa haemagglutinin pada
selubung virus dapat menghasilkan penggumpalan sel darah merah ayam dan ini
dapat dihambat oleh antibodi spesifik. Sera dari spesies selain sel darah merah ayam
juga dapat menyebabkan penggumpalan (aglutinasi), sehingga harus dihilangkan
dengan adsorpsi serum dengan ayam.
 METODE IDENTIFIKASI

Alat dan Bahan

Alat dan bahan yang digunakan termasuk 5 ekor ayam, 5 swab steril, 5
minitube berisi broth agar, orbital shaker, Processing plate, Viral Lysis/Binding
Solution, Bead Resuspension Mix, Wash Solution 1, Wash Solution 2, Elution
Buffer, magnetic stand, Plat optik 96 sumuran pada mesin Applied Biosystems 7500
Real Time PCR System. Peralatan yang dipergunakan antara lain mikropipet,
mikrotips, plat mikrotitrasi 96 sumuran berdasar V, spuit 1 cc, spuit 10 cc, sentrifus,
vortex, Biosafety cabinet (BCC) (Esco), refrigerator, freezer dan inkubator.

Metode Koleksi Sampel

Sampel dikoleksi dari ayam milik pribadi di kawasan Dramaga, Bogor.

Sampel dikoleksi menggunakan swab steril dan mini tube diisi media agar broth. 3
ekor ayam jantan diswab di daerah kloaka dan 2 ekor betina diswab di daerah
oropharynx. Swab kemudian dimasukkan ke dalam minitube dan diletakkan di
dalam freezer.

Metode MagMAX-96 AI/ND Viral RNA Isolation Kit

Dalam setiap sumur processing plate ditambah 101µL Viral Lysis/Binding

Solution yang dipreparir. Kemudian, 50µL sampel ditambah ke setiap sumur
processing plate yang mengandungi solusi Viral Lysis/Binding Solution. Sewaktu
menambah sampel, ujung pipette dimasukkan ke dalam solusi Viral Lysis/Binding
Solution sedikit untuk menghindari kontaminasi. Processing plate kemudian
diletakkan pada orbital shaker selama 30 detik. Seterusnya, 20µL Bead
Resuspension Mix ditambah ke dalam setiap sampel di dalam Processing Plate.
Processing plate kemudian diletakkan kembali pada orbital shaker selama 4 menit
untuk melysis virus dan mengikat RNA ke RNA Binding Beads. Processing plate
dipindah ke magnetic stand untuk menarik RNA binding beads selama 2 menit atau
sehingga cairan menjadi bening. Supernatan yang tinggal di setiap sumur diaspirasi
dengan hati-hati menggunakan pipette dengan tidak menganggu Beads.

Processing plate diangkat dari magnetic stand dan 100µL Wash Solution 1
(ditambah isopropanol) ditambah ke setiap sumur sampel kemudian diletakkan
pada orbital shaker untuk 30 detik. Processing plate dikembalikan ke magnetic
stand untuk 1 menit atau sehingga cairan menjadi bening. Processing plate diangkat
dari magnetic stand dan supernatan yang tinggal diaspirasi menggunakan pipette.
Proses pencucian ini diulangi dengan 100µL Wash Solution 2 (ditambah ethanol)
selama 2 kali. Semua supernatan dipastikan dikeluarkan dengan pipette ujung tipis
untuk mendapat hasil RNA yang murni. Processing Plate dipindah ke orbital
shaker selama 2 menit untuk mengevaporasikan sisa alkohol dari Wash Solution 2.
Setiap sumur sampel ditambahkan 50µL Elution Buffer kemudian ke shaker selama
3 menit. Processing plate dipindah ke magnetic stand untuk menarik RNA Binding
Beads selama 1 menit atau sehingga cairan menjadi bening. RNA murni sekarang
adalah supernatan. Supernatan dipindah ke dalam wadah yang bebas-nuclease.

Real-Time Reverse-Transcriptation Polymerase Chain Reaction (rRT-PCR)

1. Target APMV-1
Master mix PCR dibuat dengan mencampur bahan sebagai berikut: buffer 5
μl, primer forward (10 μM) 0,50 μl, primer reverse (10 μM) 0,50 μl, enzim mix
1,00 μl, probe (5 μM), dan deuxynuclease triphosphate 1,25 μl, RNAse inhibitor
13u. RNA yang berasal dari pooling beberapa sampel diamplifikasi dengan rRT-
PCR untuk penafisan keberadaan virus ND. Primer yang digunakan adalah sebagai
berikut: Matrix forward (M+4100): 5’- AGT GAT GTG CTC GGA CCT TC-3’
dan matrix reverse (M-4220) 5’ CCT GAG GAG AGG CAT TTG CTA-3’. Probe
yang digunakan adalah M+4169 5’ FAM TTC TCT AGC AGT GGG ACA GCC
TGC [TAMRA]-3 (CVL 2007).

2. Target N.A. pre 1950 genotype

Master mix PCR dibuat dengan mencampur bahan sebagai berikut: buffer 5
μl, primer forward (30 μM) 0,50 μl, primer reverse (10 μM) 0,50 μl, enzim mix
1,00 μl, probe (5 μM), dan deuxynuclease triphosphate 1,25 μl, RNAse inhibitor
13u. RNA yang berasal dari pooling beberapa sampel diamplifikasi dengan rRT-
PCR untuk penafisan keberadaan virus ND. Primer yang digunakan adalah sebagai
berikut: Matrix forward (M+4213): 5’- TCC TCA GGT GGC CAA GAT TAC-3’
dan matrix reverse (M-4350) 5’-TGC CCC TTC TCC AGC TTA GTC-3’. Probe
yang digunakan adalah M+4268 5’ FAM TTC TAA CGC TCC GCA GGC ACC
[TAMRA]-3 (CVL 2007).
Prosedur PCR yang dilakukan secara ringkas sebagai berikut: ke dalam masing-
masing sumuran plat optik 96 sumuran dimasukkan campuran ke PCR kemudian
ditambahkan RNA template hasil isolasi. Plat ditutup dengan seal optik kemudian
di tempatkan pada mesin Applied Biosystems 7500 Real-time PCR System dengan
kondisi sebagai berikut: tahap 1 (1×): reverse transkripsi 45 oC, 10 menit; denaturasi
95 oC, 10 menit; tahap 2 (40x): denaturasi 94 oC, 10 detik; annealing 56 oC, 30
detik; ekstensi 72 oC 10 detik. Hasil PCR dianalisis menggunakan Applied
B1osystems 7500 Real-Time PCR System software.
 Hasil dan Pembahasan

Identifikasi sampel AI dan ND dengan menggunakan sampel dari tempat

pengabilan sampel swab berbeda-beda dan dilakukan secara acak. Sampel diambil
pada beberapa tempat seperti peternakan, unggas yang dijual oleh peternak, pasar,
kandang penampungan sementara, unggas milik pribadi, dan tempat pemotongan
di sekitar kampus IPB Dramaga.
Berikut merupakan hasil pemeriksaan virus AI dengan metode RT-PCR :

Gambar 1. Hasil amplifikasi virus AI yang terlihat dari monitor komputer

Berdasarkan hasil amplifikasi virus diatas, tidak terjadi fluktuasi atau

peningkatan yang signifikan pada grafik dari semua sampel virus. Fluktuasi hanya
terjadi pada kontrol positif yang mengandung virus AI di dalamnya. Tidak adanya
fluktuasi grafik tersebut dapat menandakan bahwa semua sampel negatif atau tidak
tercemar virus AI. Hal ini menunjukkan bahwa unggas-unggas yang dijadikan
sampel dari berbagai lokasi di sekitar kampus IPB Dramaga tidak tercemar virus
AI.
Tabel 1. Hasil pemeriksaan virus AI pada semua sampel

Sample Name Detector Task Ct

P1 Matriks Unknown Undet
S1 Matriks Unknown Undet
P2 Matriks Unknown Undet
S2 Matriks Unknown Undet
P3 Matriks Unknown Undet
S3 Matriks Unknown Undet
P4 Matriks Unknown Undet
S4 Matriks Unknown Undet
P5 Matriks Unknown Undet
S5 Matriks Unknown Undet
P6 Matriks Unknown Undet
S6 Matriks Unknown Undet
K+ Matriks Unknown Undet
K+AI Matriks Unknown 31.6342
K+ND Matriks Unknown Undet
K+AI 20X Matriks Unknown 36.7391
Keterangan:
P : Kelompok praktikum pagi
S : Kelompok praktikum siang

Berdasarkan tabel diatas, semua sampel kelompok praktikum pagi dan siang
memiliki hasil negatif yang menunjukkan tidak ada cemaran virus AI dalam
sampel. Sedangkan kontrol positif tetap menunjukkan hasil positif terhadap matrix.
Pemeriksaan sampel diuji dengan metode RT-PCR menggunakan primer yang
spesifik terhadap gen Matriks (M), H5 dan N1. Amplifikasi gen M menggunakan
primer yang telah direkomendasikan.
Amplifikasi RT-PCR akan berjalan sukses tergantung pada desain primer yang
spesifik. Suatu set primer tunggal telah dikembangkan oleh Phipps et al. (2004) untuk
memperoleh amplikon PCR dari virus influenza tipe A. Desain primer yang spesifik untuk
identifikasi subtipe virus AI berdasarkan pada sekuen gen HA yang konsisten diperoleh
dengan menggunakan informasi sekuen asam amino dari gen HA dengan variasi antara 20-
74% untuk subtipe yang berbeda dan variasi hanya 0-9% untuk subtipe yang sama.
Metode molekuler seperti RT-PCR mempunyai banyak kelebihan dalam
mendeteksi virus AI di antaranya adalah mempunyai sensitivitas yang tinggi yang
serupa dengan isolasi virus, memiliki spesifisitas yang tinggi, dapat dikerjakan
dalam jumlah yang besar, dapat digunakan untuk berbagai tipe sampel,
meminimalkan kontak dengan agen infeksius sebab virus inaktif selama proses RT-
PCR dan dengan harga yang cukup realistis (Atmar et al. 1996; Cattoli et al. 2004;
Pregliasco et al. 1998; Spackman et al. 2002).
 Berikut merupakan hasil pemeriksaan virus Newcastle Disease dengan
metode RT-PCR :

Gambar 2. Hasil amplifikasi virus ND yang terlihat dari monitor computer

Berdasarkan hasil amplifikasi virus diatas, terjadi fluktuasi atau peningkatan

yang signifikan pada grafik dari semua sampel virus. Kurva yang tergambar pada
grafik (lihat Gambar 2) timbul karena adanya reaksi amplifikasi asam nukleat yang
dikombinasikan oleh zat warna fluorescence. Kurva naik artinya pada siklus
tersebut ada asam nukleat yang terbentuk pada sampel sehingga ada intensitas
fluorescence yang dihasilkan dan terdeteksi oleh mesin PCR, sedangkan kurva
turun artinya pada siklus tersebut tidak ada asam nukleat yang terbentuk pada
sampel sehingga tidak ada intensitas fluorescence yang dihasilkan.
Grafik terlihat adanya pembatas yang menjadi batas maksimal terdeteksinya
virus ND di dalam sampel (threshold). Kurva kontrol positif terlihat naik melebihi
garis threshold yang berarti di dalam sampel tersebut terkandung virus ND.
Rodriquez et al. (2009) menyatakan bahwa uji PCR bernilai postif ketika kurva
yang dibentuk virus memberikan gambaran peningkatan melewati garis threshold
yang telah ditentukan. Uji dinilai valid karena terdapat amplifikasi kontrol positif
virus AI dan kontrol positif virus ND yang menunjukkan bentuk kurva yang
melewati garis threshold. Seluruh sampel S pada uji PCR yang bernilai undetected
tidak dapat diinterpretasikan diduga karena adanya bakteri kontaminan.
Kontaminasi bakteri ini kemungkinan terjadi akibat kesalahan praktikan pada saat
proses pengkoleksian virus dan proses handling virus yang tidak steril sehingga
virus rusak.
 Meskipun rRT-PCR merupakan suatu pengujian diagnostik yang sensitif dan
spesifik serta banyak digunakan untuk deteksi penyakit secara cepat, tetapi adanya
kemungkinan reaksi negatif palsu dapat terjadi. Reaksi ini kemungkinan disebabkan
oleh adanya penghambat, ekstraksi virus RNA yang sedikit atau sudah terdegradasi,
kesalahan personel laboratorium dalam melakukan pengujian rRT-PCR dan kualitas
dari salah satu reagen yang sudah kadaluarsa. Sampel yang diperiksa dapat
mengandung substansi penghambat PCR yang memungkinkan menghasilkan hasil
negatif palsu. Penghambat amplifikasi PCR dapat dideteksi dengan kontrol internal.
Kontrol internal merupakan faktor yang sangat penting sebagai kontrol dari kualitas
pengujian sehingga pengujian dilakukan secara benar (Gilbert et al. 2012).

Tabel 2. Hasil pemeriksaan virus ND pada semua sampel

Sample name Detector Ct

P1 ND Undet

P2 ND Undet

P3 ND Undet

P4 ND 39,8297

P5 ND Undet

P6 ND Undet

S1 ND Undet

S2 ND Undet

S3 ND Undet

S4 ND Undet

S5 ND Undet

S6 ND Undet

K- pagi ND Undet

K+ ND ND 32,6401

K- sore ND Undet

K+AI ND Undet

Menurut Hewajuli, NLPI (2014), kontrol positif harus mengandung organisme

atau asam nukleat yang dapat dideteksi. Konsentrasi kontrol positif yang digunakan
harus mampu memberikan hasil positif yang konsisten. Air atau buffer sering
digunakan sebagai kontrol negatif. Namun demikian, kontrol negatif yang bagus adalah
sampel yang mengandung asam nukleat selain target untuk mengetahui tidak adanya
amplifikasi PCR non-spesifik atau amplifikasi produk. Selain itu, kontrol negatif
digunakan untuk menunjukkan bahwa reagen yang digunakan tidak terkontaminasi
dengan asam nukleat target.

KESIMPULAN

Virus Newcastle Disease atau Avian Paramyxovirus-1 adalah virus

berkapsid single-stranded RNA berantai negatif. Untuk menentukan keberadaan
virus dilakukan uji metode PCR yaitu dengan penggunaan spesifik primer yang
hanya akan mentranskripsi bagian target genom virus, dengan membandingkan
kurva kontrol virus positif (kurva primer) dan kurva yang dibentuk oleh virus yang
diuji. Dari sampel semuanya memberikan hasil undeected (tidak terdeteksi) untuk
sampel AI, diduga hasil ini dikarenakan kontaminasi bakteri yang kemungkinan
terjadi akibat kesalahan praktikan pada saat proses pengkoleksian virus dan proses
handling virus yang tidak steril sehingga virus rusak. Sedangkan untuk sampel ND
ditunjukkan kurva kontrol positif terlihat naik melebihi garis threshold yang berarti
di dalam sampel tersebut terkandung virus ND
 DAFTAR PUSTAKA

Abdelrahman S, Rihan EEM, Almotairy HM, Jassem AHA, Al-Blowi M. 2013.

Seo-virological studies on Newcastke Disease and Avian Influenza in farmed
ostriches (Struhio camelus) in Saudi Arabia. J World’s Poelt Res. 3(2):38-42.
Akoso BT. 2006. Penyakit Menular pada Hewan dan Manusia. Yogykarta (ID):
Kanisius
Aldous EW dan Alexander DJ. 2001. Detection and differentiation of New Castle
disease virus (avian paramixovirus type 1). Avian Pathol. 30:117-128.
Atmar RL, Baxter BD, Domingueez EA, Taber LH. 1996. Comparison of reverse
transcription-PCR with tissue culture and other rapid diagnostic assays for
detection of type A influenza virus. J Clin Microbiol 34: 2604-2606.
Beigel JH, Farrar J, Han AM. 2005. Avian influenza (H5N1) infecttion in humans.
N Engl J Med. 1374-1385.
Bolortuya P, Cardona CJ, Leung CYH, Peiris JSM, Spackman E, Swayne DE dan
Joly DO. 2012. "Highly Pathogenic Avian Influenza Virus among Wild Birds
in Mongolia." PLoS ONE. 7(9): e44097.
Boyce WMS, Christian S, Kris KJ, terra K, Carol C. 2008. Avian influenza viruses
in wild birds: A moving target. CIMID. 20: 657.
Broll, H. ‘Polymerase Chain Reaction’. Dalam Popping, B., C.D. Amigo, K.
Hoenicke (ed.). 2010. Molecular Biological and Immunological Techniques
and Applications for Food Chemists. John Wiley & Sons, Inc., New Jersey.
Cattoli GA, Drago A, Maniero S, Toffan A, Bertoli E, Fassina S, Terregino C,
Robbi C, Vicenzoni G, Capua I. 2004. Comparison of three rapid detection
systems for type A influenza virus on tracheal swabs of experimentally and
naturally infected birds. 2004. Avian Pathol 33: 432-437
[CVL] Central Veterinary Laboratory. 2007. Standard operating procedure for real
time polymerase chain reaction detection of virulent Newcastle disease virus
in clinical specimens.
Courtney SC, Susta L, Grnez D, Hines NL, Pedersen JC, Brown CC, Miller PJ,
Afonson CL. 2013. Highly divergent virulent isolates of Newcastle disease
virus from the Dominican Republic are members of a new genotype that may
have evolved unnoticed for over 2 decades. J Clin Microbial. 51: 508-517.
Daayanti R, Darminto, Dharmayanti NLPI, Indriani R, Wiyono A. Gambaran klinis
dan patologis pada ayam terserang flu burung sangat patogenik (HPAI) di
beberapa peternakan di Jawa Timur dan Jawa Barat. JITV. 9 : 128-135.
Gilbert, M, Jambal L, Karesh WB, Fine A, Shiilegdamba E, Dulam P,
Sodnomdarjaa R, Ganzorig K, Batchuluun D, Tseveenmyadag N, 26
Horimoto T, Kawaoka Y. 2005. Influenza: Lessons from the past pandemics,
warning from current incidents. Nature Rev Microbiol. 3(8): 591-600.
Hewajuli, DA dan NLPI D. 2014. "Perkembangan Teknologi Reverse
Transcriptase-Polymerase Chain Reaction dalam Mengidentifikasi Genom
Avian Influenza dan Newcastle Diseases." WARTAZOA. 24 (1).
[Kementan] Kementerian Pertanian dan Peternakan. 2013. Keputusan Menteri
Pertanian No.4026/Kpts/OT.140/4/2013 Tentang Penetapan Jenis Penyakit
Hewan Menular Strategis [internet]. [diunduh 2018 Okt 26]. Diakses pada:
www.keswan.ditjennak.pertanian.go.id.
Kencana GAY, Kardena IM, Mahardika IGG.Peneguhan diagnosis penyakit
Newcastle disease lapang ada ayam buras di Bali menggunakan teknik RT-
PCR. Jurnal Kedokteran Hewan. 6(1):28-31
Loeffelholz, M. and H. Deng. ‘PCR and Its Variations’. Dalam : Tang, Y.W. and
C.W. Stratton (ed.). 2006. Advanced Techniques in Diagnostic Microbiology.
Springer Science Business Media LLC. New York.
OIE. 2002. Newcastle disease [internet]. [diunduh 2018 Okt 26]. Tersedia pada:
www.oie.int
Pregliasco F, Mensi C, Camorali L, Anselmi G. 1998. Comparison of RT-PCR with
other diagnostic assays for rapid detection of influenza viruses. J Med Virol
56: 168-173.
Phipps LP, Essen SC, Brown IH. 2004. Genetic subtyping of influenza A viruses
using RT-PCR with a single set of primers based on conserved sequences
within the HA2 coding region. J Virol Methods. 122: 119-122.
Rodriquez RA, Pepper IL, Gerba CP. 2009. Application of PCR-based methods to
assess the infectivity of enteric viruses in environmental samples. Journals of
Application of Environmental Microbiology. 75(2): 297-307
Saleh N. 2007. System produksi kacang-kacangan untuk menghasilkan benih bebas
virus. Jurnal Iptek Tanaman Pangan. 2(1): 69.
Spacman E, Senne E, Myers TJ, Bulaga LL, Garber LP, Perdue ML, Lohman K,
Daum LT, Suarez DL. 2002. Development pf a realtime reverse
transcriptase PCR assay for type A influenza virus and the avian H5 and H7
hemagglutinin subtypes. J Clin Microbiol 40: 3256-3260.
Sudarisman. 2009. Pengarug perkembangan sistem produksi ayam terhadap
perubahan genetik dan biologik virus Newcastle Disease. Wartazoa. 9(3):1.
Tabbu CR. 2000. Penyakit Ayam dan Penanggulangannya: Penyakit bakterial,
Mikal dan Viral. Yogyakarta (ID): Kanisius.
Wiyono A, Indriani R, Dharmayanti NLPI, Damayanti R, Adjid RMA. 2005.
Karakterisasi molekuler virus Avian Influenza isolat Indonesia. JITV.
10(2) : 127.
Yuen, KY and Wong SS. 2005. Human Infection by avian influenza A H5N1. Hong
Kong Med J. 11(3) : 189-199.
Yune N and Abdela N. 2017. Epidemiology, Diagnosis and Control Technique of
Newcastle Disease. J Vet Sci Technol. 8: 429.
Zuhriana Y.2010. Polymerase Chain Reaction (PCR). Jurnal Saintek.. 5(6)