ISOLASI DNA GENOM DARI SAMPEL

DARAH MANUSIA DENGAN METODE

SALTING OUT NON ENZIMATIS

Muhammad Raihand
PO713203191019
D.III Teknologi Laboratorium Medis

Mata Kuliah : Biokimia Praktik

Dosen Pembimbing : Ridho Pratama,S.Si,M.Kes
 DNA

DNA (Deoxyribonucleic acid) adalah

polimer asam nukleat yang tersusun
secara sistematis dan merupakan
pembawa informasi genetic yang
diturunkan kepada jasad keturunannya.
ISOLASI DNA
Isolasi DNA adalah metode untuk mendapatkan asam deoksiribonukleat dari
suatu makhluk hidup.
Isolasi DNA pertama kali dilakukan oleh ilmuwan asal Swiss bernama Friedrich
Miescher pada tahun 1869. Ia menemukan senyawa asam yang mengandung nitrogen
dan fosfat pada inti sel dari sel darah putih. Senyawa ini diberi nama nuklein, namun
pada tahun 1889 muridnya yaitu Richard Altmann menamainya asam nukleat . Metode
yang digunakan oleh Miescher adalah alkalyne lysis untuk memecahkan sel dan
mengisolasi DNA.
Menurut Wilson, Keith and John, (2010) Isolasi DNA merupakan kegunaan DNA
untuk dianalisa atau dimanipulasi yang harus diisolasi terlebih dahulu dan murni
kandungannya
ISOLASI DNA
Prinsip dasar DNA/RNA dari jaringan adalah dengan
memecah dan mengekstraksi jaringan tersebut sehingga
Prinsip isolasi DNA akan terbentuk ekstrak sel yang terdiri dari DNA, RNA,
dan substansi dasar lainnya

2. Sentrifugasi :
3. Ekstraksi :
1. Pelisisan : Untuk memisahkan
Untuk memisahkan
Untuk memecah hasil lisisan (dinding
senyawa DNA dari
dinding dan sel, dan kloroform)
protein, lipid dengan
membran sel dari DNA dengan
cara pengocokan
kecepatan tertentu
ISOLASI DNA

4. Puriikasi : 5. Sentrifugasi
Untuk memurnikan Untuk memisahkan 6. Presipitasi:
DNA dari senyawa DNA dari Untuk
kontaminan seperti pengotornya mengendapkan
senyawa sekunder dengan kecepatan DNA
(fenol), polisakarida. tertentu
ISOLASI DNA GENOM DENGAN METODE SALTING OUT
Metode salting out adalah salah satu yang paling sederhana dari semua
metode. Pada metode ini, dibutuhkan antara 3 hingga 4 jam mengisolasi DNA
dari untuk beberapa sampel dengan hasil berkisar antara (6-10ug) kualitas DNA
yang baik yaitu 300uL dari seluruh darah. Dari penelitian kami, metode salting
out lebih sedikit memakan waktu dan boros biaya serta memberikan
konsentrasi DNA yang lebih baik yang diperlukan untuk studi genotipe dengan
ukuran sampel yang besar.

Metode ini menggunakan bahan kimia standar yang dapat diperoleh dari
bahan utama; kami menggunakan bahan kimia yang dipasok oleh Sigma &
Himedia.
Alat dan Bahan
Alat Bahan
• Tabung Eppendorf 1,5ml • Tris-HCl
• Natrium
Klorida(NaCl)

• Kalium Klorida(KCl)
• Natrium Dodesil
• Centrifuge Mikro Sulfat(SDS)
• Isopropanol
• Magnesium Klorida(MgCl) • Etanol
• Triton-X
• EDTA
Metode Pengumpulan Darah
Darah dikumpulkan dalam tabung vakum yang
mengandung EDTA. Seperti halnya semua cairan
tubuh, darah merupakan biohazard potensial, oleh
karena itu perawatan harus diambil dalam semua
langkah yang membutuhkan penanganan darah. Jika
subjek berasal dari kategori berisiko tinggi, tindakan
pencegahan mungkin diperlukan. Sampel darah
disimpan dalam suhu ruangan yang sesuai untuk
ekstraksi DNA dihari yang sama & juga di lemari es
yang akan digunakan.
Persiapan Reagen
a. Reagen TKM 1/ Low salt buffer(500 ml): 0,605 g Tris HCl (10mM) pH 7.6, 0.372 g KCl
(10 mM), 1.016 g MgCl2 (10 mM), 0.372g EDTA (2mM) dilarutkan dalam 500 ml air suling

b. Triton-X (10ml): Tambahkan 0.1 ml Triton-X 100% hingga menjadi 9,9ml air suling.

c. Reagen TKM 2/ High salt buffer(100 ml): 0.121 g Tris HCl (10mM) pH 7.6, 0.074 g KCl
(10 mM), 1.203 g MgCl2 (10 mM), 0.074 g EDTA (2mM), 0.467 g dari NaCl (0.4 M)
dilarutkan dalam 100 ml air suling.

d. SDS: Satu gram natrium dodesil sulfat dilarutkan dalam 10 ml air suling.

e. 6M NaCl: 8.765 g NaCl dilarutkan dalam 25 ml air suling.

f. TE Buffer: 0.030 g Tris HCl (10mM) pH 8.0, 0.009 g EDTA (1mM) dilarutkan dalam 100ml
air suling
Ekstraksi DNA
Lisis Sel Darah Merah
1. 900 μl Reagen TKM 1 dan 50 μl 1x Triton-X
ditambahkan ke 300 μl darah yang telah
diheparinisasi dalam eppendorf 1,5 ml dalam
autoklaf
2. Diinkubasi pada suhu 37’C selama 5 menit
untuk melisiskan sel darah merah.
3. Sel disentrifugasi 8000 rpm selama 3 menit dan
supernatan dibuang.
4. Langkah ini diulangi 2-3 kali dengan penurunan
jumlah 1x Triton-X

Lisis Sel Darah Merah telah selesai dan sel pelet dari
sel darah merah telah diperoleh.
 Ekstraksi DNA

Lisis Sell
1. Pada Sell Pelet, tambahkan 300 μl Reagen
TKM 2 dan 40 μl dari 10% SDS
2. Campur sampai rata dan inkubasi pada suhu
37'C selama 5 menit
3. pada akhir inkubasi, tambahkan 100 μl dari 6M
NaCl dan vortex untuk mengendapkan protein
Presipitasi DNA

1. Supernatan dipindahkan ke tabung eppendorf baru yang mengandung 300 μl isopropanol.

2. DNA diendapkan dengan membalik eppendorf secara perlahan.
3. Selanjutnya, eppendorf disentrifugasi pada 8000 rpm selama 10 menit untuk memecah DNA.
4. Supernatan dibuang, 70% etanol ditambahkan dan dicampur perlahan untuk menghilangkan kelebihan
garam.
5. Terakhir tabung disentrifugasi pada 8000 rpm selama 5 menit untuk memecah DNA.
6. Supernatan dibuang dan DNA dikeringkan dengan udara.
7. Setelah pengeringan menyeluruh,tambahkan 50 μl buffer TE untuk melarutkan DNA.
Sekian & Terima Kasih