SPEKTROFOTOMETER

UV-VIS

DEWA AYU PUTU SATRYA DEWI

FARMASI KLINIS IIK MP BALI
HUMAS VS BIRDS

Cahaya UV bisa dilihat oleh Manusia???

Ketika Sinar Menabrak Sampel ???
Ditransmisikan
Diserap
Dipantulkan
Dihamburkan
Apabila sampel tidak
menyerap cahaya,
proses yang terjadi hanyalah :
- pemantulan
- transmisi (diteruskan)
 Instrumentasi
Spektrofotometer UV-Vis
Spektrofotometer
Spektrofotometer

 Sumber cahaya (Lampu) : memancarkan semua warna

cahaya (yaitu, cahaya putih).
 Monokromator : memilih satu panjang gelombang dan
panjang gelombang yang dikirimkan melalui sampel.
 Detektor : mendeteksi panjang gelombang cahaya
yang telah melewati sampel.
 Amplifier : meningkatkan sinyal sehingga lebih mudah
untuk baca terhadap kebisingan latar belakang.
Spektrofotometer UV-Vis
Komponen Instrumentasi UV-Vis

Sumber Radiasi Kuvet Monokromator

• Lampu Wolfram • Kuarsa atau silika • Prisma atau
Kuarsa

Detektor
• Fotolistrik Pencatat
 Instrumentasi
Spektrofotometer UV-Vis
• lampu deuterium untuk UV (190 -350 nm),
Sumber lampu lampu halogen kuarsa / tungsten untuk
Visibel (350 – 900nm).

• Untuk mendispersikan sinar ke komponen

Monokromator panjang gelombang yang selanjutnya
dipilih oleh celah (slit).

• Untuk memecah sumber sinar pada

Optik spektrofotometer berkas ganda (doubel
beam)

• Penangkap sinar yang ditransmisikan

Detektor untuk selanjutnya diolah oleh amplifier .
 INSTRUMENTASI
KOMPONEN INSTRUMENTASI SPEKTOMETER UV-VIS
1. Sumber (Source)

• Argon 100 – 160 nm

• Tungsten 350 – 800 nm
• Deuterium 160 – 360 nm
• Xenon 200 – 900 nm
 INSTRUMENTASI
KOMPONEN INSTRUMENTASI SPEKTOMETER UV-VIS
2. Kuvet (Sample Container)
 INSTRUMENTASI
KOMPONEN INSTRUMENTASI SPEKTOMETER UV-VIS
3. Monokromator

PRISMA
 INSTRUMENTASI
KOMPONEN INSTRUMENTASI SPEKTOMETER UV-VIS
3. Monokromator

GRATING
 INSTRUMENTASI
KOMPONEN INSTRUMENTASI SPEKTOMETER UV-VIS
4. Detektor

Photovoltaic

Phototube

Diode array

~ Arie BS ~
Spektrofotometer UV-Vis
 Tipe Spektofotometer UV-Vis
• Menurut konfigurasi optiknya,
spektrofotometer UV-Vis dibagi menjadi
– Single Beam
– Double Beam
– Multi Channel
Single Beam
Double Beam
Multi Channel

•Tanpa monokromator
•Mendispersikan cahaya dengan panjang gelombang yang sama
•Mahal
•Resolusi terbatas
 Penyerapan sinar UV & Visibel oleh Molekul

Penyerapan (absorbsi) sinar UV dan Visibel pada umumnya

dihasilkan oleh eksitasi elektron-elektron ikatan.

Jenis penyerapan energi UV dan Visibel :

Penyerapan oleh
Penyerapan oleh
transisi elektron Penyerapan oleh
transisi elektron d
ikatan dan perpindahan
dan f dari molekul
elektron anti muatan
kompleks
ikatan
Penyerapan oleh transisi ikatan dan elektron anti ikatan

Semua molekul organik mampu

menyerap REM karena memiliki
elektron valensi yang dapat
dieksitasikan ke tingkat energi ya
ng lebih tinggi.
Penyerapan radiasi UV dan
Visibel dibatasi oleh
Elektron yang terlibat :
sejumlah gugus fungsional
elektron sigma, elektron
tertentu (kromofor) yang
phi, dan elektron bukan
mengandung elektron
ikatan.
valensi dengan tingkat
energi eksitasi yang rendah.
Ada 3 jenis orbital pada keadaan dasar :
1. Orbital molekuler ikatan σ

C C

2. Orbital molekuler ikatan π

C C C O N N C C

3. Orbital atomik non-bonding

C Cl : C OH C NH2
 TRANSISI ELEKTRONIK
Transisi sigma – sigma star
------------------- σ* (σ – σ*)
------------------- π *
Transisi n – sigma star
------------------- n (n - σ*)
------------------- π
Transisi n – phi star
------------------- σ (n – π*)
Diagram tingkat energi
Transisi phi – phi star
elektronik (π - π*)
 DISKUSI
Diagram Contoh Sinar Yang Nilai Keterangan
tingkat Nama Senyawa Diserap (λ) absorbtivita
energi Transisi Terserap s molar (ε)
elektronik

(σ – σ*) Transisi sigma Alkana

– sigma star

(n - σ*)

(n – π*)

(π - π*)
 Spektro UV-Vis
Spektrum UV-Vis merupakan hasil interaksi antara radiasi
elektromagnetik(REM) dengan molekul pada rentang panjang
gelombang 190 nm – 380 nm (UV) dan pada rentang panjang
gelombang 380 nm – 780 nm (Visible)
1 Angstrom (A) 10-8 cm 10-10 m
1 Nanometer (nm) 10-7 cm 10-9 m
1 Mikrometer 10-6 m 10-4 cm

Suatu panjang gelombang yang

merupakan jarak dalam arah
perambatan antar 2 titik yang
bersesuaian (Connors, 1982)
 Spektro Uv-Vis
Hubungan antara energi yang dimiliki REM,
frekuensi, dan panjang gelombang adalah :

E= h.v V= E=
c hc
 
E Energi radiasi cahaya
H Tetapan planck yang harganya 6,626 x 10-14 joule
C Kecepatan cahaya yang harganya 2,998 x 10-10 cms-1
lamda Panjang gelombang
 Latihan Soal
Hitunglah kuantitas-kuantitas berikut untuk
suatu radiasi pada panjang gelombang 400 nm

(a) Panjang gelombang dalam angstrom dan cm

(b) Frekuensi (v)
(c) Energi (E)
 Spektro Uv-Vis
AGAR TERJADI ABSORPSI DI DAERAH UV-VIS, BESARNYA ENERGI REM
(ANTARA 200 ~ 700 nm) HARUS TEPAT SAMA DENGAN BESARNYA
PERBEDAAN ENERGI DUA TINGKAT ENERGI ELEKTRONIK MATERI
(ATOM,MOLEKUL)

(penyerapan (absorpsi) frekuensiyang menyebabkan transisi dari tingkat

energi 0 (tingkat yang lebih rendah) ke tingkat energi 1 (tingkat energi yang
lebih tinggi)

Banyaknya sinar yang diabsorpsi pada panjang gelombang tertentu sebanding

dengan banyaknya molekul yang menyerap radiasi, sehingga spektra absorpsi
dapat digunakan untuk analisis kuantitatif
 HK LAMBERT BEER

10/11/2018 29
 HK LAMBERT BEER
Metode Kuantitatif
A=є.b.C
• Bila melakukan pengukuran suatu unsur yang
sama pada panjang gelombang yang sama dalam
kuvet sampel yang sama pula, maka akan tampak
hubungan linear antara absorbansi A dan
konsentrasi c, selama absorpsivitas molar є dan
tebal kuvet b konstan
A1 = A2
C1 C2
 Contoh
Absortivitas molar kompleks besi(II)-1,10
fenantrolin adalah 12.000 M-1cm-1. minimum
absorbansi yang dapat dideteksi adalah 0,001
jika diukur pada suatu sel (kuvet) bertebalan 1
cm.Berapakah konsentrasi minimum kompleks
besi(II)-1,10-fenantrolin yang dapat dideteksi?
A=є.b.C
0,001 = 12.0000 M-1cm-1 X 1 cm X c
c = 1,2 x 10-7 M
 HUKUM LAMBERT-BEER
Asumsi:
1. Radiasi sinar datang harus monokromatis.
2. Spesi penyerap (molekul, atom, ion, dll) independen satu sama lain.
3. Radiasi sinar datang merupakan berkas paralel yang tegak lurus
dengan permukaan media penyerap.
4. Radiasi sinar melintasi media penyerap dengan panjang yang sama.
5. Media penyerap homogen dan tidak menyebabkan penghamburan
sinar.
6. Radiasi sinar datang mempunyai intensitas yang tidak terlalu besar
yang menyebabkan efek saturasi.
 LIMITASI HUKUM LAMBERT-BEER
A  abc
Menurut Hk. Lambert-Beer, A berbanding lurus dengan panjang lintasan (b) dan
konsentrasi (c), sehingga:
1. A tidak mempunyai limitasi terkait dengan b.
Gunakan sel yang tipis untuk sampel dengan konsentrasi tinggi.
Gunakan sel yang tebal untuk sampel dengan konsentrasi rendah.

Contoh: Jika A = 0.410 dalam kuvet (b = 1.0 cm)

Sehingga jika: b = 2.0 cm, A = 0.820

b = 0.1 cm, A = 0.041
 LIMITASI HUKUM LAMBERT-BEER
2. Chemical Deviation
A berbanding lurus dengan konsentrasi (c), kecuali:
untuk konsentrasi yang terlalu tinggi atau jika terjadi reaksi kimia
a. Biasanya, A menjadi nonlinier jika c > 0.10 M
 Pada konsentrasi diatas 0.10 M, jarak antar molekul analit menjadi
cukup dekat, yang mempengaruhi distribusi muatan, sehingga
mengubah cara molekul melakukan serapan (mengubah e).
b. A menjadi nonlinier jika terjadi reaksi kimia.
 Jika analit mengalami assosiasi, dissosiasi
atau bereaksi dengan pelarut atau komponen
lain dalam larutan, penyimpangan Hk.
Lambert-Beer akan terjadi.

HIn  H  In -
Color 1 Color 2
 LIMITASI HUKUM LAMBERT-BEER
3. Instrumental Deviation
a. Efek Radiasi Polikromatik
Idealnya, monokromator akan melewatkan radiasi
monokromatis, tetapi kenyataannya monokromator akan
melewatkan radiasi berupa pita. Bandwidth spektrometer
akan mempengaruhi linieritas Hk. Lambert-Beer.
Pengukuran dilakukan pada max untuk memperkecil error.

B A
 LIMITASI HUKUM LAMBERT-BEER
3. Instrumental Deviation
a. Hamburan cahaya
10/11/2018 37
 TAHAPAN MELAKUKAN ANALISIS DENGAN
SPEKTROFOTOMETRI
1. Apakah senyawa tersebut dapat dianalisis dengan
spektrofotometri
2. Membuat larutan standar
3. Menentukan larutan panjang gelombang
maksimum
4. Membuat kurva baku antara Absorbansi versus
konsentrasi sehingga diperoleh persamaan regresi
linier.
5. Menentukan kadar sampel.
Senyawa yang dapat dianalisis dengan
spektrofotometri adalah senyawa yang memiliki
ikatan rangkap terkonjugasi (rangkap tidak rangkap

Contoh : HO NHCOCH3

Parasetamol

H2N SO2NH2

Sulfanilamid
 Contoh
1. Membuat larutan standar parasetamol 100 ppm
sebanyak 100 ml : ditimbang parasetamol murni 10
mg lalu ditambah etanol absolut sampai 100 ml
2. Membuat seri larutan standar misal 10 ppm, 20
ppm, 30 ppm, 40 ppm dan 50 ppm
3. Mencari panjang gelombang maksimum
4. Membuat kurva kalibrasi Absobansi VS Konsentrasi
5. Membuat persamaan regrasi lininier Y = a + bx
No. Konsentrasi Absorbansi
Parasetamol
1 10 ppm 0,25
2 20 ppm 0,36
3 30 ppm 0,45
4 40 ppm 0,58
5 50 ppm 0,79
Y = a + bx
Y = Absorbansi
a = intersep (titik potong garis regresi
terhadap sumbu y, a = + titik potong
di atas titik 0,0 , a = - titik potong
di bawah titik 0,0)
b = slope (kemiringan garis / tg sudut )
x = Konsentrasi larutan standar/sampel
r=
Contoh Soal
100 mg sampel yang mengandung
Parasetamol dilarutkan dengan etanol
hingga 100 ml. diambil 10 ml diencerkan
hingga 100 ml. dari larutan yang sudah
dilarutkan diukur Absorbansinya
ternyata A = 0,465. hitunglah kadar
paresetamol dalam sampel tersebut ?
Dari data di atas diperoleh
a = 0,096
b = 0,013
r = 0,9852
sehingga diperoleh persamaan
y = 0,096 + 0,013 x
jika y = 0,465 maka x = 28,38
Kadar = C.reg. x P x V
berat sampel

= 28,38 mg/L x 10 x 0,1 L x 100 %

100 mg

= 28,38 %
 PROSEDUR UMUM PENGUKURAN

• 1. HIDUPKAN ALAT ( 10~15 MENIT)

• 2. KALIBERASI ALAT DENGAN LARUTAN
BLANGKO
• 3.UKUR LARUTAN STANDAR
• 4.UKUR LARUTAN SAMPEL
• 5.ANALISIS DATA

10/11/2018 47
 PERHITUNGAN LARUTAN STANDAR

• DATA ABSORTIVITAS ( ε atau E 1%,1cm )

SENYAWA
• MASUKKAN DALAM RUMUS Beer dengan
memakai harga A dengan kesalahan minimal
( A= 0.4343)
• Buat larutan sesuai kebutuhan

10/11/2018 48
 Analisis komponen tunggal
• Jika absorbansi suatu seri
larutan diukur pada λ, suhu,
kondisi pelarut sama, dan A
larutan diplotkan terhadap
konsentrasinya  kurva baku.
• Penentuan konsentrasi
komponen tunggal dapat
dilakukan dengan :
– Menggunakan
informasi absorbtivitas
molar
– Menggunakan
persamaan regresi
linier kurva baku
 Contoh soal
Sebanyak 20 tablet furosemid ditimbang beratnya 1,656
g. Diambil sampel 519,5 mg digojog dengan 300 mL
NaOH 0,1 N , lalu diencerkan sampai 500,0 mL dengan
NaOH 0,1 N. Sejumlah ekstrak disaring dan diambil 5,0
mL lalu diencerkan dengan NaOH 0,1 N sampai 250,0
mL. Absorbansi dibaca pada λ 271 nm dengan blanko
NaOH 0,1 N ternyata absorbansinya 0,596. Jika E 1%1cm
furosemid λ271 nm = 580, Hitung kadar Furosemid tiap
tabletnya ?
 Jawab
• 519,5 mg serbuk furosemid dilarutkan sampai 500 ml = 519,5
mg/500 mL atau 103,9 mg/100 mL
• Berat rata-rata tablet = 1,656 g/20 = 82,8 mg
• Faktor pengenceran : 250/5 = 50 kali
• Konsentrasi Furosemid dalam ekstrak yang diencerkan :
Absorbansi
x1% xfaktor. pengenceran
1%
E
1cm

0,596
x1% x50  0,0514%  51,4mg / 100mL
580
 Jawab
• Kadar furosemid tiap tablet

51,4mg 500mL
x xberatrata  ratatablet
100mL 519,5mg
51,4mg 500mL
x x82,8mg / tablet  40,96mg / tablet
100mL 519,5mg
 METODE SIMULTAN

10/11/2018 53
 Analisis dua campuran secara
bersama-sama
Dua buah kromofor yang berbeda akan memiliki
kekuatan absorbsi cahaya yang berbeda pada suatu
λ tertentu, sehingga dengan mengukur kedua λ
akan diperoleh konsentrasi masing-masing
komponen campuran.
A1 = a1 b1 c1 dan A2 = a2 b2 c2,
karena tebal kuvet sama maka
A1 = a1 c1 dan A2 = a2 c2 sehingga :
Aλ1 = (a1c1) λ1 + (a2c2) λ1
Aλ2 = (a1c1) λ2 + (a2c2) λ2
 Contoh soal
• Absorbansi obat A dengan konsentrasi 0,0001
M dalam kuvet 1 cm adalah 0,982 pada λ 420
nm, dan sebesar 0,216 pada λ 505 nm.
Absorbansi obat B dengan konsentrasi 0,0002
M adalah 0,362 pada λ 420 nm dan 1,262
pada λ 505. Absorbansi campuran 2 obat
adalah 0,820 pada λ 420 nm, dan 0,908 pada
λ 505 nm. Berapakah konsentrasi masing-
masing obat A dan B dalam campuran
tersebut ?
 Hal-hal penting dalam pengukuran
spektrofotometri UV-Visibel
• Terutama untuk senyawa yang semula tidak berwarna dan
akan diukur dengan spektrofotometer Visibel  dilakukan
derivatisasi.
• Waktu operasional (operating time) untuk mengetahui
waktu pengukuran yang stabil.
• Pemilihan panjang gelombang maksimum (λ max)
• Pembuatan kurva baku sebaiknya sering diperiksa ulang.
• Pembacaan absorbansi sampel/cuplikan sebaiknya dalam
rentang 0,2 – 0,8.
 Derivatisasi sampel

Syarat pereaksi :
Reaksinya selektif dan sensitif
Reaksinya cepat, kuantitatif, dan reprodusiel
Hasil reaksi stabil dalam jangka waktu yang lama
 Operating Time
 Ditentukan dengan mengukur hubungan antara waktu
pengukuran dengan absorbansi larutan.
 Pengukuran senyawa harus dilakukan pada saat waktu
operasionalnya.
 Pemilihan panjang gelombang (λ)
• Panjang elombang
yang digunakan
adalah λmax.
• Alasan :
– Kepekaan maksimal
– Hukum Lambert-Beer
terpenuhi
– Kesalahan akan kecil
Pembuatan kurva baku
 Pembacaan absorbansi sampel
(0,2 – 0,8)
Absorban yang terbaca hendaknya A = 0,2-0,8
atau %T = 15 % - 70 % agar kesalahan
fotometrik dalam pembacaan transmitan
sebesar 0,005 atau 0,5 %