)
BERDASARKAN RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) DAN PENANDA
MOLEKULER GEN PSY (Phytoene Synthase)
Abstrak
Buah mangga merupakan buah musiman yang penting karena merupakan buah komersial yang
digemari oleh masyarakat. Karakterisasi molekuler dalam pemuliaan tanaman perlu dilakukan untuk
menyeleksi tanaman mangga berdasarkan RAPD dan penanda molekuler gen PSY. Marka RAPD
sering digunakan pada tahap awal penyeleksian tanaman karena relatif cepat dan murah. Namun,
penggunaan RAPD berdasarkan kandungan beta karoten buah masih belum diteliti. Oleh karena itu,
penelitian ini bertujuan untuk mengetahui variasi genetik beberapa varietas mangga berdasarkan
RAPD dan penanda molekuler gen PSY.
Sampel yang digunakan dalam penelitian ini adalah 4 varietas mangga yang masing-masing
mewakili warna kulit buah yang berbeda, yaitu Garifta Merah, Gedong Gincu, Podang Kuning dan
Arumanis. Primer RAPD yang digunakan adalah OPA 12, OPA 13 dan OPL 17. Amplifikasi gen PSY
menggunakan 2 primer yang didesain dari sekuen gen PSY mangga Jinhuang dari Cina. Tahap
penelitian meliputi ekstraksi DNA, amplifikasi DNA, analisa variasi genetik dengan software Popgen
3.2 dan pembuatan dendogram dengan NTSys 2.01. Parameter data dalam penelitian ini adalah
konsentrasi dan kemurnian DNA genom, jumlah dan panjang pita hasil amplifikasi DNA, persentase
lokus polimorfik, jarak genetik dan dendogram hubungan kekerabatan.
Hasil penelitian menunjukkan bahwa DNA genom hasil isolasi memiliki konsentrasi DNA
antara 115,46 sampai 342, 23 ng/µl dan kemurniannya yaitu 1,5558 sampai 2,0702. Amplifikasi DNA
dengan primer RAPD menghasilkan 23 pita dengan panjang antara 180 sampai 2500 bp, diantaranya
21 pita polimorfik dengan persentase 91,3%. Nilai jarak genetik terdekat adalah 0,3629 yaitu antara
Garifta Merah dengan Gedong Gincu dan Garifta Merah dengan Podang Kuning, sedangkan nilai jarak
genetik terjauh adalah Garifta Merah dengan Arumanis yaitu 1,3437. Dendogram hubungan
kekerabatan menunjukkan bahwa Garifta Merah berkerabat dekat dengan Gedong Gincu dengan
koefisien kemiripan 0,73. Podang Kuning memiliki koefisien kemiripan 0,64 dengan kelompok
Garifta Merah dan Gedong Gincu. Sedangkan Arumanis memiliki koefisien kemiripan 0,36 dengan
varietas lainnya. Sedangkan, hasil amplifikasi gen PSY hanya menghasilkan pita pada sampel Garifta
Merah saja dengan ukuran 400 bp.
Kata Kunci : variasi genetik mangga (Mangifera indica L.), RAPD, gen PSY, warna kulit buah, beta
karoten
PENDAHULUAN
Indonesia merupakan negara mega oleh masyarakat sehingga menjadikan mangga
biodiversitas karena memiliki kawasan hutan sebagai buah yang bernilai komersial.
tropika basah dengan tingkat keanekaragaman Dalam rangka peningkatan kualitas
hayati yang tinggi di dunia. Keanekaragaman mangga, pemerintah dan pemulia tanaman
hayati yang tinggi meliputi berbagai jenis mangga melakukan upaya pemuliaan tanaman
tanaman, termasuk tanaman buah tropis, yaitu mangga. Pemuliaan tanaman mangga selama
buah mangga (Coronel, 1996). Mangga bertahun-tahun menghasilkan ratusan tanaman
merupakan tanaman tropis dengan komoditas mangga hibrida. Tetapi, evaluasi tanaman
buah yang paling penting di pasar Eropa dan mangga hibrida tersebut memerlukan waktu
Amerika. Buah mangga merupakan sumber ß- yang lama. Tanaman mangga seperti
karoten (pro vitamin A) dan vitamin C yang kebanyakan spesies pohon lainnya memiliki
bagus (Crozier et.al, 2006). Berbagai periode juvenile yang lama yaitu 7 tahun dan
kandungan buah mangga yang bermanfaat dan waktu yang diperlukan untuk mengevaluasi
rasanya yang enak membuat mangga digemari hasil hibrida dapat mencapai 12 tahun. Oleh
karena itu, diperlukan metode efisien yang
1
tidak bergantung pada tahap perkembangan varietas mangga berdasarkan RAPD dan
tumbuhan (Wardiyati, 2010). penanda molekuler gen PSY.
Karakterisasi molekuler dapat
mempercepat proses seleksi tanaman mangga METODE PENELITIAN
(Liu et.al, 2006). Penanda molekuler yang Isolasi DNA dilakukan pada daun muda
sering digunakan adalah RAPD (Random mangga dengan menggunakan metode CTAB
Amplified Polymorphic DNA) karena relatif (Cethyl Trimethyl Ammonium Bromida)
cepat, murah dan sampel yang digunakan dapat (Azmat et. al, 2012) yang dimodifikasi.
dengan jumlah besar. Namun, primer RAPD Amplifikasi DNA dengan primer RAPD (OPA
bersifat acak karena panjang basanya hanya 10 12, OPA 13, OPL 17) sebanyak 35 siklus
bp, sehingga tidak semua primer RAPD bisa terdiri dari tahap denaturasi 94oC selama 45
menghasilkan pita amplifikasi yang detik, annealing pada suhu 36oC selama 30
polimorfik. detik, extension pada suhu 72oC selama 2
Manchekar (2008) telah mengevaluasi menit. Setelah itu sintesis tambahan 72oC
variasi genetik pada klon mangga Alfonso selama 7 menit dan akhir dari seluruh siklus
dengan menggunakan marka RAPD yang dikondisikan pada suhu tetap 4oC. Amplifikasi
dibandingkan dengan karakterisasi fenotipe DNA dengan primer gen PSY (Primer 1 F 5’
buah secara fisik dan kimia. Salah satu ATG TCT GTG GCT TTG CTA TGG 3’,
karakter buah yang diamati pada penelitian primer 1 R 5’ TAA CAG TGC TTT TCT GGA
Manchekar (2008) adalah kandungan asam GGG 3’ dan primer 2 F 5’ TGA AGC AGG
askorbat (vitamin C). Berdasarkan penelitian CAG CCT TGG T 3’ dan Primer 2 R 5’GCA
Masithoh (2008), karoten total dan vitamin C TCC TCT CCA ACA TCC C3’) Panjang basa
mengalami kenaikan signifikan ditandai yang dihasilkan primer 1 adalah 1280 bp
dengan perubahan warna buah menjadi lebih sedangkan panjang produk amplifikasi primer
merah atau oranye, sedangkan asam sitrat akan 2 adalah 622 bp denaturasi awal 95oC selama 5
mengalami penurunan secara signifikan selama menit dilanjutkan dengan 35 siklus terdiri dari
pematangan buah. Hal ini menunjukkan bahwa tahap denaturasi 97oC selama 10 detik,
kandungan vitamin C berkorelasi positif annealing pada suhu antara 50-60 oC selama 1
dengan kandungan karoten, sehingga menit, extension pada suhu 72oC selama 1
kemungkinan primer RAPD yang digunakan menit. Setelah itu sintesis tambahan 72oC
oleh Manchekar (2008) juga bisa digunakan selama 8 menit dan akhir dari seluruh siklus
untuk mengelompokkan mangga berdasarkan dikondisikan pada suhu tetap 4oC.
kandungan karoten buahnya. Elektroforesis hasil isolasi pada gel agarose
Penyeleksian tanaman mangga dengan 0,8%, sedangkan hasil amplifikasi pada gel
marka umum pada tahap awal perlu 2%.
dilanjutkan dengan marka spesifik agar Data yang didapatkan berupa
menghasilkan data yang lebih akurat. Namun, konsentrasi dan kemurnian DNA hasil isolasi,
sampai saat ini belum ditemukan marka jumlah dan ukuran pita DNA hasil amplifikasi.
molekuler spesifik yang dapat membantu Data pita hasil amplifikasi dengan primer
penyeleksian tanaman mangga berdasarkan RAPD dianalisis dengan software Popgen
warna kulit buahnya, sehingga perlu dilakukan ver.1.32 untuk mengetahui variasi genetik dan
upaya pengembangan marka molekuler jarak genetiknya. Pembuatan dendogram
spesifik. Primer spesifik dapat didesain dari dengan software NT-Sys ver. 2.0.1 dengan
salah satu gen yang bertanggungjawab secara Indeks similaritas berdasarkan koefisien
langsung dalam warna buah. perhitungan Similarity of Qualitative Data
Gen PSY merupakan gen yang (SYMQUAL). Analisis klaster dibuat dengan
mengkode enzim phytoene synthase yang perhitungan Sequential Aglomerative
merupakan enzim kunci dalam biosintesis Heirarchical and Nested (SAHN) berdasarkan
senyawa karotenoid karena mengawali un-weighted pair group method with
biosintesis beta karoten dengan mengubah aritmatical averages (UPGMA) dari indeks
geranyl geranyl diphosphate (GGDP) menjadi similaritas. Sedangkan analisis data hasil
phytoene (Fuad, 2010). Penelitian ini bertujuan amplifikasi dengan primer gen PSY berupa
untuk mengetahui variasi genetik beberapa panjang produk pita. Panjang basa yang
dihasilkan primer 1 adalah 1280 bp sedangkan
2
panjang produk amplifikasi primer 2 adalah
622 bp.
A B
Gambar 2. A. Hasil amplifikasi DNA dengan
primer OPA 12. B. Zimogram hasil
amplifikasi DNA dengan primer OPA
12. Keterangan M= marker 100bp,
Gambar 1. Hasil elektroforesis isolasi DNA.
sampel 1 Garifta Merah, sampel 2
Keterangan sumur : sumur 1 Garifta
Gedong Gincu, sampel 3 Podang
Merah, sumur 2 Gedong Gincu, sumur 3
Kuning, sampel 4 Arumanis
Podang Kuning dan sumur 4 Arumanis.
Amplifikasi DNA dengan primer OPA
Berdasarkan gambar 1 dapat diketahui
12 menghasilkan 6 pita polimorfik, namun
bahwa DNA berhasil diisolasi dengan
primer ini tidak dapat mengamplifikasi sampel
munculnya pita. Sampel DNA yang
1 (Garifta Merah) dan sampel 2 (Gedong
konsentrasinya tinggi adalah sampel 1,
Gincu). Dimungkinkan bahwa sampel 1 dan
sedangkan yang paling rendah adalah sampel
sampel 2 tidak memiliki sekuen yang cocok
4. Hasil ini sesuai dengan uji kuantitatif
dengan primer OPA 12.
dengan spektrofotometer (tabel 1).
3
Primer OPA 13 dapat mengamplifikasi 30%. Persentase ini sangat tinggi karena
semua sampel DNA mangga. Amplifikasi mendekati 100%. Dapat disimpulkan bahwa
DNA dengan primer OPA 13 menghasilkan 12 ketiga primer yang digunakan pada penelitian
pita yang polimorfik dan 1 pita monomorfik. ini sangat bagus untuk analisis variasi genetik
mangga.
PENUTUP
Kesimpulan
Berdasarkan hasil penelitian variasi
genetik antar varietas mangga dengan teknik
RAPD menggunakan primer OPA 12, OPA 13
dan OPL 17 dapat disimpulkan bahwa variasi
genetik empat varietas mangga cukup tinggi,
Gambar 7. Hasil amplifikasi gen PSY dengan dengan nilai jarak genetik terdekat adalah
menggunakan primer 2. 0,3629 yaitu antara Garifta Merah dengan
Gedong Gincu dan Garifta Merah dengan
Hasil amplifikasi menunjukkan bahwa Podang Kuning, sedangkan nilai jarak genetik
sampel yang dapat teramplifikasi adalah terjauh adalah Garifta Merah dengan Arumanis
sampel 1 (Garifta Merah) menghasilkan pita yaitu 1,3437. Dendogram hubungan
dengan panjang 400 bp. Hasil optimasi suhu kekerabatan menunjukkan bahwa Garifta
annealing menunjukkan bahwa suhu yang Merah berkerabat dekat dengan Gedong Gincu
dapat digunakan untuk amplifikasi gen PSY dan Podang Kuning, sedangkan Arumanis
dengan primer 2 adalah suhu 50,5oC. Hasil berkerabat jauh dengan ketiga varietas
amplifikasi ini lebih pendek dari target produk tersebut.
yang sudah didesain. Belum bisa dipastikan Primer gen PSY yang didesain pada
bahwa yang teramplifikasi tersebut adalah gen penelitian ini belum bisa digunakan untuk
PSY karena produk amplifikasi tidak sesuai menganalisis variasi genetik mangga karena
dengan yang didesain. amplifikasi gen PSY dengan primer 2 hanya
Terdapat beberapa faktor yang menghasilkan 1 pita pada varietas Garifta
menyebabkan tidak berhasilnya amplifikasi Merah. Pita hasil amplifikasi tersebut belum
PCR yaitu komposisi PCR (kerusakan pada dapat dipastikan merupakan gen PSY karena
enzim Taq Polimerase), suhu annealing, panjang basanya tidak sesuai dengan produk
primer yang tidak sesuai dan kualitas DNA primer yang didesain.
6
Saran Fuad, Asrul Muhammad, dkk. 2010.
1. Perlu dikembangkan teknik isolasi DNA Penapisan Klon DNA Penyandi
genom mangga untuk menghasilkan DNA Enzim Biosintesis Karotenoid Untuk
genom dengan kemurnian tinggi. Pengembangan Ubi Kayu Transgenik
2. Perlu digunakan primer RAPD yang lebih Tinggi Beta Karoten. Bogor :
banyak untuk menganalisis variasi genetik Program Insentif Peneliti Perekayasa
mangga. L1PI
3. Perlu optimasi penggunaan PCR mix untuk
menemukan komposisi yang sesuai dalam Azmat, Muhammad Abubakkar. Cheema,
proses amplifikasi gen PSY. Hafiza Masooma N. Rajwana, Ishtiaq
4. Perlu dilakukan sekuensing pita hasil Ahmad. Khan, Ahmad Sattar. Khan,
amplifikasi dengan primer gen PSY untuk Asif Ali. 2012. Extraction of DNA
mengklarifikasi apakah yang teramplikfikasi suitable for PCR application from
adalah gen PSY atau bukan. mature leaves of Mangifera indica L.
Journal of Zheijang University-
DAFTAR PUSTAKA Science B (Biomedicine and
Biotechnology). Vol.13 (4): 230-243.
Coronel, R. 1996. Status Report on Fruit
Species Germplasm Conservation Weising K, Nybom H, Wolff K, Kahl G. 2005.
and Utilization in Southeast Asia. In: DNA Fingerprinting in Plants
Expert Consultation on Tropical Principles, Methods and
fruits Species of Asia. (Ed) Arora, Applications. Boca Raton: CRC
R.K. dan V.R. Rao. IPGRI – New Press.
Delhi
Pratiwi, Putri. 2012. Analisis Variasi Genetik
Crozier, A. M. N. Clifford dan H. Ashihara. Beberapa Populasi Globba leucantha
2006. Plant Secondary Metabolites. Miq. Di Sumatera Barat dengan
Oxford: Blackwell Publishing Ltd. RAPD. Tesis. Sumatera ; Universitas
Andalas.
Wardiyati, Tatik, Arumingtyas, E. L., Roviq,
M. 2010. Evaluation Of Scar18 Liu JJ, Ekramoddoullah AKM, Hunt R, Zainal
Marker Linked To Β-Carotene For A. 2006. Identification and
Early Screening Of Mango characterization of RAPD markers
(Mangifera Indica L.) Progenies. linked to a major gene (Cr2) for
AGRIVITA. Vol. 32 No. 3 resistant to Cronartium ribicola
(Fish) in Pinus monticola (D.Don).
Manchekar, Makarand Dhandu. 2008. Mango Phytopathology. Vol. 96:395-399.
(Mangifera indica L.) by Phenotipic
Characters and Molecular Markers. Yuwono, T. 2006. Teori dan Aplikasi
Thesis. Department of Horticulture Polymerase Chain Reaction.
College of Agriculture, Dharwad Yogyakarta: Kanisus.
University of Agricultural Sciences.
Masithoh, Rudiati Evi, Rahardjo, Budi. Mlalazi, Bulukani. 2010. Defining the role of
Sutiarso, Lilik. Harjoko, Agus. 2013. phytoene sunthase in carotenoid
Model Kinetika Perubahan Kualitas accumulation of high provitamin A
Tomat Selama Penyimpanan. Jurnal bananas. Thesis. Queensland
Teknologi Pertanian. Vol. 14. No. 1 University of Technology.