TEKNIK

KROMATOGRAFI
4
METODE YANG MELIBATKAN DUA TAHAP CAMPURAN
YANG SATU FASA DIAM DAN YANG SATUNYA LAGI
FASA GERAK
Meskipun teknik konvensional pemurnian seperti distilasi , sublimasi dan kristalisasi dan lainlain dengan perbaikan terbaru di dalamnya dalam hal teknik dan peralatan yang sama pentingnya
bahkan kali ini seperti sebelumnya , teknik tersebut semakin berkembang pesat digantikan oleh
pemisahan baru dan teknik pemurnian di antara yang kromatografi , seperti yang dilakukan
dalam berbagai bentuk, adalah yang paling luar biasa contoh . Pentingnya teknik baru dapat
dengan mudah menganalisis senyawa, berat molekul tinggi seperti pemurnian protein yang tidak
mudah setuju dengan metode konvensional ditangani dengan dalam dua bab sebelumnya . Bab
ini membahas dua teknik baru yaitu distribusi Counter sesaat dan kromatografi . itu teknik
distribusi Counter sesaat ( kromatografi Counter sesaat) merupakan teknik kromatografi biasa
dalam dua fase di dalamnya didukung pada suatu pendukung inert , meskipun pemisahan
senyawa olehnya juga didasarkan pada koefisien distribusi yang berbeda antara dua bercampur
fase yang satu yaitu fase gerak dan fasa diam, seperti yang pemisahan dalam kromatografi
konvensional . Karena curah (yang timbul dari berbagai teknik kromatografi dimana biasanya
dipraktikkan, topik kromatografi khas telah dibahas secara rinci , secara umum , dalam beberapa
bab berikutnya , topic ini akan di bahas lebih lanjut.

4.1 Distribusi Counter [Kromatografi Counter (CCC)]

Metode partisi cair-cair sebagaimana dimaksud dalam bab sebelumnya dapat

diperpanjang bahkan pemisahan zat terlarut yang hanya memiliki perbedaan kecil dalam partisi
mereka koefisien dengan metode yang disebut distribusi Counter. Teknik distribusi Counter,
dikembangkan terutama oleh Craig, adalah partisi beberapa proses dengan berbagai tahap,
sepenuhnya terputus dan bertahap dalam alam.

4.1.1 Teori Distribusi Counter

Pembahasan berikut menjelaskan teori yang mendasari pemisahan konstituen campuran
yang dipengaruhi oleh prosedur distribusi Counter
Untuk tujuan diskusi ini, koefisien distribusi atau partisi akan berdiri didefinisikan oleh
persamaan:

Dalam metode ini, dari dua fasa cair bercampur yang mungkin campuran pelarut, buffer, garam
dan berbagai agen kompleks, yang lebih berat merupakan fase diam. Fase ini lebih berat
ditempatkan dalam serangkaian tabung atau sel. Itu fase ringan dalam setiap sel dipindahkan
setelah setiap kesetimbangan oleh gerakan sederhana ke sel sebelah sedangkan sel pertama
diberikan dengan kuantitas segar fase ringan. Seluruh operasi mengagitasi kereta sel untuk
ekstraksi dan demixing dari fase dan bergerak atas fase satu sel ke depan disebut 'a
mentransfer '. Berbagai komponen campuran dimasukkan ke dalam sel pertama di awal dari
muka distribusi melalui kereta pada tingkat yang berbeda. Dengan menambahkan segar kuantitas
tahap ringan ke sel pertama setelah setiap transfer, adalah mungkin untuk melaksanakan banyak
transfer yang diperlukan.

DISTRIBUSI ZAT TERLARUT TUNGGAL

Distribusi zat terlarut tunggal melalui kereta sel selama beberapa transfer mungkin diilustrasikan
dengan menganalisis terlebih dahulu melalui serangkaian tabung nomor 0, 1, 2, ......, r, masingasing berisi (demi kesederhanaan) volume yang sama dari dua cairan bercampur (yang koefisien

distribusi zat terlarut adalah KD), yang larutan ditempatkan dalam fase yang lebih rendah dari
tabung 0 untuk memulai. setelah kesetimbangan tercapai lapisan atas tabung 0 ditransfer ke
tabung 1. Proses ini diulang n kali, setiap kali, semua lapisan atas dipindahkan ke tabung yang
lebih tinggi dalam berurutan. Setelah transfer pertama (n = 1), fraksi zat terlarut yang tersisa di
dalam tabung 0 adalah

, Karena kedua cairan bercampur membentuk dua fase memiliki

sama volume. Setelah mencapai kesetimbangan, tabung kedua (tabung 1; r = 1) mengandung

dalam fase bawah dan

dalam fase atas. Dalam

transfer kedua, fase atas dipindahkan ke tabung 2. Tabung 1 kemudian berisi

ditransfer

dari tabung 0 dan sederajat Sisanya setelah transfer kedua, untuk memberikan total
distribusi zat terlarut selama empat ekstraksi dapat dilihat pada Tabel 4.1.

TABEL 4.1
Fraksi terlarut dalam yang Berhasil saat pada Tabung Distribusi Counter

Pemisahan Dua Zat terlarut

. Itu

Secara umum, dua atau lebih zat terlarut bertindak independen satu sama lain, sehingga setiap
akan bergerak sesuai dengan nilai dari
Tabel 4.2 (berasal dari Tabel 4.1 dengan menggantikan nilai-nilai yang tepat dari KD)
adalah representasi skematis dari ekstraksi selama empat transfer mengikuti prosedur distribusi
Counter ini untuk kasus pemisahan campuran dari dua larutan, A dan B, nilai-nilai koefisien
distribusi untuk A dan B masing-masing menjadi KD (A) = 0,5 dan KD (B) = 2,0, dan yang
mengingat bahwa masing-masing dua zat terlarut diambil di unit kuantitas dan volume dari dua
fasa cair bercampur adalah sama.
Table 4.2

Skema representasi dari ekstraksi dipengaruhi oleh empat transfer dilakukan dalam Prosedur
distribusi Counter digunakan untuk pemisahan konstituen dari campuran dari dua larutan, A dan

B [KD (A) = 0,5 dan KD (B) = 2,0, masing-masing zat terlarut telah diambil
di unit kuantitas dan dua fasa cair memiliki volume yang sama].
Ekspresi: Total fraksi zat terlarut dalam

tabung tertentu , Akan memberikan fraksi

itu zat terlarut di lapisan atas dari tabung

yang tertentu dengan menggantikan KD

nilai zat terlarut dalam ekspresi, substitusi

dari KD nilai dari zat terlarut dalam

ekspresi:

Total fraksi zat terlarut dalam tabung tertentu

Akan

memberikan

fraksi

itu

zat terlarut dalam lapisan bawah tabung itu. Dengan demikian, fraksi zat

terlarut B

di lapisan atas dan lapisan bawah tabung 3 setelah transfer ketiga (r = 3 dan

n = 3 pada Tabel 4.2) adalah:

Pemeriksaan tabung yang berbeda pada akhir dari masing-masing hasil transfer Analisis yang
diberikan Tabel 4.3 berkaitan dengan rasio:

(B yaitu jumlah total B di kedua fase dari setiap tabung tertentu)

(Sebuah jumlah total yaitu dari A di kedua fase itu tabung tertentu)

TABEL 4.3

Sedangkan pada awal percobaan ( keadaan urusan di nomor tabung 0 pada pemindahan angka 0
proporsi B ke A adalah 1:1, pada penyelesaian ekstraksi setelah 4 transfer , rasio B / A, 0.198 /
0,0123 (katakanlah 16:1) dalam tabung nomor 4 , dan 0,0123 / 0,198 atau 01:16 di dalam tabung
angka 0 . Setiap transfer berturut telah membawa pengayaan B relatif terhadap A dalam satu arah
dari seri dari lima tabung dan pengayaan A relatif terhadap B dalam arah yang berlawanan . Pada
kesimpulan ini didasarkan nama ' Distribution'for Counter- saat ini teknik pemisah tertentu . itu
jelas dari analisis di atas bahwa seperti skema multi - tahap ekstraksi dapat mampu pemisahan
baik dari campuran zat terlarut ke konstituennya masing-masing yang memiliki nilai sendiri
khususnya koefisien partisi untuk sepasang diberikan dari fasa cair . Tentu saja, salah satu cara
untuk meningkatkan pemisahan adalah untuk meningkatkan jumlah tahap di mana ekstraksi
selesai , tetapi kadang-kadang lebih efektif untuk mencoba untuk meningkatkan perbedaan
koefisien distribusi dengan, Misalnya , berbagai komposisi fase pelarut . Seperti disebutkan
sebelumnya , fase ini mungkin campuran pelarut , buffer , garam dan berbagai kompleks agen .

4.1.2 Teknik Eksperimental

Meskipun hasil yang sangat baik sering dapat diperoleh dengan ekstraksi pecahan dengan
peralatan sederhana seperti satu set memisahkan saluran, masih lebih efisien pemisahan dapat
dilakukan bila peralatan yang lebih rumit digunakan. Ada tersedia secara komersial peralatan
sepenuhnya otomatis, dinamai Craig, yang didesain sedemikian rupa sehingga beberapa
transfers'occur 'secara bersamaan dalam kereta menghubungi tabung. Ada instrumen Counter
mengandung dari tabung beberapa lusin up dengan 1000 atau lebih. Gambar 4.1 menggambarkan
tabung distribusi Counter Craig. Chamber C [Gambar 4.1 (a)] di setiap tabung tersebut diisi
dengan pelarut Z yang lebih berat daripada pelarut pengekstrak S. Volume pelarut Z cukup kecil
sehingga ketika

tabung dimiringkan 90 seperti pada Gambar 4.1 ( b ) , itu tidak akan mengalir melalui tabung T.
Diberikan sampel campuran yang akan dipisahkan menjadi konstituennya , A dan B , hadir
dalam larutan dalam jumlah pelarut Z terkandung dalam angka 0 tabung . Ekstrak pelarut S
diperkenalkan ke dalam tabung pertama ( yaitu angka 0 tabung ) melalui inlet I. Setelah gemetar
dengan bergoyang-goyang , dan setelah memungkinkan fase untuk memisahkan , tabung
dimiringkan 90 seperti pada Gambar 4.1 ( b ) . Pemantik pelarut S mengalir melalui tabung T ke
ruang D. Sekarang perakitan diputar kembali ke posisi semula , dan S pelarut mengalir keluar
melalui pintu keluar tabung E ke dalam tabung berikutnya , yaitu nomor 1 tabung ( tube melalui
I) , meninggalkan pelarut asli Z di ruang C nomor 0 tabung . Seluruh equilibrium dan siklus
transfer dilakukan oleh adjustable , mekanisme otomatis dalam waktu sekitar 1-2 menit . Pelarut
segar ditambahkan ke nomor 0 tabung dan proses ini diulang , kali ini zat terlarut didistribusikan
antara
dua fase dalam dua tabung; jumlah konstituen A dan B campuran awalnya diekstraksi ke dalam
pelarut S telah dialihkan ke tabung kedua ( yaitu nomor 1 tube ) yang mengandung pelarut Z (
ada sampel ) , di mana ini didistribusikan . Prosedur ini diulang beberapa kali , tergantung pada
jumlah tabung .
4.1.3 Aplikasi Distribusi Counter-current
Metode distribusi counter-current merupakan metode utama yang digunakan untuk
pemisahan campuran kompleks zat organik (seringkali alami). Pemisahan diperoleh dibawah
kondisi paling rendah; sehingga metode ini idealnya cocok untuk mengatur bahan yang
kestabilannya sensitif pada kondisi eksperimen yang bekerja selama pemisahan. Tidak ada bahan
yang terbuang, dan semua bahan yang diletakkan ke dalam mesin distribusi dapat diperoleh
kembali. Hal ini tidak berlaku bagi senyawa yang kelarutannya terbatas, dengan garam atau
senyawa polar kuat lainnya, atau dengan hidrokarbon jenuh.
Ciri special distribusi counter-current adalah bahwa metode ini dapat ditingkatkan untuk
membiarkan pemisahan sejumlah kecil komponen dari sejumlah besar bahan awal. Sebagai
contoh, teknik pemisahan pada protogen dari 4 ton daging sapi campuran dan hati babi
menggunakan 40 tabung apparatus berisi campuran tersebut sejumlah 1 liter per masing-masing
fasanya.
Teknik distribusi counter-current bernilai tertentu kapanun dibutuhkan untuk mengikuti
secara rinci kemajuan perpisahan. Sehingga, pada resolusi campuran kompleks, ekstraksi awal

mungkin akan dilakukan menggunakan beberapa tabung berukuran besar berhubungan. Setiap
fraksi yang diinginkan dari pemisahan awal selanjutnya dapat menjadi bahan fraksinasi
berikutnya, jika perlu menggunakan perangkat yang terdiri dari tabung dalam jumlah yang
banyak dan dengan transfer dalam jumlah besar. Sebuah contoh yang bagus dari pemisahan
tersebut adalah isolasi fragment peptide besar dari degradasi andrenocorticotropic hormone
(ACTH) menggunakan lebih dari 10.000 transfer pada perangkat 200 tabung.

4.2 Kromatografi
Kromatografi merupakan metode pemurnian yang paling penting saat ini. Meski teknik ini
menemukan penerapan terluas, kromatografi relative merupakan metode sederhana untuk
memisahkan senyawa yang diinginkan dari zat tidak murninya, atau memisahkan suatu senyawa
dari suatu campuran. Terlepas dari selektivitas tinggi dalam pemisahan yang ditunjukkan oleh
teknik, satu keuntungan lain dari kromatografi adalah penggunaannya melibatkan kondisi
eksperimen terendah seperti, sebagai contoh, teknik ini dapat dilakukan pada suhu ruangan.
Mikhail Tswett, ahli botani Rusia, menggunakan kata Kromatogrfi untuk menggambarkan
pemisahan pigmen tanamannya, yang dilakukan dengan melewatkan ekstrak pigmen melalui
kolom yang dikemas dengan kalsium karbonat. Hasilnya adalah serangkaian zona berwarna pada
kolom dan, dengan demikian, nama kromatografi dari Yunani chromatus dan graphein, berarti
warna dan menulis. Karena Tswett, berbagai teknik independen yang memiliki sedikit atau
tidak ada hubungannya dengan warna muncul untuk disebut kromatografi. Setidaknya satu,
kromatografi kertas, diakui seabad sebelum Tswett, sementara sebagian besar dievolusi dari
kerjanya.
Kromatografi sekarang mengacu pada salah satu dari berbagai kelompok teknik yang
menerapkan pemisahan melalui distribusi sampel antara dua fasa yang bercampur. Persyaratan
untuk membedakan kromatografi dari teknik pemisahan lainnya adalah bahwa satu fasa diam
sedangkan fasa kedua bergerak dan meresap melalui fasa pertama menghasilkan retensi selektif
komponen campuran dengan fasa diam. Fasa diam, yang mungkin padat atau cair atau mungkin
terdiri dari campuran padat dan cair, yang mudah dibagi dan tetap di tempat. Fasa yang bergerak,
yang mungkin cair atau gas, mengisi celah dari fasa diam dan mampu mengalir melalui fasa
diam.

4.2.1 Klasifikasi Sistem Kromatografi

Keadaan fisik dari fasa bergerak dan fasa diam menimbulkan empat dasar jenis kromatografi:
(i) Kromatografi cair-padat, LSC, (ii) Kromatografi cair-cair, LLC, (iii) Kromatografi gas-cair,
GLC, dan (iv) Kromatografi gas-padat, GSC.
Pemisahan komponen, atau zat terlarut, dari hasil sampel dari perbedaan tingkat penyerapan
mereka, larutan, atau reaksi dengan fasa bergerak dan fasa diam. Dalam sekejap pengamatan ini
membedakan berbagai teknik kromatografi hanya berdasarkan spesifikasi keadaan fisik fasa
diam dan fasa bergerak adalah tidak memadai, dan klasifikasi yang lebih memadai dari teknik ini
harus memperhitungkan (i) sifat pemisahan misalnya penyerapan, dan (ii) konfigurasi system
misalnya kolumnar. Tabel 4.4 memberikan sebuah system klasifikasi yang menggabungkan
pertimbangan ini.
TABEL 4.4
System Kromatografi
System

Fasa Bergerak

Fasa Diam

Konfigurasi

Pemisahan

Kromatografi cair padat

Cair

Padat

Kolom

Adsopsi

Kromatografi cair cair

Cair

Cair

Kolom

Partisi

Padat

Kolom

Reaksi

Kromatografi

pertukaran Cair

ion
Kromatografi gel

pertukaran ion
Cair

Cair

Kolom

Pengayakan
bergantung
pada

ukuran

molekul
Kromatografi pengompleks

Cair

Padat

Kolom

Pembentukan
kompleks yang
cepat

dan

reversible
Kromatografi pasangan ion

Cair

Padat

Kolom

Reaksi
pertukaran ion

Kromatografi ion

Cair

Padat

Kolom

Reaksi
pertukaran ion

Kromatografi kertas

Cair

Padat

Lembar

atau Partisi

atau

Kromatografi lapis tipis

Cair

Padat

strip

adsorpsi

Film tipis

Adsorpsi

atau

partisi
Kromatografi gas:
(i)

Gas

Padat

Kolom

Adsorpsi

Gas

Cair

Kolom

Partisi

Cair

Kolom

partisi

Kromatografi
gas-padat

(ii)

Kromatografi
gas-cair

Kromatografi kapiler cairan Cairan

supercritical

supercritical

Setiap teknik tertentu dirancang sebagai persiapan ketika diterapkan pada pemurnian material
dalam jumlah yang relative besar.

Tujuan eksperimen tersebut adalah untuk memperoleh

konstituen dalam keadaan murni untuk karakteristik lebih lanjut dan penelitian atau untuk
beberapa aplikasi praktis. Teknik yang sama dirancang sebagai suatu analisis jika digunakan
untuk penentuan komposisi sampel; namun, hal itu dapat digunakan untuk mengevaluasi
karakteristik fisik atau kimia sebuah konstituen yang diisolasi dengan penerapan teknik untuk
mendapatkan sampel.

4.2.2 Memilih Teknik Kromatografi yang Sesuai

Untuk setiap pemisahan kromatografi, factor tertentu yang mengatur harus dijadikan
pertimbangan saat membuat pilihan metode tertentu dari metode-metodr yang terdapat pada tabel
4.4. Anggap system ini cukup mudah menguap, kromatografi kolom gas-cair biasanya akan
menjadi metode yang paling cocok. Penggunaan kolom panas dan ruang penguapan
memungkinkan pemisahan oleh kromatografi gas-cair dari senyawa yang mendidih pada suhu
400oC. Kromatografi gas memiliki keuntungan besar yaitu tidak masalah menghilangkan
komponen terpisah dari kolom atau pelarut yang ada. Zat yang non-volatile, merupakan suatu
mayoritas dan perpisahan mereka kebanyakan dapat berhasil dengan adsorpsi cair-padat atau
partisi cair-cair kromatografi kolom. Metode pemisahan yang paling cocok, yang tidak
bergantung pada volatilitas, diberikan oleh kromatografi cair dengan kertas (selulosa) kepingan
atau lapisan selulosa pada permukaan pesawat (kromatografi lapis-tipis). Batasan disini adalah

bahwa, karena pemisahan bergantung pada distribusi antara pelarut organic dan air yang
teradsorpsi pada selulosa, dibutuhkan kelarutan air yang cukup. Walaupun metode ini sangat
cocok untuk pemisahan banyak produk alami, yang biasanya terjadi pada media encer, banyak
jenis senyawa organic yang dikesampingkan. Senyawa yang larut dalam air yang merupakan
ionic kuat paling baik dikromatografi dengan system pertukaran ion, menggunakan resin anionic
maupun resin kationik. Kromatografi pasangan ion dapat menyebabkan pemisahan serempak
molekul terionisasi dan molekul yang mampu diionisasi yang terdapat bersama pada campuran.
Kromatografi ion memperlihatkan berbagai macam aplikasi untuk pemisahan ion organic dan
anorganik. Kromatografi pembentukan kompleks dapat digunakan untuk pemisahan konstituen
dari campuran dasar, configurasional dan isomer isotope yang pemisahannya sulit. Senyawa
yang dibedakan berdasarkan ukuran molekul paling baik dipisahkan dengan kromatografi gel.
Pemisahan senyawa yang memiliki volatilitas dan stabilitas termal yang terbatas secara cepat dan
efisisen dapat dilakukan menggunakan kolom kapiler berhubungan dengan cairan superkritikal.
Perhitungan rinci dari berbagai macam system kromatografi

dihitung pada Tabel 4.4,

bersama dengan penerapan dari system tersebut, diikuti dengan Bab 514.
Selain teknik kromatografi yang terdapat pada Tabel 4.4, terdapat beberapa metode
kromatografi yang biasanya menarik bagi biokimiawan dan Bab 15 menguraikan contoh-contoh
dari teknik pemisahan tersebut. Metode-metode yang diuraikan pada Bab 15 diantaranya:
affinitas

kromatografi,

kromatografi

dye-ligand,

kromatografi

kovalen,

kromatografi

hydroxylapatite dan kromatogafi interaksi hidrofobik. Tentu saja, beberapa dari metode ini yang
terdapat pada Tabel 4.4 juga mampu mempengaruhi pemisahan biomolekul, dan pemisahan
sejenisnya mengetahui posisinya pada tempat yang tepat dalam buku ini.

5
Kromatografi Kolom Adsorpsi
[Kromatografi Cair-Padat (LSC)]

Kromatografi adsorpsi, metode kromatografi yang paling tua, berasal dari investigasi Tswett
(lihat halaman 67), yang pertama kali mendeskripsikannya pada tahun 1906. Tidak lama
berselang setelahnya Kuhn Winterstein dan Lederer menemukan kembali metode pemisahan
campuran kompleks alami pada awal tiga puluhan pada abad dua puluhan. Di dalam system
kromatografi dimana fasa diamnya adalah zat padat seperti halnya pada kromatografi cair-padat
yang dilakukan pada tabung (kolom) vertical, pemisahan yang dihasilkan dibawa melalui proses
adsorpsi dan desorpsi.

5.1 Cara Kerja dari Teknik

5.1.1 Teori yang Mendasari Kromatografi Kolom Adsorpsi
Bahan padat atau adsorben memiliki are permukaan yang sangat luas dan memiliki
kemampuan untuk menyerap zat kimia pada permukaannya melalui semacam interaksi fisika dan
kimia seperti (i) Gaya Van der Waals, (ii) Gaya Induktif, (iii) Ikatan Hidrogen, (iv) Transfer
muatan, dan (v) Ikatan Kovalen.
(i) Gaya Van der Waals menahan molekul netral bersama pada keadaan cair atau padat.
Adsorpsi didasarkan pada fisik murninya pada karakter alami dengan energy adsorpsi
rendah dan keseimbangan cepat yang diatur, dan hasilnya memberikan pemisahan yang
baik. Adsorpsi larutan non-polar pada adsorben non-polar terjadi berkat adanya gaya Van
der Waals, sebagai contoh, pada kasus hidrokarbon di dalam grafit.
(ii) Gaya induktif atau atraksi dipol-dipol muncul ketika ikatan kimia memiliki medan listrik
permanen dengan itu (misalnya, CNO2, CCl, dll). Electron dari atom yang
berdekatan atau kelompok atau molekul yang terpolarisasi di bawah pengaruh medan ini.
Hal ini menimbulkan suatu atraksi tarik-menarik dipol-dipol antara adsorben dan larutan.
kebanyakan adsopsi pada alumina menggambarkan cara kerja dari gaya induktif ini.

(iii)Ikatan hydrogen menjadi penting ketika zat terlarut memiliki kelompok donor-proton
yang dapat menjalin ikatan hydrogen dengan kelompok polar yang ada pada permukaan
adsorben (misalnya, gugus hidroksil permukaan yang dimiliki oleh silica atau alumina).
Gugus hidroksil permukaan ini akan dengan sendirinya bertindak sebagai kelompok
donor proton, sehingga menimbulkan ikatan hydrogen jika terjadi kontak setelahnya,
sebagai contoh, eter, nitril atau hidrokarbon aromatik.
(iv) Kontribusi dari transfer muatan untuk energi adsorpsi akan menjadi sangat kecil pada
kasus kebanyakan senyawa. Sebuah kompleks teradsorpsi dari suatu jenis, (zat terlarut)+
(Adsorben)- dihasilkan oleh transfer sebuah electron dari zat terlarut ke permukaan.
(v) Ikatan kovalen (chemisorption) dihasilkan dari operasi gaya kimia yang relative kuat
antara zat terlarut dan adsorben. Komponen campuran yang diperoleh dengan pemisahan
kromatografi mungkin tidak memiliki suatu tingkat kemurnian yang tinggi dalam kasus
dimana gaya kimia yang kuat sedang berlangsung.
Jika sejumlah kecil larutan terkonsentrasi dari campuran dua zat, A dan B, dipakaikan di bagian
atas kolom, keduanya teradsorpsi ke dalam packing material. Jika suatu pelarut pada A dan B
terlarut untuk beberapa derajat sekarang lewat melalui kolom zat tersebut dapat dihilangkan, atau
diserap kembali, dari adsorben. Namun, tingkat dimana A dan B diserap kembali biasanya tidak
sama karena salah satu zat kemungkinan terserap lebih kuat daripada yang lain. Pelarut yang
mengalir yang memperebutkan zat terlarut dengan adsorben, akan lebih mudah menghilangkan
zat yang kurang kut yang ada (misalkan, senyawa A) dan membawanya menuruni kolom,
dimana ia di adsorbsi lagi. Senyawa B diserap kembali lebih lambat, sehingga jauh di belakang
A. Seperti aliran pelarut yang terus menuruni kolom, proses ini diulang berkali-kali.
Pengulangan ini memperbesar perbedaan jarak yang ditempuh melewati kolom oleh kedua zat
terlarut sehingga komponen A dan B menjadi terpisah satu sama lain. Proses pergerakan
campuran larutan melewati system kromatografi disebut development. [lihat Gambar 5.1(b)].
Analisis terdekat dari paragraf sebelumnya akan mengungkapkan bahwa kromatografi kolom
adsorpsi memiliki hubungan yang sama dengan metode pemisahan sederhana dengan adsorpsi
sebagai distilasi dengan sebuah kolom fraksinasi yang mengalami distilasi sederhana. Analogi
dengan kolom fraksinasi memang dekat. Sama seperti distilasi dengan kolom fraksinasi setara
dengan ribuan distilasi terpisah, kromatografi dengan pergerakan fasa geraknya yang teratur
relative dengan adsorben setara dengan pengadukan berulang dengan adsorben dan penyaring.

5.1.2 Kriteria yang harus dipenuhi oleh Adsorben

Adsorben harus memenuhi beberapa persyaratan umum: (i) dipilih dengan tetap melihat
relevansi dengan sifat zat yang dipisahkan sehingga keberhasilan dalam pemisahan dapat dicapai
(pengetahuan tentang sifat adsorben dan kekuatan yang digunakan untuk adsorpsi akan menjadi
pra-syarat untuk memperoleh kondisi terbaik untuk mrncapai pemisahan yang memuaskan); (ii)
tidak boleh larut atau bereaksi dengan pelarut; (iii) harus inert secara kimia terhadap komponen
campuran; (iv) harus memiliki kapasitas adsorpsi tinggi; (v) harus menunjukkan kemampuak
produksi kembali yang sangat baik dan reversibilitas pada karakteristik adsorpsi.
Beberapa bahan untuk menurunkan polaritas dan kekuatan adsorpsi, diantaranya: Alumina >
magnesium oksida > arang > silica gel > kalsium oksida > magnesium karbonat > kalsium
karbonat > kalium karbonat > natrium karbonat > sukrosa > pati > selulosa. Peningkatan
polaritas dari fasa diam meningkatkan waktu retensi yaitu waktu dimana komponenn campuran
ditahan pada kolom sementara dikucurkan mmenuruni kolom.
Diantara daftar adsorben diatas, alumina dan silica gel sangat sering digunakan.
Berdasarkan kapasitas dan aktifitasnya, adsorben diklasifikasikan menjadi lemah (misalnya
sukrosa, pati), menengah (misalnya kalsium karbonat, magnesium oksida) dan kuat ( misalnya
alumina aktif, karbon aktif, magnesium aktif). Perubahan aktifitas adsorpsi adsorben dapat
melalui salah satu cara berikut:
(i)

Penghilangan atau penambahan zat seperti air, yang menahan sisi aktif. Aplikasi dari
prosedur ini dapat diilustrasikan untuk kasus persiapan sebuat alumina pada aktifitas
yang diinginkan. Aktifitas adsorptive alumina bergantung kepada jumlah air yang ada
di dalamnya dan pada kenyataannya skala aktifitas Brockman didasarkan pad jumlah
air yang dikandung alumina:
I, 0% H2O; II, 3% H2O; III, 6% H2O; IV, 10% H2O dan V, 15% H2O. alumina pada
aktifitas yang diinginkan dapat dipersiapkan dengan dehidrasi adsorben pada 360oC
selama 5 jam dan membiarkan bahan yang terdehidrasi menyerap jumlah air yang
sesuai.

(ii)

Meningkatkan sifat permukaan dengan perubahan pada kelompok fungsional atau

ukuran pori-pori. Adsorben standar didasari oleh partikel pada aktifitas pasti dan
ukuran mesh yang tersedia secara komersial.

Ukuran Mesh adalah istilah konvensional yang digunakan untuk menentukan ukuran partikel
sebuah adsorben, alternative untuk penggunaan istilah ini, tentu saja,

Tabel 5.1
Ukuran Adsorben Mesh dan Tipe Penerapannya
Ukuran Mesh

Penerapan

2050

Pekerjaan preparative mentah, laju aliran sangat tinggi

50100

Aplikasi preparative, laju aliran tinggi

100200

Pemisahan analitik, laju aliran sedang

200400

Pemisahan yang sangat efisien, laju aliran lambat

definisi biasa ukuran partikel dalam hal [micron(10-6 m). Penggunaan simbol ini mengacu
kepada saringan standar dimana partikel dapat lewat. Saringan 100 mesh memiliki 100 lubang
kecil per inchi kuadrat. Bahan adsorbs dengan ukuran mesh tinggi (400 dan lebih) sangat baik
dan menciptakan pemisahan kromatografi dengan efisiensi tinggi. Tabel 5.1 mengurutkan ukuran
mesh standar sesuai dengan aplikasi yang paling tepat.

5.1.3 Kriteria yang harus dipenuhi oleh Pelarut

Peran pelarut dalam memaksimalkan kerja (yaitu mencapai resolusi memadai dalam waktu
yang wajar) adalah signifikan dan, dalam praktiknya, diketahui bahwa lebih mudah mengubah
pelarut untuk memepengaruhi pemisahan daripada menggunakan adsorben berbeda. Diantara
persyaratan yang harus dipenuhi oleh pelarut terpilih yang paling jelas adalah bahwa sampel
harus larut dalam pelarut dan pelarut tidak boleh mengganggu perolehan kembali fraksi yang
dipisahkan. Juga, pelarut terpilih adalah yang tidak bereaksi irreversibel dengan fasa diam
(misalkan asam tidak dapat digunakan bersama dengan alumina basa). Mengingat sejumlah besar
volume pelarut yang digunakan, bahkan jejak kotoran yang ada di dalamnya secara bertahap
dapat mengubah fasa diam pada kromatografi cair. Akibatnya, persyaratan kemurnian yang harus
dipenuhi ditetapkan untuk pelarut yang bekerja pada teknik kromatografi cair (LC).
Fasa gerak bertanding dengan komponen sampel untuk tempat adsorpsi pada fasa diam dan
dengan demikian mengurangi jumlah adsorpsi yang tersedia untuk zat terlarut (yaitu komponen
sampel). Akibatnya, pengggunaan fasa gerak yang semakin polar mengurangi waktu retensi zat

terlarut. Beberapa zat terlarut yang digunakan pada kromatografi padat-cair untuk meningkatkan
kepolaran diantaranya: fluoroalkana, petroleum eter, karbon tetraklorida, sikloheksana, toluene,
benzene, ester, kloroform, etil eter, dikloroetana, metil etil keton, asetonitril, alcohol, air, piridin,
asam-asam organik.
Dalam praktiknya, pemilihan pelarut dengan kekuatan yang tepat dapat dibuat dengan
percobaan sederhana dan metode uji atau dengan menggunakan kromatografi lapis tipis. Untuk
senyawa yang sangat mudah teradsorbsi, biasanya lebih baik menggunakan pelarut polar seperti
alcohol, piridin, atau ester, sedangkan zat terlarut yang tidah mudah teradsorbsi pelarut biassanya
petroleum eter, karbon tetraklorida atau sikloheksana. Campuran dua atau tiga pelarut dpolaritas
berbeda sering menjadikan pemisahan yang lebih baik daripada pelarut yang tidak tercampur.

5.1.4 Urutan Elusi dari Beberapa Jenis Senyawa Berbeda

Pemisahan yang berhasil bergantung pada pemilihan fasa diam dan juga pelarut (fasa gerak)
yang tepat. Hal ini merupakan bagian dari uji coba, tapi terdapat beberapa pedoman. Beberapa
jenis senyawa dapat diserap lebih mudah daripada yang lainnya. Secara kasar asam dan basa kuat
adalah yang paling mudah diadsobsi, siikuti dengan alcohol dan amina, kemudian oleh aldehid,
keton ester dan halide. Tingkat terbawah adalah hidrokarbon tak jenuh jenuh dan hidrokarbon
aromatic, dan terakhir hidrokarbon jenuh. Dengan demikian senyawa berikut, masing-masing
mengandung 3 atom karbon, teratur dalam urutan dimana mereka akan dielusi dari kolom:
CH3CH2CH3;

CH3CH

CH2;

CH3CH2CH2Cl;

CH3COOCH3;

CH3CH(NH2)CH3;

CH3CH2CH2OH; CH3CH2COOH.

5.1.5 Prosedur Pemisahan oleh LSC dan Deteksi dan Kuantifikasi Konstituen Terpisah
Kolom yang dikemas untuk LSC biasanya terdiri dari kemasan tabung kaca dengan adsorben
yang membagi padatan secara halus. Packed kolom biasanya disiapkan dengan menuangkan
bubur fasa diam pada fasa gerak kedalam tabung kaca tertutup di bagian bawah dengan bantalan
kapas atau plat berlubang dengan lubang yang terlalu kecil untuk membiarkan bagian dari
partikel padat digunakan. Kolom tersebut kemudian dibiarkan untuk memebentuk dengan
menggunakan salah satu atau lebih metode berikut:
1. Filtrasi gravitasi sederhana.

2. Penerapan tekanan udara ke bagian atas kolom untuk memepercepat filtrasi dan
mendorong pengepakan fasa diam.
3. Penggunaan ramrod (yang sering berisi gabus diujung glassrod) dengan diameter yang
sedikit lebih kecil daripada tabung kaca, untuk membantu bahkan mengemas fasa diam.
Ketika pengemasan basah seperti yang dinyatakan diatas dilakukan, diperhatikan untuk
menghindari gelembung di dalam kolom dan untuk menghasilkan kolom sehomogen mungkin.
Setelah packing, fasa gerak dibiarkan mengalir keluar kolom hanya sampai level teratasnya
yaitu level packing, untuk menghindari gelembung udara pada packing.
Sampel, yang terlarut pada fasa gerak kemudian ditambahkan ke atas kolom dengan volume
seminimum mungkin. Sangat penting untuk menghindari gangguan kolom packing dengan
penambahan sampel. Penambahan harus dilakukan dengan suatu cara sehingga sampel
membentuk lapisan tipis di bagian atas kolom dan menembus packing dalam kedalaman yang
sama di setiap titik. Sampel biasanya dibilas ke dalam kolom dengan satu atau dua aliquot kecil
fasa gerak, setiap kali memungkinkan hanya cukup mengeluarkan limbah dari kolom untuk
menurunkan level fasa gerak dibawah permukaan packing. Sejumlah besar volume fasa gerak
sekarang ditambahkan ke bagian kolom kromatografi diatas packing.
Eksperimen dasar dari kromatografi kolom adsorpsi atau kromatografi padat-cair (LSC)
digambarkan pada Gambar 5.1(a). Pemisahan progresif komponen dengan pelarut yang
mengalir (eluen) digambarkan pada Gambar 5.1(b). Seperti yang terlihat pada gambar,
perlengkapan sederhana yang digunakan; modifikasi sederhana

Gambar 5.1 Kromatografi kolom adsorpsi

Dapat dilakukan, sebagai contoh, seseorang ingin mempercepat proses dengan pengisapan atau
bekerja dengan suasana inert. Kolom dengan diameter beberapa millimeter hingga beberapa
centimeter dapat digunakan, berdasarkan skala eksperimen. Pada umumnya kolom yang oanjang
dan tipis memberikan pemisahan yang paling baik dalam kasus yang sulit, tapi jumlah besar zat
yang mudah dipisahkan dapat dilakukan dengan cepat dengan kolom yang lebar.
Akan lebih sederhana untuk memisahkan zat berwarna, karena dalam pemisahannya dapat
dilihat dan dihentikan pada titik yang tepat [Gambar 5.1(b)]. Isi tersebut kemudian didorong
keluar dan dipotong menjadi zona warna yang bermacam-macam, dari komponen yang mungkin
terlarut dan diperoleh kembali.
Untuk bahan tidak berwarna, zat yang terpisah terkadang terlihat pada kolom dengan
fluoresensi, yang dikeluarkan oleh lampu ultra violet. Namun, bahan tidak berwarna biasanya
paling baik melewati sampel menuruni kolom hingga semua sampel terbilas melewati kolom
oleh fasa gerak. Fasa gerak yang tertinggal pada kolom dan sekarang berisi molekul terlarut
disebut effluent atau eluat dan dikumpulkan sebagai sejumlah fraksi atau potongan pada waktu
yang berbeda. Pengumpulan fraksi cair (terutama jika jumlah fraksi besar) membosankan dan
memeakan waktu sehingga, pada praktiknya, beberapa bentuk alat mekanik digunakan.

Pengumpulan fraksi otomatis terdiri dari turntable dimana serangkaian tabung pengumpulan
ditempatkan. Turntable dioperasikan oleh alat elektronik, dan penerima berubah secara otomatis
setelah waktu yang ditentukan atau setelah beberapa volume eluat diberikan; pada waktu yang
sama provisi dibuat untuk mengisi eluen (pelarut) dari reservoir secara terus-menerus. Jika
proses kromatografi sudah efektif, fraksi berbeda yang terkumpul masing-masing berisi satu
komponen berbeda dari sampel original.
Prosedur penghilangan komponen campuran berurutan dari kolom denga menyapunya
melewati fasa gerak, seperti yang digambarkan sebelumnya, yang diketahui sebagai elusi.
Dalam kasus yang paling sederhana kekuatan eluen dipertahankan konstan selama elusi.
Elusi ini menggunakan semua eluen yang sama (yaitu pelarut atau campuran pelarut dari
komposisi tetap) disebut elusi isokratik.
Gradien elusi adalah prosedur dimana komposisi fasa gerak secara progresif divariasikan
melalui proses elusi. Sebagai contoh, jika pearut yang digunakan adalah campuran etil alcohol
dan air, komposisinya bervariasi terus menerus mulai dari air murni hingga alcohol murni.
Dalam prosedur yang serupa elusi bertahap kondisi disaat elusi yang berlangsung berubah
secara berkala bukan secara progresif.
Disamping itu analisis elusi terdapat dua prosedur pemisahan lain dan penghilangan
komponen bermacam-macam dari campuran pada kolom; mereka adalah analisis frontal dan
analisis perpindahan.
Pada analisis frontal larutan sampel ditambahkan terus-menerus ke dalam fasa diam di
bagian atas kolom. Selama penambahan tersebut sebuah tahap dicapai saat komponen sampel
yang diberikan mulai muncul dari kolom, awal yang dibuat oleh komponen yang memiliki rasio
distribusi terkecil antara fasa diam dan fasa gerak. Komponen lain mengikuti dan keluar dari
kolom agar dapat meningkatkan rasio distribusi tapi tidak terpisah sebaik pada metode elusi.
Pada analisis perpindahan larutan sampel ditambahkan dalam satu lot ke kemasan kolom
dengan fasa diam dan diikuti dengan penambahan berlanjut larutan suatu zat yang lebih kuat
tertarik ke fasa diam daripada komponen sampel lain. Penembahan terus larutan ini
menggerakkan komponen sampel menuruni kolom dan komponen ini meninggalkan kolom
sesuai urutan rasio distribusinya, tapi jauh lebih sedikit tumpang tindih daripada di analisis
frontal.

Analisis frontal dan analisis perpindahan merupakan kepentingan sekunder jika dibandingkan
denga analisis elusi dan kedua metode ini tidak lebih bermanfaat daripada elusi, kecuali
pemisahan skala ppreparatif diaman jumlah yang harus ditangani besar.
Bagian analitik dari eksperimen kromatografi dapat dilakukan pada fraksi eluat tunggal yang
telah dikumpulkan dalam interval waktu proses pemisahan yang bermacam; proses ini, walaupun
lama dalam praktiknya biasanya akurat.
Atau, seperti pada praktik biasanya, analisis limbah kolom dengan menganggap identifikasi
dan estimasi kuantitatif dari komponen sampel yang berbeda keluar dari kolom pada berbagai
interval dapat dilakukan selama percobaan dengan menggunakan instrumentasi yang tepat, di
samping membuat koleksi dari fraksi eluat. Perubahan diindikasikan oleh detector yang bekerja
pada system instrumentasi yang digunakan direkam pada grafik perekam oleh pena yang
berpasangan dengan detector. Plot rekaman dari respon detector sebagai fungsi waktu atau
volume fasa gerak disebut kromatogram. Detector yang digunakan pada kromatografi cair akan
dibahas mendalam pada Bab 6.

5.2 Penerapan Kromatografi Kolom Adsorpsi

Meskipun perkembangan dibidang kromatografi sejak pekerjaan Tswett dengan kolom
sederhana membawa revolusi pada teknik eksperimen, kromatografi kolom adsorpsi
konvensional masih menyimpan kepentingannya dalam pengaturan gravitasionalnya, karena
teknik kerja yang sederhana dan kapasitasnya yag besar.
Karena kekuatan adsorpsi adalah karakteristik umum kelompok fungsional pada senyawa
organic, LSC sangat berguna dalam memisahkan senyawa yang beragam. Kromatografi adsorpsi
telah banayk digunakan dalam pemisahan fenol dan amina. Untuk amina, alumina biasanya
digunkan karena amina adalah basa dan menjadi sangat kuat terserap pada silica yang merupakan
asam. Dengan kata lain, senyawa asam seperti fenol lebih baik dikromatografi pada siliki
daripada di alumina.
Dari sekian banyak aplikasi kromatografi kolom adsorpsi, contoh yang menarik adalah
pemisahan campuran dua enantiomer menjadi konstituennya yang pemisahannya tidak dapat
dilakukan dengan metode fisika biasa lainnya seperti kristalisasi fraksional atau distilasi
fraksional. Sebuah ilustrasi yang terkenal dari pemisahan enantiomer tanpa harus diubah menjadi

diastereoisomer dengan reaksi kimia dengan asam optic aktif adalah resolusi basa Troger,
dipengaruhi oleh V. Prelog dan P. Wieland pada tahun 1944,

Menggunakan kromatografi kolom adsorpsi. Metode ini didasarkan pada adsorsi selektif oleh
bahan asimetris alami.
Resolusi percobaan basa Troger oleh Prelog dan Wieland dengan asam optic aktif hanya
sebagian berhasil, untuk diamin yang merupakan basa lemah dan itu juga cepat beralih ke dalam
campuran dl-racemic pada larutan asam. Ketika basa diserap pada daerah khusus hidrat d-laktosa
dan kolom terelusi dengan petroleum eter, fraksi awal adalah dekstrorotatori, fraksi menengah
non-aktif secara optikal, dan fraksi akhir levorotatory.
Dalam prosedur yang dimodifikasi, adsorban yang non-aktif secara optic (seperti alumina)
sudah dilapisi dengan lapisan tipis zat yang aktif secara optic. Resolusi asam dl-mandelic adalah
sebuah contoh pemisahan yang termasuk ke dalam kategori ini.
Dalam prosedur lain campuran rasemat diubah menjadi campuran diastereoisomers (oleh
reaksi dengan senyawa yang aktif secara optikal) yang kemudian dikromatografi pada kolom
adsorben non-aktif secara optikal untuk memisahkan diastereoisomer.
Dua senyawa yang berhubungan dekat seperti isomer cis dan trans azobenzena telah
dipisahkan dengan memanfaatkan perbedaan kepolaran kedua isomer. Sudah dikatakan
sebelumnya bahwa seiring meningkatnya kepolaran suatu komponen sampel, waktu retensinya
pada kolom LSC juga meningkat. Dengan demikian, cis-azobenzena (I), salah satu yang lebih
polar dari dua azobenzena, dipertahankan di kolom kromatografi lebih lama daripada transisomer (II) dimana pemisahan dua isomer geometrical dihasilkan.

Senyawa dengan berat molekul lebih besar lebih lama berada di kolom daripada yang
memiliki berat molekul yang lebih kecil jika sebuah rangkaian dianggap dimana senyawa
memiliki polaritas yang mendekati identic misalnya jika senyawa memiliki kelompok fungsional
yang sama terikat dengan cara yang sama. Observasi ini sesuai dengan aturan Traub yang
menyatakan bahwa adsorpsi pada kolom LSC meningkat dengan meningkatnya berat molekul
untuk rangkaian senyawa yang homogen. Ini dicontohkan oleh pemisahan yang sangat penting
campuran hidrokarbon dalam petroleum seperti yang diberikan dibawah ini.
Dalam pemisahan khas fraksi minyak bumi terdiri dari hidrokarbon C18C25, kolom silica
gel awal digunakan untuk memisahkan aromatic dari paraffin dan sikloparafin. Aromatic
kemudian dikromatografi pada kolom alumina untuk memisahkan mereka ke dalam kelompok
yang terdiri dari satu, dua, dan tiga cincin. Dibawah kondisi yang sesuai, silica gel dapat
memisahkan (i) olefin, paraffin, sikloparafin, dan aromatic, (ii) mono-olefin dari di-olefin, (iii)
mono-olefin dari aromatic, dan (iv) beberapa mono-olefin asiklik dari mono-olefin siklik.
Pemisahan campuran hidrokarbon jenuh telah dilakukan pada silica gel atau arang. Alcohol,
fenol, aldehid dan keton, asam, ester dan lakton, amina, senyawa nitro, senyawa azo, halogen
dan senyawa sulfur, gula dan glikosida, alkaloid, pewarna alami, vitamin, harmones, antibiotic,
dll telah dipisahkan dibawah kondisi yang sesuai.
Penurunan adsorpsi dari kelompok sampel, X, yang dekat dengan kelompok yang cukup
besar, Y (mungkin karena interferensi Y dengan pendekatan oleh X kepada adsorben), telah
dimanfaatkan dalam beberapa pemisahan. Sebagai contoh, bentuk orto alkil fenol lebih lemah
diserap pada silica daripada para isomer dan perbedaan pada peningkatan energy adsorpsi

dengan ukuran efektif kelompok alkil. Sebuah efek pertahanan kebalikan sterik yang menarik
telah dilaporkan pada adsorpsi bentuk firol pada alumina. Kelompok besar yang dekat dengan
nitrogen meningkatkan adsorpsi. Hal ini disebabkan oleh fakta keasaman senyawa ini meningkat
ketika ikatan NH tegang.
Ortho di-substituted benzenes, mampu mengikat H (misalkan di-amino atau di-hidroksi
benzene) umumnya lebih lemah diserap pada silica daripada isomernya yang tidak berikatan
dengan H.
Dekomposisi dari beberapa senyawa hidrokarbon aromatik tambahan (dibentuk dengan asam
pikrat, asam stifnik atau trinitrobenzena) pada sebuah kolom adsorben telah dimafaatkan untuk
pembuatan hidrokarbon murni untuk analisis spectral. Misalnya, senyawa adisi trinitrobenzene
chamazulene terurai pada kolom alumina. hidrokarbon murni yang dilepaskan dielusi dengan
petroleum eter, meninggalkan trinitrobenzena (yang memiliki afinitas tinggi untuk alumina) pada
bagian atas kolom. Ini dapat dielusi lagi dengan pelarut yanglebih polar.
Contoh praktis juga telah dilaporkan dalam penggunaan adsorben spesifik (misalnya
persiapan silica gel dengan afinitas spesifik untuk metil oren). Pendekatan tertentu melibatkan
persiapan adsorben untuk zat spesifik yang berhubungan. Kromatografi suatu campuran dari zat
berhubungan telah menunjukkan bahwa terdapat spesifikasi tertentu untuk zat yang ada dengan
adsorben yang disiapkan.
Kegunana juga telah dibuat adsorben polar (seperti silica gel) yang dimodifikasi dengan
penggabungan agen pengompleks ke dalam adsorben. Sebagai contoh, pemisahan hidrokarbon
olefin dari hidrokarbon jenuh meningkat ketika silica gel penuh dan AgNO3 digunakan.
Adsorpsi terbatas, atau keberadaan adsorpsi diskrit yang cocok untuk molekul yang diserap,
juga memiliki peran penting dalam selektifitas, sebagian pada pemisahan isomer. Selektifitas
tingkat tinggi ini dicontohkan oleh pemisahan isomer posisional seperti meta dan para
dibromobenzena, pada silica gel yang memiliki bagian adsorsi SiOH polar. Karena perbedaan
geometri molecular, isomer para mampu berinteraksi dengan dua permukaan kelompok OH,
sedangkan isomer meta hanya dapat berinterkasi dengan satu dan ikatan yang kurang kuat.
Beberapa kasus penerapan kromatografi adsorpsi cair-padat pada anorganik juga telah
dilaporkan. Pemisahan dalam waktu lam pada Kimia Anorganik dari ion Li+, Na+, K+, dan Mg2+
ketika bersama-sama terdapat pada larutan dapat dilakukan dengan cara kromatografi kolom
adsorpsi biasa menggunakan silica gel G yang dimurnikan sebagai adsorben dan mempekerjakan

pelarut yang tercampur, etanol-asam asetat, untuk mengelusi kolom. sama halnya, pemisahan
campuran (misalkan SbCl3, AsCl3 dan Bi(NO3)3], yang terdiri dari kation dan anion yang
beragam, dapat dilakukan dengan kromatografi kolom cair-padat menggunkan alumina dengan
adanya asam tartarat. Hal ini, bagaimanapun, ditekankan bahwa pemisahan ini tidak diatur oleh
efek adsorpsi saja. Efek seperti presipitasi fraksional, hidrolisis atau pembentukan kompleks juga
mungkin.
Penggunaan adsorben organic seperti 8-hidroksi quinolone juga disarankan untuk pemisahan
senyawa anorganik.

6
Kromatografi Kolom Partisi
[Kromatografi Cair-Cair (LLC)]

Beberapa campuran tidak merespon dengan baik terhadap teknik kromatografi adsorpsi dan
proses partisi mungkin lebih cocok untuk pemisahan mereka. Teknik kromatografi partisi
merupakan hasil penemuan sejarah yang dibuat oleh Martin dan Synge pada 1941. Fasa diam
pada kolom cair-cair atau kromatografi kolom partisi adalah sebuah film tipis cairan yang
diserap pada permukaan sebuah bahan padat inert seperti kieselguhr, tanah diatom, bubuk
selulosa atau silica gel, bahan padat yang mengisi kolom packing. Padatan hanya menopang
cairan; tidak berpartisipasi langsung dalam kromatografi. Cairan kedua merupakan fasa gerak.

6.1 Cara Kerja Teknik Kromatografi Kolom Partisi

Bayangkan pemisahan campuran dua konstituen, A dan B. pemisahan bergantung pada
jumlah mini-ekstraksi berturut dalam jumlah besar berdasarkan perbedaan distribusi komponen
A dan B pada dua cairan. Sebagaimana fasa gerak melewati kolom, zat A diekstraksi dan
bergerak kebawah dengan lebih cepat daripada B yang terikat kepada tingkat yang lebih besar
pada fasa diam.
Secara umum, mekanisme pelaksanaan kromatografi partisi pada kolom sama saja dengan
pada adsorpsi, kecuali untuk persiapan bahan untuk packing kolom. Padatan yang terbagi
dengan baik berperan, sebagai contoh, silica gel, yang dicampur dengan cairan (air atau cairan
lain yang sesuai) pada perbandingan berat yang pasti; perbandingan yang digunakan bergantung
kepada sifat bahan yang akan dipisahkan. Campuran hasil fasa diam dan padat sebenarnya
kering, bubuk yang mudak mengalir, tidak seperti bahan pendukung sebelum diperlakukan
dengan cairan. Jadi silica gel menyerap sekitar 70% berat air tanpa menjadi basah dalam arti
biasa. Tabung kromatografi, oleh karena itu, dapat dikemas dengan bubuk ini dan cara ini
dilakukan untuk kromatografi adsorpsi. Walaupun pengemasan kering terkadang lebih baik

untuk pengemasan bubur, namun pengemasan kering umumnya tidak dapat digunakan ketika
fasa diam adalah cairan pada padatan pembawa inert.
Pasangan pelarut yang merupakan fasa diam dan fasa gerak harus memiliki saling kelarutan
yang rendah. Air biasanya merupakan fasa diam. Pelarut organic hidrofilik adalah cairan lain
yang dapat merupakan fasa diam menggantikan air. Urutan pelarut untuk Kromatografi cair-cair
adalah: air > formaldehid > methanol > asam asetat > etanol > aseton > n-propanol > t-butanol >
fenol > n-butanol > amil alcohol > etil asetat > eter > butyl asetat > kloroform > benzene >
toluene > sikloheksana > petroleum eter. Ini juga merupakan urutan penurunan kapasitas pelarut
untuk mengikat H.
Untuk cara kerja teknik ini, prediksi untuk kombinasi optimum fasa diam dan fasa cair gerak
tidak selalu mungkin karena sistem partisi mungkin melibatkan pelarut campuran, larutan garam,
buffer, atau agen pengompleks, dan penentuan kombinasi yang tepat dari fasa diam dan sistem
pelarut pada kromatografi partisi bukan merupakan teknik uji coba yang sering dilakukan.
Kumpulan fraksi limbah diikuti analisisnya menggunakan alat pendeteksi berdasarkan sifat
fisik seperti indeks refraktif, konduktifitas, ultra violet atau adsorpsi terlihat.
Gambar 6.1 menggambarkan rancangan khas kromatografi cair.

Gambar 6.1 Rncangan khas kromatografi cair

Hampir pada semua kasus kromatografi partisi sistem pelarut campuran, terkadang
membutuhkan tiga pelarut, jika dibutuhkan, dan kamar pencampuran untuk pelarut adalah bagian
penting dari kromatografi cair. Selama pelaksanaan pemisahan kromatografi kebutuhan sering
meningkat untuk memvariasikan komposisi fasa gerak pada berbagai tahap percobaan. Operasi
iini deprogram sehingga pada setiap tahap percobaan hanya beberapa kuantitas beragam pelarut
sesuai untuk tahap tersebut, yang dibiarkan melewati kamar pencampuran yang berfungsi
membawa variasi yang dibutuhkan pada komposisi fasa gerak. Pompa menarik fasa gerak dari
reservoir, mendorong fasa gerak melewati kolom, menahan semua selama tingkat aliran fasa

gerak tetap selama proses dalam kolom. sebuah kumparan ditempatkan diantara pompa dan
kolom yang meredam denyutan pompa. Dimasukkan di bagian atas kolom adalah sistem
penyuntikan. Salah satu sistem injeksi, jarum injector (Gambar 6.2), melibatkan port injeksi
septum dimana jarum digunkan untuk menyuntikkan sampel melewati septum inert langsung ke
fasa yang mengalir. Tipe kedua dari sistem injeksi melibatkan katup yang dapat diputar dari
tabung fasa gerak ke tabung sampel. Jadi sampel disuntikkan ke dalam garis sampel, katup
dipurar, dan fasa gerak membilas sampel ke jalur utama. Setelah itu, katup dikembalikan ke
posisi semula. Campuran sampel melewati kolm dan terjadi pemisahan, fraksi efluen terdeteksi
oleh salah satu alat pendeteksi yang akan dijelaskan dibawah.

Gambar 6.2 Jarum Injektor

6.2 Detektor LC
Terdapat dua tipe alat pendeteksi umum. Yaitu detector properti jumlah besar dan detector
property larutan. detector property jumlah besar menghitung perubahan pada keseluruhan sifat
fisik pada fasa gerak yang muncul dari kolom. dua contoh tipikal adalah pengukuran indeks
refraktif dan konduktansi. Detector sifat larutan sensitive terhadap perubahan sifat fisik larutan
saat muncul dari kolom pada fasa gerak; contoh tipikalnya adalah pengukuran ultra violet
dan/atau absorpsi visible. Secara umum, detector sifat larutan lebih sensitive, khususnya jika fasa
gerak tidak berkontribusi terhadap sifat yang akan diukur.

Dibawah ini merupakan penjelasan tipe-tipe detector yang berbeda bersama teori yang
mendasari cara kerja masing-masingnya.

6.2.1 Detektor Fotometri Penyerapan

Ketika cahaya frekuensi diserap oleh molekul, electron membentuk ikatan kimia meningkat
ke level enegi yang lebih tinggi (molekul mengalami transisi dari keadaan awal ke salah satu
keadaan tereksitasi dengan konten energy yang lebih tinggi), perbedaan level energy dinyatakan
dengan hubungan:
H = E1 E0,
dimana E0 dan E1 merupakan energy pada keadaan awal dan keadaan tereksitasi molekul.
Absorpsi energy cahaya dapat meningkatkan energy vibrasional (yaitu meningkatkan
amplitude vibrasi nucleus atom pada ikatan), energy rotasi molekul secara keseluruhan (dan
bagiannya tentang ikatan kimia) atau mengakibatkan eksitasi electron valensi terluar. Untuk
meningkatkan energy rotasi molekul, jumlah energy yang relative kecil cukup dan, karena itu,
absorpsi yang sesuai terletak jauh di daerah inframerahdaerah panjang gelombang terpanjang.
Energy yang dibutuhkan untuk meningkatkan energy vibrasional molekul disediakan oleh radiasi
di daerah infra merah yang dekat.
Jumlah energy yang lebih besar dibutuhkan untuk mengeksitasi electron terluar molekul
(penyerapan di daerah terlihat dan daerah ultraviolet). Jumlah yang dibutuhkan untuk mengubah
energy elektronik sekitar satu atau dua kali lipat lebih tinggi daripada yang dibutuhkan untuk
mengubah energy vibrasi. Oleh karena itu, absorpsi di daerah ultra violet, menyebabkan transisi
elektronik, vibrasi atau rotasi; absorpsidi daerah panjang gelombang nframerah yang panjang
disertai dengan perubahan energy rotasi saja.
Detector fotometrik absorpsi didasarkan pada pengukuran relasi antara intensitas absorpsi
cahaya dan frekuensi cahaya (atau panjang gelombang). Untuk pengukuran ini seberkas cahaya
monokromatik (cahaya dengan panjang gelombang tertentu), dimana panjang gelombangnya
berubah secara bertahap dengan bantuan instrument khusus disebut monokromator,
diperbolehkan melewati lapisan zat (lebih sering dalam larutan). intensitas transmisi cahaya, I,
diukur dan ditransmisikan ke perekam yang mencatatnya dalam bentuk grafik (spectrum),
dengan intensitas I di plot sebagai ordinat dan panjang gelombang atau frekuensi sebagai absis.

Prosedur pengukuran yang dijelaskan diatas adalah karakteristik yang disebut instrument
beam-tunggal. Operasi dari spektro-fotometer sekarang didasarkan kepada prinsip double-beam.
Detector radiasi dana alat perekam mencatat tidak hanay intensitas cahaya, I, yang
ditransmisikan melalui zat tapi juga intensitas biasa, I0. Sinyal direkam sebagai pembeda I0I
atau sebagai perbandingan I/ I0; pengukuran harus dilakukan agar kedua berkas cahayabiasa
dan transmisidapat seimbang secara optikal. Ketika absorpsi pektrum larutan diukur, satu
berkas (I0) melewati lubang kecil (kuvet) penuh akan pelarut murni (atau bahan referensi), dan
lainnya (I) melalui lubang kecil berisi larutan bahan yang sedang diamati.
Ketika bekerja di daerah spectrum ultraviolet, penggunaan dibuat dari optic kuarsa, dan
daerah inframerah, prisma garam dipekerjakan (prisma terbuat dari NaCl, LiF dan KBr,
bergantung pada panjang gelombang); sumber radiasi biasa adalah lampu atau (di daerah
inframerah) batang berpijar yang terbuat dari bahan tertentu.
Terdapat dua hokum fundamental dalam spektrofotometro, yang menggambarkan absorpsi
cahaya oleh materi. Ini adalah Hukum Lambert dan Beer.
Hukum Lambert menyatakan bahwa intensitas cahaya yang ditransmisikan melewati media
homogeny menurun secara geometris seiring ketebalan lapisan meningkat secara aritmatika,
yaitu, jika ketebalan tertentu menyerap sebagian cahaya, kemudian ketebalan yang mengikutinya
dan sama tidak akan menyerap sebagian sisa cahayanya, tapi hanay setengah dari sebagian dan
akibatnya menguranginya hngga seperempat.
Hukum Beer menyatakan bahwa tiap molekul larutan menyerap fraksi yang sama dari cahaya
biasa diatasnya, terlepas dari konsentrasi di media yang tidak menyerap, yang dinyatakan dengan
kata lain, berarti bahwa sebagian kecil dari cahaya diserap oleh zat terlarut sebanding dengan
jumalah molekul zat terlarut pada jalur cahaya (dua kali lipat dari konsentrasi sehingga
berjumlah dua kali lipat dari lapisan penyerap pada konsentrasi awal). Hukum Beer tidak berlaku
untuk semua batas konsentrasi dan penyimpangan dari hukum ini dicatat untuk setiap tingkat
asosiasi berbeda, solvasi dan disosiasi molekul pada larutan dengan konsentrasi berbeda
Kombinasi Hukum Lambert dan Beer dapat ditulis secara matematika denga hubungan:

Dimana A kerapatan optic atau adsorben, a adalah absorptifitas, a konstan bergantung pada
panjang gelombang radiasi dan sifat materi yang diserap dimana konsentrasinya, C, dinyatakan
dalam gram per liter, dan b adalah panjang jarak optic.

Penyerapan cahaya dapat dicatat sebagai grafik (spectrum) dalam jumlah bervariasi:
(i)

transmisi;

(ii)

persen transmisi;

(iii)

dan 100

(iv)

fraksi cahaya yang diserap dan persen absorben;

kerapatan optic (absorben atau ekstinksi)

(v) A

absorben lapisan 1 cm larutan yang mengandung 1% berat larutan yang

diserap.
Pada spectrum ultraviolet, biasanya panjang gelombang [dalam milimikro (m) atau
nanometer (nm), 10-9 m] di plot pada absis dan atau log pada ordinat, merupakan koefisien
ekstinksi molar, dimana kerapatan optic dari 1 M larutan untuk ketebalan lapisan 1cm yaitu =
dimana C adalah konsenyrasi dalam mol per liter dibawah kondisi tertentu panjang
gelombang dan pelarut. Spektroskopi ultraviolet biasanya mempekerjakan larutan yang sangat
encer sehingga penyimpangan hokum Beer kecil.
Ketika spectrum inframerah dicatat, frekuensinya [dalam sentimeter pangkat minus 1 (cm-1)]
atau, lebih jarang, panjang gelombang [dalam mikro ()], [dalam mikro ()] diplot sebgai
absis,dan persen absorben atau persen transmisi diplot sebagai ordinat.
Perubahan energi molekul yang disebabkan oleh penyerapan energi cahaya (energi transisi)
mengacu pada jenis tertentu elektronik atau vibrasi eksitasi (untuk setiap transisi vibrasi murni
terdapat progress dari level rotasi dekat) molekul. Maxima pada spectrum absorpsi sesuai dengan
kebnayakan transisi yang mungkin diantara eingkat energy molekul, sehingga spectrum absorpsi
trekait dengan sangat baik dengan struktur molekul. Maxima tertentu pada spectrum absorpsi
sangat khusus untuk beberapa kelompok ataom atau ikatan yang posisi maximanya sedikit
bervariasi dari senyawa ke senyawa yang terdiri dari beberapa kelompok fungsional yang sama
atau ikatan yang sama. Sebagai contoh, vibrasi valensi ikatan; C=O (sekitar 1700 cm-1), C N
(Ca, 2250 cm-1), OH (3550 cm-1) (lihat Tabel 6.1) yang ditunjukkan pada spectrum IR. Mereka
disebut karakteristik band IR dan memungkinkan menentukan ada tidaknya dalam molekul dari
berbagai kelompok atom atau obligasi. Dalam Spektrum UV, titik yang menunjukkan panjang
gelombang dimana absorpsi mencapai maksimum disebut max (dimana ditampilkan sebagai
max), dan ini lagi dapat memberikan bantuan yang berharga untuk mendeteksi kelompok

fungsional yang ada dalam molekul yang tidak diketahui, meskipun spektrum ultraviolet-tampak
tidak berguna sebagai spektrum inframerah dalam hal ini.
Detektor yang paling sering digunakan untuk LC adalah detektor fotometri absorpsi dan ini
dicontohkan oleh deskripsi beberapa UV tertentu dan fotometer IR berikut.

6.2.1.1 Detektor UV
Detektor UV memiliki banyak karakteristik positif termasuk sensitivitas yang tinggi, volume
sampel kecil, linearitas atas rentang konsentrasi yang luas dan nondestructiveness sampel.

PANAJANG GELOMBANG TETAP DOUBLE-BEAM FOTOMETER UV

Secara skematis diperlihatkan pada Gambar 6.3 adalah salah satu detektor LC yang lebih
populer, panjang gelombang tetap double-beam UV fotometer sederhana. Sumber cahaya yang
digunakan adalah lampu merkuri tekanan rendah yang memberikan sebagian besar output pada
254 nm. Sistem optik dari detektor dirancang sehingga energi radiasi yang cukup dapat dibuat
untuk melewati sel penyerapan sempit, yang terbatas pada sekitar 1 mm diameter untuk
menghindari ruang kosong. Sampel dan sel referensi terdiri dari saluran silinder dibor di blok
stainless steel atau Teflon dan ditutup oleh silika jendela. Radiasi UV dari lampu, collimated
oleh lensa, melewati dua sel. Sampel sel berisi kolom limbah terus mengalir. Sel referensi

biasanya diisi dengan udara. Intensitas cahaya yang melewati setiap sel tergantung pada jumlah
cahaya yang diserap dalam sel masing-masing. Radiasi yang melewati sel referensi dan sampel
melakukan perjalanan melalui filter UV untuk menghilangkan radiasi yang tidak diinginkan dan
jatuh pada dua fotosel yaitu detektor yang lightsensitive dan dapat mendeteksi sejumlah kecil
energi cahaya. Output dari kedua detektor melewati preamplifier untuk pembanding log yang
menghasilkan sinyal listrik untuk perekam. Log pembanding diperlukan untuk mengubah foton
yang diukur pada photodetektor (transmitansi) menjadi unit-unit absorbansi yang berbanding
lurus dengan konsentrasi.
Detektor UV ini murah, sensitif terhadap aliran normal dan fluktuasi suhu, dan cocok untuk
elusi gradien. Hal ini, bagaimanapun, detektor selektif. Molekul sampel Hanya yang menyerap
pada 254 nm dapat dideteksi.

Variabel Panjang gelombang Detektor UV

Banyak analit (yaitu senyawa dipisahkan saat mereka muncul dalam limbah dari kolom)
tidak menyerap pada 254 nm dan berbagai detektor UV / VIS menawarkan panjang gelombang
lain telah tersedia.
Sebuah panjang gelombang detektor UV variabel jenis ini, spektrofotometer, menghasilkan
cahaya dari panjang gelombang terpilih, mengarahkan melewati sel sampel, dan mengukur
cahaya yang ditransmisikan oleh sel.
Gambar 6.4 menunjukkan skema spektrofotometer digunakan sebagai detektor LC.
Untuk pengukuran penyerapan dalam daerah ultraviolet, hidrogen tekanan tinggi atau lampu
deuterium digunakan. Lampu ini menghasilkan radiasi di 200-320 nm

jangkauan. Sumber cahaya untuk daerah tampak adalah lampu tungsten, dengan kisaran panjang
gelombang 320-800 nm. Instrumen dengan kedua lampu memiliki fleksibilitas yang lebih besar
dan dapat digunakan untuk studi berbagai spesies molekul.
Kedua lampu dibahas di atas menghasilkan emisi terus menerus dari semua panjang
gelombang dalam jangkauan mereka. Oleh karena itu, spektrofotometer harus memiliki sistem
optik untuk memilih cahaya monokromatik. Instrumen modern menggunakan kisi difraksi
biasanya untuk menghasilkan panjang gelombang yang diinginkan.
Sebelum cahaya monokromatik impinges pada sampel, melewati sistem diperlukan
kondensasi optik yang memfokuskan dengan intensitas yang cukup terhadap sampel. Dengan
memvariasikan posisi kisi-kisi, panjang gelombang yang diinginkan difokuskan pada celah
keluar dan kemudian dilewatkan melalui sampel dan sel referensi melalui beam splitter. Detektor
mengukur perbedaan antara intensitas cahaya yang muncul dari sampel dan sel referensi. Sinyal
detektor diubah menjadi absorbansi oleh pembanding logaritmik. Pembacaan langsung

absorbansi diberikan oleh meter baik dalam bentuk analog (yaitu indikasi dengan cara tangan
bergerak sepanjang dial sebagai waktu ditunjukkan dalam jam tradisional) atau bentuk digital
(yaitu menampilkan pengukuran dengan cara mengubah nomor seperti pada jam digital).
Agar umumnya lebih berguna dalam hal selektivitas, spektrofotometer, dengan panjang
gelombang continuously variable, adalah diinginkan, meskipun akan ada beberapa hilangnya
sensitivitas. Spektrofotometer ini memberikan gelar selektivitas tambahan tidak dimiliki oleh
detektor LC lainnya, untuk dapat membedakan antara berbagai komponen dari kolom limbah.
Spektrum absorbansi senyawa diperoleh dengan memindai berbagai panjang gelombang dan
merencanakan absorbansi pada setiap panjang gelombang. Kebanyakan spektrofotometer
double-beam secara otomatis memindai rentang panjang gelombang yang diinginkan dan
merekam absorbansi sebagai fungsi dari panjang gelombang. Jika pelarut hadir dalam sel
referensi dan kolom limbah dalam sel sampel, instrumen terus menerus dan secara otomatis akan
mengurangi absorbansi pelarut dari total (pelarut ditambah sampel) absorbansi pada setiap
panjang gelombang. Sebuah scan panjang gelombang vs absorbansi diberikan oleh perekam.
Beberapa spektrofotometer dilengkapi dengan pena perekam, tapi biasa Strip perekam grafik
dapat terhubung ke sebagian spektrofotometer.
Detektor ultraviolet cocok untuk senyawa yang mengandung ikatan -dan electron tidak
berikatan.

6.2.1.2 Fotometer Inframerah

Penyerapan di wilayah inframerah dapat digunakan baik sebagai detector umum dan sebagai
detektor khusus. Untuk digunakan sebagai detektor umum teknik stopped-flow harus digunakan.
Dalam

Tabel 6.1
Frekuensi Absorpsi Inframerah
Tipe Senyawa

Kelompok Fungsional

cm-1

Alifatik hidrokarbon

C H

2800-3000

Olefin

1600-1670

Nitril

2210-2260

Alcohol

3610-3640

Karbonil

1735

Keton

1715

mode ini sampel dapat diselenggarakan dalam sel detektor dan panjang gelombang dipindai
untuk mendeteksi berbagai kelompok fungsional. Atau, sampel mungkin terjebak keluar dan
dianalisis.
Sebagai detektor panjang gelombang tertentu diatur pada nilai tertentu untuk mendeteksi
kelompok fungsional tunggal. Tabel 6.1 mencantumkan beberapa kelompok fungsional yang
khas dengan frekuensi inframerah masing-masing penyerapan. Tentu saja, detektor beroperasi
pada 3,4 (2800 cm-1) akan menanggapi setiap senyawa organik yang menunjukkan penyerapan
C-H dan pada dasarnya adalah detektor universal.
Contoh dari detektor inframerah adalah Detector Miran, yang merupakan spektrometer
Singlebeam dengan filter continuously variable yang memindai 2,5-14,5 (4000-690 cm-1),
dengan resolusi 0,12 pada 5 . Jadi baik berhenti-aliran dengan pemindaian serta pemantauan
panjang gelombang tunggal adalah mungkin. Detektor tidak sensitif terhadap variasi suhu atau
aliran-rate. Detektor dapat digunakan dengan elusi gradien, meskipun pergeseran dasar-line
(yaitu respon detektor direkam ketika hanya eluen yang melewati detektor) yang berpengalaman.
Salah satu masalah utama dengan detektor inframerah adalah pilihan fase gerak, terutama
ketika menggunakan modus scan. Karena detektor IR mengukur absorbansi pada panjang
gelombang yang dipilih ketersediaan 'spektral jendela' dalam spektrum fase gerak harus
dipertimbangkan serta persyaratan kromatografi biasa. Sebuah jendela spektral umumnya
didefinisikan sebagai wilayah spektrum di mana pelarut, dalam sel sampel diberikan jalanpanjang, menunjukkan setidaknya 30% transmitansi. Dengan demikian, pelarut dalam sel lagi
akan memiliki sedikit jendela misalnya dengan al-jalan mm panjang asetonitril sel memiliki
jendela dari 6-8 dan 8,5-11 ; namun, kedua wilayah ini spektral buram dalam sel 3 mm. Hal
ini menunjukkan bahwa sel-sel jalan-panjang pendek yang menguntungkan. Memang pada
pathlength dari 0,1 mm, pelarut kromatografi yang paling umum memiliki jendela besar, tetapi
lebih pendek jalan panjang mengurangi sensitivitas deteksi.
Karena besarnya penyerapan bervariasi dari satu pelarut lain dan dari satu panjang
gelombang yang lain, pergeseran dasar-line biasanya diamati selama elusi gradien. Ini
pergeseran dasar-line sering linier dengan konsentrasi pelarut kedua. Ukuran pergeseran tersebut

tergantung pada sejauh mana perubahan

komposisi dan karakteristik absorbansi dari
fase mobile, pathlength optik dan sensitivitas
detektor.
Prinsip pencocokan absorbansi dapat
diterapkan
mengurangi

untuk

deteksi

pergeseran

ini

IR

untuk

dasar-line.

Pencocokan absorbansi melibatkan campuran

pelarut untuk memberikan pasangan fase
gerak dengan absorbansi optik yang sama
untuk

digunakan

dalam

gradien

elusi.

Misalnya, dengan menggunakan asetonitril sebagai pelarut primer dan sekunder pelarut yang
terdiri dari campuran metilen klorida dan tetrahidrofuran yang sangat cocok dengan absorbansi
asetonitril, senyawa karbonil yang mengandung dapat dielusi dalam kondisi gradien dengan
sedikit pergeseran dasar-line, dan dapat dimonitor pada 5,8 .

6.2.2 Detektor Fluoresen

Seperti dibahas sebelumnya, interaksi foton dengan molekul memberikan molekul yang
dikatakan dalam keadaan tereksitasi akibat pada promosi kelambu elactrons dari tanah negara
untuk orbital orbital tingkat energi yang lebih tinggi. Molekul dalam keadaan tereksitasi tidak
tinggal di sana lama, tapi spontan rileks ke keadaan dasar lebih stabil. Dengan sebagian besar
molekul, proses relaksasi ini disebabkan oleh transfer energi tumbukan dengan molekul pelarut
atau lainnya dalam larutan. Dalam kasus beberapa molekul bersemangat, namun, proses
relaksasi, yang sangat cepat, meninggalkan molekul dalam tingkat vibrasi terendah dari keadaan
tereksitasi dari mana molekul dapat kembali ke beberapa tingkat getaran dari keadaan dasar oleh
pelepasan energi yang dipancarkan sebagai cahaya, fenomena ini disebut fluoresensi.

Dua karakteristik penting dari cahaya yang dipancarkan adalah: (1) Memiliki panjang
gelombang yang semuanya lebih lama (dan, oleh karena itu, energi yang lebih rendah) dari
panjang gelombang cahaya eksitasi (yang ini terjadi karena bagian dari energi awalnya terkait
dengan keadaan tereksitasi hilang sebagai energi panas, dan karena energi yang hilang oleh emisi

mungkin cukup hanya untuk kembali molekul bersemangat untuk tingkat getaran yang lebih
tinggi dari keadaan dasar), (2) cahaya yang dipancarkan terdiri dari banyak panjang gelombang
dan hasilnya adalah fluoresensi spektrum. Hal ini disebabkan fakta bahwa fluoresensi dari setiap
molekul bersemangat tertentu dapat kembali molekul ke salah satu dari berbagai tingkatan
vibrasi dalam keadaan dasar. Sama seperti dalam kasus penyerapan spektrum, panjang
gelombang fluoresensi maksimum diamati, dan spektrum terdiri dari distribusi panjang
gelombang berpusat maksimum emisi ini; tentu saja, semua panjang gelombang yang
dipancarkan lebih panjang dan energi lebih rendah dari panjang gelombang eksitasi awal.

6.2.3 Detektor Refraktometrik

Tipe lain dari detektor penting adalah refraktometer diferensial . Perangkat ini terus
memonitor perbedaan antara indeks bias pelarut murni ( fase gerak ) dan fase gerak yang
mengandung sampel ( kolom limbah ) , dan tergantung untuk sensitivitas yang semata-mata pada
perbedaan yang cukup besar dalam indeks pelarut dan zat terlarut . Perbedaan indeks bias dapat
diukur menjadi sekitar 1 bagian dalam 107 , yang sesuai dengan bagian per juta beberapa dari zat
terlarut organik dalam air , sehingga detektor ini hanya cukup sensitif dibandingkan dengan
detektor dibahas sebelumnya . Keuntungan deteksi indeks bias adalah bahwa hal itu dapat
digunakan dengan pelarut yang sifat fisik ( seperti penyerapan UV ) dapat mengganggu mode
lain deteksi . Fleksibilitas dari penggunaan detektor refraktometer adalah keuntungan utama .
Namun, keunggulan ini memiliki keterbatasan utama dalam jenis detektor tidak dapat digunakan
dengan elusi gradien karena perubahan indeks karena pemrograman pelarut benar-benar
menguasai setiap sinyal yang dihasilkan oleh komponen dielusi .

6.2.4 Detektor Lain

(i) detektor Reaksi: Dalam detektor ini, aliran cairan dari kolom dicampur terus menerus
dengan zat yang akan bereaksi dengan spesies yang diharapkan untuk membentuk
menyerap atau fluorescing produk.
(ii) Dielektrik konstan detektor memanfaatkan ruang sempit di antara dua elektroda
logam sebagai kapasitor. Kolom limbah, melewati saluran ini, menyebabkan variasi
kapasitansi menurut konstanta dielektrik. Pelarut LC sangat bervariasi dalam nilainilai konstanta dielektrik mereka, dari sekitar 2 untuk molekul simetris seperti
benzena dan sikloheksana menjadi lebih besar dari 180 untuk suatu senyawa yang
sangat polar seperti metil formamida.
(iii) Deteksi elektrokimia menemukan aplikasi dalam kromatografi fase terbalik (lihat

halaman 101) dimana komponen-komponen sampel yang elektroaktif. Komponen

eluat dari kolom dikenakan oksidasi atau reduksi pada permukaan elektroda dimana
arus kecil diproduksi. Arus yang dihasilkan sebanding dengan jumlah bahan
teroksidasi atau dikurangi.
(a) Menghitung gemilang Cairan

Sampel untuk menghitung sintilasi cair terdiri dari tiga komponen yaitu. (1) bahan
radioaktif, (2) pelarut, biasanya aromatik, di mana zat radioaktif dibubarkan atau ditunda,
dan (3) satu atau lebih zat neon organik. Komponen (2) dan (3) membentuk sistem cairan
kilau. Partikel dipancarkan dari sampel radioaktif (sebagian besar radioisotop yang
digunakan dalam penelitian biokimia emitter ) berinteraksi dengan sistem kilau,
menghasilkan kilatan cahaya kecil atau scintillations. Lampu berkedip dideteksi oleh
tabung photomultiplier (PMT). Pulsa elektronik dari PMT diperkuat dan dicatat oleh
perangkat menghitung disebut scaler.
Proses kilau, secara rinci, dimulai dengan tabrakan dipancarkan partikel dengan
molekul pelarut, S:
+S

S* + (kurang berenergi)

Kontak antara partikel energik dan S dalam hasil keadaan dasar dalam transfer
energi dan konversi dari molekul S menjadi negara gembira, S *. Pelarut aromatik seperti
toluena atau dioksan yang paling sering digunakan karena elektron mereka mudah
dipromosikan ke keadaan tereksitasi orbital. Partikel setelah satu tabrakan masih

memiliki energi yang cukup untuk merangsang beberapa molekul yang lebih pelarut.
Molekul-molekul pelarut bersemangat biasanya kembali ke keadaan dasar dengan emisi
foton, S * S + h. Foton dari pelarut aromatik khas dari panjang gelombang pendek
dan tidak efisien terdeteksi oleh fotosel. Sebuah cara mudah untuk mengatasi masalah
teknis ini adalah dengan menambahkan satu atau lebih zat fluorescent (Fluors) ke dalam
campuran kilau. Molekul pelarut Excited berinteraksi dengan fluor primer, F1, energi
yang ditransfer dari S * ke F1, sehingga molekul dasar negara S dan molekul F1
bersemangat, F1 *:
S* + F1

S + F1*

F1 * molekul neon dan memancarkan cahaya dari panjang gelombang lebih panjang
dari S *:
F1*

F1 + h1

Jika cahaya yang dipancarkan selama peluruhan F1 * masih panjang gelombang

terlalu pendek untuk pengukuran yang efisien oleh PMT, seorang fluor sekunder, F2,
yang menerima energi dari F1 * dapat ditambahkan ke sistem kilau. Berikut dua
persamaan menguraikan proses transfer energi berkelanjutan dan fluoresensi F2:
F1* + F2

F1 + F2*

dan
F2*

F2 + h2

Lampu, h2, dari F2 * adalah panjang gelombang lebih panjang dari h1 dari F1 *
dan lebih efisien terdeteksi oleh PMT. Dua banyak digunakan Fluors primer dan
sekunder adalah 2, 5-diphenyloxazole (PPO) dengan maksimum emisi 380 nm, dan 1,4bis-2 - (5-phenyloxazolyl)-benzene (POPOP) dengan maksimum emisi 420 nm .
Unsur-unsur paling dasar dalam pencacah sintilasi cair adalah PMT, seorang amlifier
pulsa, dan counter, yang disebut scaler. Ini perakitan sederhana dapat digunakan untuk
menghitung, namun, ada banyak masalah dan kerugian dengan set-up. Banyak kesulitan
ini dapat diatasi dengan lebih banyak fitur canggih berperan. Beberapa masalah dan
solusi praktis yang diuraikan di bawah ini.
Kebisingan termal dalam Tabung photomultiplier: The energi partikel dari
kebanyakan emitter sangat rendah. Ini, tentu saja, menyebabkan foton energi rendah
yang dipancarkan dari Fluors dan pulsa elektrik energi yang relatif rendah di PMT. Selain

itu,

tabung

photomultiplier

menghasilkan

thermal

noise

background dengan 25 sampai 30%

dari energi yang berkaitan dengan
foton

fluoresensi

dipancarkan.

Kesulitan ini tidak dapat dihilangkan,

namun

efeknya

dapat

dikurangi

dengan menempatkan sampel dan

PMT dalam freezer pada 0,5-0,8 oC
untuk mengurangi noise termal.
Metode kedua untuk membantu
menyelesaikan

masalah

kebisingan

termal adalah penggunaan dua tabung

photomultiplier

untuk

mendeteksi

scintillations. Setiap kilatan cahaya

yang

dideteksi

oleh

tabung

photomultiplier dimasukkan ke sirkuit

kebetulan. Sebuah rangkaian kebetulan menghitung hanya berkedip yang tiba secara
bersamaan di dua photodetectors. Pulsa elektrik yang merupakan hasil acak emisi
simultan (noise thermal) di tabung individu sangat tidak mungkin. Sebuah diagram
skematik counter kilau khas dengan sirkuit kebetulan ditunjukkan pada Gambar 6.7.
Kebetulan sirkuit memiliki kelemahan dari penghitungan efisien partikel energi yang
sangat rendah yang dipancarkan dari 3H dan 14C.
Menghitung lebih dari Satu Isotop dalam Sampel: dasar pencacah sintilasi cair
dengan sirkuit kebetulan hanya dapat digunakan untuk menghitung sampel yang
mengandung satu jenis isotop. Banyak percobaan di Biokimia memerlukan penghitungan
hanya satu isotop, namun eksperimen lebih berharga dapat dilakukan jika dua radioisotop
dapat sekaligus dihitung dalam sampel tunggal (percobaan double-label). Dasar pencacah
sintilasi dijelaskan sebelumnya tidak memiliki sarana membedakan antara pulsa elektrik
energi yang berbeda.

Ukuran arus yang dihasilkan dalam photocell adalah hampir sebanding dengan energi
partikel memulai pulsa . partikel dari isotop yang berbeda memiliki spektrum energi
karakteristik dengan energi rata-rata. Counter kilau modern dilengkapi dengan analisis
tinggi pulsa yang mengukur ukuran pulsa listrik dan menghitung hanya pulsa dalam batas
energi terpilih ditetapkan oleh diskriminator. Sirkuit yang dibutuhkan untuk analisis
tinggi pulsa dan diskriminasi energi partikel ditunjukkan pada Gambar 6.7.
Diskriminator yang elektronik 'jendela' yang dapat disesuaikan untuk menghitung partikel
dalam energi tertentu atau rentang tegangan disebut Channels. Saluran ditetapkan untuk
batas bawah dan batas atas, dan semua tegangan dalam batas-batas dihitung.
Diskriminator nomor 1 disesuaikan untuk menerima partikel khas dipancarkan oleh 3H
dan nomor saluran 2 disesuaikan untuk menerima partikel dari karakteristik energi 14C.

Aspek Praktis Menghitung Scintillation

I. Quenching
Setiap bahan kimia atau kondisi eksperimental yang mengurangi efisiensi proses kilau dan
deteksi mengarah ke penurunan tingkat menghitung, atau pendinginan. Ada empat asal umum
pendinginan.
Pendinginan Warna adalah masalah jika zat kimia yang menyerap foton dari Fluors sekunder
yang hadir dalam campuran kilau. Karena Fluors sekunder memancarkan cahaya di daerah
tampak antara 410 dan 420 nm, zat berwarna dapat menyerap cahaya yang dipancarkan sebelum
terdeteksi oleh fotosel. Sampel radioaktif harus diperlakukan untuk menghilangkan kotoran
berwarna sebelum pencampuran dengan kilau pelarut.
Pendinginan kimia terjadi ketika zat kimia dalam larutan kilau berinteraksi dengan pelarut
bersemangat dan molekul fluor dan, karenanya, menurunkan efisiensi proses sintilasi. Untuk
menghindari jenis pendinginan sampel dapat dimurnikan atau konsentrasi Fluors dapat
ditingkatkan.
Titik pendinginan terjadi jika sampel radioaktif tidak benar-benar larut dalam pelarut.
Partikel dipancarkan dapat diserap sebelum mereka memiliki kesempatan untuk berinteraksi
dengan molekul pelarut. Penambahan agen pelarut seperti Cab-O-Sil atau Thixin mengurangi
pendinginan titik dengan mengkonversi sintilator cair gel.

Hasil pendinginan Dilusi ketika volume besar sampel radioaktif cair ditambahkan ke dalam
larutan sintilasi. Dalam kebanyakan kasus, jenis pendinginan tidak bisa dihilangkan, tetapi dapat
diperbaiki. Counter kilau modern dilengkapi dengan sumber radiasi standar dalam instrumen
tetapi di luar solusi kilau. Sumber radiasi, biasanya emitor gamma, secara mekanik pindah ke
posisi sebelah botol berisi sampel, dan sistem gabungan standar dan sampel dihitung. Sinar
gamma dari standar akan merangsang molekul pelarut dalam sampel, dan proses sintilasi terjadi
seperti yang dijelaskan sebelumnya. Namun, instrumen yang disesuaikan untuk mendaftar hanya
scintillations karena tabrakan partikel dengan molekul pelarut.

II. Persiapan Sampel

Banyak masalah pendinginan dibahas di atas dapat dikurangi jika percobaan ini
direncanakan. Berbagai macam metode persiapan sampel dan cairan kilau yang tersedia untuk
digunakan. Beberapa teknik yang lebih umum yang disebutkan di bawah.

Dua jenis utama dari pelarut yang digunakan, mereka yang bercampur dengan air dan yang
larut dalam air. Tabel 6.2 berisi beberapa sistem kilau lebih populer.
Campuran pelarut dan fluor (s) yang populer disebut koktail kilau. Berbasis Toluene koktail
yang paling banyak digunakan untuk sampel radioaktif tidak berair. Banyak sampel biologis,
bagaimanapun, mengandung air atau tidak larut dalam larutan toluena. Berbasis dioksan koktail
telah dikembangkan yang larut sampel yang paling hidrofilik, namun, dioksan menyebabkan
beberapa pendinginan sendiri. Solusi Bray, mengandung pelarut polar etilena glikol, metanol,
dan dioksan, sangat cocok untuk sampel air. Berbasis Toluene koktail dapat digunakan dengan
sejumlah kecil sampel air jika zat pengemulsi seperti Aquasol, Bisolov, Cab-O-Sil, atau Triton
ditambahkan.

TABEL 6.2
Kegunaan Sistem Scintillation
Untuk SenyawaOrganik Non-Polra:
1. Berbasis Toluena: PPO, POPOP (atau POPOP dimetil) dalam toluena.

Untuk Larutan Encer:

1. Berbasis Toluena: PPO, POPOP, agen pengemulsi (Aquasol, Biosolv, Cab-O-Sil atau
Triton - X 100) dalam toluena.
2. Bray solusi: PPO, POPOP, naftalena, metanol, etilen glikol di dioksan.
3. Berbasis dioksan: PPO, p-bis (O-methylstyryl) benzena, naftalena di dioksan.

Untuk CO2 dan Zat Asam:

1. Toluene-dioksan berbasis: PPO, POPOP, naftalen di dioksan-toluena. Sampel
disiapkan di sebuah pangkalan seperti Hyamine hidroksida.

Sampel radioaktif yang larut dalam kedua toluena dan air harus pra-perawatan sebelum
analisis. Beberapa sampel tidak larut dapat kimia atau secara fisik berubah menjadi bentuk yang
larut. Sebuah metode yang umum adalah untuk membakar sampel dalam kondisi yang terkendali
dan mengumpulkan 3H2O dan / atau 14CO2 dalam larutan sintilasi. Atau, zat radioaktif dapat
dikumpulkan pada selulosa atau fiberglass filter membran. Filter dengan sampel radioaktif
tertanam ditempatkan langsung dalam botol kilau berisi koktail yang tepat. Zat asam dan CO2
dapat diukur setelah pengobatan dengan basa seperti Hyamine.
Sampel radioaktif dan solusi kilau ditempatkan dalam botol kaca untuk menghitung. Kaca
khusus dengan kandungan kalium rendah harus digunakan karena kalium alami mengandung
radioisotop 40K, emitor . Botol Polyethylene juga umum digunakan saat ini.

III. Latar Belakang Radiasi

Semua perangkat menghitung radiasi mendaftar jumlah bahkan jika tidak ada sumber tertentu
atau langsung radiasi dekat detektor. Hal ini disebabkan radiasi latar belakang. Ini memiliki
banyak sumber termasuk radioaktivitas alam, sinar kosmik, radioisotop dalam bahan konstruksi
dari counter, bahan kimia radioaktif yang disimpan di dekat meja, dan kontaminasi sampel botol

atau peralatan menghitung. Count Latar belakang counter kilau akan tergantung pada solusi kilau
digunakan. Latar Belakang jumlah yang dihasilkan dari sumber-sumber alam tidak dapat
dihilangkan, namun mereka karena kontaminasi dapat dikurangi jika laboratorium dan instrumen
penghitungan tetap bersih dan bebas dari kontaminasi radioaktif. Karena sulit untuk mengatur
radiasi latar belakang, biasanya diperlukan untuk memantau tingkat. Prosedur khas adalah untuk
menghitung sampel radioaktif dan kemudian menghitung sampel latar belakang yang berisi
sistem kilau yang sama tapi tidak ada radioisotop. Kegiatan yang sebenarnya atau yang benar
diperoleh dengan mengurangi jumlah latar belakang dari hasil sampel radioaktif.
IV. Penghitungan Scintillation Sinar
24

Na dan

131

I keduanya dan emitter, dan sering

digunakan dalam penelitian biokimia. Sinar gamma

yang lebih energik daripada partikel , dan bahan padat
yang diperlukan untuk penyerapan. Sebuah meja
gamma (Gambar 6.8) terdiri dari sampel sumur,
natrium iodida kristal fluor dan tabung photomultiplier.
Sinar energi tinggi tidak diserap oleh larutan kilau
atau botol, tetapi mereka berinteraksi dengan fluor kristal, menghasilkan scintillations. Para
scintillations dideteksi oleh tabung photomultiplier dan elektronik dihitung.

(b) Perhitungan Radioaktifitas Geiger-Muller

Metode lain deteksi radiasi yang memiliki beberapa aplikasi dalam Biokimia adalah
penggunaan kamar ionisasi gas. Perangkat yang paling umum yang menggunakan teknik ini
adalah Geiger-Mller tube (tabung GM). Ketika partikel melewati gas, mereka bertabrakan
dengan atom dan dapat menyebabkan pengusiran elektron dari atom gas. Hal ini menyebabkan
pembentukan pasangan ion terdiri dari elektron bermuatan negatif dan atom bermuatan positif.
Jika ionisasi terjadi antara dua elektroda dibebankan (anoda dan katoda), elektron akan tertarik
ke anoda dan ion positif terhadap katoda. Hal ini menghasilkan arus kecil dalam sistem
elektroda. Jika hanya perbedaan tegangan rendah ada antara anoda dan katoda, pasangan ion
akan bergerak perlahan-lahan dan akan, kemungkinan besar bergabung kembali untuk
membentuk atom netral. Jelas, ini akan mengakibatkan tidak ada pulsa di sirkuit listrik karena

ion individu tidak mencapai elektroda masing-masing. Pada tegangan yang lebih tinggi, partikelpartikel bermuatan sangat dipercepat menuju elektroda dan bertabrakan berkali-kali dengan
serikat atom gas. Hal ini menyebabkan ionisasi luas dan riam atau longsoran ion. Jika tegangan
cukup tinggi (1000 volt untuk sebagian tabung GM), semua ion dikumpulkan pada elektroda.
Sebuah sistem penghitungan Geiger-Mller menggunakan wilayah tegangan ini untuk
percepatan ion dan deteksi. Sebuah khas G-M tabung diwakili dalam Gambar 6.9. Ini terdiri dari
sebuah jendela mika untuk masuknya
partikel dari sumber radiasi, anoda di tengah-tengah tabung, dan permukaan katoda dalam
dinding. Sebuah tegangan tinggi diterapkan antara elektroda. Arus yang dihasilkan dari
pergerakan elektron menuju anoda diperkuat, diukur, dan diubah menjadi hitungan per menit.
Silinder berisi gas inert yang siap ionises (argon, helium, atau neon) ditambah gas pendinginan
(gas Q, biasanya butana) untuk mengurangi ionisasi terus menerus dari gas inert. Partikel beta
energi tinggi yang dipancarkan dari atom seperti 24Na, 32P, dan 40K memiliki sedikit kesulitan
memasuki silinder dengan menembus jendela mika. Partikel dari lemah emitter (terutama 14C
dan 3H) tidak dapat efisien melewati jendela untuk menginduksi ionisasi di dalam ruangan.
Modifikasi tabung GM dengan milar tipis (poliester) jendela, yang disebut tabung jendela aliran
dapat digunakan untuk menghitung lemah emitter .
Sampel disiapkan dalam disc logam yang disebut planchet a. Sampel
cair dibiarkan kering, menyisakan residu radioaktif untuk menghitung
pada piringan metal. Atau, sampel dapat dikumpulkan pada filter membran
dan dimasukkan ke planchet tersebut.
Menghitung GM memiliki beberapa kelemahan dibandingkan dengan
cacahan sintilasi cair. The menghitung efisiensi nof sistem GM tidak
setinggi. Waktu respon untuk GM tabung lebih panjang daripada tabung
photomultiplier, sehingga sampel radioaktivitas tinggi tidak efisien
dihitung dengan tabung GM. Selain itu, persiapan sampel lebih
membosankan dan memakan waktu untuk menghitung GM.
Jika pilihan metode penghitungan yang tersedia, peneliti biasanya
akan memutuskan sintilasi cair kecuali sampel tidak setuju untuk
pengukuran tersebut. Bahan tidak larut atau kehadiran agen pendinginan
yang kuat mungkin akan menunjukkan perlunya penghitungan GM.

Pengamatan umum berikut dapat dilakukan untuk menyimpulkan akun ini dari berbagai
sistem deteksi yang digunakan dalam kromatografi cair.
Karena sensitivitas tinggi, resproducibility, dan kemudahan operasi, detektor UV akan
menjadi pilihan alami untuk berbagai analisis. Untuk zat terlarut menyerap non-UV detektor
indeks bias adalah yang paling mungkin pilihan.

6.3 Kromatografi Fasa-Terbalik

Pemisahan zat yang sedikit larut dalam air tidak dapat berhasil dicapai jika fase hidrofilik
seperti air yang akan digunakan sebagai fase diam dalam kolom, karena zat-zat tersebut akan
bergerak bersama dengan bagian depan pelarut. Dalam pemisahan zat seperti air repellant atau
hidrofobik materi merupakan fase diam, sedangkan fase gerak adalah salah satu yang hidrofilik.
Kromatografi partisi ini cair-cair dikenal sebagai kromatografi partisi fase terbalik, karena
molekul yang paling polar sekarang akan cenderung mengelusi pertama.
Persiapan fase diam untuk kromatografi fase terbalik melibatkan teknik khusus. Dukungan
stasioner seperti gel silika, alumina, teflon atau kieselguhr digunakan untuk tujuan yang pertama
kali diberikan hidrofobik oleh paparan uap chlorosilane. Hal ini diikuti dengan pengobatan dari
dukungan stasioner dengan hidrofobik yang sesuai pelarut. Ini pengobatan dukungan stasioner
mungkin hanya dilakukan dengan cara merendam dalam pelarut hidrofobik pilihan, alternatif,
langkah ini dilakukan menggunakan evaporator vakum rotary yang memberikan lapisan
seragam.
Sebuah keuntungan besar dari kromatografi fase terbalik adalah bahwa manfaat dapat diambil
dari pengetahuan sebelumnya tersedia dari ekstraksi bets (Bab 2) sehubungan dengan (i) pelarut
yang cocok yang dapat dipilih untuk membentuk fase diam dan fase gerak, dan (ii) variasi perlu
dilakukan dalam keasaman atau komposisi fase gerak selama elutions, dalam rangka mencapai \
pemisahan kromatografi rapi. Etil asetat, tributilfosfat (TBP), tributil fosfin oksida (TBPO),
trioctylphosphine oksida (TOPO) dan oksida mesityl adalah contoh fase diam hidrofobik
digunakan dalam kromatografi partisi fase terbalik. Sebagai contoh, baik pemisahan ion logam
Fe (III), Cr (VI), Ge (IV), Mo (VI), V (V), Au (III) dan Hg (II), yang pemisahan tidak mudah
pekerjaan lain, telah dicapai dari campuran multikomponen dengan menggunakan TBP sebagai
fase diam. Demikian pula, dengan menggunakan TOPO sebagai fase diam, bismut dan timah
dapat dipisahkan campuran FRM. Amina berat molekul tinggi seperti trioctylamine (TOA),

triisooctylamine (TIOA) juga dapat digunakan sebagai fase hidrofobik. Jadi adalah mungkin
untuk memisahkan kobalt dari nikel dan besi dari mangan menggunakan TOA sebagai fase
hidrofobik stasioner. Chelating penggalian ligan misalnya dinonyl sulfonat (DNS), semakin
sering digunakan sekarang sebagai fase hidrofobik.
Kromatografi kolom partisi Terbalik-fase dapat digunakan sebagai pengganti perbaikan dari
teknik ekstraksi batch dengan pelarut. Ekstraksi Batch memberikan hasil yang kurang
memuaskan di mana nilai-nilai dari konstanta distribusi yang relevan rendah. Dalam kasus
seperti kromatografi terbalik-fase dapat membuktikan sukses, karena teknik ini menambah
keuntungan dari kromatografi kolom dengan ekstraksi pelarut. Tersirat dalam keunggulan ini
ditambah adalah kontak intim berulang didirikan antara fase hidrofilik mobile dan fase stasioner
hidrofobik karena banyak kesetimbangan dicapai antara dua fase pada sejumlah besar pelat
teoritis dari kromatografi kolom yang bersangkutan. Selain itu, kromatografi kolom fase terbalik
juga akan kurang timeconsuming dari ekstraksi batch dengan pelarut.
6.3

Kromatografi Fasa Kebalikan

Pemisahan zat secara hemat yang larut dalam air tidak dapat diterima sepenuhnya jika

fasa hidrofilik menyukai air yang digunakan sebagai fasa diam dalam klom, semenjak zat
berjalan terus dengan pelarut di depannya. Dalam pemisahan seperti zat yang tidak menyerap air
atau material hidrofobik merupakan fasa diam, sedangkan fasa gerak adalah hidrofilik.
Kromatografi partisi cair-cair yang terkenal adalah kromatografi partisi fasa kebalikan, semenjak
molekul polar cenderung terkenal untuk elute
Persiapan fasa diam untuk kromatografi fasa kebalikan termasuk teknik spesial. Contoh
dari fasa diam adalah silika gel, alumina, teflon atau kieselguhr yang digunakan untuk
menyumbangkan hidrofobik dengan pencahayaan untuk menguapkan klorosilan. Diikuti dengan
perlakuan dukungan fasa diam dengan perkiraan pelarut hidrofobik. Perlakuan ini mendukung
fasa diam agar lebih simpel membawa dengan mencelupkan itu dalam pelarut hidrofobik yang
dipilih; secara alernatif, langkah ini memanfaatkan putaran alat vakum penguap yang
memberikan keseragaman lapisan.
Keuntungan kromatografi fasa kebalikan adalah keuntungannya dapat diambil dari
pengetahuan yang ada sebelumnya dari ekstraksi batch (Bab 2) dengan memperhatikan (i)
pelarut yang sesuai yang dipilih untuk konstituen fasa diam dan fasa gerak, dan (ii) variasi yang
dibutuhkan untuk membuat keasamaan atau komposisi fasa gerak selama rangkaian eluen, dalam

mencapai pemisahan kromatografi secara murni. Etih asetat, tributilfosfat (TBP), tributil fosfain
oksida (TBPO), trioktilfosfain oksida (TOPO) dan mesitil oksida adalah contoh hidrofobik fasa
diam yang digunakan dalam kromatografi partisi fasa kebalikan. Contohnya, pemisahan yang
baik dari ion logam Fe (III), Cr(VI), Ge(IV), Mo(VI), V (V), Au(III), dan Hg(II)yang
pemisahannya tidak mudah, pencapaian dari campuran multi komponen dengan menggunakan
TBP sebagai fasa diam. Dengan cara yang sama, penggunaan TOPO sebagai fasa diam, bismut
dan timan\h dapat dipisahkan dari campuran. Berat molekul amina yang tinggi seperti trioktil
amina (TOA), triisoktilamin (TIOA), dapa digunakan sebagai fasa diam. Jadi kemungkinan
untuk memisahkan kobalt dari nikel dan besi dari mangan menggunakan TOA sebagai fasa diam
hidrofobik. Ekstraksi ligan kelat seperti dinonil sulfonat (DNS), dengan meningkatkan kerja fasa
hidrofobik.
Kromatografi kolom partisi fasa kebalikan dapat digunakan sebagai

penrbaikan

substitusi dari teknik ekstraksi batch dengan pelarut. Ekstraksi batch memberikan hasil yang
tidak memuaskan dimana nilai hubungan yang rendah dengan konstanta distribusi. Dalam
beberapa kasus kromatografi fasa kebalikan terbukti berhasil, karena teknik ini menambah
keuntungan kromatografi kolom dalam ekstraksi pelarut. Pernyataan dalam penambahan
keuntungan adalah pengulangan tetapan secara mendalam antara fasa gerak hidrofilik dan fasa
diam hidrofobik karena bilaangan kesetimbangan tercapai antara kedua fasa dalam jumlah yang
besar dari penggambaaran secara teoritis terkait kromatografi kolom. Apalagi, kromatografi
kolom fasa kebalikan juga lebih cepat dari pada ekstraksi batch dengan pelarut.
6.4

Aplikasi Kromatografi Cair-Cair

Karena variasi fasa diam yang ada, LLC, khususnya berdaya guna tinggi, HPLC (Bab 10)

adalah cara yang paling berguna dalam kromatografi cair, dan variasi yang lebih bermacammacam dalam tipe sampel, antara polar dan non-polar dapat dipisahkan. Pemisahan terjadi pada
dasar kealamian dan jumlah golongan substituen, dan perbedaan berat molekul.
Beberapa kelas senyawa lebih baik dipisahkan dengan fasa LCC normal dan beberapa
dengan LLC fasa kebalikan. Contohnya:
LLC fasa normal anilin, glikol, alkohol, fenol, aromarik, alkaloid, plastisizer, pewarna
pestisida, steroid, dan logam kompleks.
LLC fasa lebalikan alkohol, aromatik, ekspoksi, hidroksi dan ester yang tidak jenuh,
alkaloid, oligomer, antibiotik, steroid dan klorinasi pestisida.

Kromatografi cair-cair adalah teknik pemisahan yang sangat efisien dari pada
kromatografi cair-padat. Pemisahan pada senyawa yang sama (contohnya anggota rangkaian
pencahayaan) yang dibawa lebih efisien dan karena itu lebih disukai oleh LCC. Juga, kerugian
LSC dari penggambaran kolom yang biasanya tidak dapatdiulang untuk digunakan kembali,
semenjak tempat aktivitas dapar teracuni oleh penyerapan yang tidak dapat diubah dari senyawa
aktif yang sangat besar. Sedangkan, cairan tipis LLC tidak berhenti pada bantuan padatan yang
mudah dicuci dan digantikan tanpa pergantian kolom.