TEKNIK BIOASSAY

UJI TOKSISITAS, ANTIMIKROBA, ANTIVIRAL &

ANTIKANKER, ANTIFUNGAL

Laelatul Rohniyah (16070860 Kelompok 2

Sanaa (16070860 Kimia Bahan Alam Terestrial
Laely Faizatun F (1708076040)
 APA ITU BIOASSAY ?

Bioassay adalah sebuah metode yang dirancang untuk

menganalisis suatu senyawa oleh dosis yang sesuai terhadap sistem
biologi seperti binatang, jaringan, mikroba, dll.
Bioassay merupakan analisis atau pengukuran dari suatu zat
untuk menentukan keberadaan dan dampaknya. Umumnya yang diuji
adalah efek obat dan kadar hormon.
 UJI TOKSISITAS
Toksisitas adalah kemampuan suatu bahan atau senyawa kimia untuk
menimbulkan kerusakan pada saat mengenai bagian dalam atau permukaan
tubuh yang peka. Uji toksisitas digunakan untuk mempelajari pengaruh suatu
bahan kimia toksik atau bahan pencemar terhadap organisme tertentu
Pada umumnya toksisitas diekspresikan sebagai [C50 atau LD50 yaitu
konsentrasi atau dosis yang dalam kondisi spesifik menyebabkan mortalitas
separoh populasi organisme dalam jangka waktu tertentu.
Secara eksperimental efek 50% populasi merupakan ukuran toksisitas
yang paling reproduksibel suatu bahan toksik terhadap suatu kelompok
organisme uji. Waktu 96 jam merupakan lama (durasi) persentuhan yang
mullah dan umum digunakan, oleh karena itu pengukuran toksisitas akut yang
paling banyak dilakukan yaitu penentuan LC50-96 jam.
 PENGUJIAN TOKSISITAS
• Alat dan Bahan
Bahan yang digunakan dalam uji toksisitas dapat berupa berbagai
senyawa kimia baik organik maupun anorganik. Bahan uji lainnya yang mutlak
diperlukan dalam uji toksisitas akuatik yaitu air. Guna memperoleh hasil uji
toksisitas yang baik dan akurat, air uji harus memenuhi beberapa persyaratan
berikut:
a. suhu berkisar antara 25-27°C dengan amplitudo harian kurang dari 5°C
b. derajat keasaman (pH) sebaiknya antara 6,0-7,5 atau setidak-tidaknya
antara 5,0- 9,0
c. kandungan oksigen (O2) telarut antara 4,0-8,0 ppm atau setidak-tidaknya
tidak kurang dari 3 ppm
Lanjutan…

d. kandungan karbon dioksida (CO2) bebas antara 3,0-15,0 ppm atau

setidaknya kurang dari 50,0 ppm
e. kandungan ammonia, nitrit atau nitrat tidak lebih dari 10,0 ppm
f. kandungan HCO3 antara 60,0-70,0 ppm
g. volume air sekitar satu liter per 0,8 g berat ikan.
Alat yang diperlukan dalam uji toksisitas antara lain bejana uji,
aerator, dan berbagai alat pendukung lainnya. Bejana uji yang baik yaitu
yang terbuat dari bahan gelas.
• Organisme Uji
Dalam uji toksisitas dapat digunakan berbagai jenis organisme, misalnya
anggota kelompok crustacea, mollusca atau pisces (ikan); walaupun demikian,
terdapat jenisjenis organisme uji yang direkomendasikan sejumlah besar
referensi digunakan dalam uji toksisitas baku, misalnya: Daphnia magna,
Daphnia pulex, Chironomus plumosus, Carrassius auratus, dll. Guna menjaga
homogenitas, hewan uji yang digunakan sebaiknya berasal dari satu tempat
yang sama

• Tatalaksana uji toksisitas

Pelaksanaan uji toksisitas diawali dengan tahap pemeliharaan (holding),
kemudian dilanjutkan dengan aklimasi (acclimation), uji pendahuluan
(exploratory test) dan uji sesungguhnya (full-scale test).
a. Pemeliharaan (holding) b. Aklimasi (acclimation)
1) Hewan uji dipindahkan dari 1) Hewan uji diadaptasikan dengan
lingkungan asal (misalnya keadaan fisik laboratorium
kolam) ke air pemeliharaan (lingkungan pengujian) dengan
yang ditempatkan dalam cara berangsur-angsur
laboratorium. dipindahkan dari 100% air
2) Lama pemeliharaan sejak pemeliharaan ke 100% air uji.
diperoleh dari daerah asal 2) Aklimasi dianjurkan selama
kemudian diangkut ke tempat minimal 10 hari. Apabila dalam
pemeliharaan lebih kurang 14 waktu 48 jam lebih dari 3%
hari. populasi hewan uji mati, maka
3) Hewan uji diberi pakan satu kali populasi hewan uji dianggap tidak
per hari. memenuhi syarat untuk pengujian.
4) Hewan uji yang mati atau 3) Dua hari sebelum diperlakukan,
abnormal segera dibuang hewan uji tidak diberi pakan.
c. Uji pendahuluan (exploratory test)
1) Masing-masing bejana uji diisi dengan 10 liter air jika hewan uji yang
digunakan sebanyak 10 ekor ikan dengan panjang 4-6 cm atau 1 liter
air untuk tiap 0,96 gram berat ikan.
2) Ke dalam tiap-tiap bejana uji yang telah diisi air dimasukkan 10 ekor
hewan uji.
3) Ke dalam masing-masing bejana uji dimasukkan bahan pencemar
dengan beberapa variasi konsentrasi.
4) Dilakukan pengamatan pola aktivitas hewan uji setiap 24 jam, mulai
dari 0 jam sampai dengan 96 jam.
5) Penentuan LC50-96 jam dilakukan dengan pendekatan analisis regresi
linier sederhana atau dengan cara mengekstrapolasi titik ordinat 50%
(sumbu Y) ke garis regresi linier yang digambar di atas kertas grafik
kemudian ditarik garis tegak lurus absis (sumbu X).
• Uji sesungguhnya (full-scale test)
1) Berdasarkan nilai LC50-96 jam uji pendahuluan, dilakukan uji toksisitas
dengan cara yang sama tetapi dengan variasi konsentrasi yang lebih
sempit di sekitar LC50-96 jam uji pendahuluan dengan mengacu pada
skala logaritmik Rand (Rand 1980).
2) Dilakukan pengamatan pola aktivitas hewan uji (meliputi frekuensi
pernafasan, pola gerak, dan escape reflex) pada 0 jam, 24 jam, 48 jam,
72 jam dan 96 jam serta pengukuran kualitas air uji pada 0 jam, 48 jam
dan 96 jam.
3) Penentuan LC50-96 jam dilakukan dengan pendekatan analisis regresi
linier sederhana atau dengan cara menginterpolasi titik ordinat 50%
(sumbu Y) ke garis regresi linier yang digambar di atas kertas grafik
(milimeter blok) kemudian ditarik garis tegak lurus absis (sumbu X).
 Dalam uji toksisitas sebaiknya dilakukan aerasi (penambahan oksigen)
pada setiap bejana uji, walaupun sebagai pembanding dapat juga dilakukan
pengujian tanpa pemberian aerasi. Pemberian aerasi bertujuan agar
diperoleh hasil yang lebih akurat karena efek yang terjadi betul-betul
disebabkan oleh bahan uji (senyawa kimia, air limbah, dan lain-lain), bukan
karena kekurangan oksigen selama masa pengujian.
 ANTIMIKROBA
Antimkiroba atau Antibiotik ialah zat-zat yang dihasilkan
oleh mikroorganisme dan zat-zat dalam jumlah yang sedikitpun
mempunyai daya penghambat kegiatan mikroorganisme yang
lain. Bahan antimikroba dapat secara fisik atau kimia dan
berdasarkan peruntukannya dapat berupa desinfektan, antiseptic,
sterilizer, sanitizer, dan sebagainya.
Antibiotika pertama kali ditemukan oleh Alexander Fleming
pada tahun 1929 yang secara kebetulan menemukan suatu zat
antibakteri yang sangat efektif yaitu penicilin.
 Tujuan pengukuran aktivitas antibakteri Metode Difusi Agar
adalah untuk menentukan potensi suatu (Agar Diffusion)
zat yang diduga atau telah memiki
aktivitas sebagai antibakteri dalam
larutan terhadap suatu bakteri

 Untuk menyiapkan ekstrak

tanaman pengujian antimikroba,
Pengujian Metode Dilusi Agar
(yaitu pengujian untuk aktivitas Antimikroba (Agar Dilution)
antibakteri dan antijamur) bahan
tanaman segar (atau bahan
bubuk kering) dapat dimaserasi
atau perkolasi dengan air atau Metode Bioautografi
pelarut organik. (Bioautography)
 1. METODE DIFUSI AGAR (AGAR DIFFUSION METHOD)
Metode difusi digunakan untuk menentukan aktivitas agen antimikroba.
Piringan yang berisi agen antimikroba
diletakkan pada media agar yang telah
ditanami mikroorganisme yang akan
berdifusi pada media agar tersebut.
Area jernih pada permukaan media
agar mengindikasikan adanya hambatan
pertumbuhan mikroorganisme oleh agen
antimikroba
 UJI DIFUSI AGAR
Alat dan Bahan:
1. Organisme uji, misalnya Escherichia coli, Bacillus
subtilis, Staphylococcus aureus, Pseudomonas
aeruginosa
2. Kaldu nutrisi
3. Penggerek gabus steril
4. Cawan petri (14 cm)
5. Pipet (0,1 ml dan 1 ml)
6. Pelarut organik
7. Inkubator
8. Antibiotik standar (streptomisin, ampisilin, dll.)
9. Uji sampel (ekstrak kasar, produk alami murni
atau senyawa sintetis)
1. 10 ml aliquot kaldu nutrisi diinokulasi dengan organisme uji dan diinkubasi
pada 37°C selama 24 jam.
2. Dengan pipet steril, 0,6 ml, biakan kaldu dari organisme uji ditambahkan
ke 60 ml agar cair yang telah didinginkan hingga 45°C, dicampur dengan
baik dan dituangkan ke dalam Cawan Petri steril. Plat duplikat dari
masing-masing organisme disiapkan.
3. Agar dibiarkan mengering dan mengeras. Jumlah lubang yang dibutuhkan
dipotong.
4. Dengan pipet 0,1 ml, 100 μl sampel uji yang dilarutkan dalam pelarut
yang sesuai dituangkan ke dalam cangkir berlabel yang tepat.
5. Pelat dibiarkan pada suhu kamar selama 2 jam. untuk memungkinkan difusi
sampel dan diinkubasi pada suhu 37 ° C selama 24 jam.
6. Diameter zona hambatan diukur hingga mm terdekat .
 2. METODE DILUSI AGAR (AGAR DILUTION METHOD)
Prinsip metode dilusi/
pengenceran adalah senyawa
antibakteri diencerkan hingga
diperoleh beberapa macam
konsentrasi, kemudian masing-masing
konsentrasi ditambahkan suspensi
bakteri uji dalam media cair.
Perlakuan tersebut akan
diinkubasi dan diamati ada atau
tidaknya pertumbuhan bakteri, yang
ditandai dengan terjadinya
kekeruhan.
 3. METODE BIOAUTOGRAFI
Bioautografi merupakan metode yang spesifik untuk mendeteksi
adanya bercak pada kromatogram hasil kromatografi lapis tipis. Daerah
hambatnya ditandai dengan adanya bercak pada kromatogram.

Alat : Bahan :
- Plat KLT ukuran7 x 5 cm - Pinset - Ekstrak antimikroba tumbuhan
- Chamber (berupa gelas ukur) - Lampu Spirtus - Bakteri Uji (Escherichia coli)
- Kertas saring - Sinar UV - Medium Agar (Nutrient Agar)
- Pipa Kapiler - Inkubator - Eluent (metanol : etil asetat)
- Petri Dish - Pensil dan spidol
Pengujian metode bioautografi:

1. Media disiapkan (panasi media) dan suspense

mikroba di buat.
2. Sediakan petri dish steril, masukkan 0.3 ml
bakteri uji (Escherichia coli). Tambahkan media
nutrient agar (NA) sampai menutupi bakteri uji.
Lalu homogenkan media dengan memutar petri
dish, Biarkan hingga mengeras.
3. Plat KLT di tempel diatas media yang mengeras
tadi sambal agak di tekan, tunggu30 menit. Di
lingkari noda dengan spidol.
4. Plat diangkat dan petri dish di inkubasi pada
suhu 37℃ selama18 –24 jam, amati dan catat
pengamatan (diameter daerah bening yang
terbentuk)
 UJI AKTIVITAS ANTIMIKROBA DARI EKSTRAK ASCIDIAN
Herdmania monus PADA MIKROBA PATOGEN MANUSIA
Ascidian termasuk ke dalam kelompok hewan invertebrata yang
merupakan salah satu komponen biota penyusun terumbu karang yang
mempunyai potensi bioaktif. Senyawa bioaktif dari ascidian berfungsi
sebagai pertahanan diri dan juga bagi kesehatan manusia, seperti
untuk antikanker, antiinflamasi, dan antimikroba.
Alat : Bahan :
1. Cawan petri 6. inkubator 1. Ascidian Herdmania monus
2. Neraca analitik 7. kertas cakram 2. Mikroba uji Staphylococcus aureus, Escherichia
3. Magnetic stirrer 8. mikropipet coli, dan Candida albicans
4. Pipet tetes 9. Jangka sorong 3. Etanol 96%, Metanol, n-heksan, kloroform
5. Batang pengaduk 10. autoklaf 4. Nutrien agar (NA)
5. Kertas cakram, kertas saring
Langkah Pengujian :
• Tahap Ekstraksi Sampel
Ekstrak ascidian sebanyak 665 gram diekstraksi dengan menggunakan
cara maserasi. Sampel dipotong kecil-kecil dengan ukuran 1 cm2 lalu
dimasukkan ke dalam botol dan direndam dengan larutan etanol 96% sampai
sampel terendam secara keseluruhan dan dibiarkan selama 24 jam.

• Pengujian aktivitas antimikroba (metode difusi agar/disc diffusion Kirby and

Baurer)
1. Pada pengujian aktivitas antimikroba digunakan kertas cakram yang
berukuran 6 mm dengan daya serap 50 µL tiap cakram.
2. Suspensi mikroba kemudian diinokulasikan ke dalam media dan
dihomogenkan.
3. Media yang telah diinokulasi mikroba dituangkan ke dalam cawan petri
sebanyak 30mL dan tunggu hingga media mengeras.
 Lanjutan…
4. Sampel yang telah ditentukan konsentrasinya (250 µg/ 50 µL) ditotolkan
pada masing-masing cakram dengan menggunakan mikropipet.
5. Masing-masing cawan petri diberi label dan nomor sampel yang sesuai.
6. Kertas cakram yang telah ditotolkan sampel uji ascidian Herdmania momus
diletakkan kedalam cawan petri dengan pinset lalu diinkubasi selama 1x24
jam.

• Pengamatan dan pengukuran Zona bening

1. Pengamatan dilakukan setelah 24 jam masa inkubasi.
2. Daerah pada sekitaran cakram menunjukkan kepekaan mikroba terhadap
antibiotic atau bahan antimikroba yang digunakan sebagai bahan uji.
3. Diameter zona bening diukur dalam satuan millimeter (mm) menggunakan
jangka sorong.
4. Zona bening yang telah diukur dibandingkan dengan pedoman.
 ANTIVIRUS DAN ANTIKANKER
 Uji anti-HIV
Prosedur yang digunakan di National Cancer Institute, Bethesda, A.S.
untuk pengujian aktivitas melawan Human Immunodeficiency Virus (HIV)
dirancang untuk mendeteksi agen bertindak pada setiap tahap siklus
reproduksi virus. Pengujian pada dasarnya melibatkan pembunuhan limfosit
T4 oleh HIV (Schwarts, et al., 1988).
Sejumlah kecil HIV ditambahkan ke sel, dan siklus lengkap virus, sel,
atau produk gen virus untuk mengganggu dengan aktivitas virus dimulai untuk
melindungi sel-sel dari sitolisis. Sistem pengujiannya adalah otomatis untuk
mengakomodasi sejumlah besar sampel uji dan umumnya dirancang untuk
mendeteksi aktivitas anti-HIV
 PENGUJIAN ANTIVIRUS (ANTI-HIV)
• Alat dan Bahan:
1. CO2 inkubator dengan kontrol suhu
2. Garam tetrazolium, XTT
3. Dimethyl sulfoxide (DMSO)
4. Limfosit T4 (garis sel CEM)
5. Virus HIV-1 (sangat hati-hati)
6. Spektrofotometer
7. Mikroskop majemuk
8. piring 96-well
9. AZT
10. Pipet multichannel
11. Sampel uji (ekstrak kasar, produk alami atau senyawa sintetis)
 Prosedur pengujian :
1. Sampel uji dilarutkan dalam dimetil sulfoksida, kemudian diencerkan 1: 100
dalam kultur sel Limfosit T4 (garis sel CEM) ditambahkan dan setelah interval
singkat HIV-1 ditambahkan . Sel yang tidak terinfeksi dengan senyawa
(sampel uji) berfungsi sebagai toksisitas penngontrol, dan sel-sel yang
terinfeksi dan tidak terinfeksi tanpa senyawa berfungsi sebagai dasar
kontrol.
2. Kultur diinkubasi pada suhu 37 ° C dalam atmosfer karbon dioksida 5%
selama 6 hari.
3. Garam tetrazolium, XTT, ditambahkan ke semua sumur, dan biakan diinkubasi
untuk memungkinkan pengembangan warna formazan oleh sel-sel yang layak.
 Lanjutan…

4. Sumur individu dianalisis secara spektrofotometri untuk formazan

kuantitatif dan, di samping itu, dilihat secara mikroskopis untuk
mendeteksi sel yang hidup dan konfirmasi kegiatan perlindungan.
5. Sel yang terinfeksi virus yang diobati dengan obat dibandingkan
dengan sel yang tidak terinfeksi dan yang diobati dengan obat
kontrol lain yang sesuai (sel yang tidak terinfeksi dan tidak diobati,
mengandung obat dengan baik tanpa sel, dll)
6. Data ditinjau dibandingkan dengan tes lain yang dilakukan pada
waktu yang sama dan aktivitas yang telah ditentukan.
 Uji Antikanker

Uji aktivitas anti-kanker ekstrak daun pandan wangi

1. Ekstraksi
• Sampel dikeringkan dan dihaluskan
• Dimaserasi dengan butanol, etil asetat, dan petroleum eter
• Dipekatkan pada suhu 40-65 hingga diperoleh padatan
2. Uji Toksisitas
Ekstrak yang memiliki potensi aktivitas anti kanker (toksisitas)
tertinggi kemudian diuji kandungan fitokimia nya.
Lanjutan…

3. Skrining Fitokimia
Skrining fitokimia ini bertujuan untuk mengetahui kandungan
alkaloid, flavonoid, steroid, terpenoid, dan saponin dalam
ekstrak etil asetat daun pandan wangi yang mempunya efek
biologi menghambat pertumbuhan kanker.
4. Identifikasi GC-MS
Ekstrak etil asetat yang memiliki toksisitas tertinggi
diidentifikasi kandungan senyawanya menggunakan GC-MS.
 ANTIFUNGAL
Antifungal merupakan obat-obatan yang digunakan untuk
menghilangkan infeksi yang disebabkan oleh jamur.

Uji aktivitas anti jamur ekstrak etanol biji buah langsat

1. Pembuatan simplisia
• Dilakukan sortasi basah dan kering pada biji buah langsat
• Kemudian diblender untuk memperkecil ukuran simplisia
• Disimpan dalam wadah tertutup dan diletakkan pada suhu kamar
2. Pembuatan ekstrak
• Dilakukan meserasi pada simplisia dengan 2,8 liter etanol 96% di dalam
sebuah wadah
• Pada proses meserasi dilakukan pengadukan
• Dilakukan penyaringan menggunakan kertas saring untuk memisahkan
pelarut hasil meserasi (filtrat) dengan simplisia sisa penyaringan
• Dievaporasi menggunakan alat vacum rotatory evaporator.
• Filtrat kental hasil evaporasi kemudian di waterbath.
• Ekstrak disimpan dalam wadah kaca yang dilapisi aluminium foil
3. Pengujian aktivitas antijamur
• Pengujian dilakukan dengan metode difusi cakram (disc diffusion
method).
• Media SDA yang sudah cair dituangkan kedalam cawan petri steril dan
dibiarkan menjadi padat
• Kemudian suspensi disebar di permukaan medium secara merata (1 ml)
• Cawan diinkubasi pada suhu 37°C selam 24-48 jam.
KESIMPULAN
DAFTAR PUSTAKA
Mujipradhana, dkk. 2018. Aktivitas Antimikroba dari Ekstrak Ascidian
pada Mikroba Patogen Manusia. Jurnal Ilmiah Farmasi. 7(3):
338-347.
Rahman, Atta, dkk. 2005. Bioassay Techniques For Drug Development.
San Diego,USA: harwood academic publishers.