a) Kromofor Kromofor adalah suatu gugus fungsi, tidak terhubung dengan gugus lain, yang menampakkan spektrum absorpsi

karakteristik pada daerah sinar UV-sinar tampak. Ada 3 jenis Kromofor sederhana :

Ikatan ganda antara dua atom yang tidak memiliki pasangan elektron bebas

Contoh :

Ikatan ganda antara dua atom yang memiliki pasangan elektron bebas

Contoh :

Cincin Benzena. Jika beberapa Kromofor berhubungan maka absorpsi menjadi lebih kuat dan berpindah ke panjang gelombang yang lebih panjang.

b) Auksokrom Auksokrom tidak menyerap pada panjang gelombang 200-800nm, namun mempengaruhi spektrum chromophore dimana auxochrome tersebut terikat - CH3 OH -NH2 NO2 Auksokrom dapat mempengaruhi sebagai berikut :

Menggeser ke panjang gelombang lebih panjang (red shift) disebut efek batokromik Menggeser ke panjang gelombang lebih pendek (blue shift) disebut efek hipsokromik

amax meningkat ( peningkatan intensitas) disebut hiperkromik amax menurun (penurunan intensitas) disebut hipokromik SPEKTROFOTOMETRI (Elisabeth Deta Lustiyati, M.Si) UV-VIS

Spektrofotometri Sinar Tampak (UV-Vis) adalah pengukuran energi cahaya oleh suatu sistem kimia pada panjang gelombang tertentu (Day, 2002). Sinar ultraviolet (UV) mempunyai panjang gelombang antara 200-400 nm, dan sinar tampak (visible) mempunyai panjang gelombang 400750 nm. Pengukuran spektrofotometri menggunakan alat spektrofotometer yang melibatkan energi elektronik yang cukup besar pada molekul yang dianalisis, sehingga spektrofotometer UV-Vis lebih banyak dipakai untuk analisis kuantitatif dibandingkan kualitatif. Spektrum UVVis sangat berguna untuk pengukuran secara kuantitatif. Konsentrasi dari analit di dalam larutan bisa ditentukan dengan mengukur absorban pada panjang gelombang tertentu dengan menggunakan hukum Lambert-Beer (Rohman, 2007).

Hukum Lambert-Beer menyatakan hubungan linieritas antara absorban dengan konsentrasi larutan analit dan berbanding terbalik dengan transmitan. Dalam hukum Lambert-Beer tersebut ada beberapa pembatasan, yaitu : - Sinar yang digunakan dianggap monokromatis - Penyerapan terjadi dalam suatu volume yang mempunyai penampang yang sama - Senyawa yang menyerap dalam larutan tersebut tidak tergantung terhadap yang lain dalam larutan tersebut - Tidak terjadi fluorensensi atau fosforisensi - Indeks bias tidak tergantung pada konsentrasi larutan Hukum Lambert-Beer dinyatakan dalam rumus sbb : A = e.b.c dimana : A = absorban e = absorptivitas molar b = tebal kuvet (cm) c = konsentrasi TAHAPAN PENENTUAN KADAR SAMPEL SECARA SPEKTROFOTOMETRI 1. Penentuan panjang gelombang maksium (?max) Definisi: panjang gelombang yang mempunyai absorbansi maksimal, dilakukan dengan membuat kurva hubungan antara absorbansi dengan panjang gelombang dari suatu larutan baku pada konsentrasi tertentu Hal yang perlu diperhatikan pada penentuan ?max sbb : Absorban yang terbaca pada spektrofotometer hendaknya antara 0,2 sampai 0,8 atau 15% sampai 70% jika dibaca sebagai transmitans. Anjuran ini berdasarkan anggapan bahwa kesalahan dalam pembacaan T adalah 0,005 atau 0,5% (kesalahan fotometrik). (Rohman, A. 2007) 2. Penentuan Operating Time (OT) TUJUAN : untuk mengetahui waktu pengukuran yang stabil yaitu saat sampel bereaksi sempurna dengan reagen warna . Waktu kerja ditentukan dengan mengukur hubungan antara waktu pengukuran dengan absorbansi larutan 3. Pembuatan Kurva Larutan Baku Linier TUJUAN : untuk memperoleh persamaan larutan baku dalam penentuan kadar sampel Tahapan yang diperlukan sbb : a. Dibuat seri larutan baku dari zat yang akan dianalisis dengan berbagai konsentrasi. b. Masing-masing absorbansi larutan dengan berbagai konsentrasi diukur pada ?max (berdasarkan hasil ?max yang diperoleh dari tahap 1) dan Operating Time (berdasarkan waktu yang diperoleh pada tahap 2) c. Membuat Kurva Larutan Baku yang merupakan hubungan antara konsentrasi (sumbu y) dan absorbansi (sumbu x). d. Bila hukum Lambert-Beer terpenuhi maka kurva baku berupa garis lurus.

e. Paling sedikit menggunakan 5 rentang konsentrasi yang meningkat yang dapat memberikan serapan linier f. Kemiringan atau slope adalah nilai e (absorptivitas molar). g. Nilai R antara 0,70 1,00 (pertanda terbentuk garis lurus linear pada rentang konsentrasi yang dibuat) Apabila persyaratan pembuatan kurva baku di atas tidak terpenuhi maka penyimpangan dari garis lurus biasanya dapat disebabkan oleh: (i) kekuatan ion yang tinggi, (ii) perubahan suhu, dan (iii) reaksi ikutan terjadi. 4. Penentuan Kadar Sampel Penentuan kadar sampel metode regresi linier yaitu metode parametrik dengan variabel bebas (konsentrasi sampel) dan variabel terikat (absorbansi sampel) menggunakan persamaan garis regresi Kurva Larutan Baku. Konsentrasi sampel dapat dihitung berdasarkan persamaan kurava baku tersebut (Rohman, 2007). PENENTUAN KETELITIAN METODE SPEKTROFOTOMETRI Melalui Perhitungan Standar Deviation (SD) dan Relative Standar Deviation (RSD) harga SD < 2 dan harga RSD < 2 % dapat dikatakan mempunyai harga ketelitian yang baik (Harminta, 2004) Tabel 2. Data Hasil Ketelitian Eksperimen PENENTUAN KETEPATAN METODE SPEKTROFOTOMETRI Metode Penambahan Baku (standard addition method) Dilakukan dengan menambahkan analit dengan konsentrasi tertentu pada sampel yang diperiksa, lalu dianalisis lagi metode tersebut (WHO, 1992). Nilai rentang recovery dianggap baik 80 120% Uji Perolehan Kembali / Recovery (%) = (Co-C1)/C Co = konsentrasi sampel yang diperoleh setelah penambahan larutan baku C1 = konsentrasi sampel sebelum penambahan larutan baku C = Konsentrasi larutan baku yang ditambahkan 4. Dalam percobaan ini, metode analisis yang digunakan adalah metode kurva kalibrasi. Dalam metode ini dibuat suatu larutan standar dari asetosal, parasetamol dan kofein dengan berbagai konsentrasi dan absorbansi dari larutan tersebut diukur spektrofotometer UV-Vis. Langkah selanjutnya adalah membuat grafik antara konsentrasi(C) dengan absorbansi (A) yang merupakan garis lurus yang melewati titik nol dengan slobe = atau = a.b. konsentrasi larutan sampel dapat dicari setelah absorbansi larutan sampel diukur dan diintrapolasi ke dalam kurva kalibrasi atau dimasukkan ke

dalam persamaan garis lurus yang diperoleh dengan menggunakan program regresi linear pada kurva kalibrasi 5. ebelum dilakukan pengukuran serapan, maka masing-masing komponen harus ditentukan panjang gelombang maksimumnya terlebih dahulu. Alasan penggunaan panjang gelombang maksimum ( maks) yakni panjang gelombang maksimum memiliki kepekaan maksimal karena terjadi perubahan absorbansi yang paling besar serta pada panjang gelombang maksimum bentuk kurva absorbansi memenuhi hukum Lambert-Beer KCKT 1 Prinsip kerja Kerja HPLC pada prinsipnya adalah pemisahan analit-analit berdasarkan kepolarannya, alatnya terdiri dari kolom (sebagai fasa diam) dan larutan tertentu sebagai fasa geraknya. Yang paling membedakan HPLC dengan kromatografi lainnya adalah pada HPLC digunakan tekanan tinggi untuk mendorong fasa gerak. Campuran analit akan terpisah berdasarkan kepolarannya, dan kecepatannya untuk sampai ke detektor (waktu retensinya) akan berbeda, hal ini akan teramati pada spektrum yang puncak-puncaknya terpisah. Urutan skala polaritas : golongan fluorocarbon < golongan hidrokarbon < senyawa terhalogenasi < golongan eter < golongan ester < golongan keton < golongan alkohol < golongan asam. 2. . Detektor Detektor diperlukan untuk mengindera adanya komponen cuplikan di dalam eluen kolom dan mengukur jumlahnya. Detektor yang baik sangat peka, tidak banyak berderau, rentang tanggapan liniernya lebar dan menanggapi semua jenis senyawa. Jenis-jenis detektor : - UV / Vis - Retraktif indeks (RI) Detector - konduktifitas detector - Elektrokimia Detector - PDA ELSD - MS Detector 3. A.Waktu retensi Waktu yang dibutuhkan oleh senyawa untuk bergerak melalui kolom menuju detektor Waktu retensi diukur berdasarkan waktu dimana sampel diinjeksikan sampai sampel menunjukkan ketinggian puncak yang maksimum dari senyawa itu. Senyawa-senyawa yang berbeda memiliki waktu retensi yang berbeda.

B. faktor kapasitas (faktor pembebanan) adalah perbandingan antara daya rata-rata yang dihasilkan dalam suatu periode tertentu dengan daya (terukur) terpasang. C.

4. ALAT KCKT DAN FUNGSINYA 1. Pompa Pompa pendesakan tetap dapat dibedakan menjadi pompa torak dan pompa semprit. Pompa torak menghasilkan aliran yang berdenyut jadi memerlukan peredam denyut atau peredam elektronik untuk menghasilkan garis alas detektor yang stabil jika detektor peka terhadap aliran. Pompa semprit menghasilkan aliran yang tak berdenyut, tetapi tandonnya terbatas. 2. Injektor Cuplikan harus dimasukkan ke dalam pangkal kolom (kepala kolom), diusahakan agar sesedikit mungkin terjadi gangguan pada kemasan kolom. Ada dua ragam utama aliran henti dan pelarut mengalir. Ada 3 macam system injector, yaitu : a. stop flow : aliran dihentikan, injeksi dilakukan padakinerja atmosfir, system tertutup, dan aliran dilanjutkan lagi. Teknik ini bisa digunakan karena difusi di dalam cairan kecil dan resolusi tidak diperngaruhi. b. Septum : septum yang digunakan pada kckt sama dengan yang digunakan pada kromatografi gas. Injector ini dapat digunakan pada kinerja sampai 60-70 atmosfir. Tapi septum ini tidak tahan dengan semua pelarut-pelarut kromatografi cair. Partikel kecil dari septum yang terkoyak (akibat jarum injector) dapat menyebabkan penyumbatan. c. Loop valve : tipe injector ini umumnya digunakan unutk menginjeksi volume lebih besar dari 10 dan dilakukan dengan cara automatis (dengan menggunkan adaptor yang sesuai, volume yang lebih kecil dapat diinjeksikan secara manual). Pada posisi load, sampel diisi ke dalam loop pada kinerja atmosfir, bila valve difungsikan, maka sampel akan masuk dalam kolom. 3. Kolom Kolom merupakan jantung kromatograf. Keberhasilan atau kegagalan analisis bergantung pada pilihan kolom dan kondisi kerja yang tepat. Kolom dapat dibagi menjadi kolom analitik dan kolom preparatif. 4. Detektor Detektor diperlukan untuk mengindera adanya komponen cuplikan di dalam eluen kolom dan mengukur jumlahnya. Detektor yang baik sangat peka, tidak banyak berderau, rentang tanggapan liniernya lebar dan menanggapi semua jenis senyawa. Jenis-jenis detektor : - UV / Vis- Retraktif indeks (RI) Detector- konduktifitas detector- Elektrokimia Detector- PDAELSD- MS Detector 5. Fase gerak Fase gerak memiliki syarat-syarat : - murni, tanpa cemaran - tidak bereaksi dengan kemasan

- sesuai dengan detektor - dapat melarutkan cuplikan - mempunyai viskositas rendah - memungkinkan memperoleh dengan mudah cuplikan jika diperlukan - harganya wajar Jenis-jenis KCKT Dilihat dari jenis fase diam dan fase gerak, KCKT (kolomnya) dibedakan menjadi: a. Kromatografi fase normal Kromatografi dengan kolom konvensional dimana Fase diam : normal (bersifat polar), misalnya Silika gel Fase gerak : bersifat non polar b. Kromatografi fase terbalik Fase diam : sifatnya non polar, misalnya Silika gel direaksikan dengan klorosilan Fase gerak : bersifat polar Keuntungan kromatografi fase terbalik : Senyawa yang polar akan lebih baik pemisahannya Senyawa ionic dapat dipisahkan Air dapat digunakan sebagi pelarut ALAT KCKT

POTENSIOMETRI 1. Potensiometri adalah Mengukur potensial dua elektrode yang tidak terpolarisasi pada kondisi arus nol merupakan potensiometri yang mengaplikasi secara langsung dari persamaan Nerst. Penyisipan elektroda tidak mengubah komposisi larutan uji seseuai dengan sifat nondesktruktif potensiometri terhadap sampel. Bahkan, dapat digunakan untuk menetapkan tetapan

kesetimbangan (Day, 1999). Potensiometri dalam proses titrasi biasanya tidak memerlukan potensial-potensial mutlak maupun potensial relatif terhadap suatu sel-peruh standar. Titik ekivalen reaksi akan ditunjukkan oleh perubahan potensial secara mendadak dalam aturan e.m.f. yang dibaca lawan volume larutan penitrasi (J, Basset, 1994). Berbagai macam reaksi titrasi yang dapat diikuti pengukuran potensiometri diantaranya reaksi netralisasi, reaksi redoks serta reaksi pembentukkan kompleks dan pengendapan (Khopkar, 1990). 2. Titik akhir dalam titrasi potensiometri dapat dideteksi dengan menetapkan volume pada mana terjadi perubahan potensial yang relatif besar ketika ditambahkan titran. Dalam titrasi secara manual, potensial diukur setelah penambahan titran secara berurutan, dan hasil pengamatan digambarkan pada suatu kertas grafik terhadap volum titran untuk diperoleh suatu kurva titrasi. Dalam banyak hal, suatu potensiometer sederhana dapat digunakan, namun jika tersangkut elektroda gelas, maka akan digunakan pH meter khusus. Karena pH meter ini telah menjadi demikian biasa, maka pH meter ini dipergunakan untuk semua jenis titrasi, bahkan apabila penggunaannya tidak diwajibkan (Basset, J. dkk., 1994). Bermacam reaksi titrasi dapat diikuti dengan pengukuran potensiometri. Reaksinya harus meliputi penambahan atau pengurangan beberapa ion yang sesuai dengan jenis elektrodanya. Potensial diukur sesudah penambahan sejumlah kecil volume titran secara berturut-turut atau secara kontinyu dengan perangkat automatik. Presisi dapat dipertinggi dengan sel konsentrasi (Khopkar, 2003). a) Reaksi netralisasi: Titrasi asam basa dapat diikuti dengan elektroda indikatornya elektroda gelas. Tetapan ionisasi harus kurang dari 10-8. b) Reaksi pembentukan kompleks dan pengendapan: Pembentukan endapan atau kompleks akan membebaskan ion terhidrasi dari larutan. Biasanya digunakan elektroda Ag dan Hg. Berbagai logam dapat dititrasi dengan EDTA. c) Reaksi redoks: Elektroda Pt atau elektroda inert dapat digunakan pada titrasi redoks. Oksidator kuat (KMnO4, K2Cr2O7, Co(NH3)3) membentuk lapisan logam-oksida yang harus dibebaskan dengan reduksi secara katoda dalam larutan encer (Khopkar, 2003). Penentuan titik ekivalen titrasi potensiometri dapat dilakukan dengan cara diferensial yaitu dengan merajah kurva titrasi turunan pertama dan atau turunan kedua yang disebut kurva diferensial. Kurva diferensial pertama dibuat dengan cara menghitung

kenaikan pH persatuan kenaikan volume titran ( pH/V ) atau ( pE/V ), kemudian perbandingan ( pH/V ) atau ( pE/V ) disajikan dalam bentuk grafik sebagai fungsi dari volume titran yang ditambahkan. Sementara itu kurva diferensial kedua dibuat dengan cara merajah ( 2pH/V2 ) atau ( 2pE/V2 ), kemudian perbandingan ( 2pH/V2 ) atau ( 2pE/V2 ), disajikan dalam bentuk grafik sebagai fungsi dari volume titran yang ditambahkan. Penambahan volume ( V ) yang optimum bergantung pada besarn ya arah lereng kurva titrasi pada titik ekivalen dan ini dapat dengan mudah diperkirakan pada titrasi pendahuluan. Pada umumnya semakin besar arah lereng pada titik ekivalen, semakin kecil perbedaan volume titran ( V ) yang diberikan. Bila kurva titrasi s imetris di sekitar titik ekivalen, titik akhir yang didefinisikan oleh nilai maksimum dari ( pE/V ) adalah identik dengan titik ekivalen stoikiometrik yang sebenarnya. Kurva titrasi simetris diperoleh apabila electrode indikator bersifat reversible dan bila dalam reaksi titrasi satu mol reagen titran bereaksi dengan satu mol zat yang dititrasi. Kurva titrasi tidak simetris terjadi bila banyaknya molekul atau ion reagensia dan zat yang dititrasi tidak sama dalam reaksi titrasi ( Rohman, 2007 ).

HPLC (High Performance Liquid Chromatography) atau biasa juga disebut dengan Kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT) dikembangkan pada akhir tahun 1960-an dan awal tahun 1970-an. Saat ini, HPLC merupakan teknik pemisahan yang diterima secara luas untuk analisis bahan obat, baik dalam bulk atau dalam sediaan farmasetik. SISTEM PERALATAN HPLC Instrumentasi HPLC pada dasarnya terdiri atas: wadah fase gerak, pompa, alat untuk memasukkan sampel (tempat injeksi), kolom, detektor, wadah penampung buangan fase gerak, dan suatu komputer atau integrator atau perekam. Diagram skematik sistem kromatografi cair seperti ini :

1. Wadah Fase gerak dan Fase gerak Wadah fase gerak harus bersih dan lembam (inert). Wadah pelarut kosong ataupun labu laboratorium dapat digunakan sebagai wadah fase gerak. Wadah ini biasanya dapat menampung fase gerak antara 1 sampai 2 liter pelarut(1). Fase gerak atau eluen biasanya terdiri atas campuran pelarut yang dapat bercampur yang secara keseluruhan berperan dalam daya elusi dan resolusi. Daya elusi dan resolusi ini ditentukan oleh polaritas keseluruhan pelarut, polaritas fase diam, dan sifat komponen-komponen sampel. Untuk fase normal (fase diam lebih polar daripada fase gerak), kemampuan elusi meningkat dengan meningkatnya polaritas pelarut. Sementara untuk fase terbalik (fase diam kurang polar daripada fase gerak), kemampuan elusi menurun dengan meningkatnya polaritas pelarut. Fase gerak sebelum digunakan harus disaring terlebih dahulu untuk menghindari partikel-partikel kecil ini. Selain itu, adanya gas dalam fase gerak juga harus dihilangkan, sebab adanya gas akan berkumpul dengan komponen lain terutama di pompa dan detektor sehingga akan mengacaukan analisis. Elusi dapat dilakukan dengan cara isokratik (komposisi fase gerak tetap selama elusi) atau dengan cara bergradien (komposisi fase gerak berubah-ubah selama elusi) yang analog dengan pemrograman suhu pada kromatografi gas. Elusi bergradien digunakan untuk meningkatkan resolusi campuran yang kompleks terutama jika sampel mempunyai kisaran polaritas yang luas.4)

Fase gerak yang paling sering digunakan untuk pemisahan dengan fase terbalik adalah campuran larutan bufer dengan metanol atau campuran air dengan asetonitril. Untuk pemisahan dengan fase normal, fase gerak yang paling sering digunakan adalah campuran pelarut-pelarut hidrokarbon dengan pelarut yang terklorisasi atau menggunakan pelarut-pelarut jenis alkohol. Pemisahan dengan fase normal ini kurang umum dibanding dengan fase terbalik.2) 2. Pompa Pompa yang cocok digunakan untuk HPLC adalah pompa yang mempunyai syarat sebagaimana syarat wadah pelarut yakni: pompa harus inert terhadap fase gerak. Bahan yang umum dipakai untuk pompa adalah gelas, baja tahan karat, Teflon, dan batu nilam. Pompa yang digunakan sebaiknya mampu memberikan tekanan sampai 5000 psi dan mampu mengalirkan fase gerak dengan kecepatan alir 3 mL/menit. Untuk tujuan preparatif, pompa yang digunakan harus mampu mengalirkan fase gerak dengan kecepatan 20 mL/menit. Tujuan penggunaan pompa atau sistem penghantaran fase gerak adalah untuk menjamin proses penghantaran fase gerak berlangsung secara tepat, reprodusibel, konstan, dan bebas dari gangguan. Ada 2 jenis pompa dalam HPLC yaitu: pompa dengan tekanan konstan, dan pompa dengan aliran fase gerak yang konstan. Tipe pompa dengan aliran fase gerak yang konstan sejauh ini lebih umum dibandingkan dengan tipe pompa dengan tekanan konstan. 6) 3. Tempat penyuntikan sampel Sampel-sampel cair dan larutan disuntikkan secara langsung ke dalam fase gerak yang mengalir di bawah tekanan menuju kolom menggunakan alat penyuntik yang terbuat dari tembaga tahan karat dan katup teflon yang dilengkapi dengan keluk sampel (sample loop) internal atau eksternal.

Posisi pada saat memuat sampel

Posisi pada saat menyuntik sampel

4. Kolom dan Fase diam Ada 2 jenis kolom pada HPLC yaitu kolom konvensional dan kolom mikrobor. Kolom merupakan bagian HPLC yang mana terdapat fase diam untuk berlangsungnya proses pemisahan solut/analit. Kolom mikrobor mempunyai 3 keuntungan yang utama dibanding dengan kolom konvensional, yakni:

Konsumsi fase gerak kolom mikrobor hanya 80% atau lebih kecil dibanding dengan kolom konvensional karena pada kolom mikrobor kecepatan alir fase gerak lebih lambat (10 -100 l/menit). Adanya aliran fase gerak yang lebih lambat membuat kolom mikrobor lebih ideal jika digabung dengan spektrometer massa. Sensitivitas kolom mikrobor ditingkatkan karena solut lebih pekat, karenanya jenis kolom ini sangat bermanfaat jika jumlah sampel terbatas misal sampel klinis.

Meskipun demikian, dalam prakteknya, kolom mikrobor ini tidak setahan kolom konvensional dan kurang bermanfaat untuk analisis rutin.3] Kebanyakan fase diam pada HPLC berupa silika yang dimodifikasi secara kimiawi, silika yang tidak dimodifikasi, atau polimer-polimer stiren dan divinil benzen. Permukaan silika adalah polar dan sedikit asam karena adanya residu gugus silanol (Si-OH). Silika dapat dimodifikasi secara kimiawi dengan menggunakan reagen-reagen seperti klorosilan. Reagen-reagen ini akan bereaksi dengan gugus silanol dan menggantinya dengan gugus-gugus fungsional yang lain. Oktadesil silika (ODS atau C18) merupakan fase diam yang paling banyak digunakan karena mampu memisahkan senyawa-senyawa dengan kepolaran yang rendah, sedang, maupun tinggi. Oktil atau rantai alkil yang lebih pendek lagi lebih sesuai untuk solut yang polar. Silika-silika aminopropil dan sianopropil (nitril) lebih cocok sebagai pengganti silika yang tidak dimodifikasi. Silika yang tidak dimodifikasi akan memberikan waktu retensi yang bervariasi disebabkan karena adanya kandungan air yang digunakan. 5. Detektor HPLC Detektor pada HPLC dikelompokkan menjadi 2 golongan yaitu: detektor universal (yang mampu mendeteksi zat secara umum, tidak bersifat spesifik, dan tidak bersifat selektif) seperti detektor indeks bias dan detektor spektrometri massa; dan golongan detektor yang spesifik yang hanya akan mendeteksi analit secara spesifik dan selektif, seperti detektor UV-Vis, detektor fluoresensi, dan elektrokimia. Idealnya, suatu detektor harus mempunyai karakteristik sebagai berikut: 1. 2. 3. 4. 5. 6. Mempunyai respon terhadap solut yang cepat dan reprodusibel. Mempunyai sensitifitas yang tinggi, yakni mampu mendeteksi solut pada kadar yang sangat kecil. Stabil dalam pengopersiannya. Mempunyai sel volume yang kecil sehingga mampu meminimalkan pelebaran pita. Signal yang dihasilkan berbanding lurus dengan konsentrasi solut pada kisaran yang luas (kisaran dinamis linier). Tidak peka terhadap perubahan suhu dan kecepatan alir fase gerak. 2)

Beberapa detektor yang paling sering digunakan pada HPLC dengan karakteristik detektor seperti berikut : Detektor Sensitifitas Kisaran Karakteristik (g/ml) linier Absorbansi Uv-vis Sensitivitas bagus, paling sering

Fotometer filter Spektrofotometer spektrometerphotodiode array Fluoresensi

5 x 10 5 x 10

-10

10 10 10

-10

digunakan, selektif terhadap gugus-gugus dan struktur-struktur yang tidak jenuh.

> 2 x 10

-10

10

-12

10

Sensitifitas sangat bagus, selektif, Tidak peka terhadap perubahan suhu dan kecepatan alir fase gerak. Hampir bersifat universal akan tetapi sensitivitasnya sedang. Sangat sensitif terhadap suhu, dan tidak dapat digunakan pada elusi bergradien

Indeks bias

5 x 10

-7

10

Elektrokimia Konduktimetri Amperometri 10 10

-8

10 10

-12

Peka terhadap perubahan suhu dan kecepatan alir fase gerak, tidak dapat digunakan pada elusi bergradien. Hanya mendeteksi solut-solut ionik. Sensitifitas sangat bagus, selektif tetapi timbul masalah dengan adanya kontaminasi elektroda.

JENIS HPLC Pemisahan dengan HPLC dapat dilakukan dengan fase normal (jika fase diamnya lebih polar dibanding dengan fase geraknya) atau fase terbalik (jika fase diamnya kurang non polar dibanding dengan fase geraknya). Berdasarkan pada kedua pemisahan ini, sering kali HPLC dikelompokkan menjadi HPLC fase normal dan HPLC fase terbalik. Selain klasifikasi di atas, HPLC juga dapat dikelompokkan berdasarkan pada sifat fase diam dan atau berdasarkan pada mekanisme sorpsi solut, dengan jenis-jenis HPLC sebagai berikut: 1. Kromatografi Adsorbsi Prinsip kromatografi adsorpsi telah diketahui sebagaimana dalam kromatografi kolom dan kromatografi lapis tipis. Pemisahan kromatografi adsorbsi biasanya menggunakan fase normal dengan menggunakan fase diam silika gel dan alumina, meskipun demikian sekitar 90% kromatografi ini memakai silika sebagai fase diamnya. Pada silika dan alumina terdapat gugus hidroksi yang akan berinteraksi dengan solut. Gugus silanol pada silika mempunyai reaktifitas yang berbeda, karenanya solut dapat terikat secara kuat sehingga dapat menyebabkan puncak yang berekor.3) 2. Kromatografi fase terikat Kebanyakan fase diam kromatografi ini adalah silika yang dimodifikasi secara kimiawi atau fase terikat. Sejauh ini yang digunakan untuk memodifikasi silika adalah hidrokarbon-hidrokarbon non-polar seperti dengan oktadesilsilana, oktasilana, atau dengan fenil. Fase diam yang paling populer digunakan adalah oktadesilsilan (ODS atau C18) dan kebanyakan pemisahannya adalah fase terbalik. Sebagai fase gerak adalah campuran metanol atau asetonitril dengan air atau dengan larutan bufer. Untuk solut

yang bersifat asam lemah atau basa lemah, peranan pH sangat krusial karena kalau pH fase gerak tidak diatur maka solut akan mengalami ionisasi atau protonasi. Terbentuknya spesies yang terionisasi ini menyebabkan ikatannya dengan fase diam menjadi lebih lemah dibanding jika solut dalam bentuk spesies yang tidak terionisasi karenanya spesies yang mengalami ionisasi akan terelusi lebih cepat. 3) 3. Kromatografi penukar ion KCKT penukar ion menggunakan fase diam yang dapat menukar kation atau anion dengan suatu fase gerak. Ada banyak penukar ion yang beredar di pasaran, meskipun demikian yang paling luas penggunaannya adalah polistiren resin. Kebanyakan pemisahan kromatografi ion dilakukan dengan menggunakan media air karena sifat ionisasinya. Dalam beberapa hal digunakan pelarut campuran misalnya air-alkohol dan juga pelarut organik. Kromatografi penukar ion dengan fase gerak air, retensi puncak dipengaruhi oleh kadar garam total atau kekuatan ionik serta oleh pH fase gerak. Kenaikan kadar garam dalam fase gerak menurunkan retensi solut. Hal ini disebabkan oleh penurunan kemampuan ion sampel bersaing dengan ion fase gerak untuk gugus penukar ion pada resin. 4. Kromatografi Pasangan ion Kromatografi pasangan ion juga dapat digunakan untuk pemisahan sampel-sampel ionik dan mengatasi masalahmasalah yang melekat pada metode penukaran ion. Sampel ionik ditutup dengan ion yang mempunyai muatan yang berlawanan.2) 5. Kromatografi Eksklusi Ukuran Kromatografi ini disebut juga dengan kromatografi permiasi gel dan dapat digunakan untuk memisahkan atau menganalisis senyawa dengan berat molekul > 2000 dalton. Fase diam yang digunakan dapat berupa silika atau polimer yang bersifat porus sehingga solut dapat melewati porus (lewat diantara partikel), atau berdifusi lewat fase diam. Molekul solut yang mempunyai BM yang jauh lebih besar, akan terelusi terlebih dahulu, kemudian molekul-molekul yang ukuran medium, dan terakhir adalah molekul yang jauh lebih kecil. Hal ini disebabkan solut dengan BM yang besar tidak melewati porus, akan tetapi lewat diantara partikel fase diam. Dengan demikian, dalam pemisahan dengan eksklusi ukuran ini tidak terjadi interaksi kimia antara solut dan fase diam seperti tipe kromatografi yang lain. 6. Kromatografi Afinitas Dalam kasus ini, pemisahan terjadi karena interaksi-interaksi biokimiawi yang sangat spesifik. Fase diam mengandung gugus-gugus molekul yang hanya dapat menyerap sampel jika ada kondisi-kondisi yang terkait dengan muatan dan sterik tertentu pada sampel yang sesuai (sebagaimana dalam interaksi antara antigen dan antibodi). Kromatografi jenis ini dapat digunakan untuk mengisolasi protein (enzim) dari campuran yang sangat kompleks. 2) DERIVATISASI PADA HPLC Derivatisasi melibatkan suatu reaksi kimia antara suatu analit dengan suatu reagen untuk mengubah sifat fisikakimia suatu analit. Tujuan utama penggunaan derivatisasi pada HPLC adalah untuk: 1. 2. Meningkatkan deteksi Merubah struktur molekul atau polaritas analit sehingga akan menghasilkan puncak kromatografi yang lebih baik

3. 4.

Merubah matriks sehingga diperoleh pemisahan yang lebih baik Menstabilkan analit yang sensitif.5)

Detektor yang paling banyak digunakan dalam HPLC adalah detektor UV-Vis sehingga banyak metode yang dikembangkan untuk memasang atau menambahkan gugus kromofor yang akan menyerap cahaya pada panjang gelombang tertentu. Di samping itu, juga dikembangkan suatu metode untuk menghasilkan fluorofor (senyawa yang mamapu berfluoresensi) sehingga dapat dideteksi dengan fluorometri.7) Suatu reaksi derivatisasi harus mempunyai syarat-syarat sebagai berikut, yakni: produk yang dihasilkan harus mampu menyerap baik sinar ultraviolet atau sinar tampak atau dapat membentuk senyawa berfluoresen sehingga dapat dideteksi dengan spektrofluorometri; proses derivatisasi harus cepat dan menghasilkan produk yang sebesar mungkin (100 %); produk hasil derivatisasi harus stabil selama proses derivatisasi dan deteksi; serta sisa pereaksi untuk derivatisasi harus tidakmenganggu pemisahan kromatografi.7) Berbagai macam bahan penderivat telah tersedia antara lain : Gugus fungsional Reagen untuk dapat dideteksi Reagen untuk dapat dengan UV-Vis dideteksi dengan Fluoresen Asam-asam kaboksilat; asamasam lemak;asamasam fosfat p-nitrobenzil-N,Ndiisopropilisourea (PNBDI); 3,5dinitrobenzil-N,Ndiisopropilisourea (DNBDI); pbromofenasil bromida (PBPB) 3,5-dinitrobenzil klorida (DNBC); 4dimetilaminiazobenzen-4-sulfinil (Dabsyl-Cl); 1-naftilisosianat (NIC-1). p-nitrobenziloksiamin hidroklorida (PNBA); 3,5-dinitrobenziloksiamin hidroklorida (DNBA); Dansil hidrazin 4-bromometil-7asetoksikumarin; 4-bromometil-7metoksikumarin;

Alkohol

Aldehid; keton

Amin primer

Fluoresamin o-ftalaldehid (OPA)

Amin primer (1 ) dan o sekunder (2 )

3,5-dinitrobenzil klorida (DNBC);Nsuksinimidil-p-nitrofenilasetat (SNPA);N-suksinimidil-3,5dinitrofenilasetat (SDNPA); 4dimetilaminiazobenzen-4-sulfinil (Dabsyl-Cl); 1-naftilisosianat (NIC-1). 4-dimetilaminiazobenzen-4-sulfinil (Dabsil-Cl)

7-kloro-4-nitrobenzo-2-oksa1,3-diazol (NBD-Cl); 7-fluoro4-nitrobenzo-2-oksa-1,3diazol (NBD-F); Dansil klorida

Asam-asam amino (peptida)

Fluoresamin o-ftalaldehid (OPA) 7-kloro-4-nitrobenzo-2-oksa1,3-diazol (NBD-Cl); 7-fluoro4-nitrobenzo-2-oksa-1,3-

diazol (NBD-F); Derivatisasi ini dapat dilakukan sebelum analit memasuki kolom (pre-column derivatization) atau setelah analit keluar dari kolom (post-column derivatization).

Referensi: 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. Settle, F (Editor), 1997, Handbook of Instrumental Techniques for Analytical Chemistry, Prentice Hall PTR, New Jersey, USA. Meyer, F.R., 2004, Practical High-Performance Liquid Chromatography, 4thEd., John Wiley & Sons, New York. Kealey, D and Haines, P.J., 2002, Instant Notes: Analytical Chemistry, BIOS Scientific Publishers Limited, New York. Kenkel, J., 2002, Analytical Chemistry for Technicians, 3th. Edition., CRC Press, U.S.A. Snyder, L. R., Kirkland, S.J., and Glajch, J.L., 1997, Practical HPLC Method Development, John Wiley & Son, New York. Munson, J.W., 1981, Phrarmaceutical Analysis: Modern Methods, Part A and B, diterjemahkan oleh Harjana dan Soemadi, Airlangga University Press, Surabaya. Cserhati, T. And Forgacs, E., 1999, Chromatography in Food science and Technology, Technomic Publishing, Lancaster, Basel.