BAB II PEMBAHASAN

2.1 Pengertian Uji Cemaran Bakteri Pada Makanan Makanan dan minuman ialah suatu bahan-bahan yang mengandung karbohidrat, lemak, protein, mineral-mineral, vitamin yang diperlukan oleh tubuh. Makanan dan minuman sangat cocok untuk pertumbuhan bakteri karena mengandung nutrisi yang dibutuhkan dalam metabolisme kuman. (Widianti dkk,2004). Namun makanan dan minuman juga dapat menimbulkan gangguan kesehatan. Kurangnya hygiene dan sanitasi merupakan faktor yang menunjang terjadinya penyakit yang berasal dari makanan atau minuman yang tercemar( Mukono, 1996 ). Uji cemaran bakteri pada makanan dapat diartikan sebagai percobaan yang dilakukan dengan berbagai metode untuk mengetahui mutu suatu makanan atau minuman yang disebabkan oleh mikroorganisme pathogen yang dianggap berbahaya bagi kesehatan manusia.

2.2 Manfaat Pengujian Bakteri Mikroba yang terkandung dalam makanan bisa menyebabkan terjadinya kerusakan mikrobiologis pada makanan sehingga tidak layak untuk dikonsumsi. Salah satu manfaat dari pengujian bakteri yang terkandung dalam makanan tersebut adalah untuk mengetahui layak atau tidaknya suatu bahan makanan untuk dikonsumsi oleh masyarakat, maka perlu dilakukan pengujian mikroba, salah satu cara tersebut adalah dengan analisis kuantitatif mikrobiologi pada bahan pangan (Buckle 1987). Pengujian mutu suatu bahan pangan diperlukan berbagai uji yang mencakup uji fisik, uji kimia, uji mikrobiologi, dan uji organoleptik. Uji mikrobiologi merupakan salah satu uji yang penting, karena selain dapat menduga daya tahan simpan suatu makanan, juga dapat digunakan sebagai indikator sanitasi makanan atau indikator keamanan makanan. Pengujian mikrobiologi diantaranya meliputi uji kualitatif untuk menetukan mutu dan daya tahan suatu makanan, uji kuantitatif bakteri patogen untuk menentukan tingkat keamanannya, dan uji bakteri indikator untuk mengetahui tingkat sanitasi makanan tersebut (Fardiaz, 1993).

2.3 Jenis Jenis Pengujian Bakteri Patogen Pada Makanan Berbagai macam uji mokrobiologis dapat dilakukan terhadap bahan pangan, meliputi uji kuantitatif mikroba untuk menentukan daya tahan suatu makanan, uji kualitatif bakteri patogen untuk menenetukan tingkat keamanan dan uji indikator untuk menentukan tingkat sanitasi makanan tersebut. Pengujian yang dilakukan terhadap tiap bahan pangan tidak sama tergantung berbagai faktor, seperti jenis dan komposisi bahan pangan, cara pengepakan dan penyimpanan serta komsumsinya, kelompok konsumen dan berbagai faktor lainnya (Dirjen POM., 1979). Beberapa metode yang biasanya digunakan dalam pengujian bakteri pathogen pada makanan antara lain : 2.3.1 Metode MPN (Most Probable Number) MPN (Most Probable Number) merupakan metode penentuan jumlah bakteri yang tumbuh pada pengenceran beberapa seri tabung dengan tabel MPN coliform. Metode MPN ini lebih baik bila dibandingkan dengan metode hitung cawan, karena lebih sensitif dan dapat mendeteksi coliform dalam jumlah yang sangat rendah di dalam sampel pangan (Supardi dan Sukamto, 1999). Metode MPN muncul pada awal abad 20. Estimasi paling akurat dari tabel MPN di publikasikan oleh Mc Crady pada tahun 1915 kemudian dasar statistik dari metode MPN dikemukakan oleh Halvorson dan Ziegler (1933), Eisenhart dan Wilson (1943) dan Cochan (1950). Pada tahun 1957 Woodward menyarankan tentang pengabaian hasil positif (banyak tabung positif pada pengenceran tinggi dan sebaliknya) yang dapat meningkatkan kesalahan laboratorium dalam tabel MPN. Kemudian De Mann pada tahun 1983 mempublikasikan tentang metode perhitungan tingkat kepercayaan (convidence interval) dalam tabel MPN (Indra Pradhika, 2011). MPN adalah suatu metode enumerasi mikroorganisme yang menggunakan data dari hasil pertumbuhan mikroorganisme pada medium cair spesifik dalam seri tabung yang ditanam dari sampel padat atau cair yang ditanam berdasarkan jumlah sampel atau diencerkan menurut tingkat seri tabungnya sehingga dihasilkan kisaran jumlah mikroorganisme yang diuji dalam nilai MPN/satuan volume atau massa sampel (Anonim, 2011)

Contoh : Data yang didapat adalah : 3 tabung positif dari pengenceran 1/10, 2 tabung positif dari pengenceran 1/100 dan 1 tabung positif dari pengenceran 1/1000. Lalu dicocokkan dengan tabel, menghasilkan nilai : 150 MPN/g.

Prinsip utama metode ini adalah mengencerkan sampel sampai tingkat tertentu sehingga didapatkan konsentrasi mikroorganisme yang pas/sesuai dan jika ditanam dalam tabung menghasilkaan frekensi pertumbuhan tabung positif kadang-kadang tetapi tidak selalu. Semakin besar jumlah sampel yang dimasukkan (semakin rendah pengenceran yang dilakukan) maka semakin sering tabung positif yang muncul. Semakin kecil jumlah sampel yang dimasukkan (semakin tinggi pengenceran yang dilakukan) maka semakin jarang tabung positif yang muncul. Jumlah sampel/pengenceran yang baik adalah yang menghasilkan tabung positif kadang-kadang tetapi tidak selalu. Semua tabung positif yang dihasilkan sangat tergantung dengan probabilitas sel yang terambil oleh pipet saat memasukkannya ke dalam media. Oleh karena itu homogenisasi sangat mempengaruhi metode ini. Frekuensi positif (ya) atau negatif (tidak) ini menggambarkan konsentrasi mikroorganisme pada sampel sebelum diencerkan. Asumsi yang diterapkan dalam metode MPN adalah (Anonim, 2011) : Bakteri terdistribusi sempurna dalam sampel Sel bakteri terpisah-pisah secara individual, tidak dalam bentuk rantai atau kumpulan (bakteri coliform termasuk E. coli terpisah sempurna tiap selnya dan tidak membentuk rantai). Media yang dipilih telah sesuai untuk pertumbuhan bakteri target dalam suhu dan waktu inkubasi tertentu sehingga minimal satu sel hidup mampu menghasilkan tabung positif selama masa inkubasi tersebut. Jumlah yang didapatkan menggambarkan bakteri yang hidup (viable) saja. Sel yang terluka dan tidak mampu menghasilkan tabung positif tidak akan terdeteksi.

MPN dinilai dari perkiraan unit tumbuh (Growth Unit / GU) seperti CFU, bukan dari sel individu. Meskipun begitu baik nilai CFU atau MPN dapat menggambarkan seberapa banyak sel individu yang tersebar dalam sampel. Metode MPN dirancang dan lebih cocok untuk

diterapkan pada sampel yang memiliki konsentrasi <100/g atau ml. Oleh karena itu nilai MPN dari sampel yang memiliki populasi mikroorganisme yang tinggi umumnya tidak begitu menggambarkan jumlah mikroorganisme yang sebenarnya. Jika jumlah kombinasi tabung positif tidak sesuai dengan tabel maka sampel harus diuji ulang. Semakin banyak seri tabung maka semakin tinggi akurasinya tetapi juga akan mempertinggi biaya analisa (Anonim, 2011). Pemilihan media sangat berpengaruh terhadap metode MPN yang dilakukan. Umumnya media yang digunakan mengandung bahan nutrisi khusus untuk pertumbuhan bakteri tertentu. Misalnya dalam mendeteksi kelompok coliform dapat menggunakan media Brilliant Green Lactose 2% Bile (BGLB) broth. Di dalam media ini mengandung lactose dan garam empedu (bile salt) yang hanya mengizinkan coliform untuk tumbuh. Jika terdapat ketidaksesuaian jenis media dan bakteri yang diinginkan maka metode MPN akan menghitung bukan bakteri yang dituju. Untuk menghitung coliform dapat menggunakan Lauryl Sulphate Tryptose (LST) broth, sedangkan untuk menghitung E.coli diperlukan media EC (Escherichia coli) broth. Berdasarkan prinsip diatas maka seharusnya/sebaiknya jumlah tabung positif pada pengenceran 1/10 > 1/100 > 1/1000 (misalnya 5-3-1) karena setiap pengenceraan mengurangi jumlah mikroorgansime target dan akibatnya semakin kecil kesempatannya untuk membuat tabung menjadi positif. Namun seringkali hasil yang didapat tidak sesuai dengan logika peluang, seperti 5-3-4 yang menghasilkan nilai 210 (lihat tabel dibawah). Bisa saja banyak sel tidak sengaja terambil dan memperbanyak pengenceran selanjutnya atau homogenisasi tidak berlangsung sempurna (Anonim, 2011).

Tabel 3. Nilai MPN

Untuk memahami peranan peluang dalam mendistribusikan sel sehingga menghasilkan tabung positif maka jumlah tabung positif (digaris bawah) pada tabel dicoba untuk dirunut dan diilustrasikan kembali dalam proses penanamannya pada gambar berikut (dianggap bahwa nilai MPN/ml sama dengan sel/ml). Namun perlu diingat, jumlah sel yang terambil tidak selalu seperti itu, semuanya adalah peluang dan angka yang didapat adalah angka paling mungkin. (Anonim, 2011). Gambar 1. Aspek Peluang dalam Metode MPN

Metode MPN terdiri dari tiga tahap, yaitu uji perkiraan (presumtive test), uji penegasan (confirmed test), dan uji kelengkapan (completed test) (Ali Tamyis, 2008). 1. Uji Perkiraan (Presumtive Test)

Terdapat dua macam ragam pemeriksaan yang digunakan, yaitu (Ali Tamyis, 2008) : Ragam 1 : Untuk sampel air yang sudah diolah menggunakan metodde MPN 511 yaitu : 5 X 10 ml; 1 X 1 ml; 1 X 0,1 ml. Ragam 2 : Untuk sampel air yang belum diolah mempergunakan metode MPN 555, yaitu : 5 X 10 ml; 5 X 1 ml; 5 X 0,1 ml dan bisa dilanjutkan dengan 5 X 0,01 ml. Tabung reaksi berisi medium cair dicampuri laktosa diisi dengan 1-5 ml dari sampel air. Perbandingan dalam pembuatan media dan volume dari sampel yang dimasukkan bergantung

pada jenis air sampel yang digunakan. Jika diduga air sampel banyak mengandung bakteri atau sangat kotor maka cukup diambil 1 ml saja untuk diinokulasikan ke dalam tabung reaksi tersebut. Di dalam tabung reaksi tersebut terlebih dahulu diletakkan tabung durham dalam posisi terbalik. Presumtive test ini merupakan tes pendahuluan tentang ada tidaknya kehadiran bakteri koliform berdasarkan terbentuknya asam dan gas disebabkan karena fermentasi laktosa oleh bakteri golongan koli. Terbentuknya asam dilihat dari kekeruhan pada media laktosa, dan gas yang dihasilkan dapat dilihat dalam tabung Durham berupa gelembung udara. Tabung dinyatakan positif jika terbentuk gas sebanyak 10% atau lebih dari volume di dalam tabung Durham. Banyaknya kandungan bakteri coliform dapat dilihat dengan menghitung tabung yang menunjukkan reaksi positif terbentuk asam dan gas dan dibandingkan dengan tabel MPN. Metode MPN dilakukan untuk menghitung jumlah mikroba di dalam contoh yang berbentuk cair. Bila inkubasi 1 x 24 jam hasilnya negatif, maka dilanjutkan dengan inkubasi 2 x 24 jam pada suhu 370C. Jika dalam waktu 2 x 24 jam tidak terbentuk gas dalam tabung Durham, dihitung sebagai hasil negatif. Dalam uji tahap pertama, keberadaan coliform masih dalam tingkat probabilitas rendah; masih dalam dugaan. Uji ini mendeteksi sifat fermentatif Coliform dalam sampel. Karena beberapa jenis bakteri selain Coliform juga memiliki sifat fermentatif, diperlukan uji konfirmasi untuk mengetes kembali kebenaran adanya coliform. 2. Uji Penegasan (Confirmed Test) Hasil uji dugaan dilanjutkan dengan uji ketetapan/penegasan. Ada 2 cara untuk melakukan uji ini yaitu (Ali Tamyis, 2008) : Uji dapat dilakukan seperti pada uji pendugaan, hanya di dalam media perlu ditambahkan zat warna hijau berlian (media BGLB). Kepada medium ini kemudian dinokulasikan sejumlah ml air yang mengandung bakteri yang menghasilkan gas. Hijau berlian berguna untuk menghambat pertumbuhan gram positif dan menggiatkan pertumbuhan bakteri golongan kolon. Untuk membedakan bakteri golongan coli dari bakteri golongan coli fecal (berasal dari tinja hewan berdarah panas), pekerjaan dibuat Duplo, dimana satu seri diinkubasi pada pada suhu 370C (untuk golongan coli) dan satu seri diinkubasi pada suhu 440C (untuk golongan coli fecal). Bakteri golongan koli tidak dapat tumbuh dengan baik pada suhu 440C, sedangkan golongan koli fekal dapat tumbuh dengan baik pada suhu 440C.

Menginokulasikan air yang menghasilkan gas ke dalam cawan petri berisi medium yang mengandung laktose dan eosin biru metilen atau laktose dan eosin biru metilen. Jika dalam 24 jam tumbuh koloni-koloni yang berinti dan mengkilap seperti logam maka tes ini positif.

3. Uji Pelengkap (Completed Test) Uji kelengkapan ini kadang-kadang tidak dilakukan. Uji dilakukan dengan alasan demi kesempurnaan hasil percobaan. Pada uji ini diambil inokulum dari suatu kolon pada cawan petri (uji konfirmasi cara 2). Inokulum dimasukkan ke dalam medium cair yang mengandung laktose dan dari inokulum tersebut dibuat gesekan pada agar-agar miring. Jika kemudian timbul gas dalam cairan laktose, lagipula pada agar-agar miring ditemukan basilbasil gram negatif yang berupa spora maka tes dinyatakan positif. Uji kelengkapan ini kembali meyakinkan hasil tes uji konfirmasi dengan mendeteksi sifat fermentatif dan pengamatan mikroskop terhadap ciri-ciri Coliform: berbentuk batang, Gram negatif, tidakberspora. Jika pada uji penduga tidak menunjukkan adanya Coliform maka tidak perlu dilakukan uji pelengkap. Output metode MPN adalah nilai MPN. Nilai MPN adalah perkiraan jumlah unit tumbuh (growth unit) atau unit pembentuk-koloni (colonyforming unit) dalam sampel. Namun, pada umumnya, nilai MPN juga diartikan sebagai perkiraan jumlah individu bakteri. Satuan yang digunakan, umumnya per 100 mL atau per gram. Jadi misalnya terdapat nilai MPN 10/g dalam sebuah sampel air, artinya dalam sampel air tersebut diperkirakan setidaknya mengandung 10 Coliform pada setiap gramnya. Makin kecil nilai MPN, maka air tersebut makin tinggi kualitasnya, dan makin layak minum. Metode MPN memiliki limit kepercayaan 95 persen sehingga pada setiap nilai MPN, terdapat jangkauan nilai MPN terendah dan nilai MPN tertinggi (Ali Tamyis, 2008).

Table MPN 511 menurut Formula Thomas (Sumarno) Jumalah Tabung (+) Gas pada Penanaman 5 x 10 mL 1 x1 mL 1 x 0,1 mL 0 0 0 0 0 1 0 1 0 0 1 1 1 0 0 Indek MPN per 100 mL 0 2 2 4 2

1 1 2 2 2 2 3 3 3 3 4 4 4 4 4 5 5 5 5

0 1 0 0 1 1 0 0 1 1 0 0 1 1 1 0 0 1 1

1 1 0 1 0 1 0 1 0 1 0 1 0 1 1 0 1 0 1

4 7 5 8 8 10 9 12 12 16 17 21 22 27 27 67 84 264 >978

2.3.2 Metode TPC(Total Plate Count) atau Angka Lempeng Total (ALT) Metode kuantitatif digunakan untuk mengetahui jumlah mikroba yang ada pada suatu sampel, umumnya dikenal dengan Angka Lempeng Total (ALT). Uji Angka Lempeng Total (ALT) dan lebih tepatnya ALT aerob mesofil atau anaerob mesofil menggunakan media padat dengan hasil akhir berupa koloni yang dapat diamati secara visual berupa angka dalam koloni(cfu) per ml/g atau koloni/100ml. Cara yang digunakan antara lain dengan cara tuang, cara tetes dan cara sebar. Prinsip pengujian Angka Lempeng Total menurut Metode Analisis Mikrobiologi yaitu pertumbuhan koloni bakteri aerob mesofil setelah cuplikan diinokulasikan pada media lempeng agar dengan cara tuang dan diinkubasi pada suhu yang sesuai. Pada pengujan Angka Lempeng Total menggunakan media PCA (Plate Count Agar) sebagai media padatnya.

Keuntungan dari metode pertumbuhan agar atau metode uji Angka Lempeng Total adalah dapat mengetahui jumlah mikroba yang dominan. Keuntungan lainnya dapat diketahui adanya mikroba jenis lain yang terdapat dalam contoh. Adapun kelemahan dari metode ini adalah : Kemungkinan terjadinya koloni yang berasal lebih dari satu sel mikroba, seperti pada mikroba yang berpasangan, rantai atau kelompok sel. Kemungkinan ini akan memperkecil jumlah sel mikroba yang sebenarnya. Kemungkinan adanya jenis mikroba yang tidak dapat tumbuh karena penggunaan jenis media agar, suhu, pH, atau kandungan oksigen selama masa inkubasi. Kemungkinan ada jenis mikroba tertentu yang tumbuh menyebar di seluruh permukaan media agar sehingga menghalangi mikroba lain. Hal ini akan mengakibatkan mikroba lain tersebut tidak terhitung. Penghitungan dilakukan pada media agar yang jumlah populasi mikrobanya antara 30 300 koloni. Bila jumlah populasi kurang dari 30 koloni akan menghasilkan penghitungan yang kurang teliti secara statistik, namun bila lebih dari 300 koloni akan menghasilkan hal yang sama karena terjadi persaingan diantara koloni. Penghitungan populasi mikroba dapat dilakukan setelah masa inkubasi yang umumnya membutuhkan waktu 24 jam atau lebih. Contoh uji angka lempeng total (ALT) Cara Perhitungan ALT: Hitung koloni pada masing-masing pengenceran. Koloni yang menumpuk tidak dapat dihitung. Cari petri dengan koloni yang tidak menumpuk dan dapat dihitung. Jumlah koloni yang representatif adalah yang berjumlah antara 30-300 koloni. Jumlah koloni dihitung dengan rumus.

RUMUS: ALT = Jumlah koloni / Volume yang ditanam x faktor pengenceran

Satuan ALT = CFU/ml atau CFU/g

2.3.4 Cara Menyelidiki Biakan Murni Dalam keadaan sebenarnya ( di alam bebas ) boleh dikatakan tidak ada bakteri yang hidup tersendiri terlepas dari spesies lainnya. Kerapkali bakteri patogen kedapatan bersama-sama bakteri saproba. Untuk menyedirikan suatu spesies ada dikenal beberapa cara, yaitu (Waluyo, 2005) : 1. Dengan pengenceran Suatu sampel dari suatu suspensi yang berupa campuran bermacam- macam spesies diencerkan dalam suatu tabung tersendiri. Dari enceran ini kemudian diambil barang 1 ml untuk dincerkan lebih lanjut. Jika dari pengenceran yang ketiga ini diambil 0,1 ml untuk disebarkan pada suatu koloni tumbuh dalam medium tersebut, tetapi mungkin juga kita hanya memperoleh satu koloni saja. Dalam hal yang demikian ini kita memperoleh satu koloni saja. Dalam hal yang demikian ini kita memperoleh satu koloni murni. Kalau kita belum yakin, bahwa koloni tunggal yang kita peroleh itu murni, kita dapat mengulang pengenceran dengan menggunakan koloni ini sebagai sampel (Waluyo, 2005).

Gambar 1. Teknik Pengenceran (http://www.scribd.com/loocev/d/18656107teknik-inokulasi-mikroorganisme)

2.

Dengan Penuangan Robert koch ( 1943 - 1905 ) mempunyai metode yang lain, yaitu dengan mengambil sedikit sampel campuran bakteri yang sudah diencerkan, dan sampel ini kemudian disebarluaskan di dalam suatu medium dari kaldu dan gelatin encer. Dengan demikian diperolehnyalah suatu piaraan adukan.

Setelah medium itu mengental, maka selang beberapa jam kemudian nampaklah koloni koloni yang masing masing dapat dianggap murni. Denagn mengulang pekerjaan seperti diatas, maka akhirnya akan diperoleh piaraan murni yang lebih terjamin (Waluyo, 2005).

Gambar 2. Teknik penuangan (Waluyo, 2005) 3. Dengan Penggesekan Metode ini sekarang banyak digunakan, karena tidak begitu memakan waktu, hanya sayang, dengan cara ini maka bakteri anaerob tidak dapat rumbuh. Jika ujung kawat inokulasi dibengkokan, kemudian ujung kawat inokulasi itu setelah disentuhkan suatu koloni lalu digesekkan pada permukaan medium padat,maka beberapa waktu kemudian (kurang lebih 12 jam ) akan tampaklah koloni koloni yang letaknya tersebar di permukaan medium. Jika diadakan pemindahan sampel dari suatu koloni yang letaknya terpencil, maka akan diperoleh suatu piaraan murni (Waluyo, 2005).

2.3.3 Penghitungan Angka Kuman Menentukan banyaknya mikroba dalam suatu bahan dilakukan untuk mengetahui sampai seberapa jauh bahan itu tercemar oleh mikroba. Dengan mengetahui jumlah mikroba, maka dapat diketahui kualitas mikribiologi dari bahan tersebut. Jumlah mikroba dapat dihitung dengan beberapa cara, namun secara garis besar dibedakan menjadi (Anonim, 2011): 1. Cara langsung

Hasil perhitungan secara langsung menunjukkan seluruh jumlah mikroba yang masih hidup maupun yang sudah mati. Caranya: a. Pembuatan preparat sederhana yang diwarnai b. Menggunakan ruang hitung 2. Cara tidak langsung Hasil perhitungan akan menunjukkan jumlah mikroba yang masih hidup saja. Caranya: a. Menghitung total jumlah mikroba b. Cara pengenceran c. Memperkirakan jumlah terkecil mikroba yang ada d. Cara kekeruhan Cara ini dapat digunakan untuk bahan padat maupun cair. Khusus untuk bahan padat maka sebelum dilakukan perhitungan bahan itu perlu dilakukan pelarutan atau dibuat suspensi, dengan memperhitungkan faktor pengencerannya. Syarat koloni yang ditentukan untuk dihitung adalah: a. Satu koloni dihitung 1 koloni b. Dua koloni yang bertumpuk dihitung 1 koloni c. Beberapa koloni yang berhubungan dihitung 1 koloni d. Dua koloni yang berhimpitan dan masih dapat dibedakan dihitung 2 koloni e. Koloni yang lebih besar dari setengah cawan tidak dihitung f. Koloni yang besarnya kurang dari setengah luas cawan dihitung 1 koloni

Gambar 3. Syarat koloni bakteri (Anonim.2008) Standar perhitungan Jumlah koloni = jumlah koloni X 1/faktor pengenceran. a. b. Cawan yang dipilih adalah yang mengandung jumlah koloni 30-300 koloni Hasil yang dilaporkan terdiri dari 2 angka yaitu angka pertama di depan koma dan angka kedua di belakang koma. Jika angka ketiga lebih besar dari 5 maka harus dibulatkan satu angka lebih tinggi pada angka kedua. c. Jika semua pengenceran menghasilkan angka kurang dari 30 koloni, maka hanya koloni pada pengenceran terendah yang dihitung. Hasilnya dilaporkan sebagai kurang dari 30 koloni dikalikan dengan faktor pengenceran tetapi jumlah sebenarnya harus dicantumkan dengan tanda kurung. d. Jika semua pengenceran menghasilkan angka lebih dari 300 koloni maka hanya koloni pada pengenceran tertinggi yang dihitung. Hasilnya dilaporkan sebagai lebih dari 300 koloni dikalikan dengan faktor pengenceran tetapi jumah sebenarnya harus dicantumkan dengan tanda kurung. e. Jika semua pengenceran menghasilkan angka 30-300 koloni maka harus dibuat perbandingan. Jika perbandingannya < 2 maka yang dilaporkan adalah rata-rata pengenceran tetapi jika perbandingannya > 2 maka yang dilaporkan adalah pengenceran terendah. f. Jika digunakan dua cawan petri (duplo) per pengenceran, maka data yang diambil harus dari kedua cawan tersebut meskipun salah satu dari cawan duplo tidak memenuhi syarat 30-300 koloni. (Anonim,2011) Pencetus kisaran hitung 30 300 koloni/mL atau 25-250 koloni/cawan dikemukakan oleh Breed dan Dotterrer pada tahun 1916 yang mempublikasikan dalam

seminarnya mengenai topik ini. Mereka menentukan kisaran ini berdasarkan alasan supaya hasil perhitungannya tidak menimbulkan kesalahan statistik yang serius. Mereka juga mencatat bahwa jenis bakteri dapat mempengaruhi ukuran koloni dan jumlah koloni yang tumbuh pada cawan. Selain itu komposisi nutrisi dan jarak antar koloni juga mempengaruhi jumlah koloni per cawan karena koloni tetangga mungkin dapat menghambat pertumbuhan atau menstimulus koloni didekatnya Breed dan Dotterrer memakai tiga kali plating tiap pengenceran (triplicate plating) dalam percobaanya dan memilih cawan yang masuk kisaran dari tiap pengenceran. Pada analisa ini cawan yang memiliki jumlah koloni 400 dianggap tidak memenuhi syarat. (Catherina Ryan, 2011) Perhitungan angka kuman juga dibantu dengan alat yang disebut Colony Counter. Alat Colony Counter masih mengharuskan para peneliti pada laboratorium menghitung jumlah koloni secara manual. Pada alat Colony Counter, penghitungan jumlah koloni bakteri dipermudah dengan adanya counter electronic. Dengan adanya counter tersebut peneliti tinggal menandai koloni bakteri yang dihitung dengan menggunakan pen yang terhubung dengan counter. Setiap koloni yang ditandai maka counter akan menghitung. (Sutedjo, 1991).

Gambar

4.

Colony

Counter

(http://ayosinauonline.blogspot.com/2010/05/pengenalan -alat-dan-teknik-sterilisasi.html)

2.4 Prosedur Pengujian Bakteri Patogen Pada Makanan 2.4.1 Escherichia coli Bakteri Escherichia coli merupakan kuman dari kelompok gram negatif, berbentuk batang dari pendek sampai kokus, saling terlepas antara satu dengan yang lainnya tetapi ada juga yang bergandeng dua-dua (diplobasil) dan ada juga yang bergandeng seperti rantai pendek, tidak membentuk spora maupun kapsula, berdiameter 1,1 1,5 x 2,0 6,0 m, dapat bertahan hidup di medium sederhana dan memfermentasikan laktosa menghasilkan asam dan gas, kandungan G+C DNA ialah 50 sampai 51 mol % (Pelczar dan Chan, 1988:949).

Escherichia

coli

dapat

tumbuh

di

medium

nutrien

sederhana,

dan

dapat

memfermentasikan laktosa dengan menghasilkan asam dan gas (Pelczar dan Chan, 2005:169). Kecepatan berkembangbiak bakteri ini adalah pada interval 20 menit jika faktor media, derajat keasaman dan suhu tetap sesuai. Selain tersebar di banyak tempat dan kondisi, bakteri ini tahan terhadap suhu, bahkan pada suhu ekstrim sekalipun. Suhu yang baik untuk pertumbuhan bakteri ini adalah antara 80C-460C, tetapi suhu optimumnya adalah 370C. Oleh karena itu, bakteri tersebut dapat hidup pada tubuh manusia dan vertebrata lainnya (Dwidjoseputro, 1978:82). Escherichia coli tumbuh mudah pada media sederhana yang dipakai sehari hari umumnya laktose fermented ( ada yang nonyon lactose fermented ), menguraikan glucose menjadi asam dan gas (aerogenic ), tetapi ada juga yang tidak membuat gas ( anaerogenic ) dan ada yang dapat memproduksi hydrogen sulfide. Blood Agar Plate : koloni sedang, abu abu, smooth, keeping, haemolytis atau an haemolytis. Mac Conkey Agar : koloni sedang, merah bata atau merah tua, metalic, smooth, keeping atau sedikit cembung. EMB Agar : koloni sedang, smooth, keeping, kehijau-hijauan hitam, metalic.5 Endo Agar : koloni sedang, smooth, cembung, bulat, merah merah tua, metalic. Violet Red Bille Agar : koloni sedang, bulat, smooth, merah ungu dilingkari oleh zona yang berwarna merah ungu muda. Tergitol 7 Agar : koloni sedang, bulat, smooth, kuning dengan zona kuning, kadang kadang dengan warna coklat kasar ( warna karat ) ditengahnya. TSI Agar : lereng : kuning dasar : kuning gas SIM medium : H2S Indol : positif / negatif : positif / negatif : positif

Motility : aktif / Brown

Simmons Citrate Agar Fermetasi glucose sorbitol lactose

: : : :

negatif + g/ + + +/+ + + +/-

arabinose : mannitol : maltose sucrose Tahap Pengujian : : :

Digunakan metode MPN 511 yaitu : 5x10 mL; 1x1mL; 1x0,1 mL a. Disiapkan lima buah tabung reaksi yang masing-masing telah berisi lactose broth double strength sebanyak 10 mL (tabung 1a s/d 5a) juga disiapkan 2 buah tabung reaksi yang masing-masing telah berisi 10 mL lactose broth single strength (tabung 1b dan 2b) b. Dengan pipet steril diinokulasikan masing-masing 10 mL sampel ke dalam tabung 1a s/d 5a c. Ke dalam tabung 1b diinokulasikan 1 mL sampel d. Ke dalam tabung 2b diinokulasikan 0,1 mL sampel e. Tabung-tabung digoyangkan perlahan agar sampel air menyebar rata ke seluruh bagian media kemudian diinkubasikan pada suhu 35-370 C selama 24-48 jam

Pemeriksaan Bakteriologi Makanan atau Minuman Uji Presumptive (Perkiraan) a. Setelah diinkubasi, diamati masing-masing tabung untuk melihat ada tidaknya gas dalam tabung durham. Adanya gas menunjukkan presumptive positif b. Tabung yang menunjukkan presumptive positif akan dilanjutkan dengan uji konfirmative (penegas) Uji Konfirmative (Penegas)

a. Dari tiap-tiap tabung presumptive yang positif dipindahkan 1-2 ose ke dalam 14 buah tabung konfirmative yang beri 5 mL BGLB b. Satu seri tabung BGLB (7 buah) diinkubasikan pada suhu 35-370 C selama 24-48 jam dan satu seri lagi (7 buah) diinkubasikan pada suhu 440 C untuk memastikan adanya Coli tinja c. Pembacaan (dicocokkan dengan tabel MPN 511) dilakukan setelah 24-48 jam dengan melihat jumlah tabung BGLB yang menunjukkan positif gas Uji Pelengkap a. Dari tiap-tiap tabung konfirmative yang positif dipindahkan dan digoreskan dengan ose steril ke dalam 4 plate yang telah berisi media EMB dengan teknik 4 kuadran b. Diinkubasi pada suhu 370 C dalam inkubator selama 24 jam Uji Biokimia a. Dari tiap-tiap plate dengan media EMB yang positif digoreskan dengan ose bulat steril ke dalam 4 tabung yang berisi media TSI slant dan ditusukkan dengan ose jarum steril ke dalam 4 tabung yang berisi media SIM b. Diinkubasi pada suhu 370 C dalam inkubator selama 24 jam Uji Mikroskopis Dari tiap-tiap plate dengan media EMB yang positif, dibuat preparat gram. 1. Pembuatan Preparat Gram a. Kaca preparat diambil, difiksasi pada api bunsen dan diberi label b. Ose diambil lalu dipanaskan pada api Bunsen c. Tutup plate yang berisi sampel dibuka Untuk suspense, diambil satu ose suspense kuman Untuk koloni, diambil 1 ose NaCl/aquades dan 1 ose koloni kuman lalu dicampur pada objek glass d. Lalu diapuskan pada objek glass

e. Diletakkan pada posisi miring dan dikeringkan pada suhu kamar f. Mulut plate dipanaskan dan ditutup kembali 2. Fiksasi Fiksasi dilakukan dengan cara kaca preparat dikelilingi pada api bunsen sebanyak tiga kali

3. Pewarnaan a. Ditetesi cat gram I pada objek glass, ditunggu hingga 1 menit, lalu dibilas pada air mengalir b. Ditetesi cat gram II pada objek glass, ditunggu hingga 1 menit, lalu dibilas pada air mengalir c. Ditetesi cat gram III pada objek glass, ditunggu hingga menit, lalu dibilas pada air mengalir d. Ditetesi cat gram IV pada objek glass, ditunggu - 1 menit, lalu dibilas pada air mengalir e. Dikering anginkan dan diletakkan pada rak preparat

4. Pembacaan a. Mikroskop disiapkan di atas meja kerja yang rata dan kokoh b. Posisi duduk (ergonomi) yang baik diatur agar tidak mengganggu pengamatan c. Tombol on/off dihidupkan pada mikroskop untuk memulai langkah selanjutnya d. Slide ditaruh pada meja mikroskop e. Lensa objektif diatur ke posisi 10 x f. Makrometer dinaikkan full ke atas g. Diturunkan pelan-pelan hingga menemukan lapang pandang h. Setelah mendapat lapang pandang, diatur focus mata kanan dan mata kiri dengan mengatur cincin diopter pada lensa okuler i. Diafragma ditutup

j. Kondensor dinaikkan, diturunkan pelan-pelan hingga menemukan polygon (segi banyak dengan sisi biru-biru tajam) k. Setelah itu diafragma dibuka seluas lapang pandang l. Oil imersi diteteskan dengan mencari celah diantara lensa objektif m. Diputar lensa objektif ke pembesaran 100 x n. Mikrometer diatur, jika kurang terang, diterangkan dengan membesarkan lampu o. Diidentifikasi bakteri gram yang ditemukan Bakteri gram positif berwarna ungu Bakteri gram negatif berwarna merah

2.4.2 Clostridium prefingens 2.4.3 Salmonella thypi Salmonella adalah penyebab utama dari penyakit yang disebarkan melalui makanan (foodborne diseases). Pada umumnya, serotipe Salmonella menyebabkan penyakit pada organ pencernaan. Penyakit yang disebabkan oleh Salmonella disebut salmonellosis. Ciri-ciri orang yang mengalami salmonellosis adalah diare, keram perut, dan demam dalam waktu 8-72 jam setelah memakan makanan yang terkontaminasi oleh Salmonella. S. typhi menyebabkan penyakit demam tifus (Typhoid fever), karena invasi bakteri ke dalam pembuluh darah dan gastroenteritis, yang disebabkan oleh keracunan makanan/intoksikasi. Gejala demam tifus meliputi demam, mual-mual, muntah dan kematian. S. typhi memiliki keunikan hanya menyerang manusia, dan tidak ada inang lain. Infeksi Salmonella dapat berakibat fatal kepada bayi, balita, ibu hamil dan kandungannya serta orang lanjut usia. Hal ini disebabkan karena kekebalan tubuh mereka yang menurun. Kontaminasi Salmonella dapat dicegah dengan mencuci tangan dan menjaga kebersihan makanan yang dikonsumsi Tahap Pengujian : Penanaman biakan sampel pada media SCB a. Sampel dituang secukupnya ke dalam tabung yang telah berisi media SCB. b. Dikocok hingga merata.

c. Diinkubasi dalam inkubator pada suhu 370 C selama 18- 24 jam. d. Hasil positif ditunjukkan dengan perubahan warna pada media yaitu menjadi keruh. Penanaman biakan ke media MCA dan SSA f. Disiapkan media MCA dan SSA yang telah diberi label. g. Dari tabung media SCB, diinokulasikan/digoreskan dengan ose steril ke media MCA dan SSA dengan metode gores kuadran (4 kuadran) h. Media yang telah digoreskan tersebut diinkubasi pada suhu 370 C selama 1824 jam Uji Biokimia c. Dari tiap-tiap plate dengan media MCA dan SSA yang positif digoreskan dengan ose bulat steril ke dalam masing-masing 4 tabung yang berisi media TSI slant dan Simmons Citrate Agar slant serta ditusukkan dengan ose jarum steril ke dalam 4 tabung yang berisi media SIM d. Diinkubasi pada suhu 370 C dalam inkubator selama 24 jam Uji Gula-Gula a. Dari tiap-tiap plate dengan media MCA dan SSA yang positif diinokulasikan dengan ose bulat steril ke dalam masing-masing 4 tabung yang berisi media Laktosa, Glukosa, dan Manitol. b. Diinkubasi pada suhu 370 C dalam inkubator selama 24 jam Salmonella tumbuh mudah pada media biasa, dengan situasi aerob, dengan suhu optimum 360 C, non lactose fermented (Sumarno,1987). Mac Conkey Agar : koloni tidak berwarna, jernih keping, sedang,

bulat,smooth. EMB Agar : koloni tidak berwarna, sedang (lebih besar daripada di MC), keping, smooth, bulat. SS Agar : koloni tidak berwarna, kecil-kecil, keping, smooth, bulat. : koloni kecil-kecil, jernih, hijau tengahnya hitam, zone hitam, smooth, metalic, keping. Kadang-kadang koloni kelihatan hitam saja.

Bismuth Sulfite Agar

Endo Agar

koloni tidak berwarna atau merah muda, kecil-sedang, keping, smooth.

Deoxycholate Citrate Agar : koloni kecil-sedang, jernih-kelabu, kadang-kadang tengahnya cembung. Hektoen Enteric Agar : koloni kecil-sedang, berwarna hijau-biru, dengan atau tanpa warna hitam ditengah koloni, bulat, smooth. Xylose Lysine Desoxycholate Agar : koloni kecil-sedang, merah tengahnya hitam, smooth, bulat, keping. TSI Agar : lereng : alkalis (merah) dasar : asam (kuning) gas SIM medium : H2S Indol : positif / negatif : positif / negatif : negatif berwarna hitam, bulat, smooth,

Motility : + (aktif) Simmons Citrate Agar : tumbuh/tidak tumbuh Glucose OI : fermentative, bergas atau tidak

2.4.4 Staphylococcus 2.4.5 Vibrio cholera Vibrio cholerae merupakan bakterigram negatif, berbentuk basil (batang) dan bersifat motil (dapat bergerak), memiliki struktur antogenik dari antigen flagelar H dan antigen somatik O, gamma-proteobacteria, mesofilik dan kemoorganotrof, berhabitat alami di lingkungan akuatik dan umumnya berasosiasi dengan eukariot. Spesies Vibrio kerap dikaitkan dengan sifat patogenisitasnya pada manusia, terutama Vibrio cholerae penyebab penyakit kolera di negara berkembang yang memiliki keterbatasan akan air bersih dan memiliki sanitasi yang buruk. Vibrio cholerae ditemukan pertama kali oleh ahli anatomi dari Italia bernama Filippo Pacini pada tahun 1854. Namun, penemuan awal ini baru dikenal luas setelah Robert Koch, yang mempelajari penyakit kolera di Mesir, pada tahun

1883 berhasil membuktikan bahwa bakteri tersebut adalah penyebab kolera ( Kurniawan,2012). Ada dua jenis Vibrio cholerae yang berpotensi sebagai patogen pada manusia. Jenis utama yang menyebabkan kolera adalah Vibrio cholerae O1, sedangkan jenis-jenis lainnya dikenal sebagai non-O1.Vibrio cholerae O1 adaalah penyebab kolera Asiatik atau kolera epidemik. Kasus kolera sangat jarang terjadi di Eropa dan Amerika Utara. Sebagian besar kasus kolera terjadi di daerah-daerah (sub)-tropis. Kolera selalu disebabkan oleh air yang tercemar atau ikan (atau kerang) yang berasal dari perairan yang tercemar. Vibrio choleraenon-O1 hanya menginfeksi manusia dan hewan primata lainnya. Organisme ini berkerabat dengan Vibrio cholerae O1, tetapi penyakit yang ditimbulkannya tidak separah kolera. Strain patogenik dan non-patogenik dari organisme ini merupakan penghuni normal di lingkungan air laut dan muara. Organisme ini pada masa lalu disebut sebagai non-cholera vibrio (NCV) dan nonagglutinable vibrio (NAG) ( Kurniawan,2012). Tahap Pengujian :