Machine Translated by Google

Arch Virol (1998) 143: 1015–1020

Urutan protein selubung dari galur potyvirus mosaik

Johnsongrass yang menginfeksi Krish

Laporan singkat

Suranto1, KH Gough2, DD Shukla3, and CK Pallaghy4 1,4

School of Botany, La Trobe University, Bundoora, Victoria, Australia
2,3CSIRO, Division of Biomolecular Engineering, Parkville, Victoria, Australia

Diterima 18 Desember 1997

Ringkasan. Morfologi potyvirus mosaik Johnsongrass galur Australia (strain

penginfeksi JGMV Krish), yang mampu menginfeksi sorgum yang membawa gen
resistensi potyvirus Krish, diselidiki dan urutan dasar dari wilayah protein mantel
ditentukan. Di bawah mikroskop elektron, virus itu tidak dapat dibedakan dari jenis liar
yang lazim di Australia, JGMV-Jg. Namun, ada beberapa perubahan signifikan dalam
urutan asam amino yang disimpulkan baik di N-terminus dan daerah inti dari protein
mantel. Beberapa perubahan asam amino ini mungkin bertanggung jawab untuk
mematahkan ketahanan sorgum yang membawa gen ketahanan virus Krish. Dalam
diskusi disebutkan hasil awal dengan transkrip in vitro bermutasi yang mendukung
saran ini.
ÿ

Virus mozaik Johnsongrass, strain Johnsongrass (JGMV-Jg), virus single stranded

positive sense RNA, dalam genus Potyvirus (Potyviridae), menyerang sejumlah rumput
tropis termasuk jagung dan sorgum yang menyebabkan kerugian ekonomi yang
signifikan [6, 13]. Pada tahun 1959 sorgum, yang kemudian diberi nama Krish,
diperkenalkan ke Australia dari India; sorgum ini kemudian ditemukan mengandung
gen yang memberi tanda mampu resistensi tinggi terhadap JGMV-Jg lazim di Australia
[4, 16, 17]. Pada tahun 1985 strain baru JGMV ditemukan menginfeksi galur sorgum
QL12 dan kultivar WT (Trojan putih) yang mengandung gen ketahanan Krish [10-12].
Karena perubahan di wilayah N-terminal yang terpapar permukaan dari protein
mantel potyvirus telah terlibat dalam perlindungan silang, kisaran inang dan perilaku
virulensi strain potyvirus [15], dan sejak wilayah N-terminal dari protein mantel JGMV
adalah wilayah yang paling bervariasi antara strain JGMV, kami menduga bahwa
mutasi pada JGMV-Jg yang menentukan spesifisitas inang mungkin terjadi di wilayah ini
Machine Translated by Google

1016 Suranto dkk.

[15]. Laporan singkat ini mendokumentasikan perbedaan urutan basa, dan akibatnya urutan
asam amino yang disimpulkan, antara JGMV-Jg dan strain yang menginfeksi JGMV Krish di
wilayah protein selubung.
Sebuah isolat galur penginfeksi JGMV Krish dikumpulkan oleh Mr. DM Pers ley dari
daun tanaman sorgum yang terinfeksi (kultivar WT, resisten terhadap JGMV-Jg) yang tumbuh
di Darling Downs, Queensland, sedangkan isolat jenis liar, JGMV- Jg, disumbangkan dengan
baik oleh Dr. DS Teakle, Departemen Mikrobiologi, University of Queensland. Strain yang
menginfeksi JGMV Krish disebarkan dan dipertahankan dalam dua sorgum yang mengandung
gen resistensi Krish (QL12 dan WT) di rumah kaca kami di Universitas La Trobe.

Inokulum dibuat dari daun yang terinfeksi dengan menggiling dalam mortar dalam
campuran buffer fosfat dingin 0,01 M (pH 7) dan natrium sulfit 0,1 M (masing-masing 1:4 v/v).
Inokulasi mekanis bibit dilakukan selama tahap perkembangan daun ketiga dengan
menggosokkan ke daun setelah pertama kali ditaburi bubuk Car borundum. Daun kemudian
dicuci sebentar dengan air ledeng dan tanaman disimpan dalam kandang tahan serangga di
ÿ

rumah kaca (suhu berkisar antara 16 30 C dan

ÿ

C). Gejala mosaik diamati sedini 5 hari pasca inokulasi.

Isolasi, pemurnian dan visualisasi virus dilakukan sekitar 10-15 hari setelah inokulasi.

Partikel virus yang digunakan untuk mikroskop elektron diperoleh dari fraksi virus yang
dimurnikan [7]. Suspensi virus (2-3 l) ditempatkan pada kisi-kisi yang dilapisi karbon yang
sebelumnya dilapisi dengan albumin 1% untuk meningkatkan kepatuhan virion. Volume kecil
1,5-2% potasium fofotungstat (pH 7) ditambahkan dan kelebihan cairan dihilangkan dengan
kertas saring sobek [17]. Virion bernoda negatif diamati menggunakan mikroskop elektron
transmisi Siemens 102 dan difoto pada perbesaran 60.000.

Seperti yang diharapkan, morfologi strain yang menginfeksi Krish tidak dapat dibedakan
dari JGMV-Jg. Analisis mikroskop elektron dari virion bernoda negatif dari strain yang
menginfeksi Krish menghasilkan panjang rata-rata 736 ± 11 nm (n = 200) dengan distribusi
frekuensi normal, yang sebanding dengan 735 ± 17 (n = 100) yang diterbitkan untuk tipe liar
[17]. Kami berasumsi bahwa strain yang menginfeksi Krish berevolusi dari tipe liar selama
1959–1985.
Isolasi RNA virus genom panjang penuh [7] sedikit dimodifikasi seperti yang
direkomendasikan oleh Dr. A. Davidson (Monash University, pers.comm.). KCl digunakan
sebagai pengganti NaCl selama sentrifugasi ekstrak kasar dengan PEG 8 000.
Seperti yang diharapkan, mRNA yang diekstraksi memberikan hasil yang menunjukkan
ukuran sekitar 10 kb saat dielektroforesis dalam gel formaldehida/ agarosa.
Sintesis cDNA untai pertama dari daerah protein selubung dari galur yang menginfeksi
Krish dibuat menggunakan SuperScript II, sebuah transkriptase terbalik, menurut rekomendasi
pabrikan dalam kit yang disediakan (Gibco, BRL). Primer antisense (34-mer) dirancang untuk
melengkapi basis 9 478–9 501 pada genom JGMV-Jg (nomor aksesi Genbank Z26 920) dan
juga menyertakan situs Xba I di ujung ke-5, 3 GCGATCGTAACACACTTCGAGATTAGATCTAAAA
5 (huruf diperlihatkan dengan huruf miring tebal). Primer sense (31-mer) berhubungan dengan
basis 8267–8287 dari JGMV-Jg dan juga termasuk situs BamH I, 5 AAAAGGATCCTTGTCA-
Machine Translated by Google

Urutan protein mantel dari strain JGMV yang menginfeksi Krish 1017

ÿ
GAGACAGCTCTACGC 3 . Kondisi PCR 95 C selama 2 menit dilanjutkan dengan
ÿ ÿ ÿ

35 siklus dari 95 72 C selama 40 detik, 55 C selama 50 detik, 72 C selama 60 detik, dan akhirnya
ÿ

C selama 20 menit untuk ekstensi. Produk PCR 1,2 kb yang dihasilkan, mencakup seluruh wilayah
protein mantel, serta 129 basa up-stream (sebagian NIb, protein inklusi nuklir besar) dan 197 basa
down-stream (3 UTR, meskipun tidak lengkap), dikloning ke vektor pGEM -3fZ( + ) (Promega) untuk
pengurutan.
Klon lain disiapkan menggunakan vektor pGEM-3fz( + ) dan metode yang sama, tetapi menggunakan
primer dengan situs pembatasan yang diperkenalkan berbeda (BamHI/HincII atau BglII/ MscI).

Oleh karena itu, cDNA 1,2 kb disiapkan dalam tiga cara berbeda, menggunakan RT PCR pada
dua kesempatan terpisah. Kedua helai cDNA diurutkan untuk setiap klon, satu untuk masing-masing
dari tiga cDNA, oleh Unit Sekuensing DNA Monash University (Applied Biosystems 373 DNA Sequencer
"Stretch" dengan pemutakhiran XL, menggunakan campuran awal dari PRISM Dyeterminasi Kit oleh
Applied Biosystems) . Satu klon juga diperiksa secara manual di laboratorium kami menggunakan
metode pengurutan Circum Vent (Thermal Cycle Sequencing Kit, New England Biolab). Untuk setiap
klon yang diurutkan, enam primer sekuensing digunakan untuk memberikan tiga daerah yang tumpang
tindih untuk kedua untai cDNA. Semua klon menghasilkan data urutan yang identik.

Sebanyak 1.235 basis strain yang menginfeksi JGMV Krish diurutkan, mewakili sekitar 12%
genomnya, termasuk semua urutan protein mantel (nomor aksesi EMBL dan Genbank AF032404).
Perbandingan sekuens nu kleotida menunjukkan 24 perubahan basa pada protein selubung antara
strain yang menginfeksi JGMV Krish dan JGMV-Jg (Tabel 1). Sepuluh dari perubahan ini mengubah
urutan asam amino yang disimpulkan sedangkan sisanya tidak (Tabel 1). Tiga dari perubahan asam
amino ini (posisi asam amino 8, 27 dan 30) terjadi pada domain terminal amino yang terpapar
permukaan dan tujuh sisanya (posisi asam amino 34, 54, 65, 134, 272, 275, dan 276) di domain inti
dari protein mantel. Domain terminal amino yang terpapar permukaan adalah wilayah yang paling
imunodominan dari seluruh protein selubung potyvirus. Ini juga terlibat dalam transmisi aphid [3] dan
pergerakan potyvirus jarak jauh pada tanaman [5]. Shukla et al. [14] mengusulkan bahwa kurangnya
perlindungan silang antara potyvirus tertentu mungkin disebabkan oleh keragaman urutan ekstrim yang
diamati dalam domain N-terminal dari potyvirus yang berbeda, karena domain inti dan C-terminal dari
potyvirus yang berbeda sangat homolog. Selanjutnya ditunjukkan bahwa strain dari sugarcane mosaic
potyvirus (SCMV), dengan motif yang sama pada protein mantel N-terminusnya, saling melindungi
silang sedangkan yang dengan motif yang berbeda tidak [9]. Selanjutnya, Xiao et al. [18] menunjukkan
bahwa keragaman urutan dalam domain N-terminal yang terpapar permukaan dari protein mantel dari
tujuh galur SCMV berkorelasi dengan kisaran inang dari galur tersebut.

Dengan demikian, ada kemungkinan bahwa perubahan asam amino yang diamati pada terminal
N protein mantel, serta domain inti dari strain yang menginfeksi JGMV Krish, terlibat dalam mematahkan
resistensi Krish pada sorgum. Perbandingan urutan asam amino protein selubung dari galur yang
menginfeksi JGMV Krish, dengan dua galur virus AS, JGMV-KS1 dan JGMV-O, menunjukkan bahwa
perubahan yang teramati pada asam amino
Machine Translated by Google

1018 Suranto dkk.

Tabel 1. Ringkasan perbedaan antara JGMV-Jg (tipe liar) dan JGMV (strain yang menginfeksi Krish)
dalam DNA dan sekuens asam amino yang disimpulkan dari wilayah protein mantel. Data urutan nukleotida
muncul di basis data EMBL dan GenBank dengan nomor tambahan AF032404

Basis Perubahan basis Perubahan asam amino Basis Perubahan basis Perubahan asam amino

8 364 TÿC MÿT 8614 TÿC ÿ

8 387 GÿA EÿK 5 8 635 TÿA ÿ

8 398 AÿG ÿ 8 647 AÿG ÿ

8 418 AÿG KÿR(8) 8 710 CÿT ÿ

8 437 KÿA ÿ N 8 795 GÿA VÿI (134) CR

8 475 TÿC VÿA (27) 8 848 GÿA ÿ

8 483 AÿG TÿA(30) 8.910 TÿC VÿA(172)

8 497 TÿG DÿE(34) 8 920 CÿA NÿK(175)

8 506 GÿA ÿ 8 921 AÿG NÿD(176)
8 521 GÿT ÿ CR 9 082 CÿT ÿ

8 556 GÿA GÿD(54) 9 142 GÿA ÿ

8 560 BÿT ÿ 9 196 CÿT ÿ

8 588 AÿG TÿA(65) 9 298 CÿT ÿ C

Tanda kurung menunjukkan asam amino berubah (dari JGMV-Jg menjadi strain yang menginfeksi JGMV Krish)
sebagaimana diberi nomor dari N-terminus dari protein mantel. Urutan protein mantel dimulai pada basis 8 396 dan
berakhir pada 9304. Basa yang diurutkan adalah dari 8 267 hingga 9 467, angka untuk strain yang menginfeksi JGMV
Krish mewakili padanannya dalam genom JGMV-Jg (nomor akses basis data EMBL dan GenBank Z26 920, diperbarui
Oktober 1997). Daerah N dan C menunjukkan terminal N- dan C-. 5 menunjukkan sebagian dari wilayah pengkodean
yang berdekatan untuk protein inklusi nuklir (NIb)/polimerase yang lebih besar. Garis padat (CR) menunjukkan luasnya
wilayah inti. Tanda bintang menunjukkan tidak ada perubahan asam amino di situs tersebut

posisi 8, 27, 54, 65 dan 134 pada galur penginfeksi JGMV Krish juga ada pada galur
AS (Gbr. 1) yang tidak menginfeksi garis Krish-sorghum QL-3 [8]. Namun, perubahan
asam amino pada posisi 30, 34, 272, 275 dan 276 terlihat baru dan hanya berlaku
untuk strain yang menginfeksi JGMV Krish. Sangat menarik untuk dicatat bahwa dua
dari perubahan ini pada posisi 30 dan 34, ada di, atau dekat dengan, domain terminal
amino yang terpapar permukaan dari protein mantel regangan yang menginfeksi
JGMV Krish. Perubahan asam amino ini, dan yang ada dalam domain protein inti,
akan menjadi fokus pekerjaan kami di masa depan untuk memeriksa apakah mereka
bertanggung jawab untuk mematahkan ketahanan sorgum dengan gen Krish untuk ketahanan.
Kami saat ini mengikuti pendekatan Atreya et al. [1, 2] yang memutasikan basa di
dekat terminal-N dari protein pelapis untuk menentukan efek substitusi asam amino
pada penularan virus belang vena tembakau oleh serangga, kecuali bahwa kami akan
menentukan spesifisitas inang dari transkrip in vitro yang diinokulasi secara mekanis
dari mutasi cDNA panjang penuh. Hasil awal menunjukkan infeksi yang berhasil pada
sorgum (QL12 dan WT, keduanya membawa gen ketahanan Krish) setelah inokulasi
dengan transkrip JGMV-Jg cDNA panjang penuh yang disiapkan secara in vitro, di
mana daerah protein selubung diganti dengan urutan yang sesuai yang diperoleh dari
strain yang menginfeksi Krish. Pendahuluan ini
Machine Translated by Google

Urutan protein mantel dari strain JGMV yang menginfeksi Krish 1019

Gambar 1. Perbandingan urutan asam amino antara protein selubung dari empat galur JGMV. Data
untuk strain JG, KS1 dan O diambil dari Shukla et al. [15]. KS1 dan O merupakan isolat dari USA

hasilnya, yang akan dipublikasikan secara rinci nanti, menyarankan urutan di wilayah
protein mantel dari strain yang menginfeksi JGMV Krish bertanggung jawab untuk
mematahkan resistensi Krish.

Ucapan Terima Kasih

Kami berterima kasih kepada Dr. Andrew Davidson dari Departemen Mikrobiologi di Universitas
Monash, Clayton, atas bantuannya dalam isolasi RNA genomik panjang penuh JGMV.

Referensi

1. CD Atreya, Raccah B, Pirone TP (1990) Mutasi titik pada protein selubung dihapuskan
penularan aphid dari potyvirus. Virologi 178: 161–165
2. Atreya PL, Atreya CD, Pirone TP (1991) Substitusi asam amino pada protein selubung
mengakibatkan hilangnya kemampuan menular serangga dari virus tanaman. Proc Natl Acad Sci
USA 88: 7 887–7 891
Machine Translated by Google

1020 Suranto et al.: Urutan protein selubung dari galur JGMV yang menginfeksi Krish

3. Atreya PL, Lopez-Moya JJ, Chu M, Atreya CD, Pirone TP (1995) Analisis mutasi dari protein
mantel asam amino N-terminal yang terlibat dalam transmisi potyvirus oleh kutu daun.
J Gen Virol 76: 265–270 4.
Conde BD, Moore RF, Fletcher DS, Teakle DS (1976) Pewarisan resistensi
Krish sorgum untuk virus mosaik tebu. Aust J Agric Res 27: 45–52
5. Dolja VV, Haldeman R, Robertson NL, Dougherty WG, Carrington JC (1994) Fungsi yang berbeda
dari protein kapsid dalam perakitan dan pergerakan potyvirus etsa tembakau pada tanaman.
EMBO J 13: 1 482–1 491
6. Gough KH, Shukla DD (1993) Urutan nukleotida dari RNA genom potyvirus mosaik Johnsongrass.
Intervirologi 36: 181–192 7. Hammond J, Lawson RH (1988) Prosedur pemurnian yang
ditingkatkan untuk menyiapkan potyvirus dan inklusi sitoplasma dari jaringan yang sama. Metode J
Virol 20: 203–217 8. Jensen SG, Hall JS (1993) Karakterisasi potyvirus yang menginfeksi Krish-
sorghum.
Sorgum Newslett 34: 17 9.
Krstic B, Ford RE, Shukla DD, Tosic M (1995) Studi perlindungan silang antara strain mosaik tebu,
mosaik kerdil jagung, mosaik Johnsongrass dan potyvirus mosaik sorgum. Tanam Dis 79: 135–
138 10. Persley DM, Henzell RG, Greber RS, Fletcher DS (1986) Virus mosaik tebu pada biji
sorgum di Australia. Prosiding Konferensi Sorgum Australia Pertama, Gatton.

Australian Institute of Agriculture Science, Melbourne 3: 63–72 11.

Persley DM, Greber RS, Henzell RG (1987) Isolat virus mosaik tebu – strain rumput Johnson yang
menginfeksi genotipe sorgum tahan Krish di Australia. Sorgum Newslett 30: 72–73 12. Persley
DM, Syme JR (1990) Tanaman ladang dan padang rumput. Panduan penanganan penyakit.

Departemen Industri Primer Queensland, Brisbane 13. Shukla

DD, Teakle DS (1989) Virus mosaik Johnsongrass. Deskripsi Tanaman AAB
Virus, No. 340
14. Shukla DD, Frenkel MJ, Ward CW (1991) Struktur dan fungsi genom potyvirus dengan referensi
khusus pada daerah pengkode protein mantel. Can J Plant Pathol 13: 178–191 15. Shukla DD,
Ward CW, Brunt AA (1994) Potyviridae. CAB Internasional, Walling
mengarungi

16. Teakle DS, Pritchard AJ (1971) Ketahanan sorgum Krish terhadap empat galur virus mosaik tebu
di Queensland. Plant Dis Rep 55: 596–598 17. Teakle DS, Grylls NE (1973) Empat galur virus
mosaik tebu yang menginfeksi sereal
dan rumput lainnya di Australia. Aust J Agric Res 24: 465–477
18. Xiao XW, Frenkel MJ, Teakle DS, Ward CW, Shukla DD (1993) Keragaman urutan di daerah
terminal amino yang terpapar permukaan dari protein mantel dari tujuh galur virus mosaik tebu
berkorelasi dengan kisaran inangnya. Arch Virol 132: 399–408

Alamat penulis: Dr. CK Pallaghy, School of Botany, Fakultas Sains, Teknologi

dan Teknik, Universitas La Trobe, Bundoora 3 083, Australia.

Diterima 9 Juni 1997