Wahyuari Wibowo 1106020983

Desain primer mutagenesis Menurut spesifikasi GENEART Site-Directed Mutagenesis System, terdapat beberapa spesifikasi yang harus dipenuhi untuk membuat primer diantaranya yaitu : 1. Primer forward dan reverse harus mengandung gen pembawa mutasi yang diinginkan dan 100% complement tanpa overhang. 2. Situs mutas harus terletak pada kedua primer dan panjangnya bias lebih dari 12 basa (delesi, insersi, subtitusi) 3. Kedua primer (forward dan reverse) harus memiliki panjang 30-45 nukleotida, tidak termasuk basa mutasi. Primer yang lebih panjang dari 45 meningkatkan kemungkinan membentuk struktur sekunder dimana dapat mengakibatkan efisiensi amplifikasi PCR. 4. Oligonukleotida DNA dimurnikan dengan desalting atau dapat dimurnikan melalui HPLC dan PAGE yang lebih meningkatkan efisiensi mutagenesis.

Nukleotida yang digunakan yaitu 45 nukletioda, berdasarkan spesifikasi yang diberikan GENEART Site-Directed Mutagenesis System yaitu berkisaran antara 30-45 Nukleoida : AAAGAAAGCTTGATTACCACTACTCCCAGCCGACCCCGAACCGCA

Gambar.1 karakteristik dari susunan nukleotida (sumber : diambil melalui software http://www.bioinformatics.org/primerx/cgi-bin/primer.cgi) Berikurt merupakan primer forward dan reverse yang akan dimutasi. Mutasi yang dilakukan adalah subtitus yaitu dengan mengganti Thereonin ACT dengan Cystein TGC. Primer Forward 5 GAAAGCTTGATTACCACTTGCCCCAGCCGACCCCGAACC 3 Anneal Temp : 720C , Tm primer forward 810C

Primer reverse 5 GGTTCGGGGTCGGCTGGGGCAAGTGGTAATCAAGCTTTC 3 Anneal Temp : 720C , Tm primer reverse : 760C

Gambar 2. Suhu annealing dan Tm pada primer reverse dan forward (sumber : kalkulator https://www.neb.com/tools-and-resources/interactive-tools/tm-calculator)