GENETIKA MOLEKULER

Genetika molekular adalah cabang ilmu di Biologi, yang merupakan

bagian dari ilmu genetika yang dikhususkan untuk mengkaji bahan
genetik dan ekspresi genetik di tingkat subselular (di dalam sel). Kajiannya
meliputi struktur, fungsi, dan dinamika dari bahan-bahan genetika serta
hasil ekspresinya.
ISOLASI DAN PURIFIKASI
DNA DARI SEL
• Sistematik molecular menggunakan informasi yg terdapat
dalam molekul asam nukelat (DNA dan RNA)
• Ada 3 macam DNA yang digunakan
1. DNA sel total
2. Pure plasmid DNA
3. DNA virus
Preparasi DNA sel Total
• Dasar preparasi DNA akan mudah dipahami jika mempelajari
purifikasi DNA yang paling sederhana yaitu purifikasi DNA
total sel bakteri
• Setelah mengetahui prosedur paling dasar kita dapat
memahami preparasi DNA yang dimodifikasi untuk tujuan
purifikasi dari sumber apa saja
Prosedur Preparasi DNA total dari Bakteri
1. Kultur bakteri ditumbuhkan lalu dipanen
2. Sel bakteri dipecah untuk mengeluarkan isinya
3. Ekstrak sel untuk membuang semua komponen sel selain
DNA
4. DNA yang dihasilkan dipekatkan
5. Pengukuran konsentrasi DNA
Penumbuhan dan Pemanenan kultur bakteri
• Growing
➢Broth culture
➢Defined medium
• Pemanenan
➢Sentrifugasi pada 8000rpm
2. Preparasi ekstrak sel
• Sel bakteri memiliki dinding yang membungkus sitoplasma
• Semua pembungkus sel harus dihancurkan agar komponen
sel dapat dikeluarkan
• Teknik penghancuran sel :
✓Metode fisika : pemecahan secara mekanik
✓Metode kimia : sel dilisisiskan dengan agen kimiawi
Preparasi ekstrak sel
• Pemecahan kimiawi dilakukan dg merusak sel dan membrane
sel
• Penghancuran dinding sel dapat menggunakan lysozyme
• Penghancuran membrane sel dg EDTA
• EDTA merusak membrane dan dinding sel dg cara
mengangkap ion Mg++ yg mempertahankan integritas
pembungkus sel
• EDTA menghambat enzim nuklease
Preparasi ekstrak sel
• Menghancurkan sel juga dapat menggunakan SDS,
membantu lisis sel
• Setelah sel dilisiskan, tahap terakhir membersihkan kotorab
tdk terlarut dg sentrifugasi
3. Purifikasi DNA dari esktrak sel
• Disamping DNA, dalam ekstrak sel bakteri terdapat protein
dan RNA
• Berbagai prosedur dapat digunakan untuk membersihkan
protein dan RNA agar diperoleh DNA murni
• Prosedur standar untuk menghilangkan protein dari ekstrak
sel adalah dengan penambahan fenol atau campuran fenol:
kloroform (1:1)
• Fenol-kloroform akan mempresipitasi protein sehingga yg
tinggal DNA dan RNA
Purifikasi DNA dari ekstrak sel
• Protein yg terakgulasi dipisahkan dg sentrifugasi
• Jika kadar protein sangat tinggi maka pembersihan protein
dilakukan dg penambahan enzim protease sebelum ekstraksi
fenol-kloroform
• Enzim tersebut memotong protein menjadi potongan molekul
yg lebih mudah dibersihkan dg ekstraksi fenol-kloroform
• Larutan asam nukleat (DNA dan RNA) dapat diambil dg pipet
Purifikasi DNA dari ekstrak sel
• Sebagian RNA dapat dibersihkan dg fenol tetapi Sebagian
masih tersisa Bersama DNA sehngga harus dibersihkan dg
enzim RNAase (ribonuclease)
4. Pemekatan DNA
• Jika diperoleh DNA yang pekat maka tidak perlu dipekatkan, tetapi
ada kalanya DNA yg diperoleh tidak pekat sehingga perlu
pemekatan
• Metode umum untuk memekatkan DNA adalah presipitasi etanol
• Dalam larutan yg mengandung garam dan suhu <20C, etanol
absolut akan mempresipitasi molekul DNA yg panjang
• Presipitat diambil dg sentrifugasi sedangkan yg pendek serta RNA
yg patah2 karena RNAase akan tetap dalam larutan sehingga
dapat dibersihkan Bersama supernatan
5. Pengukuran konsentrasi DNA
• Konsentrasi DNA dapat diukur dg
UV spektrofotometer
• Jumlah sinar UV yg diserap larutan
dalam DNA berbanding lurus dg
konsentrasi DNA dalam larutan
• Absorbansi diukur pada 260 nm
Pengukuran konsentrasi DNA
• Absorbansi UV oleh larutan DNA dapat pula digunakan untuk
memeriksa kemurnian suatu larutan DNA
• Untuk larutan DNA murni, rasio A260/A280 = 1,8
• Hasil < 1,8. menunjukan bahwa larutan DNA terkontaminasi
oleh protein atau fenol.