AKTIVITAS ANTIBAKTERI DAN ANTIFUNGI EKSTRAK PETROLEUM ETER Dumortiera hirsuta Junairiah, Hanik Faizah, dan Salamun

Prodi S-1 Biologi, Depatermen Biologi, Fakultas Sains dan Teknologi, Universitas Airlangga, Surabaya

ABSTRAK The aims of this study were to investigate the secondary metabolite compound and antimicrobial activity of petroleum eter extract of liverwort Dumortiera hirsuta against Escherichia coli, Staphylococcus aureus and Candida albicans. Secondary metabolite which contained in extract was tested with phytochemical screening method. Antimicrobial activity were investigated by disc diffusion method to measure the inhibition zone diameter and tube dilution method to determine minimal inhibitory concentration (MIC) and minimal bactericidal concentration/minimal fungicidal concentration (MBC/MFC). Diameters of the inhibition zone were analyzed using Kruskall-Wallis Test (=0,05) followed up with Mann-Whitney Test (=0,05). Data of MIC, MBC/MFC and phytochemical screening were descriptively analyzed. The result of phytochemical screening test showed that there was steroid in petroleum eter extract of D. hirsuta. The result showed that the diffferent concentration of petroleum eter extract of D. hirsuta influenced diameter of the inhibition zone growth of E. coli, S. aureus and C. albicans. The kinds of microbe did not have effect on diameter of the inhibition zone. MIC and MBC/MFC have not been able determined in this study. Key words : Dumortiera hirsuta, antimicrobial, petroleum eter, Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Candida albicans
PENDAHULUAN

Penyakit infeksi merupakan salah satu masalah dalam bidang kesehatan yang dari waktu ke waktu terus berkembang. Penyakit infeksi banyak disebabkan oleh mikroorganisme flora normal, sebagai contoh, beberapa bakteri penting yang dapat menyebabkan penyakit adalah Staphylococcus aureus dan Escherichia coli. Infeksi juga dapat disebabkan oleh mikroorganisme lain seperti Candida albicans yang juga merupakan anggota flora normal penyebab candidiasis (Jawetz et al., 2005). Antibiotik memberikan dasar utama untuk terapi infeksi mikroba (bakteri

dan fungi). Namun, terlalu sering menggunakan antibiotik telah menjadi faktor utama bagi munculnya dan penyebaran beberapa kelompok mikroorganisme yang resisten terhadap antibiotik (Harbottle et al., 2006). Dalam beberapa tahun terakhir, permasalahan resistensi bakteri pada penggunaan antibiotika merupakan salah satu masalah yang berkembang di seluruh dunia (Bronzwaer et al., 2002). Oleh karena itu diperlukan zat antibakteri baru dengan mekanisme aksi yang berbeda (Tenover, 2006). Karena alasan ini, peneliti mengalihkan perhatiannya untuk menemukan zat antimikroba dari sumber baru yang berasal dari tumbuhan (Singh et al., 2010). Zhu et al. (2006) mengungkapkan bahwa tumbuhan lumut adalah salah satu sumber antibiotik yang paling signifikan dan menjanjikan di alam. Hasil penelitian yang dilakukan oleh Veljic et al. (2010) mengungkapkan bahwa ekstrak metanol lumut hati Ptilidium pulcherrimum memiliki aktivitas antibakteri dan antifungi. Bodade et al. (2008) menjelaskan bahwa diantara kelompok lumut yang diuji, lumut hati Plagiochasma appendiculatum adalah paling aktif menghambat bakteri, lumut hati memiliki aktivitas antibiotik lebih baik (aktivitas 88%) daripada lumut daun (aktivitas 33%), ini memperlihatkan bahwa senyawa antibakteri terdapat pada sebagian besar takson dari lumut hati. Pada beberapa penelitian sebelumnya telah dilaporkan bahwa lumut hati Dumortiera hirsuta memiliki aktivitas antibakteri dan antifungi (Madsen dan Pates, 1952 dalam Glime, 2007; Alam et al., 2011). Escherichia coli, Staphylococcus aureus dan Candida albicans merupakan flora normal manusia akan tetapi akan berubah menjadi mikroba patogen dalam kondisi tertentu. Dalam penelitian ini, untuk mengetahui aktivitas antimikroba ekstrak petroleum eter lumut hati Dumortiera hirsuta terhadap penghambatan pertumbuhan bakteri gram positif dan bakteri gram negatif serta penghambatan pertumbuhan fungi patogen digunakan Escherichia coli, Staphylococcus aureus dan Candida albicans sebagai mikroba uji. Petroleum eter digunakan untuk mengikat metabolit sekunder yang terkandung dalam Dumortiera hirsuta yang diduga bersifat toksik bagi mikroba uji. Penggunaan berbagai variasi konsentrasi ekstrak lumut tersebut diharapkan dapat menunjukkan aktivitas antimikroba yang berbeda sehingga dapat diketahui

nilai MIC (Minimal Inhibitory Concentration) dan MBC/MFC (Minimal Bactericidal Concentration/Minimal Fungicidal Concentration)
BAHAN DAN METODE

Tempat dan Waktu Penelitian Penelitian dilaksanakan selama 6 bulan pada bulan Pebruari 2012 sampai dengan Juli 2012 di Laboratorium Biologi Dasar dan Laboratorium Mikrobiologi, Departemen Biologi, Fakultas Sains dan Teknologi, Universitas Airlangga, Surabaya. Bahan Tumbuhan Tumbuhan lumut Dumortiera hirsuta yang diperoleh dari Taman Hutan Raya Raden Suryo, Cangar-Batu. Dumortiera hirsuta diidentifikasi dengan buku Guide to the Liverworts of North Carolina (Hicks, 1992). Lumut diambil dari habitatnya dan disimpan dalam kantong koleksi lumut. Sampel yang diambil merupakan fase gametofit lengkap dan telah dewasa. Mikroba Uji Mikroba uji yang digunakan adalah Escherichia coli ATCC 25922, Staphylococcus aureus ATCC 25923 dan Candida albicans ATCC 10231, yang merupakan koleksi Laboratorium Mikrobiologi, Departemen Biologi, Fakultas Sains dan Teknologi, Universitas Airlangga, Surabaya. Ekstraksi Lumut D. hirsuta Hasil koleksi tumbuhan lumut D. hirsuta yang diperoleh diekstraksi dengan menggunakan pelarut petroleum eter. Sebanyak 10 gram lumut D. hirsuta kering direndam secara keseluruhan dengan 300 mL petroleum eter. Larutan petroleum eter dan tumbuhan lumut tersebut dimaserasi selama 3 hari. Ekstrak cair dari hasil maserasi disaring menggunakan kertas saring kemudian disaring kembali dengan menggunakan corong buchner. Filtrat yang dihasilkan kemudian ditampung dalam gelas beaker dan ditutup dengan aluminium foil yang telah diberi lubang-lubang

kecil untuk mengguapkan pelarut petroleum eter. Kemudian 80 mg dari ekstrak kering dilarutkan dalam 1 mL DMSO 20%. Skrining Fitokimia Ekstrak petroeum eter D. hirsuta diidentifikasi komponen fitokimianya terhadap golongan senyawa triterpenoid dan steroid. Sampel dimasukkan ke dalam spot plate dengan menggunakan tusuk gigi, kemudian ditambahkan larutan Liebermann Burchard. Liebermann Burchard terdiri atas 3 tetes asam asetat anhidrat dan 1 tetes asam sulfat pekat. Apabila terbentuk warna hijau maka menunjukkan adanya senyawa steroid dan warna merah atau ungu menunjukkan adanya triterpenoid (Harborne, 1987). Penentuan Aktivitas Antimikroba Metode cakram kertas Metode cakram kertas menggunakan media Mueller-Hinton Agar (MHA) steril sebagai media pertumbuhan dalam uji antimikroba. Metode ini meletakkan kertas cakram (diameter 6 mm) yang ditetesi dengan 25 L ekstrak peroleum eter D. hirsuta pada permukaan medium MHA (volume medium 15 mL) dalam cawan petri yang sudah diinokulasi E. coli, S. aureus dan C. albicans secara aseptik. Suspensi mikroba uji kurang lebih 1 mL dengan OD 0,1 pada 625 nm untuk bakteri dan 600 nm untuk fungi. Kemudian medium yang telah diberi perlakuan, yaitu dengan pemberian ekstrak petroleum eter D. hirsuta dengan konsentrasi yang berbeda-beda (0 ppm, 2.500 ppm, 5.000 ppm, 10.000 ppm, 20.000 ppm, 40.000 ppm, 60.000 ppm, dan 80.000 ppm) diinkubasi selama 24 jam untuk bakteri dan 48 jam untuk fungi. Menurut Bailey dan Scott (1994) terbentuknya daerah penghambatan (halo) di sekitar cakram uji menunjukkan adanya aktivitas antimikroba. Diameter daerah penghambatan pertumbuhan mikroba diukur dengan menggunakan jangka sorong. Metode pengenceran dalam tabung Metode pengenceren dalam tabung digunakan untuk memperoleh nilai MIC dan MBC/MFC. Konsentrasi ekstrak petroleum eter D. hirsuta untuk metode

pengenceran ini adalah 2.500, 2.000, 1.500, 1.000, 750, 500, 250, dan 0 ppm. Metode ini diawali dengan membuat suspensi mikroba uji pada media MullerHinton Broth (MHB) dengan mengatur kekeruhan mikroba pada OD yang sesuai dengan standar Mc. Farland 0,5 625 nm=0,1 untuk bakteri dan 0,5 600 nm=0,1 untuk fungi. Kemudian 1 mL larutan ekstrak untuk masing-masing konsentrasi yang telah ditentukan dimasukkan kedalam tabung reaksi dan ditumbuhkan dengan 1 mL mikroba uji di dalamnya. Kultur dihomogenkan dan diinkubasi selama 24 jam untuk bakteri dan 48 jam untuk fungi. Aktivitas antimikroba dalam kultur dapat diketahui jika terjadi penurunan densitas dalam kultur yang sudah ditambah dengan ekstrak lumut. Dari kultur positif tersebut diambil sebanyak 0,1 mL untuk ditumbuhkan dalam media MHA dan diinkubasi selama 24 jam untuk bakteri dan 48 jam untuk fungi. Setelah inkubasi, ketika terjadi pertumbuhan pada media MHA, maka pada konsentrasi tersebut merupakan nilai MIC dan nilai MBC/MFC dapat ditentukan jika dalam media tersebut tidak ditumbuhi oleh mikroba, yang menunjukkan bahwa pada konsentrasi tersebut zat antimikroba ekstrak lumut dapat membunuh mikroba uji (Bailey dan Scott, 1994). Analisis Data Data yang diperoleh, yaitu berupa diameter zona hambat pertumbuhan bakteri E. coli, S. aureus, dan fungi C. albicans pada berbagai konsentrasi ekstrak petroleum eter D. hirsuta. Data tersebut dianalisis secara statistik dengan menggunakan program SPSS versi 16. Data diuji dengan Kruskall-Wallis Test Kemudian dilakukan uji lanjutan menggunakan uji Mann-Whitney. Sedangkan data jumlah sel mikroba uji, nilai MIC, nilai MBC/MFC dan skrining fitokimia dianalisis secara deskriptif.
HASIL DAN PEMBAHASAN

Ekstraksi Lumut D. hirsuta Hasil ekstraksi 10 gram serbuk lumut hati D.hirsuta dengan 1300 ml petroleum eter diperoleh ekstrak padat berwarna kuning pekat sebanyak 0,22 gram. Ekstraksi ini dilakukan untuk mengambil komponen non polar dari

sampel lumut D. hirsuta. Ekstrak ini selanjutnya diidentifikasi komponen fitokimianya dan dilakukan uji aktivitas antimikroba. Skrining Fitokimia
Uji fitokimia kandungan metabolit sekunder ekstrak petroleum eter D. hirsuta dilakukan terhadap uji triterpenoid dan steroid. Hasil pengujian skrining fitokimia

menunjukkan ekstrak mengandung senyawa steroid yang ditunjukkan dengan terbentuknya warna hijau. Steroid bersifat nonpolar karena tersusun dari isoprenisopren dari rantai panjang hidrokarbon (Robinson, 1995), sehingga steroid dapat larut dalam petroleum eter. Penentuan Aktivitas Antimikroba Metode cakram kertas Uji aktivitas antimikroba ekstrak petroleum eter D. hirsuta terhadap E. coli, S. aureus, dan C. albicans dengan metode cakram kertas adalah positif yaitu ditunjukkan dengan terbentuknya zona hambat (halo) di sekitar kertas cakram. Dari hasil uji cakram kertas terlihat jelas ekstrak petroleum eter D. hirsuta mempunyai aktivitas penghambatan terhadap mikroba uji. Diameter zona hambat pertumbuhan bakteri E. coli, S. aureus, dan fungi C. albicans pada berbagai konsentrasi ekstrak petroleum eter D. hirsuta disajikan pada gambar 1 berikut:
25 20 15 10 5 0

Diameter Zona Hambat (mm)

E.coli
S.aureus C.albicans

Konsentrasi Ekstrak Petroleum Eter Dumortiera hirsuta (ppm)

Gambar 1. Diagram batang diameter zona hambat pertumbuhan E. coli, S. aureus, dan C. albicans pada berbagai konsentrasi ekstrak petroleum eter D. hirsuta 6

Pada gambar 1 terlihat bahwa konsentrasi ekstrak petroleum eter D. hirsuta berpengaruh terhadap diameter zona hambat ketiga mikroba uji. Perlakuan konsentrasi ekstrak petroleum eter D. hirsuta terhadap E. coli, S. aureus, dan C. albicans mulai terlihat perbedaan yang nyata dengan kontrol pada konsentrasi 2.500 ppm, rerata diameter zona hambat E. coli sebesar (7,77 0,17) mm, S. aureus sebesar (8,64 0,23) mm, dan C. albicans sebesar (11,16 0,31) mm. Rata-rata diameter zona hambat terbesar untuk perlakuan konsentrasi ekstrak petroleum eter D. hirsuta terhadap E. coli dan S. aureus, yaitu pada konsentrasi 10.000 ppm, berturut-turut sebesar (9,22 0,15) mm dan (9,68 0,65) mm. Sedangkan rata-rata diameter zona hambat terbesar untuk perlakuan konsentrasi ekstrak petroleum eter D. hirsuta terhadap C. albicans sebesar (23,00 2,52) mm pada konsentrasi 60.000 ppm. Menurut Arora dan Bhardwaj (1997), aktivitas antimikroba dikategorikan tingkat sensitifitas tinggi apabila diameter zona hambat mencapai > 12 mm. Kategori tingkat sensitifitas sedang diberikan apabila ekstrak mampu memberikan diameter zona hambat sekitar 9-12 mm. Kategori tingkat sensitifitas rendah, apabila diameter berkisar antara 6-9 mm dan resisten apabila <6 mm. Pada penelitian ini, konsentrasi ekstrak petroleum eter D. hirsuta berpengaruh terhadap diameter zona hambat akan tetapi jenis mikroba tidak berpengaruh terhadap besarnya diameter zona hambat, hal ini dapat dilihat pada gambar 1. Pada beberapa penelitian, telah dilaporkan bahwa bakteri gram positif ditemukan lebih sensitif daripada bakteri gram negatif. Hal ini dapat terjadi karena bakteri gram negatif memiliki membran luar sementara bakteri gram positif hanya memiliki lapisan peptidoglikan. Membran luar ini bertanggung jawab untuk melindungi bakteri dari antibiotik, deterjen, dan enzim yang biasanya merusak membran dalam atau peptidoglikan (Lehninger et al., 2005). Namun, hasil yang diperoleh dalam penelitian ini adalah berbeda. Sensitivitas bakteri gram positif atau bakteri gram negatif terhadap ekstrak petroleum eter D. hirsuta tidak berbeda nyata. Hal ini menyimpulkan bahwa jenis mikroba uji, yaitu E. coli, S. aureus, dan C. albicans tidak memiliki pengaruh terhadap besarnya diameter zona hambat.

Metode pengenceran dalam tabung Metode pengenceran dalam tabung digunakan untuk mengetahui kadar hambat terkecil (MIC) dan kadar bunuh (MBC/MFC) terkecil dari suatu bahan antimikroba tertentu (Bailey dan Scott, 1994; Wistreich, 2003). Nilai MIC ditentukan secara kasat yang didasarkan pada kekeruhan kultur mikroba yang telah diinkubasi. Pada penelitian ini, sulit dilakukan pengamatan terhadap tingkat kekeruhan kultur pada berbagai konsentrasi, sehingga penentuan nilai MIC tidak didasarkan pada kekeruhan kultur mikroba uji. Penentuan nilai MIC dilakukan dengan pengamatan secara kuantitatif dengan cara menghitung jumlah koloni (nilai TPC atau Total Plate Count) dari masing-masing konsentrasi melalui metode pencawanan. Hasil perhitungan nilai TPC tersebut dapat dilihat pada tabel 1 berikut: Tabel 1. Nilai TPC (Total Plate Count) dan log TPC E. coli, S. aureus, dan C. albicans pada kultur uji dilusi dengan berbagai kosentrasi ekstrak petroleum eter D. hirsuta
E. coli Konsentrasi 0 250 500 750 1.000 1.500 2.000 2.500 Nilai TPC (CFU/mL) 2,44 x 10 2 x 10
8 8

S. aureus Log TPC 8,387 8,301 8,009 7,898 7,842 8,004 7,919 7,881 Nilai TPC (CFU/mL) 1,14 x 10 1,75 x 10 6,24 x 10 9,84 x 10 6,1 x 10
7 7

C. albicans Log Nilai TPC (CFU/mL) 4,3 x 10

8 7

Log TPC 8,633 7,496 7,274 8,057 7,27 8,342 7,215 7,417

TPC 7,057 7,243 6,944 6,795 6,848 6,993 7,068 6,785

3,13 x 10 1,14 x 10 2,20 x 10 2,61 x 10

1,02 x 108 7,9 x 10

7

8,8 x 106
6

1,88 x 107
8

6,95 x 107 1,01 x 10 7,6 x 10

8

7,04 x 106
6

1,86 x 107
8

8,3 x 107
7

1,17 x 107
6

1,64 x 107
7

Dari tabel 1 dapat dilihat bahwa terjadi penurunan nilai log TPC pada konsentrasi yang semakin tinggi. Penurunan jumlah koloni yang hidup pada metode pencawanan ini menunjukkan adanya aktivitas antimikroba ekstrak uji terhadap ketiga mikroba uji tersebut. Pada penelitian ini, nilai MIC dinyatakan sebagai konsentrasi terendah ekstrak lumut yang dapat menghambat pertumbuhan 8

mikroba sebanyak 90% koloni awal, sedangkan nilai MBC ditentukan dari cawan dengan konsentrasi ekstrak terkecil yang tidak dapat ditumbuhi lagi oleh bakteri atau mampu mereduksi 99,9% dari populasi bakteri awal selama inkubasi 24 jam (Koketsu et al., 1996). Dari definisi di atas, pada penelitian ini belum bisa ditemukan nilai MIC karena penurunan jumlah koloni pada berbagai konsentrasi ekstrak belum mencapai 90% baik pada E. coli, S. aureus maupun C. albicans. Nilai MBC/MFC juga belum bisa ditemukan karena belum ada konsentrasi ekstrak yang dapat mereduksi 99,9% koloni dari jumlah populasi awal baik pada E. coli, S. aureus maupun C. albicans. Dari hasil uji aktivitas antimikroba pada metode cakram kertas dan metode pengenceran dalam tabung menunjukkan bahwa pada ekstrak petroleum eter D. hirsuta terdapat zat aktif yang bersifat sebagai antimikroba. Pada beberapa penelitian sebelumnya telah dilaporkan bahwa lumut hati D. hirsuta memiliki aktivitas antibakteri dan antifungi (Madsen dan Pates, 1952 dalam Glime, 2007). Ekstrak air lumut hati D. hirsuta ditemukan dapat menghambat sejumlah fungi fitopatogen dengan mekanisme yang berbeda seperti penghambatan germinasi spora, sintesis dinding sel sehingga dinding sel menjadi lembek atau tidak kaku, sitoplasma hilang dari sel dan sitoplasma berbentuk granul atau butiran dan lainnya (Alam et al., 2011). Pada penelitian ini, ekstrak petroleum eter D. hirsuta positif mengandung senyawa steroid. Senyawa ini diduga merupakan senyawa aktif yang berperan sebagai antimikroba yang menghambat pertumbuhan E. coli, S. aureus dan C. albicans. Hal ini didukung oleh penelitian sebelumnya bahwa steroid dapat menghambat pertumbuhan mikroba. Menurut Zhu et al. (2000) dan Varricchio et.al (1967) steroid dapat menghambat pertumbuhan bakteri gram positif. Subhisha dan Subramoniam (2005) melaporkan bahwa ekstrak lumut hati Pallavicinia lyellii mengandung senyawa steroid yang aktif menghambat germinasi spora pertumbuhan C. albicans, mekanisme penghambatannya diduga berkaitan dengan sistem intraseluler.

KESIMPULAN

Uji skrining fitokimia menunjukkan adanya senyawa steroid di dalam ekstrak petroleum eter D. hirsuta. Pemberian ekstrak petroleum eter D. hirsuta pada konsentrasi berbeda berpengaruh terhadap diameter zona hambat pertumbuhan E. coli, S. aureus dan C. albicans. Jenis mikroba yang berbeda tidak memiliki pengaruh terhadap besarnya zona hambat. Pada penelitian ini belum dapat ditemukan nilai MIC (Minimum Inhibitor Concentration) dan MBC/MFC (Minimum Bactericidal Concentration/Minimal Fungicidal Concentration) dari ekstrak petroleum eter D. hirsuta terhadap E. coli, S. aureus dan C. albicans.
DAFTAR PUSTAKA

[1] Alam, Afroz, T., Abhishek, V., Sharad, B.,K. Kumar,dan S.,Vinay, 2011, In vitro antifungal efficacies of aqueous extract of D. hirsuta (Swaegr.) Nees against sporulation and growth of postharvest phytopathogenic fungi, Arc. Bryology, 103, 1-9 [2] Arora, D.S. dan Bhardwaj, 1997, Antibacterial Activity of Some Medicinal Plants, Geo. Bios., 24, 127-131 [3] Bailey, W.R. dan Scott, E.G, 1994, Diagnostic Microbiology, 4 edition, Saint Louis, The CV Mosby Company [4] Bodade R.G., Borkar P.S., Md Saiful Arfeen, dan Khobragade C. N., 2008, In vitro Screening of Bryophytes for Antimicrobial Activity, Journal of Medicinal Plans, 7 (4), 23-28 [5] Bronzwaer, SL., Cars, O., Buchhols, U., Molstad, S., dan Goettsch, W., 2002, A European Study on The Relationship between Antimicrobial Use and Antimicrobial Resistance, Emerging Infectious Disease, 8, 278-282 [6] Glime, J.M, 2007, Bryophyte Ecology, http://www.bryoecol.mtu.edu (diakses 6 Januari 2012) [7] Harborne, JB, 1987, Metode Fitokimia, Edisi kedua, Bandung, Penerbit ITB [8] Harbottle H., Thakur, S., Zhao, S., dan White, D.G., 2006, Genetics of Antimicrobial Resistance, Anim.Biotechnol, 17, 111-124 [9] Hicks, Marie L., 1992, Guide to the Liverworts of North Carolin, United States of America, Duke University Press [10] Jawetz E, Melnick GE, dan Adelberg CA, 2005, Mikrobiologi kedokteran, Edisi II, Diterjemahkan oleh dr. Nani Widorini, Jakarta, Salemba Medika [11] Koketsu, Mamoru, M., Kim, dan Yamamoto T., 1996, Antifungal activity against foodborne fungi of Aspidistra elatior Blume, J of Agric Food Chemistry 44, 301 303

10

[12] Lehninger,A., D. Nelson, M. Cox, dan Lehninger, 2005, Principles of Biochemistry 4th Edition, New ork, W.H. Freeman New York [13] Robinson, T., 1995, Kandungan Senyawa Organik Tumbuhan Tinggi, Diterjemahkan oleh Prof. Dr. Kokasih Padmawinata, Bandung, ITB [14] Singh Kaveri, Vandana Tiwar, dan Rajneesh Prajapat, 2010, Study of Antimicrobial Activity of Medicinal Plants Against Various Multiple Drug Resistance Pathogens And Their Molecular Characterization And its Bioinformatics Analysis Of Antibiotic Gene From Genomic Database With Degenerate Primer Prediction, International Journal of Biological Technology, 1(2), 15-19 [15] Subhisha, S. dan Subramoniam, A., 2005, Antifungal activities of a steroid from Pallavicinia lyellii, a liverwort. Indian Journal of Pharmacology, 37, 304-8. [16] Tenover, Fred C., 2006, Mechanisms of Antimicrobial Resistance in Bacteria, The American Journal of Medicine, 119 (6A), S3S10 [17] Varricchio, F., Norman, J.D., dan Aundre, S., 1967, Effect of azasteroids on Gram-positive bacteria, Journal of Bacteriology, 93(2), 627-635 [18] Veljic, M., Ana Ciric, Marina Socovic, P. Janackovic, dan P. D. Marin, 2010, Antibacterial and Antifungal Activity of The Liverwort (Ptilidium pulcherrimum) methanol extract. Arch. Biol. Sci., Belgrade, Serbia, 62 (2), 381-395 [19] Wistreich, G.A, 2003, Microbiology Laboratory Fundamentals and Application, Los angeles, Pearson Education Inc. [20] Zhu Y., Zhu, Q.X., dan Jia, Z.J., 2000, Epoxide sesquiterpenes and steroids from cremanthodium discoideum, Australian Journal of Chemistry, 53(10), 831-834 [21] Zhu, R.L., Wang D., Xu L., Shi R. P, Wang J., dan Zheng M., 2006, Antibacterial activity in extracts of some bryophytes from China and Mongolia, Journal of Botanical Laboratory 100, 603-615

11