DIAGMOL WEEK 2 – ANALISIS PROFIL DNA

● REA (Restriction endonuclease analysis)

o Pake enzim restriksi
▪ Sistem pertahanan sekelompok bakteri untuk bisa menghancurkan dna yg
masuk ke selnya (mirip crispr tapi mekanisme beda)
▪ Tiap bakteri rigid, di alam kemungkinan gen2 asing besar 🡪 mekanisme
defense beragam
▪ Enzim digunakan dalam prinsip pemotongan dna 🡪 berbeda dengan
nuclease lain 🡪 kalo nuclease di sel kita banyak (ekso di luar, endo
didalam)
● Endo punya recognition site
● Mereka punya proteksi untuk dna dengan enzim metilase 🡪
nambahin gugus metil 🡪 kalo ada gugus metil 🡪 enzim restriksi ga
bisa motong
● Metilase dimiliki oleh semua sel 🡪 selft protection 🡪 supaya dna
ga bisa dipotong atau diakses enzim2 untuk ekspresi gen 🡪 tidak
hanya untuk motong tapi bisa buat gen tidak terekspresi
o Ct: kalo gen cancer inducing ada penambahan metil jadi
metilasi berdampak positif
● Metilase dari makanan dll
▪ Restriction sites 🡪 sifatnya palindrom (dibaca ujung kanan kiri
memberikan susunan yg sama)
▪ Kalo mau dapet gambaran lengkap untuk suatu orientasi dna 🡪 lakukan
multiple digest (2 atau >2 enzim)
▪ Orientasi 4 ke 6 jadi urutannya Eco R1 baru Pst I
o Prinsip
▪ Kromosom bakteri umumnya double strand tapi beebrapa pengecualian
punya topologi beda seperti rhodobacter ada 2 circular, borrelia 1 linear,
agrobacterium 1 circular 1 linear)
o Basic analysis
▪ Enzim restriksi dua macam
● Frequent cutter
● Memotong jarang 🡪 biasanya recognition sitesnya panjang 8
hingga lbeih dari 10 base pair
o Kalo semakin pjg regocnition site 🡪 makin jarang ketemu
susunan dna yg sama
● Kalo semakin pendek recpgnition sitesnya misal 4 bp lebih sering
ketemu maka lebih sering terjadi pemotongan 🡪 lebih banyak
hasilin pita2 hasil pemotongan dna
● Kalo ukuran dna ga begitu besar 🡪 pake motong sering, kalo
ukuran dna yg mau dipotong panjang pake yg motong jarang aja
● Walaupun spesies sama bisa memilliki variasi
● Tinggal tambahin inkub lalu elfor 🡪 simple 🡪 tapi bisa jadi kita
gunain enzim yg ga pas jdi ga bgitu keliatan perbedaannya
 ▪ Kelebihan: gampang simple, murah tinggal beli enzim terus elfor
▪ Kelemahan: difficulty interpreting complex dna profile 🡪 yg hasilin
ratusan pita misal kita punya 500 sampel hasilin masing2 ratusan pita jdi
bakal pusing saat interpretasinya 🡪 jadi harus nemuin enzim yg pas buat
motong banyak tapi ga terllau bnyak bgt juga
● Kalo motong di tempat sama jadi ga keliatan kalo sebnernya
hasilin 3 pita Cuma keliatan satu pita 🡪 unresolved dan overlap jdi
susah dipisahkan dalam elfornya
● RFLP (restriction fragment length polymorphism)
o Analisis untuk melihat perbedaan walaupun berasal dari sumber yg sama 🡪 misal
dri satu spesies tapi bisa dilihat polymorphism (bentuk sama tapi sebenernya
strukturnya beda)
o Misal E.coli A dan B sama atau engga 🡪 berdasarkan restriction fragment length
🡪 liat dri ukuran potongan hasil enzim restriksi
o Bedanya dengan REA 🡪 sulit dengan REA sulit dipisahkan (overlap) 🡪 ukuran dna
sama sekuens beda 🡪 untuk ngatasin itu dikembangin RFLP 🡪 prinsip sama tapi
dilanjutin dengan analisis hibridisasi 🡪 sesudah dipotong, dielfor dan dilanjutkan
hibridisasi (pake labeled dna as a probe) untuk lacak sekelompok atau satu gen
yg susunannya sudah tau apa jadi meskipun overlap dielfor kalo akan dilakukan
deteksi dengan probe bakal ketauan sekuens yg beda itu walaupun ukuran sama
(walaupun overlap)
o Probe akan selalu cari yg mirip yg match base pairnya dengan dia jadi tetap
ketauan sekuens yg overlap itu
o Jadi variasi ukuran dan jumlah bisa diatasi teknik ini
o Probe nya macam2 tergantung kita lagi mau deteksi apa (apakan ribosomal dna,
dna yg belum tau apa, dna yg ekspresi gen yg udh diketahui seperti gen2 amilase
aja)
o Prinsip: memotong dna pada sekuens spesifik
▪ Restriction sites ada yg 6 cutter, 4 cutter dll
▪ Bisa lakuin analisis terjadinya mutasi
● Misal orang normal bisa dipotong hanya 2 kali tetapi orang yg
mutan bisa dipotong 3 kali jdi berarti di orang mutan ada 3
recognition sites dan bisa tau gen mutannya di bagian mana
▪ Dna 1 yg dipotong eco ri punya 3 situs pengenalan sedangkan dna 2 salah
satu situs pengenalannnya terjadi mutasi sehingga situs pengenalan tsb
yg hrusnya bisa dipotong jdi ga bisa dipotong 🡪 setelah di elfor dna 1
hasilin dua pita yaitu 5 kb dan 4 kb sedangkan di dna. 2 hanya ada satu
pita ukuran 9 kb 🡪 dna 2 misal dari orang 2 memiliki mutasi (skrining awal
tejadinya suatu mutasi atau kelainan) 🡪 hanya pake enzim restriksi satu
macam bisa lihat perbedaan antara satu orang dengan orang lainnya
▪ Sumbernya diambil dna dan dilakuin ekstraksi dipotong 🡪 dielfor 🡪
dilakuin hibridisasi 🡪 terlihat band2 perbedaannya untuk ngatasin
unresolved (ukuran sama tapi numpuk atau overlap di elfornya)
o Manfaat:
 ▪ Untuk lihat satu spesies pada stu populasi
● Misal dna mitokondria manusia punya 2 situs pengenalan untuk
EcoRI sedangkan mitokondria lebah punya 5 situs pengenalan
EcoRI 🡪 bisa berguna untuk bedain dna manusia dan dna lebah
gimana jdi misal klo hasil potongannya lebih dari dua berarti
bukan punya manusia jd analisisnya udh ga usah dilanjutin
● Melihat analisis relatedness: misal di imigrasi benar ga ini
keluarganya di sana, atau Cuma ngaku2, untuk memberi izin orang
pindah ke negara lain dll
● Semakin bnyak dianalisis bisa buktiinmereka beneran berkerabat
atau tidak
o Kelebihan: Bisa lihat variasi di level dna 🡪 co dominan
o Kelemahan: lab untuk hibridisasi ga mudah, dna yg dibutuhkan juga besar
o Bisa dilakuin pada organsime apapun
o Sangat mencari situs pengenalan yg sama persis
o Enzim gab oleh expired, kondisi pas lakuin digesti hrus diperhatikan, suhu
optimum
o Lakuinnya diulang dan diconfirm dengan enzim lain
o Dna sampel harus dibuat single strand
o Biasanya juga dibuat fluorescence kalo dna probenya ketemu dengan gen yg kit
aca
o Contoh:
▪ Bisa skrrining dna yg mengalami delesi atau mutasi
● Untuk tau janin mengalami cacat atau engga dengan diambil
cairan amnionnya
▪ Bisa untuk membuktikan suatu kasus (fingerprinting)
o Kasus pertama ada orang mengalami sickle cell -🡪 gabisa folding dengan baik jadi
ga bisa jdi sel darah merah normal krn ada mutasi di dna nya (hanya satu basa
yang berubah) sehingga asam aminonya nanti yang ditranslasi berbeda
▪ Kodon basa 1, 2, 3 🡪 tabel kodon diliat 🡪 kalo mutasi meskipun satu basa
tapi terjadi di posisi 2 sifatnya fatal krn hasilin asam amino berbeda tapi
kalo di basa 1 atau 3 ada kemungkinan masih hasilin asam amino sama
atau asam amino beda tapi sifat sama (misal sama2 asam, sama2 basa
walaupun asam aminonya beda)
▪ Sickle cell pada sel kita yang diploid 🡪 terjadi mutasi hanya pada satu
pasang gen jadi resesif 🡪 ga begitu keliatan jadi lebih seperti normal
karena jumlah sel darah merah yang berbeda itu masih lebih sedikit dari
yang normalnya 🡪 aktivitas normal bisa dicover dengan sel darah merah
normal
▪ Namun yang resesif tetap bisa rasain sakit ketika berada di ketinggian
(hiking atau di) pesawat krn kadar oksigen rendah 🡪 sel darah yang
dimiliki kemampuannya terbatas krn yg sickle cell emg selnya jd sulit
mengikat oksigen 🡪 makanya orang2 resesif jdi suka sesak napas klo
kondisi oksigen di lingk dikit
 ▪ Kalo orang dominan dua2nya mengalami mutasi 🡪 sangat fatal 🡪 harus
bisa ditransfusi (tergantung kondisi) 🡪 banyak alami sakit krn mayoritas
sel darah merahnya ga bisa ikat oksigen
▪ Banyak orang afrika yg alamin sickle cell namun resesif –> kelebihannya
yaitu virus2 atau parasit2 yang menyerang sel darah merah seperti
malaria 🡪 pnya sickle cell atau sel bulan sabit, parasite gasuka hidup di
sana 🡪 self protection (self immunity) secara genetic buat orang tsb
dimana tempatnya mereka di sana malaria emg udh jadi endemic 🡪 jadi
kemungkinan kecil kena malaria tsb
▪ asam amino normalnya pnya asam glutamate tapi alamin mutasi jdi valin
akibat ada satu basa yg berubah 🡪 fatal di basa kedua dalam satu kodon
🡪 harusnya GAG hasilin glutamate tapi A nya yang diposisi kedua jadi T 🡪
glutamate berubah jadi valin 🡪 gabisa bentuk sel darah merah normal 🡪
bentuk sel darah merah seperti bulan sabit
▪ kalo orang dominan kualitas hidupnya keliatan buruk tapi kalo resesif
biasanya keliatan normal di lingkungan normal walaupun di lingk oksigen
rendah akan keliatan ga normal 🡪 perlu dideteksi
▪ kodon GAG (glutamate) berubah jadi GTG (valin) dan abolishes sequence
🡪 untungnya ada enzim restriksi yang mengenali area tersebut 🡪 dengan
cara mudah bisa terdeteksi orang tsb mengalami kelainan sickle cell atau
tidak
▪ Kotak ayah, bulat ibu 🡪 keduanya resesif (orangtuanya ga sadar kalo
mereka resesif sickle cell krn keliatan sehat2 aja) 🡪 heterozigot 🡪
menikah hasilin anak dengan kemungkinan 3 genotipe (dominan, resesif,
normal) karena antar sel telur dan sperma terbentuk semikonservatif dan
hasilin berbagai kemungkinan
▪ Keluarga Antonarakis kedua ayah ibu heterozigot jadi hasilin anak yg
kemungkinan homo, hetero, normal 🡪 makanya lebih baik sbelum
menikah melakukan genetic testing untuk mengetahui dan menghindari
anaknya cacat 🡪 sebelum menikah udah ketahuan menghasilkan anak
yang mengalami sickle cell, sehat atau resesif
o gen normal didigest 🡪 dipotng dengan enzim 🡪 dipisahin dengan elfor 🡪 terlihat
hasil pitanya
▪ dicari enzim yang memang mengenali situs pengenalan di area yang
terjadi mutasi penyebab sickle cell 🡪 enzim restriksi itu nantinya ga akan
bisa motong di tempat yg terjadi mutasi jdi ketika di elfor dihibdridisasi
ketauan mana yg mengalami mutasi 🡪 mengalami sickle cell 🡪 contoh di
ppt dipotong dengan MstI 🡪 kalo di REA doang warnanya masih hitam
semua setelah di southern blot keliatan pitanya yg terbentuk dari orang
yang skit nanti jadi beda dengan yg orang normal (jumlah pitanya lebih
dikit liat di ppt)
o jadi dengan RFLP bisa tau orang yg mengalami penyakit tertentu akibat mutasi di
gennya 🡪 tapi harus pake enzim restriksi yg bisa mengenali situs pengenalan gen
yg mengalami mutasi 🡪 jadi makanya yang penting tahu dulu gen yang akan
 mengalami mutasi apa dan situs pengenalannya apa yang bisa dipotong dengan
enzim restriksi tsb
o berasosiasi dengan genetic disease 🡪 dilihat dari ada atau ketiadaan pita yang
terbentuk tsb 🡪 untuk lihat suatu keluarga siapa yang sebetulnya genetic disease
diturunkan dari ayah atau ibunya disebut genealogy 🡪 untuk bisa prepare kalo
mau menghasilkan anak lagi ada diketahui kemungkinan cacat
▪ karena mau melihat secara keseluruhan bukan hanya pasien dan orang
sehat tapi sebanyak mungkin family member diikutkan untuk analisis
RFLP ini
▪ angka2 di gambar itu profil potongan RFLP
▪ setelah dilihat profil pita2 yg terbentuk dapat dilihat anak2 mana yg
mengalami kelainan dan bisa diketahui dari mana asal mutasi tersebut 🡪
dilihat dari 3 generasi 🡪 kalo ada RFLP potongan no 2 yg mewarisi
disorder (kelainan) 🡪 ternyata diketahui dari ibunya dan ibunya dapet dri
ayahnya jdi asal mulanya dari kakeknya 🡪 jdi kalo mau punya anak lagi
dan di janinnya diketahui punya RFLP no 2 bisa dipersiapkan nantinya
anaknya akan punya inherited disorder dan anak2nya yg udah bawa RFLP
no 2 bisa mengantisipasi agar pasangannya ga bawa RFLP no 2 juga 🡪 jadi
bisa untuk preventif
o forensic
▪ tiap sel manusia punya 6x20 pangkat 6 bp dna yang merupakan gen
structural yg sama tiap orang tetapi bagian lain sisanya selain structural
sangat bervariasi dari satu org dengan org lainnya 🡪 bisa dimanfaatkan
untuk analisis forensic 🡪 dna typing
▪ manfaat
● untuk identifikasi pelaku pemerkosaan
● cari tau orang tuanya yg mana misal krn papanya gamau ngaku
● bisa memastikan relasi keluarga di imigrasi atau imigran supaya
orang2 imigran yg ngeklaim sekeluarga bisa dipastikan benar
memiliki hubungan darah
● analisis dna dari semen yg diambil dari vagina korban, baju korban
🡪 evidence 1 dan 2
● dna korban kalo sehat bisa diambil dari darah
● dna dari dua suspect
● diketahui profil yang mirip dengan evidence adalah suspect no 1
tapi belum bisa dipastikan bersalah sehingga hrus diestimasi
probilitasnya misal setelah diestimasi probabilitas ketemu profil
dua alel yg sesuai tersebut adalah 1 dari 16 orang sedangkan
terhadap 6 alel adalah 1 dari … ribu orang (di ppt) dan jika dilihat
dari 14 band yang sama maka probabilitasnya 1 dari 268 juta
orang dimana lebih dari populasi di US sehingga semakin banyak
pita yang similar, probabilitasnya semakin kecil untuk ketemu yg
sama di suatu populasi sehingga semakin besar kemungkinan
suspect tersebut adalah benar pelakunya
 ● kasus Ghana Immigration Case
o ibu tinggal di UK, papanya di Ghana, anaknya ikut papanya
o suatu hari anaknya ingin balik sama ibunya, tinggal di UK
ikut ibunya tapi di UK ga langsung percaya gitu aja
ngebolehin Andrew tinggal di UK
o jadi dilakukan dna typing diambil profil dari ketiga anak yg
udh tinggal sama ibunya di UK untuk rekonstruksi dna
ayahnya krn ayahnya udh gaada
o ternyata hasilnya separuh pita Andrew mirip setngah
dengan kompilasi dna ayahnya dan sisanya sama dengan
profil pita ibunya dan possibility kesamaan itu terjadi 1 dari
trillion sehingga UK mengizinkan Andrew kembali
berkumpul dengan ibunya
o kalo ayahnya belum terlalu lama meninggal bisa diambil
dari personal material ayahnya
● Ribotyping
o Sebenarnya RFLP tapi probenya yg dipake adalah probe untuk deteksi gen (DNA)
penyandi rRNA
o Prinsip: yg dipotong gen penyandi ribosomal RNA
o Buat analisis spesies, bakteri, tanaman, hewan
o Transkripsi hasilin mRNA 🡪 dilanjutin smpe translasi
o tRNA setelah ditranskripsi langsung dipake untuk sintesis protein
o rRNA stelah ditranskripsi langsung dipake untuk nyusun ribosom
o jadi tRNA dan rRNA tidak sampe translasi
o pake yg gen penyandi rRNA karena jumlahnya paling banyak dibanding RNA yg
lain 🡪 75% RNA adalah rRNA jadi akan makin mudah untuk analisisnya
o selain banyak jumlahnya, ukuran besar dan stabil
o eukariot: 28s, 18s, 5s 🡪 dipake 18s untuk tujuan identifikasi
o prokariot: 23s, 16s, 5s 🡪 dipake 16s untuk tujuan identifikasi
o misal baru ketemu sampel dan mau tau itu apa pakenya gen penyandi 18s atau
16s (mau tau spesiesnya)
o kalo mau tau keragaman di tingkat spesiesnya pake yg noncoding ITS atau ETS
nya kalo pake 16s atau 18s bakal hasil pitanya sama semua
● ARDRA (Amplified ribosomal dna restriction analysis)
o Mirip dengan RFLP dan ribotyping tapi kalo RFLP (digest dan dihibridasi dengan
probe berbagai dna), ribotyping (probe dengan gen penyandi gen rRNA), tetapi
ARDRA gen 16s atau 18s diamplifikasi dahulu baru kemudian didigesti dan ga
pake hibridisasi dengan probe
o Untuk melihat kekerabatan, filogenetik
o Prinsip
▪ Diamplifikasi supaya memperbanyak 🡪 supya dengan jumlah kuantitas
sama dapat didigesti lebih mudah
▪ Untuk liat spesies beda bagus bisa liat ARDRA 🡪 sekelompok Enterobacter
 ▪ Untuk lihat pada genus sama tapi spesies beda dan kadang liat genus
beda juga bisa (level untuk lihat pada tingkat spesies beda)
▪ Setelah diamplifikasi PCR dengan primer khusus 🡪 hasil PCR didigesti
dengan enzim restriksi yang motongnya 4 cutter 🡪 untuk lihat
perbedaannya
o Contoh kasusnya mau lihat berapa bnayak spesies beda
● Rangkuman
o Kalo sama sekali blank belum tau apa2 pake gen 16s atau 18s untuk tahu itu
genusnya apa spesiesnya apa misal pake ribotyping
o Misal udh tau Botryosphaeria nya banyak tapi mau tau spesiesnya beda apa sama
🡪 di pcr 16s diamplifikasi 🡪 dipotong 🡪 untuk lihat perbedaannya dengan ARDRA
krn kalo sekuensing lebih mahal 🡪 pemotongannya hanya motong di gen 16s
rRNA nya (lihat di tingkatan spesies)
o Misal punya 100 Salmonella typhi padahal spesiesnya sama semua mau tau
beneran sama atau beda (untuk lihat strainnya misal) pakenya yg ITS (intergenic
spacer) 🡪 bagian non coding yg tidak menyandikan protein
o REA karena ada kelemahan yaitu hasilin overlap jdi pake RFLP yg pake probe jdi
bisa kebaca sekuensnya beda di yg overlap di REA
o RFLP banyk aplikasi buat deteksi mutasi penyakit, untuk lihat geneologi, forensic,
dll
o Ribotyping sama kayak RFLP tapi probe yg dipake gen rRNA
o ARDRA didigesti hasil amplifikasi PCR nya
o Prinsip untuk digesti bisa dipake buat yg noncoding juga Cuma jgn pake yg gen
16s atau 18s
o Yg REA dan RFLP juga bisa dipake buat bgian dna manapun termasuk untuk yg
noncoding
o Kalo ARDRA dan ribotyping udah pasti hanya untuk yg coding
o Kalo mau tau spesiesnya apa aja emg hrus sekuensing tapi kalo mau tau berpaa
banyak yg beda spesiesnya bisa pake yg ARDRA