ISOLASI DNA

Atna Permana, S.KM, M.Biomed

 Pengantar
 DNA terdapat pada seluruh jaringan dan cairan
tubuh  DNA genom dapat diisolasi dari semua
dahan biologis yang mengandung sel berinti
 EUKARIOT  darah, semen/sperma, rambut,
tulang, air liur dll
 PROKARIOT Mikroorganisme  bakteri
 DNA genom yang diisolasi dapat digunakan
untuk identifikasi DNA suatu organisme, baik
dengan PCR atau menggunakan enzim
endonuklease restriksi (DNA fingerprinting)
 Lanjutan
 Hasil pemeriksaan dengan kedua metode 
dapat digunakan untuk diagnosis penyakit
infeksi yg disebabkan oleh virus/bakteri,
mendeteksi adanya mutasi gen yg menimbulkan
penyakit keganasan, penyakit herediter, alat
bantu dalam bidang kedokteran kehakiman.
 Prinsip dasar isolasi DNA adalah melisiskan sel,
memisahkan DNA dari protein, mengendapkan
DNA, melarutkan kembali DNA, menghitung
jumlah DNA yang diperoleh dan menilai
kemurnian DNA.
SIDIK DNA (DNA FINGERPRINTING)
 Setiap individu, kecuali kembar identik 
memiliki keunikan genetic
 Yaitu : kesamaan dan perbedaan dalam urutan
DNA.
 Keunikan genetic disebabkan oleh dua factor :
keturunan dan mutasi
 Pd organisme diploid, satu genom diturunkan
dari ayah dan satu dari ibu  dasar
pemeriksaan sidik DNA
 Bahan pemeriksaan  Bahan biologis yang
mengandung DNA ( jaringan, cairan tubuh dll)
 Lanjutan
 Dasar  Enzim endonuklease restriksi
memotong DNA pada urutan basa spesifik yang
palindromik
 EnzimRESTRIKSI berfungsi sebagai gunting
molekuler  memotong DNA menjadi fragmen2
yang panjangnya beda
 Tempat urutan pasangan basa spesifik  situs
restriksi
 Situs restriksi pada DNA dapat lebih dari satu 
didapat panjang fragmen yang berbeda
 Lanjutan
 Palindrom  pasangan urutan basa DNA,
yang apabila dibaca dari arah 5’ ke 3’ atau
3’ ke 5’ maka urutan pada masing-masing
untai DNA tersebut adalah sama
 Contoh  AAGCTT dan TTCGAA,
GAATTC dan CTTAAG
 Contoh enzim Restriksi (endonuklease), susunan
nukleotida target dan tempat pemotongan

Bakteri Enzim Lokus pengenalan

Bacillus amyloliquefaciens H BamHI G GATCC

Bacillus globigii BglII A GATCT
Escherichia coli RY 13 EcoRI G AATTC
Haemophillus aegyptius HaeIII
GC CC
Klebsiella pneumoniae KpnI
GGTAC C
Providencia stuartii PstI
Serratia marcescens SmaI
CTGCA G
Xanthomonas malvacearum XmaI CCC GGG
C CCGGG
 Lanjutan
  Contoh  EcoRI
 GT A GAATTC ATTCACGC
A
 CAT CTTAAG TAAGTGCG
T
 
  : tempat pemotongan DNA
 Lanjutan
 Hasil pemotongan
G T A G ATTCATTCACGCA
C A T C T T A GTAAGTGCGT
 Fragmen 1 fragmen 2
 Lanjutan
 Setelah dipotong  fragmen2 DNA
dengan berbagai ukuran dipisahkan
dengan Elektroforesis gel agarosa
 Elektroforesis memisahkan fragmen2 DNA
sesuai muatan dan ukurannya.
 Fragmen DNA bermuatan negatif 
bergerak ke kutub positif (anoda).
 Fragmen DNA yang lebih kecil 
bergerak lebih jauh
 Untuk memantau mobilitas fragmen DNA pada gel
 ditambahkan zat warna biru ( Biru bromfenol)
pada larutan DNA yang akan diperiksa.
 Setelah Elektroforesis selesai :
 Gel direndam dalam larutan pewarna (DNA Bio-
Safe) untuk mewarnai DNA. Molekul zat warna
akan terikat pada DNA yang berada pada gel
tersebut.
 Gel direndam dalam air untuk menghilangkan zat
warna pada gel yang tidak terikat pada DNA.
 Setelah pita2 DNA terlihat, pola restriksi DNA pada
tiap2 sampel dapat dibandingkan.
 Manfaat
 Sidik DNA  suatu alat analitik yang sangat bermanfaat
untuk memeriksa kesamaan dan perbedaan individu
(organisme) yang berbeda.
 Manfaat lain :
 Identifikasi kandungan makanan yang membahayakan
 identifikasi bagian tubuh manusia
 mempelajari hubungan antar ras
 mencari penyebab penyakit
 identifikasi orangtua kandung
 deteksi perubahan DNA pada tumor
 menentukan keberhasilan transplantasi sumsum tulang
 identifikasi pelaku kejahatan dll