1.

PENDAHULUAN Produk biologi sangat penting untuk banyak aplikasi termasuk

biotransformasi, diagnostik, penelitian dan pengembangan, dan dalam makanan, farmasi, dan industri kosmetik. Untuk aplikasi tertentu, produk biologi dapat digunakan sebagai ekstrak kasar dengan pemurnian sedikit atau tidak ada. Namun, biasanya biopharmaceuticals membutuhkan kemurnian yang tinggi, membuat pengolahan Dari hilir merupakan pandang komponen penting dari proses sendiri keseluruhan. sudut peraturan, proses produksi

mendefinisikan produk biofarmasi definisi render yang tepat yang efektif dan pengolahan hilir efisien langkah awal penting dalam proses pembangunan. Saat ini, protein adalah biopharmaceuticals paling penting. Sejarah perkembangan mereka sebagai produk industri akan kembali lebih dari setengah abad. Darah fraksinasi plasma adalah skala pertama biofarmasi industri dengan produksi tahunan saat ini di 100 - skala ton [1, 2]. Pengendapan dengan pelarut organik telah dan terus menjadi alat pemurnian utama dalam plasma fraksinasi, meskipun, baru-baru ini, proses pemisahan kromatografi juga telah telah diintegrasikan ke dalam industri ini. Anti - racun dan anti antibodi lainnya racun diambil dari sumber hewani adalah contoh tambahan biopharmaceuticals awal, juga dimurnikan dengan Sebaliknya, saat ini kombinasi presipitasi, filtrasi dan kromatografi. biopharmaceuticals secara eksklusif hampir seluruh

diproduksi oleh teknologi rekombinan DNA. Kromatografi dan filtrasi membran yang berfungsi sebagai alat utama untuk pemurnian dalam produk ini. Gambar 1.1 menunjukkan bahwa pada tahun 2006 terdapat berbagai biopharmaceuticals. Sekitar satu - ketiga adalah antibodi atau fragmen antibodi [3], hampir 20% adalah erythropoietins, dan 14% adalah insulin. Sisanya adalah enzim, faktor pertumbuhan dan sitokin [3]. Meskipun banyak non - protein biomolekul seperti plasmid, virus atau polisakarida yang kompleks saat ini sedang dikembangkan, ada kemungkinan bahwa protein akan terus mendominasi sebagai biopharmaceuticals. Protein ditoleransi dengan baik, dapat menjadi sangat kuat, dan sering dimiliki setengah kehidupan yang panjang setelah administrasi, membuat mereka menjadi yang efektif. Beberapa sifat ini juga membuat protein yang berpotensi berguna dalam kosmetik, meskipun aplikasi di bidang ini yang rumit dalam sebagian oleh AS dan kerangka 1

hukum Eropa yang tidak memungkinkan penggunaan senyawa farmakologis aktif dalam kosmetik. Saat ini hanya sedikit protein yang digunakan di daerah ini. Yang paling menonjol adalah toksin botulinum, Botox , digunakan untuk perawatan kulit [4]. Ini dan yang sejenis senyawa yang secara eksklusif dikelola oleh dokter dan dengan demikian tidak dianggap sebagai kosmetik.

Gambar 1.1 Biopharmaceuticals pada tahun 2006. Sekitar 160 protein terapi telah mendapatkan persetujuan di Amerika Serikat dan Uni Eropa. Data dari La Merie Business Intelligence (www.lamerie.com). 1.2 Bioproduk dan kontaminasinya

Bab ini memberikan gambaran tentang kimia dan sifat biofisik protein dan kontaminan utamanya seperti DNA dan endotoksin. Penjelasan rinci tentang kimia protein dan DNA berada di luar cakupan ini . 1.2.1 Biomolekul: kimia dan strukturnya 1.2.1.1 Protein Protein merupakan biopolimer amfoter kelas besar dengan massa molekul mulai dari 5 sampai 20 000 kDa, yang didasarkan pada asam amino sebagai blok-blok bangunan. Ada variasi besar dalam struktur dan sifat dalam kelas ini. Insulin, misalnya, peptida dengan massa molekul 5808 Da, memiliki struktur

yang relatif sederhana dan jelas. Di sisi lain, glikoprotein multimerik besar dengan massa molekul 20000 kDa, memiliki struktur yang sangat kompleks yang terdiri dari hingga 80 subunit, yang masing-masing 250 kDa massa. Kebanyakan protein memiliki massa molekul yang baik, biasanya antara 15 dan 200 kDa. Protein umumnya adalah molekul yang lebih kompak, namun cukup fleksibel untuk mengalami perubahan konformasi substansial dalam lingkungan yang berbeda, di interfase, setelah mengikat substrat atau setelah pada permukaan. Protein adalah molekul-molekul yang sangat terstruktur dan struktur nya umumnya berkaitan dengan fungsi biologisnya. Struktur ini dibagi menjadi empat tingkatan yang berbeda: primer, sekunder, tersier, dan kuarterner. Struktur primer ditentukan oleh urutan asam amino, struktur sekunder oleh lipatan rantai polipeptida dan struktur tersier didefinisikan oleh gabungan beberapa domain struktur sekunder. Yang terakhir, struktur kuaterner kompleks yang dihubungkan didefinisikan oleh gabungan beberapa rantai polipeptida yang terlipat. Hasil akhir adalah supra struktur tiga dimensi yang amino dimasukkan ke dalam protein. Struktur Primer: Blok-blok bangunan protein adalah asam amino. Selama biosintesis, mengikuti transkripsi dan translasi, molekul-molekul ini dihubungkan bersamasama melalui ikatan peptida untuk membentuk rantai polipeptida dalam urutan yang unik yang ditentukan oleh kode genetik. Struktur umum asam amino dan pembentukan ikatan peptida ditunjukkan pada Gambar 1.2. oleh berbagai interaksi intra- dan antarmolekul. Seringkali unsur non - asam adsorpsi

Urutan asam amino yang diatur dalam rantai polipeptida disebut protein 'primer struktur. Perhatikan bahwa meskipun asam amino merupakan molekul kiral 3

dengan L - dan D - isomer, hanya L-isomer yang ditemukan dalam protein alami. 20 asam amino alami ditemukan dalam protein tercantum dalam Tabel 1.1 . Pada protein yang khas, rata-rata massa molekul komponen asam amino adalah 109 Da. Dengan demikian, perkiraan massa molekul protein dapat dengan mudah diperkirakan dari jumlah asam amino dalam rantai polipeptida Ikatan peptida terbentuk ketika asam amino yang dihubungkan bersamasama memiliki karakter ikatan ganda parsial. Struktur ini membatasi rotasi dalam rantai peptida yang mungkin membuat rotasi bebas hanya dalam dua dari tiga obligasi. Sebagai akibatnya, struktur unik yang terbentuk tergantung pada urutan tertentu dari asam amino. Konformasi tertentu tidak diperbolehkan karena rotasi terbatas, sementara yang lain secara aktif diperkenankan karena untuk pembentukan ikatan hidrogen dan interaksi intramolekul lainnya. Rantai samping asam amino dapat bermuatan, polar, atau hidrofobik (lihat Tabel 1.1), sehingga menentukan sifat biofisik protein.

Kelompok-kelompok bermuatan adalah asam dan basa mempunyai kekuatan atau pKa yang berbeda-beda.Dengan demikian, kelompok-kelompok ini akan menentukan muatan protein rantai samping hidrofobik, di sisi lain,juga menentukan karakter hidrofobik struktur utama, yang memainkan peran penting dalam menentukan pola lipat dari rantai polipeptida. Asam amino sistein dan prolin memainkan peran tertentu. Molekul sistein bebas dapat menjalani reaksi oksidasi untuk membentuk ikatan disulfi atau jembatan yang menghasilkan sistin seperti yang ditunjukkan pada Gambar 1.3.

Ketika sistein membentuk bagian dari sebuah rantai polipeptida, jembatan ini bisa sebaga intramolekul (dalam rantai polipeptida yang sama) atau antarmolekul untuk menghubungkan rantai polipeptida yang berbeda. Di satu sisi, jembatan ini berkontribusi pada stabilisasi struktur protein lainnya dapat membantu multimeric ikatan secara kovalen. Pembentukan jembatan disulfida umumnya reversibel. Ikatan -ikatan yang terbentuk pada keadaan oksidasi bisa dirusak dengan kondisi reduksi sehingga terjadi destabilisasi struktur lipatan protein dan pembentukan asosiasi pengganggu. Sifat ini digunakan, misalnya,dalam metode analisis pemisahan resolusi tinggi seperti elektroforesis gel poliakrilamida SDS (SDS - PAGE) yang sering dilakukan di bawah kondisi reduksi. Prolin juga memainkan peran khusus dalam struktur protein yang terdefinisi. Prolin adalah suatu asam imino siklik dan bisa dalam bentuk cis dan trans. Pada gilirannya, bentuk-bentuk ini menularkan konformasi dari rantai polipeptida. Dalam penyelesaiannya, bentuk isomerik ini berada dalam kesetimbangan. Namun, dalam polipeptida, yang interkonversi dari bentuk isomerik ini sering lambat dan dapat menjadi langkah yang membatasi tingkat pembentukan struktur protein terlipat. Struktur Sekunder Rantai polipeptida ditemukan dalam protein tidak untuk membentuk knot atau cincin dan bukan merupakan struktur sekunder protein. - heliks terdiri dari susunan spiral rantai polipeptida yang terdiri dari 3,6 residu asam amino per giliran. Helix distabilkan oleh ikatan hidrogen intramolekul dan hidrofobik, amphipathic atau hidrofilik, tergantung pada urutan tertentu asam amino dalam struktur primer. Contoh heliks tersebut diberikan pada Gambar 1.4. bercabang. Namun, rantai ini dapat membentuk heliks,lembar-lembar , dan loop-loop yang mendefinisikan dan jembatan untuk membentuk formasi struktur protein

Dalam setiap kasus karakter - helix dapat diprediksi dengan menempatkan masing-masing residu asam amino dalam sebuah spiral pada interval 100 derajat sehingga akan ada 3,6 residu per giliran. Seperti yang terlihat pada Gambar 1.4, untuk sintase sitrat, residu hidrofobik dominan dan terdistribusi secara merata sehingga -helix tersebut akan menjadi hidrofobik. Dalam kasus terakhir, troponin C, residu yang bermuatan tidak hanya dominan tetapi juga merata sehingga dihasilkan helix yang akan menjadi hidrofilik. Sehingga, pada residu alkohol hidrofobik dehidrogenase bermuatan didistribusikan secara tidak merata yang menghasilkan helix amphipathic yang salah satu sisinya hidrofilik dan hidrofobik di sisi lain. Lembar adalah elemen struktur sekunder yang sangat stabil yang juga terjadi sebagai akibat dari ikatan hidrogen. Meskipun satu ikatan hidrogen membentuk suatu energi bebas dari ikatan ( G) hanya sekitar 1 kJ mol-1, sejumlah besar dari ikatan tersebut di lembar membuat nya sangat stabil. Lembaran memiliki struktur planar, yang bisa paralel, anti - paralel, atau campuran tergantung pada keselarasan arah dari rantai polipeptida yang membentuk struktur. Pembentukan lembaran sering diamati selama proses agregasi protein yang ireversibel. Karena adanya kekuatan antarmolekul yang kuat dalam struktur ini, agen pendenaturasi yang kuat diperlukan untuk mengganggu hasil agregat. Urea, pemutus ikatan hidrogen yang kuat, dapat digunakan untuk tujuan ini. Namun, konsentrasi urea yang tinggi dibutuhkan untuk mengganggu lengkap ikatan hidrogen yang pada akan mengakibatkan destabilisasi dan berlangsung seluruh

struktur protein.Protein amiloid dan serat mengandung sejumlah besar lembar - yang menjelaskan sebagian sifat-sifat kelas protein agregasi . Loops adalah bagian protein yang sangat flexibel dan sering terhubung elemen struktrur sekunder lain dengan satu sama lain. Sebagai contoh, loop sering menghubungkan bagian dari rantai polipeptida yang membentuk anti daerah paralel lembaran atau membentuk hubungan antara berbagai heliks dan domain lembar . Beberapa. Loops juga memainkan peran penting dalam fusi artifisial protein yang berbeda seperti dalam kasus antibodi rantai tunggal. Antibodi artifisial ini dihubungkan dengan loop yang mengkontribusi secara signifikan untuk stabilitas protein. Jumlah relatif dari elemen struktur sekunder yang ada dalam sebuah kaleng protein dapat diukur dengan metode spektroskopi antara lain circular dichroism (CD) dan spektroskopi infra merah.Pada panjang gelombang tertentu perbedaan antara absorbansi kiri sirkuler terpolarisasi (AL) dan absorbansi kanan sirkuler terpolarisasi (AR) cahaya adalah : A= Al- Ar Scan panjang gelombang yang digunakan untuk menampilkan isi dari struktur sekunder dari protein dan merupakan ukuran penting dari integritas. Hal ini sering digunakan untuk konfirmasi struktur asli protein (Gambar 1.6).

(ATR FT - IR) spektroskopi juga digunakan untuk mempelajari perubahan konformasi 3D - struktur protein dalam situ. Perubahan pada elemen struktur sekunder dapat dinilai dengan ATR FT IR bahkan dalam suspensi dan larutan keruh. amida I di wilayah spektral 1600-1700 cm mengevaluasi perubahan struktural . Struktur tersier Struktur tersier dibentuk ketika elemen-elemen dari struktur sekunder (helix, lembar-lembar dan loop) dilipat bersama-sama dalam 3 tatanan dimensional. Interaksi hidrofobik dan jembatan disulfida bertanggung jawab secara dasar dalam stabilisasi struktur tersier yang digunakan sebagai petunjuk oleh kumpulan amfipatik (helix ke ikatan 4helix ). Pada struktur ini residu hidrofobik terikat secara sukar pada inti, terlindung dari pengepungan lingkungan cair, ketika bagian polar dan terlindung pada permukaannya. Struktur kuartener Struktur kuartener ditetapkan ketika 2 atau lebih rantai polipeptida diasosiasikan dalam bentuk superstruktur, yang , pada banyak kasus, sangat perlu sekali untuk fungsi biologi. Salah satu contoh yang diketahui adalah hemoglobin, yang terdiri dari 4 unit polipeptida bersama-sama diikat oleh ikatan hidrogen dan interaksi hidrofobik. Pada kasus ini, fleksibilitas struktur kuartener pada respon untuk mengikat oksigen adalah sangat kritis untuk mengambil dan melepaskan oksigen kuartener. Molekul2 ini pada paru-paru dan lingkungan ringan dan 2 pembuluh darah kapiler. Atibodi adalah contoh lain protein dengan struktur terdiri dari 4 rantai polipeptida (2 berat) terikat secara bersama-sama oleh jembatan disulfida. Struktur yang dihasilkan biasanya sangat stabil, memungkinkan antibodi untuk beredar secara bebas didalam plasma. Struktur protein diklasifikasikan dalam beberapa hirarki. Protein diklasifikasikan dalam beberapa kelas dan melekuk sehingga diketahui keasliannya dan pola perkembangannya bisa diidentifikasi. Bagaimanapun juga , akan dicatat bahwa meskipun protein termasuk dalam 10 kelas yang residu tetap yang bermuatan
- 1

digunakan untuk

sama dapat berkelakuan secara berbeda behkan sejak subtitusi asam amino yang menghasilkan variasi sifat bifisik. Tabel 1.2 menunjukkan kelas kelas protein:

11

Dengan memisahkan

demikian, isoform

kromatografi sesuai.

dapat

digunakan adalah

sebagai

alat

untuk

yang

Glikosilasi

penambahan

molekul

karbohidrat, baik gula sederhana atau oligosakarida kompleks, ke molekul protein.Glikosilasi menjadikan protein lebih hidrofilik dan dengan demikian lebih mudah larut. Selain itu, karena karbohidrat terminal dari olssigosakarida tersebut biasanya asam neuraminic (umumnya dikenal sebagai asam sialat) dengan pH 3, glikosilasi juga mempengaruhi muatan bersih dan titik isoelektrikprotein. Akibatnya, pemisahan kromatografi berdasarkan muatan yang berbeda dari glycovariants adalah mungkin. 12

Sebagai contoh, Gambar 1.10 menunjukkan isoelectric pemisahan

focusing (IEF) gel

erythropoietin manusia rekombinan (rhEPO - saat ini penjualan terbesar kedua di industri biofarmasi). Seperti dapat dilihat dalam gambar, bahan awal berisi beberapa varian dengan titik isoelektrik antara 3,5 dan 5,5. Loading start materi pada kolom penukar anion dan eluting dengan peningkatan konsentrasi garam menghasilkanfraksi terelusi yang telah secarasubstansial mengurangi heterogenitas. Kemudian fraksi eluting mengandung varian lebih asam dengan nilai isoelektrik rendah Varian ini lebih bermuatan negatif dan mengelusi hanya pada garam konsentrasi tinggi dari penukar anion bermuatan positif. rhEPO tinggiglikosilasi dan glyco variants yang memiliki bioaktivitas berbeda. Dengan demikian, kontrol pola glikosilasi pola dan, dalam beberapa kasus, pemisahan varian tertentu yang tidak diinginkan diperlukan untuk menjaga kualitas produk yang konsisten. Deamidasi juga dapat memiliki efek dramatis baik pada bioaktivitas dan perilaku kromatografi. Deamidasi melibatkan transformasi kimia dari asparagin dan glutamin, yang bermuatan asam amino polar, menjadi asam aspartat dan asam glutamat masing-masing, baik yang bermuatan negatif pada pH di atas4. Residu 13

deamidasi asparagine lebih sering diamati dari pada glutamin, namun proses ini sangat tergantung pada lokasi residu tersebut dalam struktur protein. Residu permukaan cenderung paling terpengaruh, sementara yang terbenam dalam inti protein biasanya lebih terlindungi. Deamidasi umumnya difasilitasi oleh nilai pH yang lebih tinggi dan suhu yang lebih tinggi dan terjadi melalui mekanisme yang di ilustrasikan pada Gambar 1.11. Dalam proses ini, gugus amino dipecah dari asparagin membentuk L - siklik imida intermediate. Intermediate (produk antara) umumnya tidak stabil dan selanjutnya diubah menjadi peptida L-Aspartyl dan L - iso - Aspartyl. Keduanya memasukkan muatan negatif dan menurunkan titik isoelektrik dariprotein. Perlu dicatat bahwa amida L-siklik juga dapat mengalami racemization membentuk amida D - siklik, yang kemudian diubah menjadi peptida D Aspartyldan D -isoaspartyl. Hasil akhirnya adalah pengenalan D - asam amino keprotein. Penghapusan varian terdeamidasi merupakan tugas penting karena varian inidapat memiliki bioaktivitas berbeda dan penghapusannya adalah tantangan bagi proses hilir. Pemisahan dengan kromatografi penukar ion adalah mungkin, tetapisering terjadi kesulitan karena perbedaan muatan bersih antara bentuk asli dan terdeamidasi kecil, menghasilkan selektivitas yang rendah.

14

1.2.1.2. Oligonukleotida dan polynucleotides Oligonukleotida dan polinukleotida, keduanya dapat merupakan kontaminan atau mungkin merupakan produk. Misalnya, dalam produksi DNA plasmid untuk aplikasi terapigen, DNA genom adalah kontaminan. Sebaliknya, dalam produksiobat-obatanprotein, kontaminan. Polynucleotides hadir dalam sel baik sebagai asam deoksiribonukleat (DNA) atau sebagai ribonukleat acid (RNA). DNA atau RNA mengkodekan informasi genetik. Pada manusia,hewan atau tumbuhan DNA adalah materi genetik, sedangkan RNA ditranskripsi dari itu.Dalam beberapa organisme lain seperti virus RNA, RNA merupakan bahan genetik dan, dalam mode terbalik, DNA ditranskripsi dari itu. Molekul nukleotida terdiri dari gugus fosfat,kelompokgula, 15 baik genomik dan DNA plasmid adalah

dan kelompok nukleosida nitrogen. Nukleotida lebihhidrofilik dan bermuatan negatif karena ada gugus asam fosfat. Pada DNA, nukleotida disusun atas heliks beruntai ganda yang terbentuk oleh ikatan hidrogen yang lemah antara pasangan nukleotida. Molekulmenyerupai 'tangga' memutar, di mana sisi dibentuk oleh gugus gula dan fosfat, sedangkan 'anaktangga' dibentuk oleh basis nukleosida yang tergabung dalamikatan hidrogen. Ada empat nukleotida dalam DNA, masing-masing berisi basis nukleosida yang berbeda:adenin (A), guanin (G), sitosin (C), atau timin (T). Pasangan basa terbentuk secara alamihanya antara A dan T dan antara C dan G sehingga urutan dasar masing-masinguntai tunggal DNA secara sederhana dapat disimpulkan dari untai mitranya. RNA mirip dengan DNA dalam struktur, tetapi mengandung ribosa bukan deoksiribosa.Ada beberapa kelas molekul RNA termasuk messenger RNA, transferRNA dan RNA ribosom. Mereka memainkan peran penting dalam sintesis protein dan kegiatan sel lainnya. miRNAs adalah regulator global ekspresi gen. miRNAs adalah non-coding double-stranded.Molekul RNA terdiri dari 19 sampai 22 nukleotida yang mengatur ekspresi gen di tingkat posttranskripsi yang membentuk struktur untai tunggal dan menunjukkan antisense yang saling melengkapi yang awalnya diidentifikasi pada nematoda Caenorhabditiselegans. DNA dan RNA secara kimiawi merupakan molekul sangat stabil kecuali enzim DNAse atau. Kehadiran enzimdengan cepat akan terdegradasi. Polynucleotida juga sangat sensitif terhadap pergeseran mekanik.Setelah lisis sel, DNA dan RNA dilepaskan ke dalam supernatandan dengan dramatis mengubah viskositas kaldu fermentasi sebagai akibat dari ukuran dan struktur filament. DNA genomik ada dalam inti organisme eukariotik selalu dikaitkan dengan protein yang sangat dasar yang dikenal sebagai histon. Plasmid DNA hadir dalam sitoplasma organisme prokariotik dan bukan histon tapi adadalam bentuk fisik yang berbeda yaknisuperkoil, circular, linier, dan agregatseperti yang diilustrasikan pada Gambar 1.12.

16

Bentuk-bentuk ini berbeda dalam ukuran memberikan dasar untuk pemisahan dengan gel elektroforesis atau dengan kromatografi eksklusi ukuran. Polynucleotida bermuatan negatif atasberbagai pH karena berkenaan dengan gugus fosfat. Dengan positif. demikian, Akibatnya, mereka aplikasi sangatterikat proses hilir oleh dapat permukaan bermuatan

diterapkan secara nyaman dan efisien dilakukan dengan resin penukar anionatau dengan membran bermuatan positif. 1.2.1.3.Endotoksin Endotoksin, juga dikenal sebagai pirogen, merupakan komponen dari dinding sel bakteri Gram negatif yang terus dikeluarkan oleh bakteri dan di mana-mana dalam Bioproces.Endotoksin sangat beracun ketika memasuki aliran darahdan manusia adalah salah satu organisme yang paling sensitive terhadap endotoksin. Dengan demikian penghilangan total darisuatu produk jadi diperlukan. Seperti ditunjukkan dalamGambar 1.13, endotoksinlipopolisakarida yang terdiri dari sebagian lipid A , inti wilayah, dan antigen O atau S.Sebagian lipid A adalah komponen yang paling dilestarikan dan ditemukan di semuaendotoksin. Ini juga merupakan bagian dari molekul yang bertanggung jawab untuk toksisitas.Antigen O atauS sangat bervariasi dan strain spesifik. Ukuran dan struktur juga tergantung pada kondisi pertumbuhan.

17

Endotoksin monosit, sel

menargetkan neutrofil

sel-selimun dan

responsifseperti Mereka

makrofag,

endotel,

granulosit.

menginduksi

ekspresidari interleukin, tumor necrosis factor, koloni - stimulating factor, dan leukotrien dan oksigen radikal dalam sel. Sebagai konsekuensi dari adanya endotoksin dalamaliran darah, pasien mengalami peradangan jaringan dan demam, penurunantekanandarah, shock, palpitasi, penurunan permeabilitas pembuluh darah, komplikasi pernapasan, dan bahkan kematian. Gejala yang sama terjadi dengan infeksi bakteri yang parah, sehingga disebut syok septik. Toksisitas Hati yang parah dan gangguan hematologi telah diamati terjadi pada manusia dalam respon sedikitnya 8 ng endotoksin per kg berat badan. Sebaliknya, endotoksin jauh kurang beracun bagi banyakhewan. Sebagai contoh, LD 50 sebanyak 200 - 400 mg / hewan pada tikus. Untukparenteral biopharmaceuticals tingkat ambang batas untuk aplikasi intravena5 endotoksin Unit s (EU) per kg berat badan per jam. Uni Eropa mendefinisikan aktivitas biologi endotoksin dengan 1 UE sesuai dengan 100 pg dari EC-5 standar endotoksin atau 120 pg dari endotoksin berasal dari strain E. coli O111: B4. Deteksi endotoksin sulit dan dilakukan dengan menggunakan bioassay. Di masa lalu kelinci telah digunakan untuk tujuan ini.

18

Kali

ini

penggunaan

tes

telah

digantikan

oleh

uji

yang

disebut

Limulusamoebocyte lisat (LAL), yang menggunakan Hemolimf dari kepiting tapal kuda. LAL menggumpal beberapa menit dengan adanya sejumlah endotoksin (lihat Gambar 1.14) membentuk suatu dasar untuk tes dengan batas deteksi endotoksin serendah dari 10 pg per ml. Pedoman umum dijelaskan di USP di Bab 79 pada compounding and sterile preparations (CSP).

Tabel1.4 memberikan ringkasan berbagai solusi dari tipe endotoksin. Endotoksin hadir dalam konsentrasi yang besar dalam protein yang berasal dari fermentasi bakteri, tetapi juga dapat hadir sebagai agen adventif dalam banyak sistem lain. Dalam produksi industri farmasi untuk penggunaan parenteral,

perawatan khusus digunakan untuk mencegah kontaminasi endotoksin. Misalnya, endotoksinbebas air digunakan dalam penyusunan media kultur dan buffer kromatografi, diresirkulasi pada suhu tinggi untuk menghindari pertumbuhan bakteri dan akibatnya pembentukan endotoksin. Meskipun endotoksin stabil terhadap panas, mereka hancur pada pH basa. Jadi, membersihkan peralatan pengolahan, tank, membran, dan media kromatografi dengan larutan natrium hidroksida umumnya diperlukan untuk menjamin penghilangan lengkap dari kontaminan ini.

19

1.2.2. Biomolekul: physiochemical Properti 1.2.2.1 Absorbansi UV Konsentrasi proteindalam larutan sering diukur dengan absorbansi Uv terutama karena penyerapan oleh tirosin asam amino aromatik, triptofan, dan fenil alanin dan jembatan disulfida. Absorbansi panjang gelombang maksimum dan koefisien ekstingsi untuk komponen ini dirangkum dalam Tabel 1.5.

20

Karena absorbansi kuat triptofan, absorbansi maksimum untuk protein biasanya sekitar 280 nm dan panjang gelombang ini paling sering digunakan untuk penentuan kuantitatif. Menurut hukum Lambert-Beer, absorbansi dari larutan protein pada panjang gelombang tertentu berhubungan linier dengan konsentrasi molar dari analit, c, persamaannya sebagai berikut: A=

A= mlc di mana Io adalah intensitas cahaya sebelum melewati sampel, I adalah intensitas cahaya setelah melewati sampel, madalah koefisien ekstingsi dan l adalah panjang atau jarak cahaya yang melewati sampel. Validitas Persamaan diatas umumnya relatif terbatas untuk larutan protein yang encer dan jalan cahayanya pendek, dimana A kurang dari 2. Pada nilai yang lebih tinggi, rasio yang ditransmisikan dan cahaya yang melewati sampel menjadi terlalu kecil untuk penetapan suatu determinasi. Dengan demikian, penentuan kuantitatif penentuan konsentrasi larutan protein membutuhkan dilusi atau cahaya yang sangat pendek.Seperti terlihat pada Tabel 1.6, absorbansi spesifik dari protein yang khas bervariasi dengan adanya asam amino aromatic 21 Trp dan Try dan,

jembatan disulfida. Karena isi protein relatif bervariasi, teka dempiris diperlukan untuk penentuan kuantitatif yang tepat. Untuk alternative, koefisien molar dapat diperkirakan dengan akurasi relatif sebagai kombinasi linear dari residu Trp dan Tyr jembatan disulfida menurut persamaan berikut:

dimana nTrp, nTyr, dan nSS adalah jumlah residu Trp Tyr dan ikatan disulfida Perlu dicatat bahwa asam nukleat memiliki absorbansi maksimum pada 260 nm dan dapat mengganggu secara substansial penentuan protein pada 280 nm. Dengan demikian, ketikaasam nukleat hadir simultan dalam larutan, koreksi harus dilakukan dalammenentukan konsentrasi protein dariabsorbansi pada 280 nm.Kelompok protein peptida menyerap cahaya dalam kisaran UV jauh (180-230 nm)dan nilai-nilai absorbansi yang sangat tinggi diamati di daerah ini bahkan untuk kondisi yang sangat encer. Akibatnya, deteksi dalam analitis kromatografi sering dilakukan pada 218 nm, dimana absorbansinya sekitar 100 kali lebih besar.Protein dengan chromophores tambahan menyerap di UV dekat atau terlihat di daerah sinar tampak. Contoh umum adalah protein yang mengandung besi sepertihemoglobin,mioglobin dan transferrin yang berwarna merah, atau Cu - Zn superoxide dismutase yang hijau. Asam nukleat menunjukkan absorbansi yang kuat di daerah 240-275 nm daerah transisi - *dari cincin nukleosida pirimidin dan purin. Polimer DNA danRNA menyerap pada daerah yang luas pada maksimum dekat 260 nm. Massa spesifik koefisien ekstingsiDNA adalah 20 (mg ml-1cm-1). Kemurnian DNA

diperkirakan oleh rasio absorbansi pada 260 dan 280 nm. Kemurnian DNA untai ganda dan RNA rasio E260/E280 adalah antara 1,8 dan 2,0. Pengukuran lebih dapat diandalkan pada pH basa. Berbeda dengan protein, absorbansi asam nukleat cukup sensitif terhadap pH, dan menurun pada pH rendah.

1.2.2.2 Ukuran 22

larutan dan suspensi ditemukan dalam produk bioteknologi proses hilir mengandung molekul dan partikel dengan berbagai ukuran seperti digambarkan pada Tabel 1.7. Protein globular berada di kisaran 3 - 10 nm, sedangkan asam nukleat bisa jauh lebih besar. Plasmid terapetik berada di kisaran 100 nm. Virus dan partikel seperti virus berada di kisaran 50 nm sampai 400 nm, sedangkan sel berada di jangkauan mikrometer.

Sementara sel-sel dan puing-puing sel mudah dipisahkan dengan sentrifugasi karena memiliki kecepatan sedimentasi tinggi (Tabel 1.7), protein dan asam nukleat memerlukan metode lebih canggih seperti kromatografi dan filtrasi membran. Pemisahan protein dengan ultra sentrifugasi hanya dilakukan untuk tujuan analisis karena tingkat rotasi yang diperlukan sangat tinggi (setinggi 50 000 rpm).Ukuran diberikan dalam Tabel 1.7 untuk protein globular terlipat. Struktur protein cukup padat (kepadatan massa ~ 1,4 g cm-3), bentuknya bulat atau mirip elips. Namun, protein menyimpang dari bentuk-bentuk kompak seperti yang telah didenaturasi, fibrosa, batang, atau disk. Dalam kasus ini, ukuran dari protein dan makromolekul lainnya sering digambarkan oleh parameter lain termasuk jari-jari rotasi, r g, jari-jari hidrodinamik, rh, jari-jari dibentuk dengan memutar protein sekitar pusat geometrisnya, r r, dan jari-jari, setara dengan bola dengan massa yang sama dan kepadatan sebagai molekul yang sebenarnya, rm.

23

Jari-jari rotasi dapat diukur dengan hamburan cahaya statis. Hal ini seringdilakukan dengan size kromatografi eksklusi (SEC) sehingga memungkinkan pencampuran protein yang akan dianalisa. Ada suatu hubungan umum antara radius rotasi dan jumlah cahaya yang tersebar, yang berbanding lurus dengan produk dari berat- massa molar rata-rata dan konsentrasi protein. Sebuah alternatif, biasanya metode yang digunakan untuk penentuan ukuran protein adalah size exclusion chromatography (SEC). Ukuran molekul yang berbeda tidak semua menembus pori-pori media SEC pada tingkat yang sama sehingga mengarah ke berbagai retensi dalam kolom. Kolom SEC dapat dikalibrasi dengan standar protein yang diketahui massa molekulnya yang memungkinkan ukuran protein yang tidak diketahui untuk dapat diperkirakan. Metode lain untuk penentuan ukuran molekul protein adalah SDS - gel poliakrilamida elektroforesis (SDS PAGE) yang memberikan informasi tentangmassa molekul, ultrasentrifugasi yang menyediakan informasi mengenai radius hidrodinamika, dan teknik hamburan lain seperti rayscattering (SAXS). 1.2.2.3. Muatan small angle X

Protein adalah molekul amfoter dengan muatan negatif dan positif, yang berasal dari rantai samping asam amino asam dan basa (Tabel 1.1) dan dari ujung amino dan karboksil masing-masing rantai polipeptida. Memiliki nilai pK masing-masing sekitar 8,0 dan 3,1. Modifikasi dari rantai samping asam amino secara substansial dapat mengubah muatan protein. Contoh penting adalah glikosilasi dengan asam sialat, misalnya, disitus N-glikosilasi dalam anti bodi atau eritropoietin, dan deamidasiresi dua sparagin dan glutamin. Keduanya merupakan modifikasi post-translasi membuat protein lebih asam dan dengan demikian lebih tinggi muatan negatif. Dalam banyak kasus dapat mempengaruhi waktu paruh protein in-vivo, sehingga kontrolini menjadi tujuan pentingdalam bioteknologi proses hilir. 1.2.2.4. Hidrofobitas

24

Hidrofobisitas protein di tentukan oleh rantai samping non-polar asam amino. Meskipun istilah hidrofobisitas sering digunakan, tetapi definisinya sulit dan di perdebatkan secara luas. Pengalihan senyawa apolar kedalam cairan polar seperti air yang berhubungan dengan panas dan sebagai kuantifikasi bebas energy. Efek hidrofobik meningkat saat efek entropis dominan. Efek hidrofobik meningkat dengan tegangan permukaan air yang di sebabkan oleh Daya tarik antar molekul di dalam cairan yang di sebabkan oleh berbagai kekuatan antar molekul. Efek hidrofobik demikian terutama disebabkan oleh ikatan hidrogen yang kuat dalam air, sedangkan gaya van der Waals umumnya memainkan peran kecil. Hidrofobisitas protein secara teoritis dihitung dari transfer energi asam amino dari pelarut apolar ke dalam air (lihat Gambar 1.20).

Gambar 1.20. Kalkulasi hidrofobisitas dari kalkulasi Cu-Zn seuperoxide dismutase manusia menurut skala perbedaan hidrofobisitas : Hopp dan Wood [22] {kiri} dan Kyte dan Doolittle [23] {kanan}.

Dalam rantai peptida - gugus amino dan gugus karboksil tidak ada karena gugus tersebut harus bereaksi untuk membentuk ikatan peptida. Dengan demikian energi bebas dari transfer asam amino tidak benar-benar menggambarkan hidrofobisitas dari protein dan sangat tergantung pada skala hidrofobik yang digunakan untuk menghitung hidrofobisitas protein. 25

Distribusi dari residu hidrofobik surface-exposed dalam protein tidak homogen. Hal ini digambarkan untuk lisozim pada Gambar 1.21.

Gambar 1.21. Distribusi dari

kultur hidrofobik di permukan lysozyme (kiri)

dan serum albumin manusia (kanan) pada pH netral. Kuning dan biru bercahaya menunjukkan hidrofobik dan hidrophilik bertambal, berturut.

Densitas dan distribusi dari residu permukaan protein adalah dasar untuk hydrophobic interaction chromatography (HIC) di mana permukaan hidrofobik residu berinteraksi dengan matriks hidrofobik ringan. Pada lipat yang salah dapat menyebabkan variasi dalam jumlah dari permukaan residu hidrofobik terbuka, HIC dapat digunakan sebagai alat untuk memisahkan protein asli dari isoform gagal melipat. Pendekatan lain untuk mengukur hidrofobisitas protein adalah dengan mengukur retensi dalam kolom kromatografi yang dikemas dengan media hidrofobik. Di kasus ini, jika protein tidak terungkap, retensi ini terkait dengan jumlah sisi rantai asam amino hidrofobik yang memempel pada permukaan [24]. Hidrofobisitas diperoleh dengan metode ini relatif dan tergantung pada metodologi yang digunakan, sehingga hanya berguna untuk tujuan peringkat

1.2.2.5. Solubilitas Kelarutan sering menjadi pertimbangan penting dalam pengolahan hilir, karena berbeda drastis dengan pH, kekuatan ionik, dan jenis garam. 26

Memprediksi kelarutan dari protein dalam media air dari strukturnya sangat sulit dan biasanya memerlukan pengukuran empiris. Kelarutan protein bervariasi secara dramatis. Beberapa protein, misalnya Cu - Zn superoxide dismutase, memiliki kelarutan setinggi 400 mgml 1 sementara yang lain, misalnya interferon- rekombinan, yang larut pada konsentrasi kurang dari 10 mgml-1. Secara umum, kelarutan protein terendah pada titik isoelektrik, di mana muatan bersih adalah nol, tetapi bervariasi dengan kekuatan ion, yang merupakan gambaran sebagai berikut :

(1.16) dimana Cj adalah konsentrasi ion j dan Zj lihat seperti contoh pada gambar 1.22. muatannya. Kelarutan dari -

lactoglobulin sebagai fungsi dari konsentrasi garam dan pH, yang dapat di

Gambar. 1.22. Kelarutan dari -lactoglobulin seperti fungsi pH paa empat konsentrasi yang berbeda dari NaCl (sodium clorida). Secara umum, garam pada konsentrasi rendah meningkatkan

kelarutan protein, yang prosesnya disebut sebagai 'salting in'. Sebaliknya, pada konsentrasi tinggi garam mengurangi kelarutan protein, yang disebut 27

sebagai 'salting out'. Besarnya efek ini sangat tergantung pada jenis garam, seperti yang ditunjukkan dalam contoh Gambar 1.23

Gambar 1.23 Kelarutan carboxyhemoglobin dalam larutan encer dengan perbedaan elektrolit pada 25 0C. S dan S0 yang di gunakan sebagai pengganti w atau w0. Untuk carboxyhemoglobin. Kecendrungan kelarutan protein dapat dijelaskan dari bentuk perpanjangan teori Debye Hckel. Dapat di lihat dari persamaan:

(1.17) dimana w adalah kelarutan protein dalam larutan yang sebenarnya, w 0 kelarutan dari protein dalam air, z1 dan z2 nilai garam, dan Ks dan A adalah garam dan protein parameter empiris spesifik. Pada kekuatan ion tinggi, Persamaan 1,17 tereduksi menjadi hubungan log-linear sebagai berikut:

28

(1.18) yang ditampilkan untuk berbagai protein pada Gambar 1.24.

Gambar 1.24 Kelarutan protein dalam larutan ammonium sulfat.

Pengaruh jenis garam pada kelarutan protein secara resmi dijelaskan yang pertama oleh Hofmeister yang menjelaskan peringkat anion dan kation sesuai dengan kemampuan mereka untuk mengendapkan protein, yang umumnya dikenal sebagai Hofmeister atau seri lyotropic:

Interpretasi sempel sederhana dari seri ini adalah ion tertentu yang mengikat bebas air menurun kemampuan protein untuk tetap dalam larutan. Menariknya garam dalam seri Hofmeister juga berkorelasi dengan begitu socalled Jones-Doyle koefisien-B koefisien dan hidrasi entropi sehingga tampaknya baik berhubungan dengan efek dari garam pada struktur air. Intinya, perlu dicatat bahwa dalam prakteknya, pemilihan garam untuk digunakan dalam hilir pengolahan tidak hanya tergantung pada seri Hofmeister, tetapi juga pada faktor-faktor seperti nilai ketersediaan, biokompatibilitas, dan nilai pembuangan.

29

1.2.2.6. Stabilitas Dua jenis stabilitas perlu dipertimbangkan untuk protein: Stabilitas termodinamika atau Konformasi dan stabilitas kinetik atau koloid. Stabilitas konformasi protein digambarkan oleh energi bebas G dari keseimbangan antara alami dan lipatan membuka. Transisi lipatan alami dari N, ke dalam bentuk lipatan, U, digambarkan oleh reaksi kimia berikut :

di mana k1 dan k-1 adalah konstanta laju. Keseimbangan yang sesuai konstanta K eq = [U] / [N] biasanya sangat rendah dalam larutan air, karena protein folding umumnya termodinamika disukai sebagai akibat dari konsentrasi hidrofobik residu dalam inti protein. The G yang sesuai diberikan pada persamaan berikut:

Perwakilan nilai yang diberikan dalam Tabel 1.8 bersama dengan pencairan yang sesuai 'melting temperature', yang merupakan sebagai gambaran suhu di mana setengah dari protein ini dalam keadaan tidak dilipat.

30

Kosmotropic (atau cosmotropic) garam dan poliol seperti sorbitol atau sukrosa menstabilkan protein sementara chaotropic garam atau urea pada konsentrasi konformasi. Stabilitas kinetik, di sisi lain, dapat digambarkan sebagai berikut persamaan: yang lebih tinggi memiliki efek destabilisasi di protein

yang menunjukkan lebih lanjut langkah kinetically-driven dari keadaan tidak dilipat kedaerah aggregat ireversibel. Protein dengan k2 tinggi menunjukkan stabilitas kinetik rendah. Keseluruhan stabilitas demikian tergantung pada efek termodinamika dan kinetik. mungkin, misalnya, untuk di tambahkan garam untuk mengurangi stabilitas kinetic, sementara meningkatkan stabilitas secara keseluruhan sebagai akibat dari efek termodinamika. Namun, efek ini sering susah untuk diprediksi, sehingga dalam prakteknya, stabilitas keseluruhan dan shelf-life diukur secara empiris.

1.2.2.7. Viskositas

31

Banyak larutan dan suspensi yang di temui dalam Bioprocessing sangat kental. Hal ini terutama berlaku untuk kaldu fermentasi yang mengandung DNA dan untuk konsentrasi larutan protein tinggi. Secara umum, viskositas (), berkaitan dengan tegangan geser (), dan laju geser () , Dengan persamaan sebagai berikut:

(1.22) Untuk fluida Newtonian, adalah konstan dan hubungan antara tegangan geser dan laju geser yang linear. Untuk non-fluida Newtonian, bagaimanapun, bervariasi dengan geser Tingkat dan hubungan yang non - linear. Misalnya, perilaku fluida pseudoplastik digambarkan oleh persamaan berikut:

(1.23) di mana K dan n adalah konsistensi dan flow indeks, masing-masing. Untuk sangat terkonsentrasi larutan protein unuk banyak kultur supernatan, n lebih kecil dari satuan, menunjukkan bahwa viskositas jelas, = , menurun dengan meningkatnya laju geser. Rentang suku geser untuk berbagai larutan dan suspense ditemui dalam Bioprocessing ditunjukkan pada Tabel 1.9.

Viskositas Khas yang dihadapi dalam Bioprocessing ditunjukkan pada Tabel 1.10. Pada umumnya, kultur sel supernatan memiliki viskositas rendah dari 10 MPa s, sedangkan sel homogenat jauh lebih kental dengan - nilai 32

hingga 40 mPa s. KOntribusi terbesar terhadap viskositas kaldu fermentasi mentah adalah DNA. Namun, Untungnya baik DNA genomik dan plasmid sangat sensitif terhadap geser dan sering terdegradasi mekanis pada awal proses hilir. Enzim DNAse, baik alami atau ditambahkan sengaja, juga membantu viskositas. untuk menurunkan molekul-molekul, sehingga mengurangi

Viskositas intrinsik [] adalah ukuran dari kontribusi zat terlarut ke viskositas larutan dan merupakan gambaran sebagai berikut:

(1.24) dimana 0 adalah viskositas tanpa adanya zat terlarut dan c konsentrasi zat terlarut. Pada batas semi-encer, dapat digambarkan sebagai fungsi dari c oleh ekpresi polinomial berikut:

(1.25) Pada konsentrasi protein yang sangat tinggi, namun, model semi-

empiris yang diperlukan. Sebagai contoh, Gambar 1,25 menunjukkan viskositas relatif ( / 0) IgG larutan sebagai fungsi konsentrasi IgG. Untuk konsentrasi yang lebih rendah sekitar 100 ml mg1 data kira-kira sesuai dengan Persamaan 1.25. Namun, pada konsentrasi yang lebih tinggi viskositas meningkat secara eksponensial.

33

Gambar 1.25 Viskositas dari larutan IgG manusia, sapi, dan babi seperti fungsi dari konsentrasi IgC. Tabel 1.11 daftar viskositas intrinsik dari perwakilan biomolekul. Sepertinya dapat diduga dari data tersebut, viskositas intrinsik tergantung pada bentuk molekul. Misalnya, bentuk batang protein memiliki viskositas intrinsik yang lebih tinggi daripada bentuk globular.

Sebuah hubungan empiris antara [] dan massa molekul M r adalah ditunjukkan oleh Mark - Houwink persamaan:

34

(1.26) di mana a adalah parameter yang terkait dengan 'kekakuan' dari rantai polimer. Secara teoritis, a = 2 untuk batang kaku, 1 untuk gulungan, dan 0 untuk bola keras. Secara empiris, bagaimanapun, nilai a, = 0,6 0,7, dan 0,5 telah ditemukan untuk BSA, ovalbumin, dan lisozim, masing-masing. Literature data (misalnya [33]) menunjukkan hubungan umum antara viskositas intrinsik dan jumlah residu asam amino, yang dapat dinyatakan sebagai berikut dengan [] dalam mlg-1:

(1.27) Dengan demikian, protein yang lebih besar dan agregat protein memiliki viskositas protein tinggi yang lebih kecil dan bentuk monomer.

1.2.2.8. Difusivitas Koefisien molekul difusi atau difusivitas dalam larutan, D0 adalah fungsi dari ukuran zat terlarut, dalam larutan viskositas dan suhu. Seperti sebelumnya mencatat persamaan Stokes-Einstein menggambarkan hubungan ini sebagai:

(1.28)

35

di mana kb adalah konstanta Boltzmann dan rh adalah radius hidrodinamika zat terlarut. Diffusivities ditemui dalam rentang Bioprocessing luas dari 1 10 5 cm2s-1 untuk garam dan molekul kecil lainnya 1 10 -9 cm2s-1 untuk biomolekul besar seperti DNA. Protein diffusivities dalam larutan encer umumnya dalam kisaran 10-6 sampai 10-7 cm2s-1. Tabel 1.12 menyediakan ringkasan diffusivities khas dalam larutan encer pada suhu kamar. Secara umum, diffusivities protein 10 - 100 kali lebih rendah daripada molekul kecil. Plasmid memiliki nilai lebih kecil dengan faktor sebanyak 1000.

Gambar

1.26

menggambarkan

efek

dari

massa

molekul

pada

difusivitas pada larutan encer berair pada suhu kamar. Tyn dan Gusek telah mengikuti korelasi untuk protein globular:

(1.29) di mana D adalah 0 dalam cm2s- 1, di mPa s, T di K, dan M r di Da, yang memiliki akurasi dari 10%.

36

Gambar 1.26 difusi protein globular dalam larutan encer cair pada temperature ruangan.

Beberapa pendekatan yang tersedia untuk penentuan eksperimental difusivitas contohnya, oleh Cussler [35]. Umumnya digunakan pendekatan untuk protein termasuk hamburan cahaya dinamis (lihat Bagian 1.1.2.2), sel difusi, Taylor berbasis dispersi, dan microinterferometry. 1.3 Bioproses Dalam bab ini kita akan membahas sistem ekspresi yang umum digunakan dan struktur umum dari proses hilir yang diperlukan untuk mencapai kemurnian produk yang diinginkan. Penekanan khusus dalam hal ini adalah pada produksi protein rekombinan melalui fermentasi dan kultur sel, yang memainkan peran utama dalam industri bioteknologi. 1.3.1 Sistem Ekspresi Banyak sistem ekspresi yang berbeda telah dikembangkan dalam protein rekombinan, mulai dari bakteri yang sangat sederhana sampai pada tanaman dan hewan. Namun, jumlah sel inang yang digunakan dalam produksi industri biofarmasi protein sangat terbatas. Strain bakteri yang paling populer adalah E. coli, BL21, yang digunakan untuk memproduksi protein dimana aktivitas biologis dari strain bakteri ini tidak memerlukan modifikasi pasca translasi. Ekspresi protein 37

dalam E. coli dapat terjadi dalam tiga cara yang berbeda. Protein dapat disekresi ke dalam periplasma yang merupakan ruang antara membran sel dan dinding sel; protein dapat diekspresikan dalam sitoplasma sebagai protein terlarut; atau dapat terakumulasi dalam sel sebagai badan inklusi. Masing-masing sistem efektif untuk protein tertentu. Sitoplasma E. coli merupakan lingkungan reduksi yang kuat yang menghalangi pembentukan jembatan disulfida, sedangkan periplasma menawarkan lingkungan oksidasi yang memungkinkan pembentukan jembatan ini sehingga memudahkan folding protein. Beberapa protein yang beracun bagi sel-sel atau yang memiliki waktu hidup pendek dalam sitoplasma atau periplasma telah berhasil diproduksi sebagai badan inklusi. Dalam hal ini, protein membentuk agregat yang tidak dapat diserang oleh enzim protease. Di sisi lain, meskipun tidak sepenuhnya terdenaturasi, protein yang dinyatakan sebagai badan inklusi umumnya tidak dalam konformasi asli mereka. Dengan demikian, prosedur refolding biasanya diperlukan untuk menghasilkan biaya bentuk yang aktif sepenuhnya. dapat Meskipun refolding dapat dalam memerlukan besar, bila tercapai keseimbangan

pendekatan ini, biaya akan menjadi lebih ekonomis karena tingkat ekspresi dalam sistem tubuh inklusi yang didapat melalui proses ini sangat tinggi dan prosedur untuk mencuci protein yang dihasilkan sederhana dan dapat digunakan untuk menghilangkan sebagian besar protein sel inang sehingga menghasilkan kemurnian yang relatif tinggi. Gambar 1.27 menunjukkan contoh sel E. coli yang mengekspresikan protein sebagai badan inklusi dan hasil analisis SDS-PAGE pada berbagai tahap proses.

38

Sel ragi Saccharomyces cerevisae dan Pichia pastoris telah berhasil digunakan untuk mengekspresikan berbagai macam protein rekombinan termasuk insulin dan albumin. Saccharomyces cerevisiae juga digunakan untuk produksi antigen permukaan hepatitis. Namun, sel-sel mamalia lah yang dibutuhkan untuk menghasilkan sebagian besar protein biofarmasi. Meskipun kultur sel mamalia umumnya lebih kompleks, sel-sel ini dapat membawa keluar hasil modifikasi pasca translasi, seperti glikosilasi, yang penting untuk aktivitas biologis dan farmakologis yang tepat. Hamster Ovarium Cina (CHO) sel adalah sistem ekspresi mamalia yang paling umum digunakan, terutama untuk antibodi rekombinan. Sel manusia, PerC6, telah dikembangkan baru-baru ini dan juga digunakan untuk produksi beberapa protein rekombinan. CHO dan PerC6 mampu mengekspresikan antibodi dalam konsentrasi 15 mg ml-1. Titer produk yang dicapai tinggi, hal ini terutama dikarenakan ekspresi protein dalam sistem ini umumnya independen dalam hal pertumbuhan. Akibatnya, sel-sel dapat dipertahankan dalam bioreaktor untuk waktu yang lama dalam keadaan produktif dan dapat dikembangbiakan untuk mencapai densitas yang sangat tinggi, hingga 10 8 sel per ml.

39

Sel mamalia lainnya yang digunakan dalam produksi protein rekombinan adalah sel ginjal bayi hamster (BHK), sel Vero, dan sel ginjal anjing Madin - Darbyn (MDCK). Beberapa faktor koagulasi yang membutuhkan - carboxylation diproduksi di BHK. Sel Vero, berasal dari ginjal monyet, dan sel-sel MDCK digunakan untuk produksi vaksin. Sel serangga seperti sel-sel dari jaringan ovarium kepompong ulat Spodoptera frugiperda (Sf9), juga telah diusulkan untuk mengekspresikan protein rekombinan. Sel-sel ini dapat terinfeksi virus serangga seperti virus polihedral California Autograph nuklir yang juga dikenal sebagai baculovirus. Meskipun mudah untuk menanganinya, sistem sel serangga belum berlisensi untuk dapat diproduksi pada industri protein biofarmasi. Pada masa lalu, hewan transgenik dianggap memiliki sistem produksi yang sangat baik sejak protein dapat disekresikan kedalam susu dengan titer sampai 5 mg ml-1. Satu dekade yang lalu, titer tidak dapat dicapai dengan kultur sel mamalia. Dengan demikian, pada saat itu sistem ekspresi sering disukai. Kemajuan modern dalam kultur sel, bagaimanapun, telah memungkinkan tercapainya titer yang lebih tinggi. Sistem transgenik membutuhkan prosedur yang sangat membosankan dalam mengembangkan keturunan dengan karakteristik ekspresi yang tepat. Pemurnian protein dari susu juga bisa jadi merepotkan, terutama ketika penghilangan kasein melalui pengendapan acid-induced yang tidak kompatibel dengan produk protein. Selain itu, sebagai 'sistem produksi terbuka', hewan transgenik mungkin rentan terhadap masalah keamanan dan kontaminasi eksternal. Keuntungan dari budidaya sel mamalia dalam sistem bioreaktor tertutup ditambah dengan titer lebih tinggi daripada yang dicapai dalam susu transgenik dan penggunaan proses pengolahan hilir yang sederhana mungkin adalah alasan rasional mengapa kultur sel umumnya disukai dalam industri biofarmasi. Tanaman dan sel tumbuhan juga menjadi kandidat yang potensial untuk ekspresi protein. Meski berbeda dengan sel mamalia, modifikasi pasca translasi juga memungkinkan dalam organisme ini. Namun, ekspresi dalam daun, batang, atau biji menyajikan tantangan proses penanganan dan pemurnian karena jaringan atau benih harus ditumbuk atau ditekan dan diekstraksi yang nantinya akan menghasilkan campuran yang sangat kompleks. Sebuah sistem ekspresi yang menarik adalah rhizo-secretion, dimana protein yang disekresi ke dalam cairan budidaya dari akar berbulu. Sel tumbuhan, di sisi lain, menyajikan sedikit kesulitan 40

dalam pengolahan hilir karena sel-sel tumbuh dalam media yang sangat sederhana. Sistem lain yang menarik adalah 'teknologi olesins'. Dalam kasus ini, lipid diakumulasikan dalam sel tanaman dalam bentuk tetesan kecil. Protein, yang dikenal sebagai olesins ini dapat terkonsentrasi sebagai monolayer pada permukaan tetesan ini. Setelah menggabungkan protein rekombinan ke olesins, penanganan utama protein target dapat dicapai oleh proses yang relatif sederhana melalui panen tetesan minyak.

1.3.2 Komposisi Sel Inang Komposisi sel inang memiliki efek penting pada pengolahan hilir ketika produk merupakan intrasel, karena dalam hal ini komponen seluler merupakan kotoran besar. Komponen sel inang juga ditemukan secara luas sebagai pengotor dalam produk sekresi, karena lisis sel selalu terjadi sampai batas tertentu selama proses fermentasi. Kenyataannya, dalam beberapa kasus, prosedur budidaya yang menghasilkan titer tinggi, seperti yang digunakan untuk antibodi, merupakan hasil produksi lisis sebagian dari sel yang pada gilirannya menyebabkan kontaminasi dari produk dengan komponen sel inang. Sebuah gambaran karakteristik komposisi dan fisik dari sel inang utama digambarkan pada tabel 1.13 dan 1.14.

Seperti yang dapat dilihat dari tabel ini, sel mamalia mengandung lebih banyak protein tetapi sedikit asam nukleat daripada bakteri. Bakteri dan ragi juga 41

mengandung banyak komponen dinding sel. Komponen ini sering tidak larut dan secara efisien dapat dihilangkan selama langkah proses awal. Langkah-langkah awal secara signifikan dipengaruhi oleh kepadatan sel dan viskositas dari kaldu. Kepadatan sel yang sangat tinggi dapat diperoleh pada ragi, terutama pada P. pastoris, dimana telah dilaporkan bahwa sel kepadatannya bisa sampai 400 g sel per liter. Suspensi tersebut sangat sulit untuk diklarifikasi. Suspensi ini seringkali harus diencerkan dengan tujuan untuk mensentrifus kaldu. Asam nukleat hadir dalam bentuk DNA dan berbagai bentuk RNA. Senyawa ini yang bertanggung jawab terhadap viskositas kaldu yang tinggi tetapi cepat terdegradasi akibat adanya gaya geser mekanis atau nuklease endogen.

Pertimbangan terakhir adalah stabilitas mekanik dari sel inang. Bakteri dan sel-sel ragi umumnya secara mekanis sangat stabil dan tingkat geser diatas 10 6 s-1 diperlukan untuk memecahkan sel-sel ini. Tingkat geser yang tinggi hanya dapat dicapai dengan menggunakan peralatan khusus seperti high-pressure homogenizers atauFrench presses. Sebagai perbandingan, sel mamalia jauh lebih lemah untuk memecahkan sel-sel. Kekuatan peledak yang mungkin diperlukan

42

untuk menghancurkan sel ragi adalah pada kisaran 90 N sedangkan kekuatan ledakan untuk sel mamalia berkisar 2 - 4 N.

1.3.3 Media Kultur Biofarmasi modern biasanya diproduksi bersama media dimana

komponennya secara kimiawi terkarakterisasi. Di masa lampau, ragi, daging, dan ekstrak kedelai diproduksi melalui degradasi proteolitik dan ekstraksi, yang biasa digunakan untuk budidaya bakteri dan sel-sel ragi. Standarisasi bahan baku sangat sulit karena dapat menghasilkan variasi antar batch. Sampai saat ini umumnya dilakukan penambahan media budidaya untuk sel mamalia dengan serum janin sapi, dengan konsentrasi sampai dengan 10%. Selain menambahkan kompleksitas dan biaya, suplemen tersebut dapat memperkenalkan agen adventif yang tidak diinginkan, seperti prion, yang secara signifikan dapat meningkatkan proses pengolahan hilir. Walaupun pengujian untuk agen tersebut masih mungkin diperlukan, namun penggunaan media dimaksudkan untuk menyederhanakan pengolahan hilir. Media untuk budidaya bakteri pada tingkat industri biasanya sangat sederhana dan menyediakan sumber-sumber penting dari karbon, nitrogen dan fosfat. Contoh media terpapar dalam Tabel 1.15.

Ketika pH fermentasi dikendalikan oleh penambahan NaOH, konduktivitas setinggi 40 cm mS-1 dapat dicapai pada akhir periode budidaya. Konduktivitas yang 43

tinggi tersebut dapat mengganggu operasi pengolahan hilir seperti pertukaran ion, sehingga langkah-langkah seperti pengenceran atau diafiltrasi diperlukan. Kesulitan ini dapat dihindari dengan menggunakan amonia untuk mengontrol pH, yang biasanya menghasilkan konduktivitas yang lebih rendah dari supernatan kultur. Selain garam dan gula, yang diperlukan untuk metabolisme sel, produksi protein rekombinan pada bakteri biasanya membutuhkan penambahan induser, seperti isopropil - - D - thiogalactopyranoside (IPTG), yang digunakan untuk mengaktifkan ekspresi protein saat kepadatan sel tertentu tercapai. Penggunaan senyawa alam sebagai induser menguntungkan karena spesies tersebut mudah terdegradasi dalam kultur dan kotoran tidak signifikan. Di sisi lain, deterjen atau minyak ditambahkan ke kultur sebagai agen anti-foaming, meskipun hadir dalam jumlah yang relatif kecil, dapat mempengaruhi proses hilir karena mereka cenderung dapat mengotori membran dan matriks kromatografi. Kultur media untuk ragi mirip dengan yang digunakan untuk E. coli. Metanol sering digunakan sebagai inducer untuk sistem ekspresi berbasis promotor oksidase alkohol (AOX). Kultur sel mamalia, di sisi lain, memerlukan medium jauh lebih kompleks termasuk glukosa sebagai sumber karbon, asam amino, vitamin, garamgaram anorganik, asam lemak, nukleotida, piruvat, dan butirat. Medium basal ini dilengkapi dengan protein untuk transportasi oksigen, hormon, dan faktor pertumbuhan. Protein transport oksigen seperti transferin mengandung zat besi dalam bentuk terikat. Dalam rangka mendapatkan media bebas protein, protein ini sering diganti dengan chelators besi seperti besi sitrat, asam iminodiaectic besi, amonium sitrat besi dan tropolone (2 - hidroksi - 2,4,6 - cycloheptatrien - 1 - one). Namun, senyawa ini juga dapat mengganggu pengolahan hilir. Ditambah lagi, dalam kondisi sedikit asam, sitrat besi dapat membentuk gel, yang sulit untuk dipisahkan dari protein dan biomakromolekul lainnya. Beberapa aditif lainnya yang mungkin ada dalam media kultur sel: pH indikator seperti fenol red, ditambahkan ke media kultur skala laboratorium dalam bentuk terikat sebagai pertukaran ion resin dan sebaiknya dihindari pemakaiannya untuk budidaya skala besar. Polimer, seperti poli (propilen glikol) atau poli (etilen glikol), sering diperlukan dalam konsentrasi sampai 0,02% untuk melindungi sel-sel dari tegangan geser. pH dalam kultur sel mamalia biasanya diatur dengan 44

penambahan CO2, meskipun kultur dengan kepadatan tinggi mungkin memerlukan penambahan NaOH. Konduktivitas akhir kurang dari 17 mS cm -1 adalah khas dan dapat membuat penangkapan langsung melalui pertukaran ion lebih mudah daripada menangkap dari ragi dan homogenat E. coli.

1.3.4

Komponen Kultur Kaldu Secara umum, sebelum panen, kultur kaldu mengandung komponen-

komponen berikut: sel utuh, puing-puing dari sel lisis, komponen intraseluler sel inang, media komponen yang tidak digunakan, senyawa yang disekresikan oleh sel, dan secara enzimatik atau kimiawi dikonversikan oleh komponen media. Oksigen habis karena selama proses penanganan utama suplai oksigen dimatikan dan residu oksigen yang terlarut sangat cepat dikonsumsi. Kandungan oksigen yang rendah dapat menyebabkan nekrosis dan kematian sel-sel serta dapat dengan cepat terjadi lisis selama fase ini. Beberapa jenis sel mulai autolisis hanya sekitar 30 menit tanpa oksigen. Akibatnya, pemisahan jenis sel yang cepat dari sel-sel supernatan kaldu sangat diperlukan untuk mempertahankan tingkat kotoran sel inang dalam jumlah rendah. Konsentrasi tinggi dari CO 2 yang dapat diproduksi oleh sel-sel sisa dalam kultur kaldu akan pecah dan menggeser pH menuju wilayah asam. CO2 jauh lebih mudah larut dalam larutan air daripada oksigen, sehingga konsentrasi substansial mungkin hadir. CO2 terlarut dapat dengan cepat dibebaskan ketika pH disesuaikan pada proses pengolahan hilir dan membentuk gelembung yang kemudian dapat masuk kedalam kolom kromatografi dan mengganggu pada kemasan. Komponen sel inang intraseluler yang ada sebagai pengotor dalam

supernatan kultur dapat diperkirakan dari persamaan berikut:

dimana konsentrasi komponen intraseluler dapat diperkirakan dari Tabel 1.13 dan 1.14. Dengan demikian, dari perspektif pengolahan hilir, viabilitas sel yang tinggi sangat diperlukan, ini tidak selalu mungkin. Misalnya, dalam high-titer produksi 45

antibodi oleh kultur sel, sel-sel sering lisis dalam tahap akhir dari budidaya. Akibatnya, supernatan dari kultur sel mamalia tumbuh akan mengandung protein sel inang dalam kisaran 1 - 3 mg ml -1 (1000 sampai 3000 ppm). Tingkat ini harus dikurangi menjadi kurang dari 100 ppm dalam produk akhir.

1.3.5 Persyaratan Kualitas Produk Pembuatan produk biologi untuk aplikasi farmasi harus mengikuti pedoman umum yang telah ditetapkan oleh regulasi. Tiga kata kunci persyaratan kualitas produk utama: kemurnian, potensi, dan konsistensi. Secara industri, persyaratan ini harus dipenuhi melalui proses yang ekonomis dan dapat membawa produk ke pasar dengan cepat. Proses hilir harus dirancang untuk memperoleh kemurnian yang cukup dan tetap menjaga potensi atau aktivitas farmakologi secara konsisten. 1.3.5.1 Jenis Pengotor Persyaratan kemurnian untuk biofarmasi bervariasi tergantung pada aplikasi tertentu. Dengan demikian, tidak mungkin untuk menentukan nilai absolut. Namun, sebuah perbedaan penting dapat dibuat antara zat pengotor, yang sering dikategorikan sebagai kritis atau non-kritis. Sebuah pengotor non-kritis adalah senyawa inert tanpa relevansi biologis. Hal ini dapat terjadi, misalnya, PEG sisa dari proses ekstraksi atau komponen berbahaya inangnya seperti lipid. Di sisi lain, endotoksin atau sekresi faktor pertumbuhan ke dalam supernatan kultur adalah contoh pengotor kritis, karena mereka menimbulkan aktivitas biologis yang merugikan. Pengotor ini perlu ditelusuri sepanjang proses. Pengotor dapat berasal baik dari proses budidaya atau dari bahan tambahan yang digunakan. Contoh dari proses terkait pengotor diantaranya kelarutan enhancer, redoks - buffer, inhibitor enzim, dan senyawa yang dilepaskan dari filter atau media kromatografi. Monomer yang bocor dari bahan polimer akan datang dan masuk dalam bentuk kontak dengan produk kadang-kadang perlu menjadi perhatian khusus. Pengujian ekstensif dan dokumentasi penghilangan mereka harus dan wajib dilakukan. Istilah agen adventif ini digunakan untuk menggambarkan pengotor yang berpotensi menular yang belum ditambahkan dengan sengaja dan tidak penting

46

untuk proses tapi biasanya sangat berbahaya. Mereka mungkin dapat masuk kedalam proses sebagai akibat bahan baku yang terkontaminasi atau sel. Contohcontoh zat adventif adalah virus, virus-like partikel, dan prion yang mampu mengubah agen ensefalitis spongiform. Beberapa bahan kimia beracun juga dapat dipertimbangkan untuk menjadi agen adventif. Terakhir, bioburden yang berasal dari kontaminasi mikroba dari udara atau personil atau dari peralatan yang tidak cukup bersih, juga dapat memiliki efek serius dan harus secara hati-hati dipantau dan dikendalikan. Tabel 1.16 merangkum langkah-langkah yang diperlukan untuk

menghilangkan agen adventif dan pengotor lainnya. Demonstrasi ini biasanya dilakukan dalam percobaan skala kecil karena jelas akan kontraproduktif yang dapat mencemari pabrik produksi oleh agen adventif. Untuk penentuan ini, dikenal sebagai percobaan spiking, sebuah bolus dari agen adventif, misalnya virus, akan ditambahkan ke aliran bahan baku dan memasuki langkah proses pemurnian. Titer virus sebelum pemurnian a'= log 10 (Feed titer) dan setelah pemurnian a''= log 10 (titer Harvest) harus ditentukan dan nilai faktor log - virus reduksi (LVR) dihitung sebagai berikut:

Dalam rangka untuk menjelaskan efek perubahan volume (misalnya hanya 1:10 pelarut yang dihasilkan dalam LVR 1), faktor reduksi individu, Ri, dapat dihitung:

47

di mana V' dan V" adalah masing-masing volume makanan dan panen. Akhirnya, LVR dari langkah-langkah proses individu ditambahkan bersama-sama sampai mencapai LVR kumulatif untuk seluruh proses. Tabel 1.17 menggambarkan izin skema virus khas untuk proses pemurnian antibodi.

Meskipun hampir semua sel mamalia yang terinfeksi virus harus membuat validasi pemberantasan virus, upaya untuk menghilangkan prosedur ini sering dilakukan dengan memanfaatkan proses platform yang telah menunjukkan nilai efisiensi clearance. 1.3.5.2 Peraturan Aspek dan Validasi Kualitas produk biofarmasetik dan proses validasi harus tunduk pada peraturan oleh masing-masing pemerintah. Di Amerika Serikat, kerangka hukum ini diterbitkan dalam Code of Federal Regulation 21 (21 CFR), Subchapter F Biologics. US Food and Drug Administration (US FDA) bertanggung jawab atas pelaksanaannya. Kode US ini mendefinisikan produk biologi sebagai berikut: 'produk biologis berarti virus, serum terapi, racun, antitoksin, atau produk serupa yang digunakan untuk pengobatan, pencegahan atau penyembuhan penyakit atau cedera manusia'. Plasmid, sel dan jaringan yang tidak disebutkan secara eksplisit, 48

tetapi dianggap sebagai bagian dari definisi ini. Di Uni Eropa (UE), kerangka hukum masih di bawah kedaulatan negara-negara anggota, meskipun Uni Eropa telah mendirikan Badan Kedokteran Eropa (EMEA), dengan tujuan harmonisasi struktur peraturan di negara anggota Uni Eropa. Pedoman untuk produk obat yang diperoleh dalam bioteknologi sebagaimana diatur oleh Commission of European Community, mendefinisikan biologis sebagai produk yang berasal dari: 1. darah, cairan tubuh lain manusia atau jaringan manusia 2. darah binatang 3. mikroorganisme atau komponen mikroorganisme 4. hewan atau mikroorganisme untuk imunisasi aktif atau pasif 5. antibodi monoclonal 6. produk DNA rekombinan. Adanya peraturan-peraturan tersebut menambah kompleksitas industri

biofarmasetik. Dengan demikian, Konferensi Internasional tentang Harmonisasi (ICH) dibentuk untuk mengembangkan kerangka peraturan umum internasional tersebut. ICH menyatukan kewenangan Eropa, Jepang dan Amerika Serikat, serta ahli dari industri farmasi dari tiga wilayah untuk membahas aspek-aspek ilmiah dan teknis terkait registrasi produk. Tujuannya adalah untuk membuat rekomendasi tentang cara-cara untuk mencapai harmonisasi dalam penafsiran dan penerapan pedoman teknis dan persyaratan untuk registrasi produk. Sementara kemajuan sedang dibuat dalam proses harmonisasi, kerangka peraturan masing-masing negara tetap berlaku. Selama bertahun-tahun, Pusat Penelitian dan Evaluasi Biologis (CBER) dari FDA AS telah mengeluarkan rekomendasi rinci untuk pembuatan produk biologis didalam seri makalah 'Poin Pertimbangkan'. Pertama kali makalah ini dirilis pada tahun 1983 dengan judul 'Prosedur Uji Interferon: Poin Pertimbangan dalam Produksi dan Pengujian Interferon yang Ditujukan untuk Penggunaan Investigational pada Manusia'. Makalah selanjutnya meliputi:

49

1. Hal yang Perlu Dipertimbangkan dalam Produksi dan Pengujian Obat Baru dan Produksi Produk Biologis melalui Teknologi Rekombinan DNA 1985/04/10 2. Pedoman Validasi Uji Limulus Amebocyte lisat sebagai Tes Produk Akhir Endotoksin untuk Obat Parenteral Manusia dan Hewan, Produk Biologi dan Alat Kesehatan - 12/1987 3. Hal yang Perlu Dipertimbangkan dalam Industri dan Pengujian Produk Terapi untuk Manusia yang Menggunakan Hewan Transgenik 1995 4. Hal yang Perlu Dipertimbangkan dalam Industri dan Pengujian Produk Antibodi Monoklonal untuk Penggunaan pada Manusia - 1997/02/28 5. Pedoman Industri: Penggunaan Antibodi Monoklonal sebagai Reagen dalam Produksi Obat - 2001/03/29 Validasi merupakan aspek penting dari proses pengembangan biofarmasetik. Menurut definisi ICH yang ada, parameter penting yang dapat mempengaruhi kualitas produk perlu divalidasi. Setelah validasi, protokol operasi standar (SOP) harus ada, yang menggambarkan proses dan variasi yang diperbolehkan. Parameter operasional yang kritis didefinisikan sebagai proses parameter sub-set terbatas yang secara signifikan mempengaruhi atribut kualitas produk kritis ketika memiliki variasi bermakna diluar jangkauan operasional, sempit (atau sulit untuk dikontrol). Misalnya, operasi langkah pemurnian kromatografi. Seperti terlihat pada Tabel 1.18 operasi ini akan membutuhkan definisi dari sejumlah kondisi operasi sebagai input, yang pada gilirannya akan menghasilkan karakteristik kinerja tertentu, yang didefinisikan sebagai output. Dalam rangka untuk memvalidasi proses, parameter input harus lebih bervariasi menyesuaikan rentang dan output yang diukur. Parameter kritis kemudian ditetapkan berdasarkan percobaan ini, yang biasanya dilakukan dalam skala kecil. Rentang operasional disesuaikan dengan interval yang telah ditetapkan untuk parameter ini serta untuk non - parameter kritis. Karena yang terakhir tidak mempengaruhi atribut produk kualitas kritis, range mereka biasanya akan lebih luas daripada parameter kritis (lihat Gambar 1.28).

50

1.3.5.3 Persyaratan Kemurnian Sulit untuk menjelaskan persyaratan kemurnian mutlak karena mereka bergantung pada tujuan penggunaan biofarmasetik, dosis, perbandingan risikomanfaat, dll. Tabel 1.19 menggambarkan nilai perkiraan kemurnian yang dimaksudkan sebagai pedoman umum. Agregat merupakan perhatian penting bagi banyak protein biofarmasetik. Hal ini ditunjukkan bahwa agregat dapat menginduksi reaksi kekebalan tubuh atau menyebabkan efek samping lainnya. Selain itu, agregat mungkin merupakan awal terjadinya pengendapan dan mengurangi umur simpan produk. Akibatnya, kontrol pada persentase dimer, oligomer dan bentuk agregat yang lebih tinggi sering dan sangat diperlukan. Kebocoran ligan atau bahan kimia lainnya yang dapat dilepaskan dan terjadi pada media kromatografi dan membran juga menjadi perhatian penting 51

karena bahan-bahan tersebut bisa imunogenik dan beracun. Kontaminasi virus jelas merupakan isu penting dan telah bertanggung jawab untuk banyak penyakit iatrogenik, seperti yang terjadi karena produk darah yang terkontaminasi. Sejak penghilangan absolut agen-agen adventif tidak mungkin dilakukan, terdapat batasan yang didirikan atas dasar analisis resiko-manfaat. Misalnya, Organisasi Kesehatan Dunia (WHO) menerima kasus satu vaksin yang merugikan dalam 10 9 aplikasi - maka, nilai probabilitas 10-9 yang disarankan dalam Tabel 1.19. Dalam prakteknya, kesulitan untuk mencapai probabilitas rendah seperti ini, tentu saja, tergantung pada dosis. Sebagai contoh, tingkat umum set 10 pg DNA per dosis relatif mudah untuk mencapai untuk vaksin Hepatitis B, di mana satu dosis mungkin berisi hanya sekitar 12 g protein. Di sisi lain, persyaratan seperti itu mungkin agak sulit untuk bertemu dalam kasus antibodi rekombinan, di mana satu dosis dapat terdiri dari sebanyak 500 mg protein.

Seperti telah disebutkan sebelumnya, biofarmasetik kebanyakan tidak sepenuhnya didefinisikan sebagai entitas molekul individu, mereka terdiri dari sejumlah besar isoform serupa atau bervariasi (beberapa produk antibodi rekombinan berisi 200 varian yang diidentifikasi). Karena aktivitas biologis dan farmakologis dapat bervariasi di antara isoform yang berbeda, untuk itu penting untuk menjaga distribusi varian dalam rentang yang dapat diterima. Karena kompleksitas sistem bioproduksi, konsistensi yang sama juga harus dipertahankan 52

untuk profil pengotor seperti yang ditentukan dari tes analitis, untuk menjamin keamanan produk. Akhirnya, sistem pengujian harus ditetapkan untuk mengendalikan potensi in vitro dan, jika perlu, in vivo.

Hormon / Insulin Teknologi Pemisahan pada Obat Hormon adalah unsur kimia yang mengatur efek metabolisme dan aktivitas organ. Bekerja sama dengan sistem saraf, mengkoordinasikan semua fungsi tubuh. Sebuah mekanisme kontrol yang rumit yang memastikan interaksi hormon pada fungsi tubuh. Teknologi pemisahan GEA memainkan peran penting dalam produksi hormon, misalnya insulin. Diabetes merupakan penyakit gangguan metabolik yang ditandai dengan gula darah (glukosa) tinggi, yang disebabkan dari kerusakan sekresi insulin sehingga tubuh tidak mampu memproduksi atau menggunakan insulin untuk mengubah gula dan makanan lainnya menjadi energi. Bila menderita diabetes, tubuh pastinya tidak membuat cukup insulin atau tidak dapat menggunakan insulin sendiri sebagaimana mestinya, atau keduanya. Sekitar 150 juta orang di seluruh dunia saat ini menderita gangguan metabolik ini. Mereka harus menyuntikkan insulin tambahan sehari-hari untuk mencegah penyakit kardiovaskular atau ginjal yang serius.

53

Mesin pemisah dari GEA Westfalia Separator Group memainkan peranan penting dalam proses produksi. Pemisah nosel beroperasi dalam proses seperti yang digambarkan, di mana bahan padat diekstrak terus menerus dengan konsentrasi konstan. Produksi biosintesis insulin manusia dikonduksi oleh bakteri atau ragi. Setelah fermentasi, atau konversi bahan baku kimia oleh mikroorganisme, biomassa diekstraksi oleh pemisah nozzle. Tahap selanjutnya, bahan aktif dicuci dan dipekatkan. Mesin GEA Westfalia Separator Grup juga digunakan dalam tahap kristalisasi berikutnya, misalnya GEA Westfalia Separator hycon dan pemisah chamber.

54

Protein Produk farmasi Bioproduk yang dimodifikasi secara genetik Proses bioteknologi dapat diartikan sebagai proses menggunakan

mikroorganisme hasil rekayasa genetika. Hal ini mampu menghasilkan produk biologi yang tidak dapat dibuat secara alami. Rantai DNA yang dimodifikasi dan 55

faktor hereditas yang dimanifulasi secara genetik dikembangbiakkan dengan cara fermentasi pada mikroorganisme. Produk sel yang diinginkan mungkin terdapat pada intrasel atau ekstrasel. Produk ekstraseluler Setelah proses fermentasi, mikroorganisme diekstraksi dengan separator yang beroperasi secara terus menerus. Untuk meningkatkan hasil, bahan padat dicuci dan diekstraksi lagi dengan pemusingan. Semua material yang digunakan harus disterilkan pada suhu 121 C. Untuk menjaga proses sesederhana mungkin, biomassa dimatikan secara langsung setelah fermentasi dalam fermentor baik dengan metode panas atau dengan metode kimia. Secara tertutup, uap sentrifus steril yang bekerja dalam proses ini dapat terhubung ke peralatan lain secara steril. Produk Intraseluler dan badan inklusi Dalam proses intraseluler, hal ini dibedakan apakah produk yang diinginkan terkandung dalam cairan intraseluler atau dalam badan inklusi. Berbeda dengan bioproduksi ekstraseluler, pada produk intraseluler biomassa dicuci dan terkonsentrasi secara homogen, yaitu sel-sel yang rusak dan cairan intraseluler dan badan inklusi dilepaskan. Semua ini dipisahkan dari fragmen sel, dicuci dan terkonsentrasi di tahap selanjutnya dari proses sentrifugal pada GEA Westfalia Separator Grup. Untuk produk intraseluler yang diperoleh dari cairan sel, padatan

diekstraksi dengan separator yang beroperasi secara terus menerus.

56

Kultur Sel Mamalia Budidaya kultur sel mamalia menjadi semakin menarik bagi industri farmasi. Dengan sel-sel, protein dapat diproduksi secara efektif (quartiary struktur). Dibandingkan dengan produksi oleh mikroorganisme (bakteri / ragi), tahapan hilir pada proses dapat dikurangi secara substansial. Selain itu, risiko seperti infeksi dalam produksi protein manusia dapat dihindari.

Optimalisasi pada proses produksi Dalam proses ini, perhatian khusus harus diberikan pada efek dari pengaruh asing seperti perubahan dari perilaku dan produktivitas sel. Karena keadaan ini, mesin dioptimalkan untuk mengurangi perubahan pada sel. Proses ini mendapatkan signifikansi untuk industri. "Hydrohermetic inlet" yang dikembangkan oleh GEA Westfalia Separator Group mengurangi gaya geser menjadi minimum. Kultur sel khas yang diproses adalah CHO, BHK, hibridoma dan sel-sel serangga.

Fraksinasi Plasma Darah Manusia

57

Terapi dengan komponen darah secara eksplisit dapat memerangi berbagai penyakit lama yang dikembangkan dari transfusi darah sederhana. Fraksinasi merupakan pemisahan protein dalam fase plasma oleh proses fisika dan kimia. Hal ini didasarkan pada perubahan tiga parameter yaitu temperatur, konsentrasi alkohol dan nilai pH, yang mempengaruhi kelarutan protein dalam air. Darah manusia terdiri dari fase yang berwarna merah dan fase plasma yang bersih. Fase yang berwarna merah, sekitar 40 persen dari darah, dipisahkan oleh sentrifugal khusus dalam kantong donor. Plasma akan membeku setelah diekstraksi dan diproses oleh peralatan fraksinasi. Hanya sekitar 5 persen dari plasma terdiri dari komponen yang berharga, yang harus difraksinasi, siisanya adalah air dan elektrolit. Terapi dengan komponen darah Zat berharga dapat diekstraksi dari protein. Kriopresipitat, persiapan pembekuan "Faktor VIII konsentrat" dan kompleks prothrombin (PPSB) dapat diperoleh dari plasma segar secara langsung setelah mencair. Plasma yang tersisa masuk dalam fraksi etanol dengan proses Cohn, di mana fraksi individu seperti fibrinogen, globulin gamma, alpha dan beta globulin dan albumin diendapkan. Partikel-partikel pada plasma protein digunakan untuk mencegah dan mengobati pendarahan, mengontrol perdarahan selama operasi, berbagai penyakit menular, kekurangan protein, malnutrisi dan meningkatkan proporsi plasma darah. Setelah fraksinasi, protein diperlakukan dengan berbagai metode yang spesifik sebelum digunakan untuk tujuan klinis.

58

Peran kromatografi dalam proses hilir Kromatografi adalah alat yang penting digunakan untuk pemurnian

biofarmasi. Hal ini dapat dijelaskan dengan keuntungan tertentu dari kromatografi disbanding unit operasi lainnya. Keuntungan kromatografi : 1. Kromatografi memberikan efisiensi pemisahan yang sangat tinggi,

yang memungkinkan campuran yang kompleks dengan sifat molekul yang sangat mirip. Kolom kromatografi dirancang dapat memiliki efisiensi pemisahan ratusan atau bahkan ribuan. Sebagai perbandingan, ekstraksi dan filtrasi membran biasanya terbatas hanya beberapa tahap. 2. Kolom kromatografi dikemas dengan adsorben kapasitas tinggi yang ideal untuk menangkap molekul dari larutan encer yang dilakukan dalam Bioproses. Dalam sistem tersebut, ada kontak antara efisiensi larutan volume besar dan adsorben dengan jumlah kecil yang berada dalam kolom, sehingga menghilangkan kontaminan yang ada dalam konsentrasi kecil. Sebagai perbandingan, sistem ekstraksi cair cair biasanya memerlukan volume yang hampir sama dari dua fase agar dapat berfungsi dengan baik, sehingga konsentrasi tidak dapat dikerjakan dengan mudah. 3. Kromatografi dapat dilakukan dalam suatu sistem tertutup dan fase diam dapat dengan mudah diregenerasi. Sehingga, metode kromatografi cocok dalam banyak proses manufaktur biofarmasi dan alat yang sesuai dan bahan sudah tersedia. Kelemahan yang dirasakan dari kromatografi adalah kesulitan dalam skala tinggi pada industri biofarmasi . Seperti yang ditunjukkan oleh Kelley, proses pemurnian kromatografi cocok dan secara teknis dan ekonomis untuk pemurnian protein pada

59

skala setinggi 20 ton per tahun. Meskipun tidak ada produk yang saat ini dibuat pada skala yang besar, popularitas biofarmasi meningkat dengan cepat sehingga skala tersebut dapat dibayangkan di masa depan. Larutan yg mengandung beberapa bahan terlarut diinjeksikan pada satu ujung kolom, dan eluent membawa larutan melewati fase diam ke ujung kolom. Tiap bahan terlarut bergerak pada laju yg proporsional dengan afinitas relatifnya thd fase diam dan keluar pada ujung kolom sebagai band yang terpisah. Tergantung pada tipe adsorben atau interaksi bahan terlarut dengan adsorben, kromatografi dipisahkan atas kromatografi adsorpsi, pertukaran ion, affinitas, dan filtrasi gel.

Kromatografi filtrasi gel Memisahkan protein berdasarkan ukurannya. Pemisahan terjadi berdasarkan kecepatan pergerakan relatif dari masing-masing protein melalui suatu molecular sieve. Molecular sieve yang digunakan biasanya merupakan suatu gel polisakarida dalam bentuk bulatan kecil (granula). Gel yang sering digunakan : dekstran (polimer gula) yang larut dalam air dan telah mengalami cross linkage dengan bantuan epikhlorhidrin

60

 Kromatografi penukar ion Memanfaatkan perbedaan afinitas molekul bermuatan di dalam larutan dengan senyawa tidak reaktif yang berfungsi sebagai pengisi kolom yang muatannya berlawanan. Senyawa tidak reaktif yang digunakan adalah polimer yang bersifat elastik yang mengandung kerangka resin sintetik : seperti Polistiren. Pada polimer tersebut dikaitkan gugus fungsional tertentu yang berupa penukar anion atau kation. Jenis penukar ion yang banyak digunakan : CMC dan DEAE (dietanolaminoetil) selulosa. Pemakaian penukar kation dilakukan dengan penambahan buffer pH 5 dan 10 mM kation (biasanya Na+) untuk menciptakan kondisi penyerapan yang kuat. Kromatografi pertukaran ion banyak digunakan dalam pemurnian enzim. Kromatografi afinitas

Kromatografi dengan dasar interaksi biokimia. Pemisahan terjadi karena interaksi spesifik antara pasangan senyawa enzim dengan substrat, kofaktor, allosterik, efektor atau inhibitor. Prinsip : ligan yang terikat secara kovalen pada matrik yang tidak larut air akan menyerap salah satu/beberapa dari 61

komponen campuran. Komponen yang diserap mempunyai afinitas yang spesifik dengan ligan. Komponen yang tidak memiliki afinitas akan melaju dan keluar. Molekul yang sudah diserap dilepaskan dengan mengubah kondisi elusi (dengan larutan bebas ligan, perubahan pH atau kekuatan ion Keuntungan : Sifat interaksinya spesifik Jumlah adsorben yang digunakan dapat disesuaikan dengan zat yang akan diadsorbsi Adsorben dapat diregenrasi beberapa kali Ligan dapat berupa : Substrat yang termodifikasi Inhibitor spesifik Kofaktor Efektor biologis Sistem kromatografi afinitas yang baik ditentukan oleh jenis matriks dan ligan yang digunakan. Matriks pengisi kolom : matriks gel dengan sifat : Mempunyai gugus fungsional yang ampuh untuk bereaksi dengan jenis protein dan ligan yang diinginkan, Tahan terhadap mikroba Stabil, Tahan lama Bersifat hidrofilik Ddapat diregenrasi Mempunyai kapasitas yang besar terhadap enzim atau ligan, Dapat melewatkan pelarut, Kromatogafi interaksi hidrofobik Protein enzim dapat diikat oleh matriks melalui interaksi hidrofobik pada lingkungan polaritas dan kekuatan ion yang tinggi. Matriks yang digunakan bersifat non polar, misalnya sefarosa. Enzim dipisahkan dari ikatan dengan menggunakan eluen yang polaritasnya diturunkan. Eluen yang digunakan : beberapa jenis garam. Peningkatan polaritas dapat dilakukan dengan menggunakan konsentrasi ion yang berbeda : Ba2+, Ca2+, Mg2+, Li+, Cs+, 62

Na+, K+, Rb+ dan NH4 + (untuk kation), atau SCN-, I-, ClO4-, NO3-, Br-,Cl-, CH3COO-, SO2 2- dan PO43- (untuk anion).

Gambar diatas menggambarkan struktur dari proses generik untuk recovery dan pemurnian produk biologi dengan fermentasi mikroba atau kultur sel hewan. Langkah awal di mana sel-sel dipisahkan disebut sebagai primary recovery. ke dalam media kultur atau ditunjukkan dalam sel, baik sebagai Langkah ini membutuhkan strategi yang berbeda tergantung pada apakah produk dikeluarkan inklusi, dalam bentuk cairan dalam sitosol atau periplasm, atau menuju ke membrane. Umumnya, kromatografi memainkan peran kecil dalam langkah-langkah awal, yang difokuskan pada penghilangan padatan suspense seperti sel-sel atau bagian - bagian sel. Sedimentasi, sentrifugasi, deep bed filtration, dan mikrofiltrasi atau kombinasi biasanya digunakan untuk langkah-langkah awal. Namun, kromatografi, dilakukan melalui penggunaan fluidized atau expand bed juga dapat

63

digunakan untuk menangkap langsung protein dikeluarkan dari supernatan kultur sel. Dalam sistem ini aliran cairan ke atas melalui dasar awal yang menetap

pada partikel adsorben padat. Kecepatan aliran tertentu expand bed dan partikel menjadi fluidized memungkinkan membebaskan bagian dari sel dan padatan tersuspensi lainnya sementara produk secara langsung ditangkap oleh adsorben. Pendekatan ini bisa efektif untuk suspensi encer, tapi karena ekspand bed langsung dipengaruhi oleh kepadatan dan viskositas, operasi cenderung kritis dipengaruhi oleh variasi dalam komposisi kaldu. Dalam prakteknya, viskositas tinggi dan densitas sel ditemui dalam teknologi fermentasi modern (sampai 400 mg ml - 1 massa sel basah untuk P. pastoris atau 200 mg ml -1 untuk E. coli) membuat kesulitan untuk menerapkan pendekatan ini pada skala industri. Alternatif yang mungkin untuk penangkapan awal tanpa klarifikasi adalah menggunakan adsorpsi yang memenuhi bed dengan partikel besar, disebut big beads. dan bagian bagian Jika diameter partikel lebih besar dari 400m, ruang interpartikel cukup besar untuk bagian sel sel. Walaupun efisiensi penangkapan berkurang oleh keterbatasan diffusional dengan diameter partikel yang lebih besar, pengurangan ini dalam langkah dapat memberikan keuntungan ekonomi secara keseluruhan dan operasional. Tidak seperti expanded bed, proses packed bed tidak terlalu sensitif untuk memberi viskositas bahan sehingga operasi yang handal dengan diameter beads besar dapat dicapai bahkan dengan bahan baku kental.

64

Gambar 1.30 menunjukkan contoh purifikasi dari antibodi rekombinan. Dalam proses ini, capture direalisasikan menggunakan adsorben selektif yang terdiri dari Protein stafilokokus A bergerak dalam beads berpori. ligan sangat selektif memungkinkan pemuatan langsung kultur kaldu ke kolom capture, dan kemudian secara selektif mengikat antibody. Pada tahap selanjutnya, pemurnian dan polishing dilakukan dengan pertukaran ion dan kolom interaksi hidrofobik untuk menghilangkan protein sel inang dan varian protein menyimpang. Perhatikan bahwa intermediate, non - kromatografi, langkah ini juga disertakan. Pertama, inkubasi pada pH rendah dan kemudian langkah 'virus filtration' di implementasikan untuk pemberantasan virus. Kedua, langkah diafiltration termasuk untuk pertukaran buffer dan formulasi akhir.

PROSES HILIR 1. ENZIM (Proses percepatan sebagai biokatalisator) Enzim adalah senyawa protein organik kompleks yang terdapat pada setiap sel yang hidup, dimana didalam sel tersebut enzim akan diproduksi. 65

Enzim yang dihasilkan tersebut dapat mempercepat proses organik, seperti pemecahan pati, protein lemak, atau gula sebagai katalis, tanpa ikut dalam proses atau reaksi tersebut. Produksi enzim intraseluler Glukosa isomerase adalah contoh dari enzim yang mengubah glukosa menjadi fruktosa dan merupakan pati yang sangat dibutuhkan dalam industri. Enzim diproduksi dan digunakan dalam sel-sel mikro-organisme. Untuk digunakan dalam proses tersebut, fase cair dari kaldu fermentasi dipisahkan dengan sentrifugasi setelah dilakukan fermentasi. Mikroorganisme yang telah mengalami fermentasi tersebut diperlakukan lebih lanjut setelah disentrifugasi. Dinding sel dar mikroorganisme akan rusak, Tergantung pada konsistensi suspensi, suspensi itu diencerkan sebelum fragmen sel dipisahkan oleh mesin pemisah.

Produksi enzim ekstraseluler Mesin pemisah dan mesin pendekantasi telah didesain sedemikian rupa untuk perlakuan optimal terhadap pencucian enzim serbuk. Udara yang telah dimurnikan dan disterilkan disuntikkan ke dalam fermentor yang dilengkapi dengan agitator (pengaduk). Gelembung udara didistribusikan dalam larutan nutrien, yang terdiri dari karbohidrat, protein, growth agent, dan nutrisi. Kemudian disterilkan, dipanaskan sampai suhu optimum dan 66

kemudian diinokulasi dengan kultur yang dimurnikan dari mikroorganisme patogenik. Mikroorganisme memelihara (memberi makan) diri mereka sendiri dengan mengubah zat dan sekaligus menghasilkan enzim. Ini kemudian diekskresikan ke kaldu fermentasi. Setelah fermentasi, mikroorganisme dipisahkan dengan menambahkan flocculent dan dilakukan sentrifugasi serta dekantasi. Keberhasilan proses tersebut akan diperoleh peningkatan hasil dan kemurnian dari enzim.

2. KULTUR MIKROBA MAKANAN Kultur mikroba pada makanan dapat dibagi menjadi kultur awal (starter) dan produk probiotik, keduanya digunakan dalam banyak segmen industri 67

makanan. Kultur Starter merupakan bagian tetap dari industri makanan, produk medis dan hewan. Mereka bertanggung jawab atas kualitas produk dan merupakan kontrol dari proses produksi. Produk probiotik juga penting, karena bersifatnya menguntungkan kesehatan. Pemisahan secara steril menjadi lebih penting untuk memulihkan produk tersebut, probiotik ini dapat digunakan dalam berbagai cara dan mungkin hasil dan kekuatan kultur dapat ditingkatkan kembali.

Pengkulturan, Pengolahan, dan Pemanenan Produksi biakan (kultur) biang dapat dibagi menjadi dua bagian. Setelah pengkulturan di fermentor, bakteri diproses dan dipisahkan dari larutan fermentasi. Ini terdiri dari laktobasilus dan sisa larutan nutrien termasuk asam laktat yang dihasilkan. Pertama, mikro-organisme yang telah mengalami fermentasi dipisahkan dari fase cair. Pemisah nozzle dan piringan pembersih disterilisasi uap. Laktobasilus yang telah mengalami fermentasi kemudian dilewatkan pada freeze drier. Pada tahap akhir, kultur (biang) yang dikemas dalam kedap udara dan disimpan pada suhu rendah. Hal tersebut dapat mempertahankan aktivitas probiotik selama berbulan-bulan sebelum mereka diproses, dikenal sebagai "kultur hidup" dalam yoghurt probiotik.

3. VAKSIN (Proteksi terhadap penyakit ) Vaksin adalah obat yang mengimunisasi manusia atau hewan terhadap penyakit. Organisme akan dilindungi berulang kali dengan adanya sejumlah kecil antigen (dalam vaksin) atau antibodi dalam bentuk serum. Hal ini dilakukan untuk meningkatkan atau mencapai kekebalan. Proses pembuatan vaksin Ketika strain virus yang cocok telah dipilih, kemudian diisolasi dalam ampul dan disimpan pada suhu -192 C dalam nitrogen cair. Pembiakan kemudian dilakukan dimulai dengan pra-fermentor dan dilanjutkan dalam fermentor utama. Proses fermentasi dilengkapi dengan larutan nutrien. Nutrien

68

dilarutkan dalam tangki nutrien dan ditambahkan ke proses fermentasi setelah difiltrasi. Sel-sel tersebut kemudian dipisahkan dari fase clear dengan sentrifugasi. Vaksin mentah dimasukan ke bejana pencampuran, di mana imunogen dari vaksin tersebut meningkat dengan penambahan adjuvant, stabilisator dan pengawet (preservative). Vaksin hidup (Live-Vaccine) Salah satu cara adalah terapi dengan vaksin hidup. Ini adalah kuman dengan virus yang telah dilemahkan atau erat terkait dengan kuman patogen yang biasa disebut antigen, tetapi tanpa efek patogen. Vaksin ini berasal dari mutasi virus (kuman) dengan tingkat patogen yang rendah, yang cocok untuk produksi vaksin.

Non-live vaksin

69

Dalam terapi serum, organisme yang terinfeksi diberikan serum yang diproduksi dengan antibodi dari individu yang diimunisasi. Serum diperoleh dengan membiakkan bakteri dalam larutan nutrien yang sesuai. Serum yang diproduksi selama fermentasi diekskresikan oleh sel-sel ke dalam larutan fermentasi. Serum ini kemudian diisolasi dengan memisahkan biomassa di dalam alat sentrifugasi. Dalam proses produksi vaksin dan sera ini di butuhkan teknik aseptik dalam prosesnya.

70

71