ANALISIS KERAGAMAN NANAS (Ananas cosmosus L.

)
DENGAN RAPD (Random Amplified Polymorphism DNA)

ANGGRAINI PUTRI UTAMI

P051190061

PROGRAM STUDI BIOTEKNOLOGI

SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2020
 2

PENDAHULUAN

Latar Belakang

Studi mengenai keragaman genetik tanaman mempunyai peranan penting

untuk meningkatkan efektivitas dalam program pemuliaan tanaman. Informasi
mengenai keragaman genetik tanaman nenas basil persilangan sangat diperlukan
dalam kegiatan seleksi (Nasution et al. 2009). Nenas (Ananas comosus L.)
merupakan salah satu buah unggulan di Indonesia. Hal ini mengacu pada
besarnya produksi nenas yang menempati urutan ketiga setelah pisang dan
mangga, produksinya mencapai 1.729.600 ton dengan produktivitas 117,71
ton/ha pada tahun 2015 ( Hadiati et al. 2016).
Produksi dan produktivitas nenas dapat ditingkatkan melalui penggunaan
varietas unggul. Varietas unggul dapat diperoleh dengan cara seleksi terhadap
klon-klon yang berkembang di masyarakat atau klon lokal, introduksi, maupun
perakitan varietas (Borojević 1990; Hadiati et al. 2018). Perakitan varietas
membutuhkan variabilitas fenotipik dan genotipik yang luas, untuk mengetahui
informasi tersebut maka dilakukan kegiatan karakterisasi atau identifikasi.
Karakterisasi merupakan kegiatan mendeskripsikan semua informasi yang
dimiliki oleh setiap individu (Rugayah 2006). Hasil identifikasi tersebut juga
dapat digunakan untuk mengetahui jarak genetik dan hubungan kekerabatan
melalui analisis kluster (Hadiati et al. 2009).
Analisis keragaman pada tanaman nenas telah dilaksanakan oleh beberapa
peneliti. Analisis keragaman nenas ini didasarkan pada penanda morfologi,
penanda isozim dan penanda molekuler. Ruas et al. (2001) melalui penanda
RAPD telah memperoleh koefisien kemiripan rata-rata aksesi Ananas comosus
sebesar 0.85, sementara Ananas lucid us sebesar 0.75. Popluechai et al. (2007)
berhasil mengelompokkan tiga kelompok kultivar nenas di Thailand melalui
penanda RAPD dengan kemiripan 0.64 hingga 0.96 (Nasution et al. 2009).
Kebijakan pemerintah saat ini berpusat pada peningkatan produksi dan
pemrosesan barang-barang pertanian seperti nanas. Untuk mewujudkan tujuan
ini, sektor pertanian harus fokus pada peningkatan produksi dan penyebaran
produk yang berkualitas dan industri nenas pilihan. Dengan adanya tantangan
ini, penting untuk mengkarakterisasi secara genetik kultivar nenas yang akan
diadaptasi secara lokal untuk memastikan keanekaragaman dan identitas mereka
(Makaranga et al. 2018)
Analisis keragaman dengan penanda molekuler yang tepat akan dapat
menganalisa secara pasti tingkat dari keragaman genetik karena konsisnten dan
tidak terpengaruh lingkungan (Brar 2002). Salah satu penanda molekuler adalah
RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA). Teknik sederhana penanda
molukuler DNA dengan RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) telah
digunakan untuk menuntukan hubungan filogenik pada tanaman (Sripaoraya et
al. 2001). RAPD merupakan teknik yang cepat dan mudah dilakukan
 3

dibandingkan teknik molekuler lain dikarenakan sekuen DNA sebelumnya dan

material tanaman yang dibutuhkan lebih.
Pada praktikum ini sebelum diintefikasi keragaman dengan RAPD terlebih
dahulu akan akan dilakukan PCR. Polymerase Chain Reaction (PCR) merupakan
teknik sintesis dan amplifikasi DNA secara in vitro. Adapun komponen PCR
terdiri dari dNTPs, DNA template, oligonukleotida primer, DNA polimerase,
serta buffer PCR (Watson et al., 2004). Tahapan utama dalam reaksi PCR yaitu
denaturasi, annealing, dan elongasi (Weaver, 2001).

Tujuan

Praktikum ini bertujuan mengidentifikasi keragaman genetik pada tanaman

nanas (Ananas comosus L. ) dengan teknik Random Amplified Polymorphic DNA
(RAPD).

METODE

Tempat dan Waktu

Praktikum ini dilaksanakan pada tanggal 08 April 2020 di Laboratorium
Biotechnology Research Indonesia-The Nedherland (BIORIN) lantai 4 gedung
Pusat Antar Universitas (PAU), IPB University.

Bahan dan Alat

Alat-alat yang digunakan pada praktikum ini antara lain, tabung mikro 1.5
mL steril, pipet mikro, tip, mikro pipet, mesin PCR, Gel-Doc system, marker.
Bahan yang digunakan adalah DNA tanaman nanas 10 sampel
(A,B,C,D,E,F,G,H,I,J), master mix, primer (OPA 04, 09, dan 13) dan ddH2O, gel
agarosa, EtBr, dan buffer TAE 1×

Prosedur

PCR Sampel Nanas

Sebanyak 10 sampel DNA nanas diamplifikasi menggunakan teknik PCR
dengan primer OPA-04, OPA-09, dan OPA-13. Amplifikasi DNA nanas
direaksikan dalam volume 10 μl untuk setiap primer yang terdiri atas 3.5 µl
ddH2O steril, 5 µL master mix, primer 10 pmol/µl masing-masing sebanyak 0.5
μl, serta 1 µl DNA cetakan 100ng/µl. Reaksi PCR dilakukan dengan tahapan
sebagai berikut: denaturasi awal pada suhu 940C selama 2 menit, dilanjutkan
dengan 35 kali siklus denaturasi pada suhu 940C selama 1 menit, annealing
(penempelan primer) pada suhu 370C selama 1 menit, dan elongasi pada suhu
720C selama 2.5 menit. Selanjutnya elongasi akhir pada suhu 720C selama 7
menit dan pendinginan pada suhu 250C selama 10 menit.
 4

Uji Elektroforesis Hasil PCR

Amplikon hasil PCR divisualisasikan dengan elektroforesis gel agarosa
1%. Gel agarose 1% dibuat dengan mensuspensikan 0.35 gram agarose ke dalam
buffer TAE 1x sebanyak 35 ml (Tris-HCl pH 8.3 40 mM, asam asetat pekat 1.98
mM, EDTA 1 mM), dipanaskan pada microwave 100oC hingga jernih selama 1
sampai 2 menit. Setelah suhu gel agarose tidak terlalu panas, gel dicetak dengan
menggunakan gel tray (cetakan gel) dan dipasang sisir untuk membuat sumuran.
Setelah gel mengeras, sisir dilepas kemudian gel dipindah ke dalam
electroforesis chamber dan direndam dalam bufer TAE 1x hingga setinggi 1-2
mms di atas gel.
Pada sumur pertama dimasukan penanda kuantitas (marker 1 kb)
sebanyak 2,5 µL, pada sumur selanjutnya dimasukan 30 sampel (3 primer, 1
primer 10 sampel) hasil PCR sebanyak 10 µl. Selanjutnya running dengan
tegangan 100 volt selama 45 menit (DNA bergerak dari muatan negatif ke
positif). Setelah itu gel direndam dalam larutan EtBr (Etidium Bromide) selama
10 menit. Setelah itu, dibilas dengan akuades. Gel hasil elektroforesis diamati
dibawah GelDoc/Transluminator. Jumlah pita DNA hasil PCR setiap sampel
dibandingan dengan yang lainnya untuk mengindentifikasi keragaman
genetiknya.
Analisis Kekerabatan Genetik Nanas
Amplikon DNA nanas yang telah divisualisasi dengan elektroforesis
kemudian dianalisis kekerabatan genetiknya. Sebelum dianalisis, data yang
diperoleh dilakukan pemberian skor (skoring) terhadap elektroforegram. Skoring
dilakukan dengan cara memberikan nilai 1 jika terdapat pita pada panjang basa
tertentu dan memberikan nilai 0 jika tidak terdapat pita pada panjang basa
tersebut. Proses skoring dilakukan di Microsoft Excel dan dianalisis lebih lanjut
menggunakan program NTSYSpc version 2.02 untuk mendapatkan dendrogram
kekerabatan genetic tanaman nanas. Rumus kemiripan genetic yang digunakan
yaitu kemiripan genetic SM

HASIL DAN PEMBAHASAN

Variasi genetik menggambarkan keragaman fenotipe di alam. Variasi

genetik di alam dapat terjadi karena adanya mutasi atau rekombinasi. Variasi
genetik dapat diketahui dengan melihat perbedaan urutan basa-basa. Perbedaan
urutan basa tersebut mengakibatkan adanya polimorfisme pada DNA.
Polimorfisme adalah banyaknya fragmen DNA yang berbeda berdasarkan
ukuran, karena adanya marka-marka yang tersebar pada seluruh genom (Sijapati,
2008).
Praktikum ini menggunakan 14 sampel DNA nanas (Ananas comosus L.)
yang telah diisolasi dari tanamannya pada praktikum genetika molekulur
semester lalu. Primer yang digunakan yaitu OPA4, OPA9 dan OPA13. Marker
yang digunakan merupakan marker ladder 1kb. Hasil analisis DNA pada daun
nanas dengan metode RAPD menggunakan amplifikasi dari primer OPA 4, 9 dan
 5

13 didapatkan 27 total fragmen DNA. Pita-pita DNA yang teramplifikasi terletak

pada posisi antara 250 bp dan 3000 bp. Jumlah fragmen DNA yang diproduksi
untuk setiap primer yaitu masing- masing terdapat 9 fragmen DNA(Gambar 1).
Jumlah pita polimorfis terbanyak terdapat pada primer OPA 13 yaitu terdapat 14.
Primer OPA 4 memiliki 11 lokus, dan primer OPA 9 memiliki 9 lokus (lampiran).

OPA-04 OPA-09
M A B C D E F G H I A B C D E F G H I

OPA-13
M A B C D E F G H I

Gambar 1 Visualisasi hasil elektroforesis gel agarose 1% PCR

menggunakan primer OPA4, 9 dan 13. A-I= sampel Nanas,
M = marker ladder 1 kb

Pita polimorfik merupakan pita yang tidak terdapat pada seluruh sampel.
Persentase pita polimorfik yang tinggi menunjukkan tingginya variasi pada setiap
 6

analisis keragaman yang diteliti (Sinaga et al. 2017). Setiap jumlah pita
polimorfik hasil amplifikasi berbeda-beda. Semakin banyak pita polimorfik yang
dihasilkan akan semakin mudah untuk mengamati adanya variasi. Pita polimorfik
terbentuk dari perbedaan ukuran pita yang terbentuk pada setiap sampel yang
diteliti. Pola pita yang terbentuk oleh setiap sampel unik dan berbeda-beda
(Azizah 2009. Hal ini menunjukkan adanya variasi genetik dari sampel.
Perbedaan pola pita dapat ditunjukkan dalam perbedaan jumlah pita yang
dihasilkan. Perbedaan pola pita dapat menggambarkan perbedaan genetik sampel
(Agustian 2008). Pita monomorfik merupakan pita yang ada pada semua sampel
yang diamati dan memisah pada jarak yang sama. Pada praktikum ini semua
primer yaitu OPA 4, 9 dan 13 tidak ada pita sampel semuanya termasuk pita
polimorfik, tidak ada pita dari sampel yang termasuk pita monomorfik.
Pada (Gambar 1) memperlihatkan bahwa pada setiap primer tidak semua
ada fragmen yang muncul, ini mungkin disebabkan tidak terjadinya amplifikasi,
dapat terjadi karena primer yang digunakan tidak sesuai dengan DNA cetakan.
Beberapa bukti percobaan menunjukkan bahwa perbedaan satu pasang basa saja
sudah cukup menyebabkan ketidaksesuaian cetakan primer yang kemudian
mencegah amplifikasi.
Hasil dari amplifikasi PCR yang didapat, selanjutnya dilakukan skoring
terhadap pita DNA yang muncul (lampiran), dan kemudian dianalisis terhadap
kekerabatan melalui program NTSys. Hasil analisis berbentuk pohon
kekerabatan atau dendogram (Gambar 2). Berdasarkan dendogram dapat dilihat
bahwa koefisien kemiripan genetic antar individu yang digunakan berkisar antara
0.48-0.94.
Pada tingkat kemiripan atau taraf kesamaan 0.71 terdapat 4 klaster
dengan jumlah jumlah individu dari klaster tersebut bervarisasi yaitu antara A-I.
pada klaster 1 terdapat individu A dan C, pada klaster 2 terdapat individu F.
Klaster 3 terdapat individu B,G,D dan E dan klaster 4 terdapat individu H dan I..
Menurut Olivier et al. (1995) nilai similaritas berkisar antara 0 sampai 1,0 dan
hubungan kekerabatan dekat apabila nilai similaritas mendekati 1.
Kemiripan genetik merupakan kebalikan dari jarak genetik. Makin kecil
nilai tingkat kemiripan, memiliki indikasi makin jauhnyakekerabatan genetik
sampel yang diuji. Informasi ini sangat berarti dalam kegiatan pemuliaan di mana
semakin jauh jarak genetik yang dimiliki suatu sampel dengan sampel yang lain
akan meningkatkan peluang mendapatkan keragaman genetik. Apabila
diaplikasikan dalam budidaya pemuliaan nanas, hal ini menunjukkan bahwa
antara nanas yang diuji diatas tidak bisa digunakan dalam persilangan karena
memiliki tingkat keragaman yang rendah (Hardiyanto et al. 2008; Hidayah
2017).
 7

Gambar 2 Hasil analisis hubungan kekerabatan 9 spesies nanas dengan program

NTSys2,1.

KESIMPULAN

Berdasarkan hasil pengamatan praktikum analisis keragaman nanas

(Ananas cosmosus L.) dengan RAPD (Random Amplified Polymorphism DNA)
hubungan kekerabatan genetik antar individu yang digunakan tarf kesamaannya
berkisar antara 0.48-0.94.

DAFTAR PUSTAKA

Agustian A. 2008. Karakterisasi variasi genetik Jatropha curcas L. dengan

menggunakan marka molekular Amplified Fragment Length
Polymophism (AFLP). Departemen Biologi. FMIPA UI. Jakarta.
Azizah A. 2009. Perbandingan Pola Pita Amplifikasi Dna Daun, Bunga Kelapa
Sawit Normal dan Abnormal. Institut Pertanian Bogor . Bogor.
Borojević, S & others.1990.Principles and methods of plant breeding, Elsevier,
Amsterdam.
Brar DS. 2002. Molecular marker assisted breeding. In: Molecular Techniqeus in
Crop Improvement (edited by S.M. Jain, D.S. Brar and B.S
Ahloowalia). Kluwer Academic Publisher. London
 8

Hadiati S, Riry P, Ellina M. 2018. Identifikasi molekuler dan analisis kerabatan

aksesi nenas menggunakan marka RAPD menunjang perakitan
varietas unggul baru. J. Hort. 28(1) 1 -12.
Hardiyanto NF, Devy, dan Martasari C. 2008. Identifikasi Kekerabatan Genetik
Klon-klon Bawang Putih Indonesia Menggunakan Isozim dan RAPD.
J. Hort. 18(4): 385-394
Hidayah M. 2017. Isolasi DNA genom dan identifikasi kekerabatan genetic
nanans menggunakan RAPD (Random Amplified Polimorfic DNA).
Agritop. (15) 1.
Makaranga A, Miccah SS, Ayub N, Emmarold EM, George M, Kusirieli L. Aron
G, Lilian M, Andrew K, Emmanuel M, Theodosy JM. 2018. Diversity
and genetic identity of pineapple (Ananas comosus (L.) Merr.) in
Tanzania based on microsatellite markers. African Journal of
Biotechnology
Nasution MA, Poerwanto R, Surachman M, Trikoesoemaningtyas. 2009. Studi
keragaman genetik nenas (Annanas Cosmusus L. Merr) hasil
persilangan berdasarkan penanda RAPD. Kumpulan makalah seminar
ilmiah perhorti.
Popluechai S, Onto S, Eungwanichayapant PD. 2007. Relationships between
some Thai cultivars of pineapple (Ananas comosus) revealed by RAPD
analysis, Songklanakarin Journal of Science and Technology. (29) 6.
Ruas, CF, Ruas, PM, Cabral, JRS. 2001, Assessment of genetic relatedness of
the genera Ananas and Pseudananas confirmed by RAPD markers,.
Euphytica. (119) 3 : 245–252.
Rugayah. 2006.Eksplorasi, koleksi, karakterisasi, evaluasi, konservasi, dan
pemanfaatan sumber daya genetic. Prosiding workshop penguatan
sistem pengelolaan sumber daya genetik hortikultura lingkup
Puslitbang Hortikultura, Puslitbang Hortikultura, Jakarta : 10–18.
Sijapati J, Rana N, Rana P, Shrestha S. 2008. Optimization of RAPD-PCR
Conditions for the Study of Genetic Diversity in Nepalese Isolates of
Bacillus thuringiensisBerliner. Nepal Journal of Science and
Technology. 9: 91-97.
Sinaga A, Lollie AP, Putri, Mbue KB. 2017. Analisis pola pita andaliman
(Zanthoxylum Acanthopodium D.C) berdasarkan primer OPD 03, OPD
20, OPD 07, OPM 20, OPN 09. Jurnal Agroekoteknologi. (5)1 : 55-
64.
Spipaoraya S. Blackhall. NW, Marchant R. Power JB. Lowe KC, Davey MR.
2001. Relationship in pineapple by random amplified polymorphic
DNA (RAPD) analysis. Plant Breeding. 120 : 265-267
Watson JD, Baker TA, Bell SP, Gann A, Levine M, Losick R. 2004. Molecular
Biology of the Gene Fifth Edition. USA: Pearson Education Benjamin
Cummings. Weaver, Robert F. 2001. Molecular Biology Fifth Edition.
USA: The McGrawHill.
Weaver, Robert F. 2001. Molecular Biology Fifth Edition. USA: The
McGrawHill.
 9

LAMPIRAN

Primer OPO4
Jumlah Locus
sampel 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
A 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0
B 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
C 1 1 1 1 1 1 1 0 0 1 1
D 0 0 1 1 1 0 0 0 0 0 0
E 0 0 1 1 1 0 0 0 0 0 0
F 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0
G 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
H 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
I 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
Primer OPA 9
Jumlah Locus
sampel 1 2 3 4 5 6 7 8 9
A 0 1 1 0 1 1 1 1 0
B 0 1 0 0 0 0 0 0 0
C 0 1 1 1 1 1 1 1 0
D 0 1 1 0 1 1 0 0 0
E 0 1 0 0 0 0 0 0 0
F 0 1 0 0 1 1 0 0 0
G 0 1 0 0 1 0 0 0 0
H 1 1 0 0 1 1 0 1 1
I 0 1 1 0 1 1 1 1 0
Primer OPA 13
Jumlah Locus
sampel 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
A 1 0 1 0 1 0 1 1 0 1 10 1 0 0
B 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0
C 1 0 1 0 1 0 1 1 0 0 0 1 0 0
D 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0
E 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0
F 1 0 1 0 1 0 1 0 1 0 1 1 0 1
G 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
H 1 0 0 1 1 1 0 0 1 0 0 1 1 0
I 1 1 0 1 1 1 0 0 1 0 1 1 0 0