INOKULUM DALAM PROSES

FERMENTASI
By: RAHMAYUNI, SP, M.Sc
KRITERIA INOKULUM
 kultur tersedia dalam keadaan aktif dan
sehatfase lag minimal.
 tersedia dalam jumlah cukup
 bebas dari kontaminan
 kemampuan membentuk produknya stabil
 Pada perkembangan inokulum diinginkan
jumlah sel yang tinggi dan mempunyai
kemampuan yang aktif untuk membentuk
produkkomposisi media untuk
pengembangan inokulum ≠ media
fermentasi.
 Sumber karbon pada media untuk
pengembangan inokulum < media untuk
fermentasi kecuali pada produksi protein
sel tunggal (PST).
 Proporsi inokulum3-10% dari volume
total media.
PENGEMBANGAN INOKULUM UNTUK KHAMIR

 Contoh pengembangan inokulum untuk

khamir pada pembuatan ragi roti (baker’s
yeast) dilakukan dalam 5 tahap proses,
yaitu 2 (dua) tahap secara aseptik dan 3
(tiga) tahap berikutnya dalam tangki yang
bagian atasnya terbuka (Gambar 1)
Gambar 1. Proses pengembangan inokulum pada proses produksi
baker’s yeast komersial.
PENGEMBANGAN INOKULUM UNTUK BAKTERI

 Tujuan Utama : memperoleh sejumlah

massa sel aktif pada fase logartima.
 Panjang fase log ditentukan oleh :
- keadaan fisiologis kultur inokulum
- umur inokulum (pada bakteri pembentuk
spora)
~ Spora terbentuk pada akhir fase log
~ Inokulum dengan populasi spora
tinggi pada peningkatan fase log
Gambar 2. Grafik Pertumbuhan Mikrobia. Tahap A-B = tahap istirahat
(lag phase), ahap B-C = tahap tumbuh (accelerate phase), Tahap C-D =
fase log, Tahap D-E = tahap tumbuh reda (decelerate phase), Tahap E-F =
tahap stasioner, Tahap F = tahap kematian
PENGEMBANGAN INOKULUM UNTUK BAKTERI ..........

 Contoh :
1. Dalam produksi protease oleh Bacillus sp
(thermofil) digunakan 5% inokulum kultur
dalam fase logaritma.
2. Produksi oleh B.subtillis diawali dengan
menumbuhkan kultur pada media padat
atau cair 1-2 hari, dan tahap berikutnya
sampai skala produksi dapat dilihat pada
Tabel 1.
3. Produksi aseton butanol oleh Clostridium
acetobutylicum juga dilakukan pada 5 tahap
seperti terlihat pada Tabel 2.
Tabel 1. Pengembangan inokulum pada proses produksi
protease oleh B.subtillis
Tabel 2. Pengembangan inokulum pada produksi aseton
butanol oleh Clostridium acetobutylicum.
 Pengembangan inokulum bakteri asam laktat
dalam pembuatan minuman sari buah yang
mengandung probiotik :
 Kultur yang digunakan adalah kulturliofilisasi yaitu
kultur bakteri asam laktat yang diisolasi dari
berbagai bahan pangan yang mengalami fermentasi
asam laktat seperti pikel sauerkraut, yoghurt,
dadih, yakult atau tempoyak .
 Kulturliofilisasi dipindahkan ke dalam tabung berisi
media MRS broth (de Mann Rogosa Sharpe)
 Kultur ini kemudian disimpan pada media MRS
agar yang ditambah 0.1% (b/v) CaCO3 dengan
menggunakan metode tusuk.
 Kultur diinkubasikan pada suhu 37oC selama 48 jamkultur
stok (disimpan di dalam refrigerator suhu 4ºC) , disegarkan
kembali minimal sebulan sekali. Inokulum yang akan
ditambahkan ke dalam minuman sari buah dibuat dalam
bentuk kultur kerja.
 Kultur kerja dibuat dengan menggunakan media sari buah dan
susu skim.
 Kultur induk sebanyak 0.1% di tumbuhkan pada media sari
buah yang mengandung susu skim 10% dan diinkubasikan
pada suhu 37ºC selama 48 jam, sehingga dihasilkan koloni
sebanyak 1.0-4.0 x 109 koloni/ml dengan kadar asam laktat
kurang lebih 2.7%.
 Selanjutnya kultur ditambahkan lagi sebanyak 0.5% dalam
media sari buah yang ditambah susu skim 10% dan glukosa
3%, dan diinkubasikan selama 24 jam pada suhu 37ºC.
 Kultur induk perlu diperbaharui setiap minggu dengan cara
menumbuhkannya ke dalam media sari buah dan susu skim
10%
Gambar 3. Tahap-tahap persiapan inokulum bakteri dalam pembuatan
minuman sari buah dengan probiotik
PENGEMBANGAN INOKULUM UNTUK KAPANG

 Inokulum berupa spora aseksual

 Jamur dapat membentuk spora pada media yang sesuai
dan luas permukaan yang cukup.
 Penggunaan sel vegetatif dapat dilakukan, tetapi sulit
karena populasi inokulum tidak seragam sehingga perlu
pemotongan miselia (misalnya dengan warring blender).
Teknik ini digunakan dalam produksi giberelin oleh
Gibberella fujikuroi
Cara-cara pengembangan inokulum kapang :

1. Sistem roll bottle

Media berupa agar 3% yang disterilisasi
dalam botol berbentuk silinder dengan
ukuran 1 L hingga melekat di permukaan
bagian dalam dari botol, kemudian
diinokulasikan spora kapang dan diinkubasi
pada suhu 24ºC selama 6-7hariditerapkan
dalam produksi penisilin oleh Penicillum
chrysogenum.
Cara-cara pengembangan inokulum kapang : .....

2. Sporulasi pada media biji-bijian dan sekam

Media berupa biji-bijian dan sekam seperti
biji barley dan sekam gandum disterilisasi,
kemudian diinokulasikan dengan jamur dan
diinkubasi pada suhu 28ºC selama 6 hari
dengan RH 98%.
Contoh: Aspergillus ochraceus dalam 2.8L
gelas diisi dengan 100-200 g barley dan
sekam, akan menghasilkan 5 x 10¹¹ konidia.
Cara-cara pengembangan inokulum kapang : .....

3. Sporulasi secara submerged culture

 Misalnya pada persiapan inokulum untuk
produksi gliserofulvin oleh Penicillum
patulum dalam media whey dan corn step
liquor dengan aerasi yang cukup.
 Tahap pengembangan inokulum untuk jamur
benang sama dengan bakteri dan khamir.
 Contoh produksi penicilin dilakukan dengan
5 (lima) tahap persiapan inokulum seperti
terlihat pada Tabel 3
Tabel 3. Tahap pengembangan inokulum dalam proses produksi penisilin
oleh Penicillum chrysogenum.
INOKULASI SECARA ASEPTIK
 Teknik inokulasi dalam industri fermentasi
meliputi: pemindahan kultur mikroba dari suspensi
spora pada skala laboratorium sampai skala
produksi (pabrik)harus dilakukan secara aseptik.

 Dasar teknik aseptik pada proses inokulasi adalah:

 Mempertahankan tekanan positif di dalam tanki
 Tempat jalan masuk pemindahan kultur (port)
harus dilengkapi dengan jalur persediaan uap
panas.
 Sistem klep (valve) dapat diatur sedemikian rupa
hingga setiap jalur yang dilalui kultur dapat
disterilkan terlebih dahulu
PENGGUNAAN SEL TERIMOBILISASI DALAM FERMENTASI

 Inokulum yang digunakan dalam proses fermentasi dapat juga berupa sel-sel
yang sudah diimobilisasi
 Teknologi imobilisasi sel adalah lokalisasi sel selama proses perombakan
berlangsung sehingga sel tersebut mudah dipisahkan dari substrat dan
produk untuk digunakan kembali.
 Keuntungan teknologi imobilisasi adalah :
 pemanfaatan sel dapat berulang-ulang
 mempermudah pengendalian proses
 meningkatkan stabilitas sel
 diperoleh produk bebas sel/enzim
 tahan lama dan kerusakannya dapat diperhitungkan
 Metode-metode untuk imobilisasi sel mikroba dibagi menjadi 3 (tiga)
kelompok (Chibata et al., 1983) :
1. Metode Ikatan dengan pembawa (carrier)
2. Metode Ikatan melintang
3. Metode Penjeratan
Metode Ikatan dengan pembawa
 Didasarkan pada pengikatan sel-sel mikroba
langsung pada pembawa yang tidak larut air
dengan 3 metode penyerapan yaitu fisik, ionik dan
kovalen.

 Carrier: polisakarida tidak larut air (sellulosa,

dekstran dan turunan agarosa), protein (gelatin
dan albumin), polimer sintetik (resin pertukaran
ion dan polivinilklorida) dan oksida logam
(zirkonium oksida dan titanium oksida).
Metode Ikatan Melintang
 Didasarkan pada pembentukan ikatan melintang di
antara sel-sel dengan bantuan pereaksi-pereaksi
bifungsional atau multifungsional.

 Digunakan untuk imobilisasi sel-sel E.coli yang

mempunyai aktivitas aspartase yang tinggi.

 Sel-sel E.coli diimobilisasi dengan memperkuat

dinding sel dan mengikat sel-sel secara melintang
dengan pereaksi bifungsional seperti
glutaraldehida atau toluendiisosianat.
Gambar 3. Imobilisasi sel dengan metode ikatan melintang antar sel
menggunakan glutaraldehida
Metode Penjeratan
 Metode yang menjerat sel secara langsung
ke dalam matriks polimer.
 Paling banyak digunakan untuk imobilisasi
sel dalam keadaan hidup.
 Jenis-jenis pembawa yang digunakan untuk
menjerat sel dikelompokkan berdasarkan
mekanisme pembentukan gel (Tabel 4).
Tabel 4. Metode yang dapat diterapkan untuk imobilisasi sel
utuh dengan metode penjeratan dalam gel.
Tabel 5. Produksi senyawa-senyawa penting menggunakan
sel-sel hidup terimobilisasi
PENGAWETAN DAN PEMELIHARAAN KULTUR
1. Suhu dingin, 5-10ºC, dilakukan penyegaran dengan cara pergantian
media setiap minggunya.
2. Pembekuan :
 Suhu -20ºC atau lebih rendah.
 Perlu penambahan cryoprotective misalnya gliserol.
 Selama transportasi kultur harus dalam keadaan beku.
 Viabilitas 1-2 tahun
3. Pembekuan suhu ultra cold
 Suhu -50 sampai -80ºC.
 Cryoprotective yang digunakan : gliserol 10% (v/v) dan dimetil
sulfoxida (DIMSO) 5% (v/v).
 Sel dipanen pada saat pertengahan atau akhir fase pertumbuhan
4. Pembekuan dengan Nitrogen cair dengan suhu -196ºC. 5.
Pengeringan kultur.
Pengeringan Kultur
a. Pengeringan Vakum
b. Pengeringan Semprot (suhu 70ºC)
 Telah berhasil di USA dan Swedia
 Untuk mencegah kerusakan selama pengeringan ditambahkan
senyawa :
- asam askorbat
- Na-glutamat
- Lisin
c. Pengeringan beku :
- Asam L-glutamat - Skim
- L-arginin - Gliserol
- Lactosa - Kasiton
- Malt ekstrak - Asetil Glisin
- Sukrosa
Pengawetan Spora Kapang
1. Pengeringan pada substrat tanah : 1 ml suspensi
konidia + 5 g tanah kering steril kemudian
dikeringkan pada suhu 25º C.
2. Pengeringan pada silika gel :
• Tabung reaksi (13 x 100 mm) diisi setengahnya
dengan silika gel 6-12 mesh grade 40.
• Sterilisasi 180ºC, 1.5 jam
• Ditambahkan 0.5 ml suspensi spora
• Tabung dikocok
• Dikeringkan pada suhu 25ºC
• Contoh : untuk Neurospora