AAS

A. PENGERTIAN
Spektrofotometri serapan atom merupakan metode analisis yang tepat untuk analisis analit
terutama logam-logam dengan konsentrasi rendah (Pecsok, 1976).
Atomic Absorbtion Spectroscopi (AAS) adalah spektroskopi yang berprinsip pada serapan cahaya
oleh atom. Atomatom menyerap cahaya pada panjang gelombang tertentu, tergantung pada sifat
unsurnya. Cahaya pada panjang gelombang tersebut mempunyai cukup energi untuk mengubah
tingkat elektronik suatu atom. Transisi elektronik suatu unsur bersifat spesifik. Dengan absorbsi
energi, terdapat lebih banyak energi yang akan dinaikkan dari keadaan dasar ke keadaan eksitasi
dengan tingkat eksitasi yang bermacam-macam. Instrumen AAS meliputi Hollow Cathode Lamp
sebagai sumber energi, flame untuk menguapkan sampel menjadi atom. Monokromator sebagai filter
garis absorbansi, detektor dan amplifier sebagai pencatat pengukuran. AAS bekerja berdasar pada
penguapan larutan sampel, kemudian logam yang terkandung di dalamnya diubah menjadi atom
bebas. Atom tersebut mengabsorbsi radiasi dari sumber cahaya yang dipancarkan oleh lampu katoda
(Hollow Cathode Lamp) yang mengandung energi radiasi yang sesuai dengan energi yang diperlukan
untuk transisi elektron atom. Hollow Cathode Lamp sebagai sumber sinar pada AAS akan
menghilangkan kelemahan yang disebabkan oleh self absorbsi yaitu kecenderungan atom-atom pada
ground state untuk menyerap energi yang dipancarkan oleh atom tereksitasi ketika kembali ke
keadaan ground state.
Beberapa logam yang terkandung dalam sampel dapat ditentukan secara langsung dengan
menggunakan AAS, tetapi ada beberapa gangguan kimia yang menyebabkan sampel harus
diperlakukan khusus terlebih dahulu. Gangguan kimia disebabkan oleh berkurangnya penyerapan
loncatan atom dalam kombinasi molekul dalam flame. Hal ini terjadi karena flame tidak cukup panas
untuk memecah molekul atau pada saat pemecahan atom, dioksidasi segera menjadi senyawa yang
tidak terpecah segera pada temperatur flame. Beberapa gangguan dapat dikurangi atau dihilangkan
dengan penambahan elemen atau senyawa khusus pada larutan sampel. Beberapa gangguan kimia
antara lain:
1. Pembentukan senyawa stabil
Pembentukan senyawa stabil menyebabkan disosiasi analit tidak bercampur. Gangguan kimia ini
dapat diatasi dengan menaikkan suhu nyala, menggunakan zat pembebas (releasing agent) dan
ekstrasi analit atau unsur pengganggu.
2. Ionisasi
Ionisasi dapat dicegah dengan menambahkan ion yang lebih mudah terionisasi untuk menahan
ionisasi analit. Unsur-unsur yang dapat ditentukan dengan AAS lebih dari 60 unsur logam atau
metalloid dengan konsentrasi antara 1 ppm sampai 10 ppm. Setiap unsur logam yang dideteksi
menggunakan AAS mempunyai kondisi optimum yang berbeda-beda.

A. PRINSIP KERJA
Metode AAS berprinsip pada absorpsi cahaya oleh atom. Atom-atom menyerap cahaya tersebut
pada panjang gelombang tertentu, tergantung pada sifat unsurnya Spektrometri Serapan Atom (SSA)
meliputi absorpsi sinar oleh atom-atom netral unsur logam yang masih berada dalam keadaan
dasarnya (Ground state). Sinar yang diserap biasanya ialah sinar ultra violet dan sinar tampak. Prinsip
Spektrometri Serapan Atom (SSA) pada dasarnya sama seperti absorpsi sinar oleh molekul atau ion
senyawa dalam larutan.
Hukum absorpsi sinar (Lambert-Beer) yang berlaku pada spektrofotometer absorpsi sinar ultra
violet, sinar tampak maupun infra merah, juga berlaku pada Spektrometri Serapan Atom (SSA).
Perbedaan analisis Spektrometri Serapan Atom (SSA) dengan spektrofotometri molekul adalah
peralatan dan bentuk spectrum absorpsinya.
Setiap alat AAS terdiri atas tiga komponen yaitu:
1. Unit atomisasi (atomisasi dengan nyala dan tanpa nyala)
2. Sumber radiasi
3. Sistem pengukur fotometri

B. FUNGSI ALAT
Spektrofotometri serapan atom merupakan metode analisis yang tepat untuk analisis analit
terutama logam-logam dengan konsentrasi rendah (Pecsok, 1976).
Keuntungan metode AAS dibandingkan dengan spektrofotometer biasa yaitu spesifik, batas deteksi
yang rendah dari larutan yang sama bisa mengukur unsur-unsur yang berlainan, pengukurannya
langsung terhadap contoh, output dapat langsung dibaca, cukup ekonomis, dapat diaplikasikan pada
banyak jenis unsur, batas kadar penentuan luas (dari ppm sampai %). Sedangkan kelemahannya yaitu
pengaruh kimia dimana AAS tidak mampu menguraikan zat menjadi atom misalnya pengaruh fosfat
terhadap Ca, pengaruh ionisasi yaitu bila atom tereksitasi (tidak hanya disosiasi) sehingga
menimbulkan emisi pada panjang gelombang yang sama, serta pengaruh matriks misalnya pelarut.

SISTEM ATOMISASI
1. SISTEM ATOMISASI NYALA
Secara ideal fungsi dari sistem atomisasi (source) adalah:
a. Mengubah sembarang jenis sampel menjadi uap atom fasa-gas dengan sedikit perlakuan atau
tanpa perIakuan awal.
b. Meakukan seperti pada point 1) untuk semua elemen (unsur) dalam sampel pada semua level
konsentrasi.
c. Agar diperoleh kondisi operasi yang identik untuk setiap elemen dan sampel.
d. Mendapatkan sinyal analitik sebagai fungsi sederhana dari konsentrasi tiap-tiap elemen. yakni
agar gangguan(interfererisi) dan penganih matriks (media) sampel menjadi minimal.
e. Memberikan analisis yang teliti (precise) dan tepat (accurate).
f. Mendapatkan harga beli, perawatan dan pengoperasian yang murah.
g. Memudahkan operasi.
2. SISTEM ATOMISASI DENGAN ELEKTROTHERMAL (TUNGKU)
Sistem nyala api ini lebih dikenal dengan nama GFAAS. GFAAS dapat mengatasi kelemahan dari
sistem nyala seperti, sensitivitas, jumlah sampel dan penyiapan sampel. Ada tiga tahap atomisasi
dengan tungku yaitu:
a. Tahap pengeringan atau penguapan larutan
b. Tahap pengabuan atau penghilangan senyawa-senyawa organik dan
c. Tahap atomisas
Unsur-unsur yang dapat dianalsis dengan menggunakan GFAAS adalah sama dengan unsur-
unsur yang dapat dianalisis dengan sistem nyala. Beberapa unsur yang sama sekali tidak dapat
dianalisis dengan GFAAS adalah tungsten, Hf, Nd, Ho, La, Lu, Os, Br, Re, Sc, Ta, U, W, Y dan
Zr, hal ini disebabkan karena unsur tersebut dapat bereaksi dengan graphit.
Jangan menggunakan media klorida, lebih baik gunakan nitrat 2. Sulfat dan fosfat bagus untuk
pelarut sampel, biasanya setelah sampel ditempatkan dalam tungku. Gunakan cara adisi sehingga
bila sampel ada interferensi dapat terjadi pada sampel dan standard.

METODE ANALISIS
Ada tiga teknik yang biasa dipakai dalam analisis secara spektrometri. Ketiga teknik tersebut adalah :
 1. Metoda Standar Tunggal
Metoda sangat praktis karena hanya menggunakan satu larutan standar yang telah diketahui
konsentrasinya (Cstd). Selanjutnya absorbsi larutan standar (Asta) dan absorbsi larutan sampel
(Asmp) diukur dengan Spektrofotometri.
2. Metode Kurva Kalibrasi

Dalam metode ini dibuat suatu seri larutan standar dengan berbagai konsentrasi dan absorbansi dari
larutan tersebut diukur dengan AAS Langkah selanjutnya adalah membuat grafik antara konsentrasi
(C) dengan Absorbansi (A) yang akan merupakan garis lurus melewati titik nol. dengan slope = b atau
slope = a.b. Konsentrasi larutan sampel dapat dicari setelah absorbansi larutan sampel diukur dan
diintrapolasi ke dalam kurva kalibrasi atau dimasukkan ke dalam persamaan garis lurus yang
diperoleh dengan menggunakan program regresi linear pada kurva kalibrasi.

3. Metoda Adisi Standar

Metoda ini dipakai secara luas karena mampu meminimalkan kesalahan yangdisebabkan oleh
perbedaan kondisi lingkungan (matriks) sampel dan standar.Dalam metoda ini dua atau lebih sejumlah
volume tertentu dari sampel dipindahkan ke dalam labu takar. Satu larutan diencerkan sampat volume
tertentu kemudian diukur absorbansinya tanpa ditambah dengan zat standar, sedangkan larutan yang
lain sebelum diukur absorbansinya ditambah terlebih dulu dengan sejumlah tertentu tarutan standar
dan diencerkan seperti pada larutan yang pertama. Menurut hukum Beer akan berlaku hal-hal berikut :
Ax = k.Cx AT = k(Cs + Cx)
Dimana.,
Cx = konsentrasi zat sampel
Cs = konsentrasi zat standar yang ditambahkan ke larutan sampe
Ax = Absorbansi zat sampel (tanpa penambahan zat standar)
Ar = Absorbansi zat sampel + zat standar
Jika kedua persarnaan diatas digabung akan diperoleh:
Cx = Cs x {Ax/(AT - Ax)}
Konsentrasi zat dalam sampel (Cx) dapat dihitung dengan mengukur Ax dan AT dengan
spektrofotometer. Jika dibuat suatu seri penambahan zat standar dapat pula dibuat suatu grafik antara
AT lawan Cs, garis lurus yang diperoleh diekstrapolasi ke AT = 0, sehingga diperoleh.
Cx = Cs x {Ax/(O - Ax)} ; Cx = Cs x (Ax /-Ax)
Cx = Cs x ( -1) atau Cx = - Cs

C. CARA KERJA
Sebelum penekanan power switch :
a. Display switch ke check
b. Scan speed switch ke manual
c. Ekspansi knop skala 1,00 (x1)
d. A.A Zero skala 10,00
e. Mode ke FE
f. Lamp current ke skala 0
g. FE Zero ke arah jarum jam (habis)

Sebelum pengaliran gas :

a. Pilih jenis gas yang akan digunakan
b. Buang air pada tangki air, bila diatas level yang ditentukan (perhatikan volume tangki sedikit diatas
garis strip)
c. Putar presurre control berlawanan arah sampai %
d. Flame monitor ke on-of
e. Level monitor ke udara
f. Atur flow gas yang dipakai : udara.

Menghidupkan lampu katoda :

a. Tekan power switch ke ON
b. Pasang lampu dan sesuaikan ke tempatnya
c. Longgarkan skrupnya dan atur sehinnga posisi lampu lurus ke poros opticalnya.
d. Sesuaikan lampu current menurut yang dikehendaki
e. Setelah pengaturan panjang gelombang dan slit width tepatkan pada posisi lampu sehingga skala
meteran maximum.
f. Lampu dapat digunakan untuk analisa setelah pemanasan 10 menit mengaturan slit width dan
panjang gelombang :
pengaturan slit width dan panjang gelombang :
a. Atur response 1
b. Atur slit width menurut yang dikehendaki
c. Atur A.a Zero antara 3, 5-4-3
d. Tepatkan dengan FE Zero kontrol, sehingga skala meteran pembacaan dibawah 100 (=80) lampu z
monitor seperti padam.
e. Putar perlahan-lahan panjang gelombang sehingga diperoleh harga maximum pada skala
pembacaan
Ignisi :
a. Perhatikan kembali skala-skala pengaliran gas, sesuaikan dengan tabel.
b. Putar flow kontrol sesuai arah jam (habis) dan akan terlihat knop warna merah.
c. Tekan ignisi sehingga terbentuk nyala.
d. .Atur nyala sehingga tingginya sesuai dengan memutar pengatur knop udara

Pengukuran :
a. Putar mode switch dari FE ke AA
b. Sambil mengaspirasikan solvent (air) display ke check tepatkan dengan AA Zero sehinnga skala
meteran menunjukkan antara 0-100 (=75). Maka zero monitor menjadi padam.
c. Putar display ke average 1, jika pada saat itu skala meteran diluar normal (-) tekan zero set.
d. Sambil aspirasi air, check sinar zero monitor jika tidak terang maka tekan zero set, secara continiu
aspirasi solvent sehingga zero set menjadi padam. Jika sinar zero monitor terang atur dengan AA zero
dengan aspirasi air sehingga air menjadi padam dan tekan zero set.
e. Aspirasi sampel dan tekan average start.
f. Sesudah average start padam, stop aspirasi dan tekan zero set baca skala pembacaan absorbansi.

Pemadaman Nyala :
a. .Aspirasi air -10 untuk membersihkan burner
b. Putar OFF preassure monitor dan flame monitor
c. tutup klran C2H2dan udara OFF
d. Putar preassure control sesuai lawan arah jarum jam(3/4)habis)
e. Tekan extinguish sampai skala meteran 0 stop nyala
f. Atur
 - Expansi ke 1
- Display check ke check 1
- Mode switch ke FE 2
g. Putar lamp current ke 0 untuk memadamkan lampu katoda
h. Tekan power ke OFF

D. CARA KALIBRASI
1. Cara Biasa
Kurva kalibrasi dengan cara biasa ada 2 jenis yaitu :
Konsentrasi mencakup seluruh daerah kerja (working range).
Konsentrasi larutan kalibrasi mencakup sebagian daerah kerja (hanya yang linier).
Prosedur : sama dengan pekerjaan penentuan batas daerah kerja.
Catatan : jangan sampai terjadi perbedaan absorban yang > 0,01 unit antara 2 hasil pengukuran, Bila
ini terjadi, berarti presisi menurun.

2. Cara Adisi Standar

Sediakan 5 buah labu takar yang sama ukurannya.
Pipet X mL larutan contoh yang akan diukur ke dalam labu takar no 1 4.
Pipet X mL air ke dalam labu takar no. 5.
Pipet X mL larutan standar analit Z yang :
0 ppm Z ke dalam labu takar no. 1 dan 5.
a ppm Z ke dalam labu takar no. 2.
2a ppm Z ke dalam labu takar no. 3.
3a ppm Z ke dalam labu takar no. 4
Tambahkan asam bila perlu (biasanya HNO3, atau lainnya), tambahkan air hingga tanda batas.
Homogenkan larutan dengan baik, ukur absorban dengan AAS.
Buat grafik standar adisi, kemudian tentukan Cz konsentrasi analit Z

Catatan : labu takar no. 5 digunakan untuk set zero setiapkali larutan kalibrasi akan diukur.
3. Cara High Precision Ratio (Bracketing).

E. CARA MAINTENANCE
Sebelum analisis logam dengan AAS dilakukan, terlebih dahulu pengaturan kondisioperasi alat
sehingga diperoleh kondisi analisis yang optimum. Secara garis besar langkah-langkah kerka berikut
dibawah ini:A. Pemeriksaan instrumen dan perlengkapannya
1) Periksa dan pastikan drain pot terisi air destilat.
2) Periksa dan pastikan koneksi antara tiap-tiap unit instrumen ( Unit utama AAS, PCdan Printer )
terhubung dengan benar .
3) Periksa apakah pembakar ( burner ) sudah terpasang sesuai dengan Standar Pemakaian Burner untuk
Analisis dengan AAS Hitachi Z-5000. Bila burner belumterpasang, lakukan pemasangan salah satu
burner tersebut sesuai dengan Prosedur.
Petunjuk praktis penggunaan GFAAS:
1. Jangan menggunakan media klorida, lebih baik gunakan nitrat
2. Sulfat dan fosfat bagus untuk pelarutsampel, biasanya setelah sampel ditempatkan dalam
tungku.
3. Gunakan cara adisi sehingga bila sampel ada interfensi dapat terjadi pada sampel dan standar.
4. Untuk mengubah unsur metalik menjadi uap atau hasil disosiasi diperlukan energy panas.
Temperatur harus benar-benar terkendali dengan sangat hati-hati agar proses atomisasinya sempurna.
 Ionisasi harus dihindarkan dan ionisasi ini dapat terjadi apabila temperatur terlampau tinggi. Bahan
bakar dan oksidator dimasukkan dalam kamar pencamput kemudian dilewatkan melalui baffle menuju
ke pembakar. Hanya tetesan kecil dapat melalui baffle. Tetapi kondisi ini jarang ditemukan, karena
terkadang nyala tersedot balik ke dalam kamar pencampur sehingga menghasilkan ledakan. Untuk itu
biasanya lebih disukai pembakar dengan lubang yang sempit dan aliran gas pembakar serta oksidator
dikendalikan dengan seksama.
5. Dengan gas asetilen dan oksidator udara bertekanan, temperature maksimum yang dapat
tercapai adalah 1200oC. untuk temperatur tinggi biasanya digunakan N:O: = 2:1 karena banyaknya
interfensi dan efek nyala yang tersedot balik, nyala mulai kurang digunakan, sebagai gantinya
digunakan proses atomisasi tanpa nyala, misalnya suatu perangkat pemanas listrik. Sampel sebanyak
1-2 ml diletakkan pada batang grafit yang porosnya horizontal atau pada logam tantalum yang
berbentuk pipa. Pada tungku grafit temperatur dapat dikendalikan secara elektris. Biasanya temperatur
dinaikkan secara bertahap, untuk menguapkan dan sekaligus mendisosiasi senyawa yang dianalisis.

F. BAGIAN-BAGIAN ALAT

a. Lampu Katoda
Lampu katoda merupakan sumber cahaya pada AAS. Lampu katoda memiliki masa pakai atau umur
pemakaian selama 1000 jam. Lampu katoda pada setiap unsur yang akan diuji berbeda-beda
tergantung unsur yang akan diuji, seperti lampu katoda Cu, hanya bisa digunakan untuk pengukuran
unsur Cu.
a. Tabung Gas
Tabung gas pada AAS yang digunakan merupakan tabung gas yang berisi gas asetilen. Gas asetilen
pada AAS memiliki kisaran suhu 20000K, dan ada juga tabung gas yang berisi gas N2O yang lebih
panas dari gas asetilen, dengan kisaran suhu 30000K.
b. Ducating
Ducting merupakan bagian cerobong asap untuk menyedot asap atau sisa pembakaran pada AAS,
yang langsung dihubungkan pada cerobong asap bagian luar pada atap bangunan, agar asap yang
dihasilkan oleh AAS, tidak berbahaya bagi lingkungan sekitar. Asap yang dihasilkan dari pembakaran
pada AAS, diolah sedemikian rupa di dalam ducting, agar polusi yang dihasilkan tidak berbahaya.
c. Kompresor
Kompresor merupakan alat yang terpisah dengan main unit, karena alat iniberfungsi untuk mensuplai
kebutuhan udara yang akan digunakan oleh AAS, pada waktu pembakaran atom.
d. Burner
Burner merupakan bagian paling terpenting di dalam main unit, karena burner berfungsi sebagai
tempat pancampuran gas asetilen, dan aquabides, agar tercampur merata, dan dapat terbakar pada
pemantik api secara baik dan merata. Lobang yang berada pada burner, merupakan lobang pemantik
api, dimana pada lobang inilah awal dari proses pengatomisasian nyala api.
e. Buangan pada AAS
Buangan pada AAS disimpan di dalam drigen dan diletakkan terpisah pada AAS. Buangan
dihubungkan dengan selang buangan yang dibuat melingkar sedemikian rupa, agar sisa buangan
sebelumnya tidak naik lagi ke atas, karena bila hal ini terjadi dapat mematikan proses
pengatomisasian nyala api pada saat pengukuran sampel, sehingga kurva yang dihasilkan akan terlihat
buruk.
f. Dioda Laser
Spektrokopis penyerapan atom juga dapat dilakukan oleh laser, diode laser terytama karena sifat baik
mereka untuk spektrometri penyerapan sinar laser. Teknik ini kemudian juga disebut sebagao diode
laser spektrometri penyerapan atom (DLAAS atau DLAS), atau, karena panjang gelombang modulasi
yang sering digunakan, spertro metri penyerapan panjang gelombang modulasi.
 GC

A. PENGERTIAN
Kromatografi gas adalah proses pemisahan campuran menjadi komponen-komponennya dengan
menggunakan gas sebagai fase bergerak yang melewati suatu lapisan serapan (adsorben) yang
diam.Kromatografi gas fase gerak dan fase diamnya diantaranya : Fase gerak adalah gas dan zat
terlarut terpisah sebagai uap. Pemisahan tercapai dengan partisi sampel antara fase gas bergerak
Fase diam berupa cairan dengan titik didih tinggi (tidak mudah menguap) yang terikat pada zat padat
penunjangnya Kromatografi gas termasuk dalam salah satu alat analisis (analisis kualitatif dan analisis
kuantitatif), kromatografi gas dijajarkan sebagai cara analisis yang dapat digunakan untuk
menganalisis senyawa-senyawa organik. Telah diketahui bahwa ada dua jenis kromatografi gas, yaitu
kromatografi gas padat (KGP), dan kromatografi gas cair (KGC). Dalam kedua hal ini sebagai fasa
bergerak adalah gas (hingga keduanya disebut kromatografi gas), tetapi fasa diamnya berbeda.
Meskipun kedua cara tersebut mempunyai banyak persamaan. Perbedaan antara keduanya hanya
tentang cara kerja. Pada kromatografi gas padat (KGP) terdapat adsorbsi dan pada kromatografi gas
cair (KGC) terdapat partisi (larutan). Kromatografi gas padat (KGP) digunakan sebelum tahun 1800
untuk memurnikan gas. Metode ini awalnya kurang berkembang. Penemuan jenis-jenis padatan baru
sebagai hasil riset memperluas penggunaan metode ini. Kelemahan metode ini mirip dengan
kromatografi cair padat,sedangkan kromatografi gas cair sering disebut oleh para pakar kimia organik
sebagai kromatografi fasa uap. Pertama kali dikenalkan oleh James dan Martin pada tahun 1952.
Metode ini paling banyak digunakan karena efisien, serba guna, cepat dan peka. Cuplikan dengan
ukuran beberapa mikrogram sampel dengan ukuran 10 gram masih dapat dideteksi. Komponen
cuplikan harus mempunyai tekanan beberapa torr pada suhu kolom.(Underwood,2004) 3
B. PRINSIP KERJA
Kromatografi gas (GC) merupakan jenis kromatografi yang digunakan dalam kimia organik untuk
pemisahan dan analisis. GC dapat digunakan untuk menguji kemurnian dari bahan tertentu, atau
memisahkan berbagai komponen dari campuran. Dalam beberapa situasi, GC dapat membantu dalam
mengidentifikasi sebuah senyawa kompleks.
Dalam kromatografi gas, fase yang bergerak (atau "mobile phase") adalah sebuah operator gas, yang
biasanya gas murni seperti helium atau yang tidak reactive seperti gas nitrogen. Stationary atau fasa
diam merupakan tahap mikroskopis lapisan cair atau polimer yang mendukung gas murni, di dalam
bagian dari sistem pipa-pipa kaca atau logam yang disebut kolom. Instrumen yang digunakan untuk
melakukan kromatografi gas disebut gas chromatograph (atau "aerograph", "gas pemisah").

C. FUNGSI ALAT
1. Untuk identifikasi senyawa
Dengan suatu kolom tertentu dan dengan semua fariabelnya seperti temperatur dan laju alir,
dikendalikan secara cermat, waktu retensi atau volume retensi suatu zat terlarut merupakan suatu
besaran dari zat terlarut tersebut, seperti halnya titk didih atau halnya indek bias adalah besaran. Ini
menunjukkan bahwa sifat retensi dapat digunakan untuk mengetahui suatu senyawa.
2. Analisis kuantitatif
Dengan GC tergantung pada hubungan antara jumlah suatu zat terlarut dan ukuran dari pita elusi yang
dihasilkan. Secara umum dengan detektor diferensial, ukuran jumlah zat terlarut yang paling baik
adalah luas dibawah pita elusi. Jumlah zat terlarut = faktor kalibrasi x luas dibawah pita elusi.
Keterbasan GC adalah volatilitas sampel itu harus mempunyai tekanan uap yang cukup pada
temperatur kolom tersebut, dan ini segera menghilangkan banyak jenis sampel. Suatu perhitungan
yang aktual tidak mungkin dilakukan tetapi harus diperkirakan bahwa sekitar 20% senyawa kimia
 yang diketahui kurang cukup volatil.kebanyakan sampel organik tidak cukup volatil untuk
memungkinkan penerapan langsung dari GC.
Sampel yang dapat dianalisis dengan GC diantaranya adalah :
1. Produk Gas Alam
2. Kemurnian Pelarut
3. Asam Lemak
4. Residu Pestisida
5. Polusi Udara
6. Alkohol
7. Steroid
8. Minyak Atsiri
9. Flavor
10. Ganja (mariyuana)

D. CARA KERJA
1. Mencuci jarum suntik dengan aseton dengan mengisi jarum suntik mendepak sepenuhnya dan
aseton limbah ke kertas handuk. Cuci 2-3 kali.
2. Tarik beberapa sampel Anda ke dalam jarum suntik. Anda mungkin perlu untuk menghilangkan
gelembung udara di dalam tabung suntik oleh plunyer bergerak cepat ke atas dan ke bawah sementara
jarum dalam sampel. Biasanya 1-2 mL sampel disuntikkan ke dalam GC. Boleh saja memiliki
gelembung udara kecil dalam jarum suntik. Namun, Anda tidak ingin menyuntikkan sebagian besar
udara atau puncak Anda akan terlalu kecil pada tabel perekam.
3. Pastikan tabel perekam dan diatur ke kecepatan grafik yang sesuai (Arrow A). Mengatur
baseline menggunakan nol pada tabel perekam (Arrow B). Dengan pena di tempat, menyalakan bagan
(Arrow D), pastikan pena ke bawah (yang menandai kertas) dan kertas bergerak.
4. Menyuntikkan sampel Anda baik ke kolom A atau kolom B sesuai instruksi. Pegang tingkat
jarum suntik dan mendorong jarum sepenuhnya ke injector. Setelah Anda tidak dapat lagi melihat
jarum, dengan cepat mendorong pendorong dan kemudian tarik jarum suntik injeksi keluar dari
pelabuhan.

Injeksi Catatan : injector sangat panas, jadi berhati-hatilah untuk tidak menyentuh perak disk. Jarum
akan melewati septum karet, sehingga Anda akan merasa beberapa perlawanan. Untuk beberapa GC
kita itu, kolom tidak menyelaraskan benar dalam injector, sehingga jarum hits bagian depan kolom
logam. Jika Anda merasa bahwa Anda mendorong terhadap logam, menarik jarum keluar dari injector
dan coba lagi, mungkin di sudut yang sedikit berbeda. Jarum harus benar-benar menghilang ke dalam
injeksi untuk injeksi yang tepat sampel ke kolom GC.Suntikkan dengan cepat untuk hasil terbaik.
Jangan ragu untuk menyuntikkan jarum setelah benar diposisikan di pelabuhan injeksi.Lepaskan
jarum suntik segera setelah injeksi. (Pelaksanaan catatan C dan D membantu untuk memastikan
bahwa semua sampel memasuki GC kolom di sekitar waktu yang sama.)
5. Menandai waktu injeksi Anda pada tabel perekam. Ini dapat dilakukan dengan menyesuaikan
nol tepat setelah sampel disuntikkan. Hal ini sering nyaman bagi satu orang untuk menyuntikkan
sampel sementara pasangan laboratorium menandai waktu injeksi di bagan perekam.
6. Bersihkan jarum suntik Anda segera setelah injeksi. Jarum suntik sering tersumbat dengan cepat
dan harus diganti jika mereka tidak dibersihkan setelah setiap penggunaan.
7. Catatan pengaturan perekam grafik Anda selama berjalan. Anda perlu mengetahui kecepatan
grafik dan pengaturan skala penuh.
8. Catatan pengaturan GC selama Anda berlari. Sebuah tombol di bagian tengah bawah GC dapat
diubah untuk membaca kolom (atau oven) suhu, suhu detektor dan suhu injektor pelabuhan dalam
 C. Jembatan saat ini ditampilkan dalam mA. Perhatikan bahwa ada dua skala pada layar. Berhati-hati
untuk membaca skala yang tepat!
E. CARA KALIBRASI DAN MAINTENANCE
Berikut adalah beberapa langkah yang mungkin bisa diterapkan dalam proses pemeliharaan dan
perawatan terhadap instrumen gas kromatografi:
1. Instrumen perlu diperiksa terlebih jika tidak dipakai secara terus menerus.
2. Salah satu pemeriksaannya mungkin bisa dilakukan pada kolom guna mengetahui apakah ada lubang
besar atau kebocoran akibat sering dipakai.
3. Selain itu, sambungan gas kedap perlu dicheck apakah tutup tanur tertutup rapat serta memastikan
bagian listrik masih bekerja secara optimal dan pastikan detektor terpasang dengan benar.
4. Selanjutnya kita mulai mengalirkan gas ke kolom dengan cara mmbuka katup utama pada tangki gas.
5. Jika instrumen sudah lebih canggih lagi teknologinya maka aliran gas bisa diatur secara aliran
otomatis ata pengendali tekanan.
6. Dalam mendeteksi kebocoran kita bisa menggunakan larutan sabun dan kolom akan dipanaskan
sampai suhu awal yang dikehendaki.
7. Apabila terjadi sesuatu maka menghubungi petugas kalibrasi dan maintenance.

F. BAGIAN-BAGIAN ALAT

1. Fase Mobil (Gas Pembawa).

Fasa mobil (gas pembawa) dipasok dari tanki melalui pengaturan pengurangan tekanan.
Kemudian membawa cuplikan langsung ke dalam kolom. Jika hal ini terjadi, cuplikan tidak menyebar
sebelum proses pemisahan. Cara ini cocok untuk cuplikan yang mudah menyerap.

Gas pembawa ini harus bersifat inert dan harus sangat murni. Seringkali gas pembawa ini
harus disaring untuk menahan debu uap air dan oksigen. Gas sering digunakan adalah N2, H2 He dan
Ar.

2. Injeksi sampel

Sejumlah kecil sampel yang akan dianalisis diinjeksikan pada mesin menggunakan semprit
kecil. Jarum semprit menembus lempengan karet tebal (Lempengan karet ini disebut septum) yang
mana akan mengubah bentuknya kembali secara otomatis ketika semprit ditarik keluar dari
lempengan karet tersebut.

Injektor berada dalam oven yang mana temperaturnya dapat dikontrol. Oven tersebut cukup
panas sehingga sampel dapat mendidih dan diangkut ke kolom oleh gas pembawa misalnya helium
atau gas lainnya.
 Fase bergerak dalam kromatografi ini adalah gas, yang paling lazim adalah helium, hidrogen,
atau nitrogen. Kompenen pilihan gas spembawa terutama tergantung pada karakteristik detektor.
Kromatografi gas komersial biasanya menyediakan katup pengatur tambahan untuk pengendalian
tekanan yang baik pada inlet kolom. Dekat inlet kolom ada suatu alat dimana sampel-sampel dapat
dimasuukan kedalam aliran gas pembawa. Sampel-sampel tersebut bisa berupa gas atau cairan yang
mudah menguap. Lubang injeksi dipanaskan agar sampel cair teruapkan dengan cepat.

3. Kolom

Aliran gas selanjutnya menemui kolom yang diletakkan dalam oven bertemperatur konstan.
Ini adalah jantung instrumen tesebut, tempat dimana proses kromartgrafi dasar berlangsung. Kolom
memilki variasi dalam hal ukuran dan bahan isian. Tabung diisi dengan bahan padat halus dengan luas
permukaan besar yang relatif inert. Padatan iitu sebenarnya hanya sebuah penyangga mekanik untuk
cairan, sebelum diisi kedalam kolom, padatan tersebut diimpregnasi dengan cairan yang diinginkan
yang berpareran sebagai fasa stasioner sesungguhnya. Cairan ini harus stabil dan nonfolatil pada
temperatur kolom, pemisahan dan harus sesuai untuk pemisahan tertentu.

Ada dua tipe utama kolom dalam kromatografi gas-cair. Tipe pertama, Kolom Partisi, berisi
bahan padat inert menyangga lapisan tipis cairan, disebut Chromatography Gas Cair (GLC); Tipe
kedua, Kolom Adsorbsi, berisi partikel penyerap yang umumnya digunakan untuk analisa gas
permanen dan hydrokarbon rendah, biasa disebut Chromatography Gas Padat (GSC).

Kolom biasanya dibuat dari baja tak berkarat dengan panjang antara 1 sampai 4 meter, dengan
diameter internal sampai 4 mm. Kolom digulung sehingga dapat disesuakan dengan oven yang
terkontrol secara termostatis.Kolom dipadatkan dengan tanah diatomae, yang merupakan batu yang
sangat berpori. Tanah ini dilapisis dengan cairan bertitik didih tinggi, biasanya polimer lilin.

Temperatur kolom

Temperatur kolom dapat bervariasi antara 50 oC sampai 250 oC. Temperatur kolom lebih
rendah daripada gerbang injeksi pada oven, sehingga beberapa komponen campuran dapat
berkondensasi pada awal kolom. Kolom memulai pada temperatur rendah dan kemudian terus
menerus menjadi lebih panas dibawah pengawasan komputer saat analisis berlangsung.

Proses pemisahan pada kolom

Ada tiga hal yang dapat berlangsung pada molekul tertentu dalam campuran yang
diinjeksikan pada kolom:

Molekul dapat berkondensasi pada fase diam.

Molekul dapat larut dalam cairan pada permukaan fase diam

Molekul dapat tetap pada fase gas

Dari ketiga kemungkinan itu, tak satupun yang bersifat permanen.Senyawa yang mempunyai
titik didih yang lebih tinggi dari temperatur kolom secara jelas cenderung akan berkondensasi pada
bagian awal kolom. Namun, beberapa bagian dari senyawa tersebut akan menguap kembali dengan
dengan jalan yang sama seperti air yang menguap saat udara panas, meskipun temperatur dibawah
1000C. Peluangnya akan berkondensasi lebih sedikit selama berada didalam kolom.

Sama halnya untuk beberapa molekul dapat larut dalam fase diam cair. Beberapa senyawa akan
lebih mudah larut dalam cairan dibanding yang lainnya. Senyawa yang lebih mudah larut akan
 menghabiskan waktunya untuk diserap pada fase diam: sedangkan senyawa yang suka larut akan
menghabiskan waktunya lebih banyak dalam fase gas.

Proses dimana zat membagi dirinya menjadi dua pelarut yang tidak bercampurkan karena
perbedaan kelarutan, dimana kelarutan dalam satu pelarut satu lebih mudah dibanding dengan pelarut
lainnya disebut sebagai partisi. Sekarang, anda bisa beralasan untuk memperdebatkan bahwa gas
seperti helium tidak dapat dijelaskan sebagai pelarut. Tetapi, istilah partisi masih dapat digunakan
dalam kromatografi gas-cair.

Substansi antara fase diam cair dan gas. Beberapa molekul dalam substansi menghabiskan
waktu untuk larut dalam cairan dan beberapa lainnya menghabiskan waktu untuk bergerak bersama-
sama dengan gas.

4. Detektor

Setelah muncul dari kolom itu, aliran gas lewat melalui sis lain detektor. Maka elusi zat
terlarut dari kolom itu mengatur ketidakseimbangan antaradua sisi detektor yang direkam secara
elektrik. Laju aliran gas pembawa adalah hal yang sangat penting, dan biasanya pengukur aliran untuk
itu tersedia. Secara normal gas-gas yang muncul dialirkan keluar pada tekanan atmosfir. Karena
pekerja laboratorium secara terus menerus terpapar oleh uap senyawa-senyawa yang terkromatogafi
yang mungkin tak baik walaupun kadarnya biasanya kecil maka ventilasi pada keluaran instrumen
harus diperhatikan. Ketentuan bisa dibuat untuk menjebak zat terlarut yang dipisahkan setelah muncul
dari kolom jika hal ini dibutuhkan untuk penyelidikan lebih lanjut.

Ada beberapa tipe detektor yang biasa digunakan. Detektor ionisasi nyala dijelaskan pada
bagian bawah penjelasan ini, merupakan detektor yang umum dan lebih mudah untuk dijelaskan
daripada detektor alternatif lainnya.

Detektor ionisasi nyala

Dalam mekanisme reaksi, pembakaran senyawa organik merupakan hal yang sangat
kompleks. Selama proses, sejumlah ion-ion dan elektron-elektron dihasilkan dalam nyala. Kehadiran
ion dan elektron dapat dideteksi.

Seluruh detektor ditutup dalam oven yang lebih panas dibanding dengan temperatur kolom.
Hal itu menghentikan kondensasi dalam detektor.

Jika tidak terdapat senyawa organik datang dari kolom, anda hanya memiliki nyala hidrogen yang
terbakar dalam air. Sekarang, anggaplah bahwa satu senyawa dalam campuran anda analisa mulai
masuk ke dalam detektor.
 Ketika dibakar, itu akan menghasilkan sejumlah ion-ion dan elektron-elektron dalam nyala.
Ion positif akan beratraksi pada katoda silinder. Ion-ion negatif dan elektron-elektron akan beratraksi
pancarannya masing-masing yang mana merupakan anoda.Hal ini serupa dengan apa yang terjadi
selama elektrolisis normal.

Pada katoda, ion positif akan mendatangi elektron-elektron dari katoda dan menjadi netral.
Pada anoda, beberapa elektron dalam nyala akan dipindahkan pada elektroda positif; ion-ion negatif
akan memberikan elektron-elektronnya pada elektroda dan menjadi netral.

Kehilangam elektron-elektron dari satu elektroda dan perolehan dari elektroda lain, akan
menghasilkan aliran elektron-elektron dalam sirkuit eksternal dari anoda ke katoda. Dengan kata lain,
anda akan memperoleh arus listrik.

Arus yang diperoleh tidak besar, tetapi dapat diperkuat. Jika senyawa-senyawa organik lebih
banyak dalam nyala, maka akan banyak juga dihasilkan ion-ion, dan dengan demikian akan terjadi
arus listrik yang lebih kuat. Ini adalah pendekatan yang beralasan, khususnya jka anda berbicara
tentang senyawa-senyawa yang serupa, arus yang anda ukur sebanding dengan jumlah senyawa dalam
nyala.

Kekurangan utama dari detektor ini adalah pengrusakan setiap hasil yang keluar dari kolom
sebagaimana yang terdeteksi. Jika anda akan mengrimkan hasil ke spektrometer massa, misalnya
untuk analisa lanjut, anda tidak dapat menggunakan detektor tipe ini.

5. Pencatat (Recorder)

Fungsi recorder sebagai alat untuk mencetak hasil percobaan pada sebuah kertas yang
hasilnya disebut kromatogram (kumpulan puncak grafik).

Hasil akan direkam sebagai urutan puncak-puncak; setiap puncak mewakili satu senyawa
dalam campuran yang melalui detektor. Sepanjang anda mengontrol secara hati-hati kondisi dalam
kolom, anda dapat menggunakan waktu retensi untuk membantu mengidentifikasi senyawa yang
tampak-tentu saja anda atau seseorang lain telah menganalisa senyawa murni dari berbagai senyawa
pada kondisi yang sama.

Area dibawah puncak sebanding dengan jumlah setiap senyawa yang telah melewati detektor,
dan area ini dapat dihitung secara otomatis melalui komputer yang dihubungkan dengan monitor.
Area yang akan diukur tampak sebagai bagian yang berwarna hijau dalam gambar yang
disederhanakan.
 Perlu dicatat bahwa tinggi puncak tidak merupakan masalah, tetapi total area dibawah
puncak. Dalam beberapa contoh tertentu, bagian kiri gambar adalah puncak tertinggi dan memiliki
area yang paling luas. Hal ini tidak selalu merupakan hal seharusnya..

Mungkin saja sejumlah besar satu senyawa dapat tampak, tetapi dapat terbukti dari kolom
dalam jumlah relatif sedikit melalui jumlah yang lama. Pengukuran area selain tinggi puncak dapat
dipergunakan dalam hal ini.

Waktu retensi

Waktu yang digunakan oleh senyawa tertentu untuk bergerak melalui kolom menuju ke
detektor disebut sebagi waktu retensi. Waktu ini diukur berdasarkan waktu dari saat sampel
diinjeksikan pada titik dimana tampilan menunujukkan tinggi puncak maksimum untuk senyawa itu.

Setiap senyawa memiliki waktu retensi yang berbeda. Untuk senyawa tertentu, waktu retensi
sangat bervariasi dan bergantung pada: Titik didih senyawa. Senyawa yang mendidih pada temperatur
yang lebih tinggi daripada temperatur kolom, akan menghabiskan hampir seluruh waktunya untuk
berkondensasi sebagai cairan pada awal kolom. Dengan demikian, titik didih yang tinggi akan
memiliki waktu retensi yang lama.

Kelarutan dalam fase cair. Senyawa yang lebih mudah larut dalam fase cair, akan mempunyai
waktu lebih singkat untuk dibawa oleh gas pembawa.. Kelarutan yang tinggi dalam fase cair berarti
memiiki waktu retensi yang lama.

Temperatur kolom. Temperatur tinggi menyebakan pergerakan molekul-molekul dalam fase

gas; baik karena molekul-molekul lebih mudah menguap, atau karena energi atraksi yang tinggi cairan
dan oleh karena itu tidak lama tertambatkan. Temperatur kolom yang tinggi mempersingkat waktu
retensi untuk segala sesuatunya di dalam kolom.

Untuk memberikan sampel dan kolom, tidak ada banyak yang bisa dikerjakan menggunakan
titik didih senyawa atau kelarutannya dalam fase cair, tetapi anda dapat mempunyai pengatur
temperatur.

Semakin rendah temperatur kolom semakin baik pemisahan yang akan anda dapatkan, tetapi
akan memakan waktu yang lama untuk mendapatkan senyawa karena kondensasi yang lama pada
bagian awal kolom.

Dengan kata lain, menggunakan temperatur tinggi, segala sesuatunya akan melalui kolom
lebih cepat, tetapi pemisihannya kurang baik. Jika segala sesuatunya melalui kolom dalam waktu yang
sangat singkat, tidak akan terdapat jarak antara puncak-puncak dalam kromatogram.

Jawabannya dimulai dengan kolom dengan suhu yang rendah kemudian perlahan-lahan secara
teratur temperaturnya dinaikkan.

Pada awalnya, senyawa yang menghabiskan lebih banyak waktunya dalam fase gas akan melalui
kolom secara cepat dan dapat dideteksi. Dengan adanya sedikit pertambahan temperatur akan
memperjelas perlekatan senyawa. Peningkatan temperatur masih dapat lebih `melekatan` molekul-
molekul fase diam melalui kolom.
 ELISA WASHER

A. PENGERTIAN
ELISA atau singkatan dari Enzyme-linked Immunosorbent Assay merupakan jenis immunoassay (uji
imun) yang telah digunakan secara luas. ELISA merupakan rapid test atau uji cepat dalam mendeteksi
atau mengkuantifikasi jumlah antibodi atau antigen melawan virus, bakteri, atau bahan lain. ELISA
dinamakan demikian karena memang melibatkan penggunaan enzim dan immunosorbent.
Metode ELISA untuk mengukur reaksi Antigen (Ag) Antibodi(Ab) meningkat penggunaannya dalam
pendeteksian antigen (dari agen infeksius) atau antibodi karena metodenya yang sederhana tapi
sensitif. Sensitivitasnya sama dengan radioimmunoassay (RIA) dan hanya membutuhkan kuantitas
mikroliter untuk penggunaan reagen ujinya. Sekarang ELISA telah diterapkan secara luas dalam
deteksi berbagai antibodi dan antigen seperti hormon, toksin, dan virus.
Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) merupakan suatu teknik biokimia untuk mendeteksi
kehadiran antibodi atau antigen dalam suatu sampel. Penggunaan ELISA melibatkan setidaknya satu
antibodi dengan spesifitas untuk antigen tertentu. ELISA terdiri atas tiga macam yaitu Direct ELISA,
Indirect ELISA, dan Sandwich ELISA (Baker dkk. 2007: 211).
Direct ELISA merupakan jenis ELISA yang digunakan untuk mendeteksi dan mengukur konsentrasi
suatu antigen. Antigen yang akan dideteksi akan berikatan langsung (direct) dengan antibodi detector
(antibodi yang telah dilabeli oleh enzim reporter). Antibodi yang digunakan pada teknik direct ELISA
berjumlah satu buah. Kelebihan dari direct ELISA yaitu Cepat dan tidak terdapat Cross Reaksi
dengan antibodi sekunder. Akan tetapi, direct ELISA memiliki kekurangan yaitu harga pelabelan
antibodi primer yang mahal, tidak ada fleksibilitas pemilihan antibodi primer, dan sinyal
amplifikasinya sedikit (Walker & Rapley 2008: 668).
Indirect ELISA merupakan jenis ELISA yang digunakan untuk mendeteksi dan mengukur konsentrasi
antigen atau antibodi. Teknik tersebut memiliki karakteristik yaitu antigen tidak menempel langsung
pada antibodi detector (indirect). Antigen akan berikatan dengan antibodi lain terlebih dahulu.
Antibodi tersebut kemudian akan berikatan dengan antibodi yang telah dilabeli. Kelebihan indirect
ELISA yaitu memiliki sensitivitas tinggi dan sinyal amplifikasi yang tinggi. Kekurangan indirect
ELISA yaitu membutuhkan waktu yang lama dan terjadi cross reaksi terjadi (Walker & Rapley 2008:
669). .
Sandwich ELISA merupakan jenis ELISA yang dapat digunakan untuk mengukur antigen maupun
antibodi,. Karakteristik khas dari sandwich ELISA adalah menggunakan antibodi penangkap atau
primer antibodi. Antigen yang akan dideteksi dan diukur konsentrasinya berikatan terlebih dahulu
dengan antibodi penangkap. Antigen akan berikatan kembali dengan antibodi sesuai jenis sandwich
ELISA yang digunakan. Sandwich ELISA dibagi menjadi dua jenis yaitu sandwich direct ELISA dan
sandwich indirect ELISA (Crowther 1995: 39 43).
Sandwich direct ELISA menggunakan dua antibodi yaitu antibodi penangkap dan antibodi yang
dilabeli enzim. Antigen yang telah berikatan dengan antobodi penangkap akan berikatan kembali
dengan antibodi yang dilabeli enzim. Sandwich indirect ELISA menggunakan tiga antibodi yaitu
antibodi penangkap, antibodi detektor, dan anti-antibodi yang dilabeli enzim. Antigen yang telah
berikatan dengan antibodi penangkap akan berikatan dengan antibodi detektor dan anti-antibodi yang
dilabeli enzim (Crowther 1995: 39). Antigen dalam sandwich ELISA tidak perlu dimurnikan sebelum
digunakan. Sandwich ELISA sangat spesifik sehingga tidak semua antibodi dapat digunakan.

B. PRINSIP KERJA
Pertama antigen atau antibodi yang hendak diuji ditempelkan pada suatu permukaan yang berupa
microtiter. Penempelan tersebut dapat dilakukan melalui dua cara, yaitu penempelan secara non
spesifik dengan adsorbs ke permukaan microtiter, dan penempelan secara spesifik dengan
 menggunakan antibody atau antigen lain yang bersifat spesifik dengan antigen atau antibodi yang
diuji (cara ini digunakan pada teknik ELISA sandwich). Selanjutnya antibodi atau antigen spesifik
yang telah ditautkan dengan suatu enzim signal (disesuaikan dengan sampel => bila sampel berupa
antigen, maka digunakan antibodi spesifik , sedangkan bila sampel berupa antibodi, maka digunakan
antigen spesifik) dicampurkan ke atas permukaan tersebut, sehingga dapat terjadi interaksi antara
antibodi dengan antigen yang bersesuaian. Kemudian ke atas permukaan tersebut dicampurkan suatau
substrat yang dapat bereaksi dengan enzim signal. Pada saat substrat tersebut dicampurkan ke
permukaan, enzim yang bertaut dengan antibodi atau antigen spesifik yang berinteraksi dengan
antibodi atau antigen sampel akan bereaksi dengan substrat dan menimbulkan suatu signal yang dapat
dideteksi. Pda ELISA flourescense misalnya, enzim yang tertaut dengan antibodi atau antigen spesifik
akan bereaksi dengan substrat dan menimbulkan signal yang berupa pendaran flourescense.

C. FUNGSI ALAT
Teknik ELISA pertama kali diperkenalkan pada tahun 1971 oleh Peter Perlmann dan Eva Engvall.
Mereka menggunakan teknik ELISA ini dalam bidang imunologi (ELISA konvensional) untuk
menganalisis interaksi antara antigen dan antibodi di dalam suatu sampel, dimana interaksi tersebut
ditandai dengan menggunakan suatu enzim yang berfungsi sebagai pelopor/ reporter/ signal.
Dalam perkembangan selanjutnya, selain digunakan sebagai uji kualitatif untuk mengetahui
keberadaan suatu antibodi atau antigen dengan menggunakan antibodi atau antigen spesifik, teknik
ELISA juga dapat diaplikasikan dalam uji kuantitatif untuk mengukur kada antibodi atau antigen yang
diuji dengan menggunakan alat bantu erupa spektrofotometer atau dengan cara menetukan jumlah
penambahan atau kadar antibodi atau antigen, sehingga dapat dibuat suatu kurva standard an kadar
antibodi atau antigen yang tidak diketahui dapat ditentukan.
Contoh aplikasi terapan menggunakan teknik ELISA adalah mendeteksi dan menghitung jumlah
antibodi virus HIV. Antigen (virus HIV) akan ditangkap oleh antibodi reseptor di dalam tubuh.
Selanjutnya antigen akan berikatan dengan anti-antibodi di dalam tubuh yang terdapat enzim dan akan
memberikan sinyal kepada tubuh.
Berikut ini adalah beberapa ontoh aplikasi teknik ELISA, antara lain:
a. Pemeriksaan donor darah untuk pembuktian adanya kontaminasi virus:
HIV-1 dan HIV-2 (keberadaan antibody anti-HIV)
Hepatitis C (presence of antibodies)
Hepatitis B (test untuk keberadaan antibody dan antigen virus)
HTLV-1 dan -2 (keberadaan entibodi)
b. Pengukuran level hormone
hCG (sebagai tes kehamilan)
LH ( menentukan waktu ovulasi)
TSH, T3dan T4 (untuk fungsi thyroid)
c. Pendeteksian Infeksi
Agen penularan secara seksual, HIV, Syphilis dan Chlamydia
Hepatitis B dan C
Toxoplasma Gondii
d. Pendeteksian bahan allergen pada makanan dan debu rumah.
e. Pendeteksian keberadaan zat obat-obatab terlarabg, seperti
Cocain
Opium
-9-tetrahydrocannabiol, campuran aktif pada marijuana.

D. CARA KERJA
 Berikut ini adalah contoh langkah kerja beberapa macam teknik ELISA, yaitu:
Pendeteksian antibody dengan ELISA indirect:
1. Melapisi mikrotiter plate dengan antigen yang sudah dimurnikan dengan membiarkan
larutan berisi antigen menempel pada dinding/ permukaan selama 30-60 menit.
2. Membilas antigen yang tidak terikat dengan buffer.
3. Melapisi sisi-sisi tertentuyang mungkin tidak spesifik dilekati oleh antigen dengan protein
yang tidak berhubungan/ tidak spesifik (seperti larutan susu bubuk)
4. Membilas protein yang tidak melekat.
5. Menambahkan sampel serum yang akan dideteksi antibodinya dan membiarkan antibody
spesifik untuk berikatan dengan antigen.
6. Membilas antibody yang tidak terikat.
7. Menambahkan anti-Ig yang akan berikatan pada daerah Fc pada antibody yang spesifik
(sebagai contoh, anti-rantai gamma manusia yang berikatan dengan IgG manusia). Daerah Fc pada
anti-Ig akan berikatan secara kovalen dengan enzim.
8. Membilas kompleks antibody-enzim yang tidak terikat.
9. Menambahkan substrat chromogenic: substrat yang tidak berwarna yang terikat ke enzim
akan dikonversi menjadi produk.
10. Inkubasi sampai muncul warna, dan
11. Ukur dengan spectrometer. Jka semakin pekat warna yang dideteksi, maka makin besar kadar
antibody spesifik dalam sampel.
Pendeteksian antigen dengan ELISA sandwich:
1. Melapisi mikrotiter plate dengan antibodi yang sudah dimurnikandimurnikan dengan
membiarkan larutan berisi antigen menempel pada dinding/ permukaan selama 30-60 menit.
2. Membilas antibodi yang tidak terikat dengan buffer
3. Melapisi sisi-sisi tertentuyang mungkin tidak spesifik dilekati oleh antigen dengan protein
yang tidak berhubungan/ tidak spesifik (seperti larutan susu bubuk)
4. Membilas protein yang tidak melekat.
5. Menambahkan sampel yang akan dideteksi antigennya dan membiarkan antibodi untuk
berikatan dengan antigen spesifik dari sampel.
6. Membilas antigen yang tidak terikat.
7. Menambahkan antibody yang telah terlabeli dengan enzim dan bersifat spesifik untuk epitope
yang berbeda pada antigen sampel, sehingga terbentuk sandwich.
8. Membilas antibody-enzim yang tidak terikat.
9. Menambahkan substrat chromogenic: substrat yang tidak berwarna yang terikat ke enzim akan
dikonversi menjadi produk.
10. Inkubasi sampai muncul warna.
11. Ukur dengan spektrofotometer. Jika semakin pekat warna yang terdeteki, maka makin besar
kadarantigen spesifi dalam sampel.

E. CARA KALIBRASI DAN MAINTENANCE

1. Kalibrasi elisa reader
Yang perlu dikalibrasi adalah:
- liniaritas alat
- stabilitas pembacaan
- ketepatan pembacaan
Kalibrasi harus dilakukan:
- Pertama kali alat tersebut dipakai
- Setelah penggantian lampu
- Secara berkala untuk ketepatan pembacaan.
2. Kalibrasi elisa washer
- Volume dispenser
Waktu dispensing, volume didalam washer harus sesuai dengan sertifikat masing-masing alat. Apabila
volume tidak tepat, dikalibrasi sesuai dengan petunjuk yang ada pada alat.
- Sisa yang tersisa dalam sumur (rest volume)
Sisa yang tertinggal tidak boleh melebihi volume yang ditentukan untuk masing-masing alat. Apabila
volume melebihi volume melebihi yang ditentukan maka alat perlu dikalibrasi.
- Posisi sumur
Hal-hal yang perlu diperhatikan yaitu pada waktu dispensing atau asperasi, bagian head tidak boleh
menyentuh tepi atau dasar sumur.