Analisis Keragaman Genetik Varietas Padi (Oryza sativa L) di Kerala dengan Menggunakan RAPD Marker

Beras (Oryza sativa) merupakan bahan makanan pokok yang banyak dikonsumsi di dunia. Di Asia secara keseluruhan, sebagian besar penduduk mengkonsumsi beras untuk memenuhi kebutuhan makannya (Kanawapee et al., 2011). Beberapa varietas padi yang tumbuh secara liar, memainkan peran yang sangat penting dalam pemuliaan padi secara praktis dan teoritis. Oleh karena itu, banyak upaya dilakukan untuk menghasilkan varietas padi dengan meningkatkan tingkat ketahanan terhadap penyakit (Cho Chan, 2007). India Selatan merupakan salah satu negara yang subur akan tanaman padinya dan telah dikenal sejak lama. Oleh karena itu, plasma nutfah padi asli India Selatan, termasuk bagian Kerala dapat diperkaya dengan keragaman genetik dan sistem gen yang dapat meningkatkan adaptasi hidup dan hasil produksi beras. Pemahaman terperinci mengenai struktur variasi genetik dalam varietas yang berbeda dari spesies yang sama sangat penting untuk pengembangan, konservasi, dan pelestarian kerabat kultivar tanaman padi yang tepat dan efisien. Perkembangan teknik biologi molekuler yang semakin pesat dapat menjadi solusi terhadap kendala pengembangan produktivitas padi serta mempermudah pekerjaan analisis sampai pada tahap molekuler (Bimpong et al. 2011). Menurut Rahman Naima et al. (2007) pemilihan tanaman varietas berdasarkan karakter morfologi terkadang tidak cukup untuk mengetahui karakter utama tanaman yang memiliki heritabilitas rendah dan secara genetik kompleks. Maka penanda molekuler berdasarkan urutan DNA merupakan salah satu cara yang cukup efisien. Penanda DNA yang banyak digunakan untuk alat bantu seleksi ketahanan tanaman adalah Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD), yaitu penanda DNA yang dibangkitkan berdasarkan amplifikasi segmen DNA secara random pada Polymerase Chain Reaction (PCR) dengan menggunakan praimer tunggal yang urutannya arbitrar. RAPD merupakan metode yang pertama kali dijelaskan oleh Welsh, McClelland dan Williams et al. dimana 10 nukleotida fragmen DNA hasil dari amplifikasi PCR dari segmen acak DNA genomic dengan urutan nukleotida primer tunggal mampu dibedakan secara genetis tiap individunya. Teknik RAPD sangat bermanfaat untuk penggunaan di masa depan seperti penyeleksian, hibridisasi, keanekaragaman hayati, evaluasi dan konservasi keanekaragaman

dalam gene pool. Analisis RAPD telah banyak digunakan untuk berbagai tujuan, termasuk identifikasi dan klasifikasi plasma nutfah (Kanawapee et al., 2011). Dalam metode penelitian ini tahap awal yang dilakukan adalah sampling. Delapan varietas padi (O. sativa L) yaitu MO 16 (Uma), PTB 43 (Swarnaprabha), Palakkadan Matta, PTB 40 (Sabari), MO 17 (Revathi), MO 6 (Pavizham), PTB 39 (Jyothi) dan KTR 2 (Cheradi) yang berasal dari lembaga penelitian seperti Penelitian Padi Institute, Mankomb, Universitas Pertanian Kerala, Vellayani, dan berasal dari budidaya padi diberbagai lokasi seperti Kuttanad, Alapuzha dan Palakad. Benih-benih padi yang telah berkecambah dimasukkan ke dalam nampan plastik dengan label nama varian. Setelah dua minggu pertumbuhan kecambah dilakukan pengumpulan daun untuk ekstraksi DNA. Sampel daun diekstraksi dengan menggunakan metode CTAB standar. Setelah presipitasi etanol, DNA itu resuspended dalam 100 l menggunakan TE. Untuk mereduksi RNA, 10 mg RNase A ditambahkan ke dalam larutan DNA dan diinkubasi selama 10 menit pada 37 C. Tahap kedua adalah reaksi RAPD, amplifikasi RAPD dilakukan dalam volume reaksi 25 ml yang mengandung 1 reaksi X buffer (100 mMTris, 500 mM KCl, 0,1% gelatin, pH 9.0) dengan 1,5 mM MgCl2 (Ryodan, Bangalore, India), 5 pM dari primer, 0,2 mM dNTP (dATP, dCTP, dan dTTP dGTP), 2 U Taq DNA polimerase (Ryodan, Bangalore, India) dan 25 ng DNA template. Amplifikasi PCR dilakukan dalam cycler 200 PTC termal (MJ Research, Inc, Watertown, Massachusetts, USA). Campuran reaksi pra-dipanaskan pada 950C selama 3 menit diikuti dengan 40 siklus (940C selama 3 menit, 400C selama 1,30 menit, dan 720C selama 2 menit). Kemudian tahap terakhir reaksi pada suhu 720C selama 10 menit. Produk yang dihasilkan adalah elektroforesis gel agarosa dianalisis melalui 1,5% diwarnai dengan etidium bromida (5 ug / ml) di TBE buffer (90 mM Tris-borat dan 2 mM EDTA, pH 8,0) dan gel didokumentasikan menggunakan Image Guru 1D gel sistem dokumentasi (Amersham Biosciences, New Jersey, USA). Tahap terakhir adalah analisis data dari dokumentasi foto gel bernoda dan menganalisis pola pita dengan menghitung band seperti yang terlihat dalam foto-foto. Produk RAPD direproduksi diberi skor dengan ada (1) atau tidak ada (0) dari fragmen. Band massa molekul yang sama dan mobilitas yang dihasilkan oleh primer yang sama dianggap sebagai lokus identik. Semua fragmen RAPD mencetak dua-alel sistem, yaitu, yang ada sebagai band dominan dan tidak adanya (resesif). Jarak genetik dihitung dengan mengukur jarak genetik Nei objektif

kemudian membentuk dendrogram dengan menggunakan rata-rata aritmatika (UPGMA). Dendrogram tersebut diuji menggunakan 1.000 bootstrap. Filogenetik dideskripsikan dengan PHYLIP menggunakan POPGENE ver. 1,31. Hasil dari penelitian dapat dilihat dari 101 band yang dihasilkan, 28 (27,7%) dari delapan varietas. Sisanya 73 fragmen yang ditemukan polimorfik (72.27%). Untuk keseluruhan varietas, jumlah (ne), (na) dan alel masing-masing adalah 1,66 dan 1,37. Heterozigositas (H) dari semua jenis (H) adalah 0,224. Pada hasil penelitian menunjukkan, varietas KTR 2 (Cheradi) dan Palakkadan Matta memiliki nilai identitas genetik 0,47 dan jarak genetik (0,62). Identitas genetic berkisar antara kurang dari (0,05) atau jarak genetik lebih dari (0,95) ditunjukkan antara varietas PTB 43 (Swarnaprabha) dan MO 6 (Pavizham). Analisis Cluster dengan menggunakan dendrogram UPGMA berdasarkan jarak genetik delapan varietas padi dikelompokkan menjadi dua, cluster 1 2 menurut jarak kedekatan geografis. Cluster 1 meliputi 5 varietas yaitu MO16, PTB 39, MO17, PTB 40, Ptb43. Klaster ini lebih lanjut dibedakan menjadi 2 subclusters dengan subcluster 1 termasuk 2 varietas padi yaitu MO16 dan PTB 39 dan subcluster 2 dengan varietas MO17, PTB 40 dan Ptb 43. Cluster-II mencakup dua varietas lokal 'KTR 2' dan 'palakkadan matta' yang terkait erat dan membentuk independen cluster dengan MO 6. Varietas yang berbeda hybrid dan diambil dari lokasi yang berbeda (geografis terpisah), yang juga menjadi faktor untuk jarak genetik tinggi (Rahman Naima et al., 2007). Keragaman Marker spesifik, Fragmen RAPD ini dapat digunakan sebagai penanda untuk membedakan varietas. 21 fragmen RAPD terdeteksi sebagai varietas-spesifik penanda dalam 10 primer di semua varietas. Primer OPJ 03 tidak menunjukkan berbagai band tertentu. Seperti penanda RAPD spesifik dapat dihasilkan sebagai tag genetik untuk varietas padi di masa depan yang akan membantu dalam budidaya dan program seleksi untuk berbagai spesies. Ketika aliran gen lebih rendah, maka keragaman gen lebih tinggi. Dalam percobaan ini, semua varietas padi yang lebih tinggi menunjukkan genetic jarak (0,7417). Secara singkat, peelitian ini menunujukkan RAPD merupakan salah satu metode yang digunakan sebagai alat yang handal dan berguna untuk megetahui variasi genetic delapan varietas padi (O. sativa). Penemuan ini membuktikan perbedaan genetik pada padi. Pengamatan dan identifikasi spesifik marker merupakan langkah signifikan dalam mewujudkan tujuan berbagai berbasis manajemen dan budidaya dan konservasi sumber daya padi di Semenanjung India.

Dari hasil penelitian ini dapat disimpulkan bahwa RAPD markers merupakan alat yang berpotensi tinggi untuk menganalisis struktur genetik varietas padi yang berbeda. Marker atau penanda tersebut menunjukkan perbedaan genetik mencolok antara pasangan varietas padi diperiksa. Geografis menurut jarak lahan kemungkinan menjadi faktor yang memberikan kontribusi terhadap adanya perbedaan gen antar varietas. Penelitian ini mengungkapkan variasi genetik rata-rata antara varietas padi diperlukan berbagai kebijaksanaan dalam teknik budidaya, konservasi dan propagasi serta pemilihan atau seleksi populasi alami beras (O. sativa).