Pendahuluan

Analisis sel diperlukan untuk mengetahui berapa jumlah sel yang terdapat
dalam suatu sampel. Jumlah sel atau kerapatan sel dalam suatu sampel perlu
diketahui agar dapat digunakan dalam penentuan perlakuan terhadap sampel,
seperti misalnya konsentrasi nutrisi yang diperlukan.
Salah

satu

metode

analisis

sel

adalah

dengan

menggunakan

spektrofotometri. Spektrofotometri merupakan metode analisis sel tidak langsung

yang menggunakan variabel yang diukur oleh alat spektrofotometer untuk
menentukan konsentrasi sel dalam suatu larutan sampel. Topik analisis sel dengan
metode spektrofotometri ini yang diangkat oleh penulis dalam makalah ini.

1.

Pengertian Analisis Sel dengan Spektrofotometer

Analisis sel dengan spektrofotometer merupakan metode analisis sel yang

didasarkan oleh pengukuran sinar monokromatis oleh suatu larutan berwarna

dengan panjang gelombang tertentu . Spektrofotometer merupakan suatu alat yang
dgunakan untuk mengukur transmitansi dan absorbansi suatu larutan sampel.
Teknik

analisis

spektrofotometer

berdasarkan

atas

interaksi

radiasi

elektromagnetik dengan komponen atom atau molekul yang menghasilkan

fenomena yang dipakai sebagai parameter analisisnya. Dalam melakukan analisis
sel dengan perangkat spektrofotometer, terdapat dua jenis analis yang digunakan,
yaitu Optical Density (OD) dan absorbansi.
Pada metode absorbansi, seberkas sinar diarahkan ke larutan yang
mengandung sel. Setiap spektrofotometer

dikalibrasi secara bebas untuk

memperkirakan konsentrasi mikroba. Korelasi dari absorbsi terhadap berat kering

sangat baik untuk endapan larutan bakteri dan hubungan tersebut tidak bergantung
pada ukuran sel. Akan tetapi jika konsentrasi endapan terlalu tinggi maka korelasi
tersebut (absorpsi terhadap berat kering) tidak berlaku.
Metode analisis spektrofotometer dengan Optical Density (OD) dapat
digunakan untuk mengukur konsentrasi dari bakteri dalam suatu endapan. Ketika
cahaya melewati endapan sel maka cahaya tersebuat akan dihamburkan. Semakin
banyak hamburan yang dihasilkan menunjukkan bahwa jumlah bakteri juga
semakin banyak. Metode OD pada tipe sel tertentu memerlukan panjang
gelombang tertentu pula yang berhubungan dengan fasa yang berbeda dari
pertumbuhan bakteri.

2.

Prinsip Dasar Analisis Spektrofotometri

Setiap unit panjang larutan akan menyerap cahaya yang melewatinya.

Banyaknya cahaya yang diserap atau absorbansi bergantung pada seberapa besar
konsentrasi larutan atau seberapa banyak jumlah zat dalam larutan. Hubungan ini
menjadi dasar metode analisis spektrofotometri. Hubungan dasar ini dapat ditulis
dalam bentuk persamaan Lambert Beer. Persamaan Lambert Beer adalah:

di mana

A adalah absorbansi
Io dan I adalah intensitas
Gambar 2.3. Diagram sederhana spektrofotometri
E adalah absorpivitas molar
l adalah panjang kuvet
c adalah konsentrasi larutan

Metode spektrofotometri ini digunakan untuk menghitung jumlah sel

dalam suatu sampel secara tidak langsung. Instrumen spektrofotometer
memancarkan cahaya monokromatik dengan panjang gelombang tertentu agar
melewati larutan berisi sel dalam wadah transparan (kuvet). Karena sel tidak
bergerak, cahaya yang dapat melewati kuvet berisi sel akan semakin sedikit
dengan semakin besarnya densitas sel. Spektrofotometer digunakan juga
untukmengukur absorbansi cahaya.

Gambar 2.1. Kuvet yang digunakan

Gambar 2.2. Spektrofotometer

dalam spektrofotometri

Untuk mengetahui optical density (kerapatan) sel dalam suatu larutan,

perlu dibuat beberapa larutan standar agar kurva kalibrasi dapat diplot. Larutan
standar adalah larutan-larutan berisi sel yang sudah diketahui kerapatannya.
Larutan-larutan standar ini kemudian diukur absorbansinya terhadap panjang
gelombang tertentu. Selanjutnya, data absorbansi dan kerapatan larutan standar
diplot pada grafik. Kurva yang dihasilkan disebut kurva kalibrasi. Dari kurva
kalibrasi dapat diperoleh persamaan garis. Persamaan garis ini digunakan untuk
menghitung kerapatan larutan asal.
Contoh anlisis menggunakan metode spektrofotometri adalah sebagai
berikut:
1.

Pertama-tama larutan standar perlu disiapkan. Larutan standar disiapkan

dengan pelarutan berseri (serial dilution). Akan diperoleh sejumlah larutan
dengan faktor pelarutan berbeda-beda. Larutan-larutan ini dituang ke
dalam kuvet.

2.

Kemudian, perlu juga disiapkan blanko yang hanya merupakan aquades

dan menuangkannya dalam kuvet.

3.

Selanjutnya, sampel yang tidak diketahui optical density-nya disiapkan

dan dituang ke dalam kuvet.

4.

Instrumen spektrofotometer diatur agar memancarkan cahaya yang

memiliki panjang gelombang dengan absorbansi tertinggi oleh sel yang
dianalisis.

5.

Kuvet berisi blanko ditempatkan ke dalam spektrofotometer untuk menja

di pembanding. Spektrofotometer dikalibrasi menurut absorbansi blanko

6.

Absorbansi larutan-larutan standar dan sampel diukur menggunakan

spektrofotometer

Berikut adalah contoh data yang diperoleh dalam analisis sel

menggunakan spektrofotometer:
Tabel 2.1. Data percobaan spektrofotometri

Dilution Factor

Absorbance

1.00

1.275

0.50

0.665

0.25

0.246

0.125

0.092

0.0625

0.033

Gambar 2.4. Grafik hasil plot data percobaan

5

Dari percobaan dan data yang diperoleh, didapatkan persamaan garis:

y = 1,3541x - 0,0625
Nilai y dapat disubstitusikan dengan nilai absorbansi larutan sampel. Dengan
sedikit kalkulasi dari persamaan di atas, dapat diperoleh nilai faktor pelarutan
sampel. Akhirnya, kerapatan optik sel dalam sampel dapat diperoleh.

3.

Komponen Alat Spektrofotometri

Terdapat beberapa komponen penting dalam alat spektrofotometer.

Beberapa komponen ini yaitu:

1. Sumber cahaya digunakan sebagai sumber cahaya pada spektrofotometer,
haruslah memiliki pancaran radiasi yang stabil dan intensitasnya tinggi.
Sumber energi cahaya yang biasa untuk daerah tampak dan infra merah
dekat dengan panjang gelombang 350-2500nm adalah sebuah lampu pijar
dengan kawat rambut terbuat dari walfram (bungsten). Sedangkan lampu
hidrogen dan lampu deuterium digunakan untuk sumber pada daerah
ultraviolet dan radiasi yang dihasilkan mempunyai panjang gelombang
180-350nm.
2. Monokromator : berfungsi sebagai penyeleksi panjang gelombang yaitu
mengubah cahaya yang berasal dari sumber sinar polikromatis menjadi
cahaya monokromatis.
Komponen-komponen monokromator yaitu :

Celah untuk masuknya radiasi polikromatir dari sumber radiasi

Lensa/ sermin untuk menyerap chaya

Pendispersi cahaya yang berupa prisma atau grating yang dapat

memecah

radiasi

menjadi

komponen-komponen

panjang

gelombang

Lensa/cermin pemfokus chaya atau celah keluar

3. Kuvet adalah kuarsa atau silika untuk radiasi UV dan gelas biasa atau
kuarsa untuk radiasi sinar tampak. Tebal kuvet bervariasi dari 1-10cm.
Kuvet merupakan wadah dari sampel berupa cairan yang telah diatur
takarannya hingga dapat terbaca oleh spektrofotometer. Biasanya sampel
yang digunakan adalah sampel yang digunakan adalah sampel berwarna
yang mudah menyerap sinar yang dipancarkan oelh sumber cahaya.
4. Detektor fungsinya adalah mengabsorpsi foton yang menumbuknya dan
mengubahnya menjadi kuantitas yang dapat diukur seperti arus listrik atau
perubahan suhu. Sebagian besar detektor mengubah energi foton menjadi
sinyal listrik yang segera mengaktifkan meteran / recorder.
Syarat detector :

Sensitivitas tinggi sehingga daya radiasi yang kecil dapat terdeteksi

Waktu respon yang singkat

Stabil

Sinyal elektronik yang dihasilkan mudah diperkuat sehingga

dipakai untuk mengoperasikan alat pembaca hasil pengukuran

Macam-macam detektor yaitu photovoltaic, phototube, diode array,

penguat (amplifier) yang berfungsi untuk memperbesar arus yang
dihasilkan oleh detektor agar dapat dibaca oleh indikator. Indikator
dapat berupa recorder atau komputer.

Gambar 3.1. Komponen instrumen pada spektrofotometer

Jenis-jenis Spektrofotometer
Spektrofotometer dibagi menjadi dua jenis yaitu spektrofotometer single
beam dan spektrofotometer double-beam. Perbedaan kedua jenis spektrofotometer
ini hanya pada pemberian cahaya, dimana pada single-beam, cahaya hanya
melewati satu arah sehingga nilai yang diperoleh hanya nilai absorbansi dari
larutan yang dimasukan. Berbeda dengan single-beam, pada spektrofotometer
double-beam, nilai blanko dapat langsung diukur bersamaan dengan larutan yang
diinginkan dalam satu kali proses yang sama. Suatu spektrofotometer tersusun
dari sumber spektrum tampak yang kontinyu, monokromator, sel pengabsorbsi
untuk larutan sampel atau blanko dan suatu alat untuk mengukur perbedaan
absorbsi antara sampel dan blanko ataupun pembanding.
Single-beam instrument dapat digunakan untuk kuantitatif dengan
mengukur absorbansi pada panjang gelombang tunggal. Single-beam instrument
mempunyai beberapa keuntungan yaitu sederhana, harganya murah, dan
mengurangi biaya yang ada merupakan keuntungan yang nyata. Beberapa
instrumen menghasilkan single-beam instrument untuk pengukuran sinar ultra
violet dan sinar tampak. Panjang gelombang paling rendah adalah 190 sampai 210
nm dan paling tinggi adalah 800 sampai 1000 nm (Skoog, DA, 1996).

Gambar 3.2. Spektrofotometer Single Beam Instrument

Double-beam instrument dibuat untuk digunakan pada panjang gelombang
190 sampai 750 nm. Double-beam instrument dimana mempunyai dua sinar yang
dibentuk oleh potongan cermin yang berbentuk V yang disebut pemecah sinar.
Sinar pertama melewati larutan blangko dan sinar kedua secara serentak melewati
sampel, mencocokkan fotodetektor yang keluar menjelaskan perbandingan yang
ditetapkan secara elektronik dan ditunjukkan oleh alat pembaca (Skoog, DA,
1996).

Gambar 3.3. Spektrofotometer Dual Beam Instrument

4.

Perkembangan Metode Analisis

Perkembangan metode analisis spektrofotometri dimulai pada tahun 1729.

Pada tahun tersebut, Bouger merumuskan hubungan antara absorpsi dari radiasi
monokromatik dan panjang jalan melalui medium yang menyerap. Berkurangnya
tenaga radiasi tiap satuan ketebalan medium penyerap sebanding dengan tenaga
radiasi. Lambert pada tahun 1768 juga merumuskan hal yang sama seperti
Bouger. Setelah itu pada tahun 1814, Fraunhofer menciptakan spektrokop, dan
menemukan 574 garis-garis gelap (garis-garis serapan atom) dalam spektrum
matahari. Spektrofotometri serapan atom adalah perkembangan dari spektroskopi
pancaran nyala. Selanjutnya, pada tahun 1859 Beer merumuskan hubungan antara
konsentrasi jenis zat penyerap dan besarnya absorpsi. Metode ini hanya dapat
digunakan dengan tepat hanya untuk radiasi monokromatik dan sifat macam zat
yang menyerap ditetapkan di atas jangkau konsentrasi yang bersangkutan
Thomas

Engelmann

melakukan

percobaan

spektrum

aksi

untuk

fotosintesis pada tahun 1883. Percobaan ini dilakukan dengan menerangi alga
berfilamen dengan cahaya yang telah dilewatkan dengan prisma, kemudian
memaparkan segmen alga yang berbeda ke panjang gelombang cahaya yang
berbeda.

Setelah

itu,

A.

Walsh

dari

Australia

pada

tahun

1955

memanfaatkan prinsip serapan atom pada bidang analisis. Hingga pada tahun
1960-an teknik serapan atom pun berkembang.
Namun terjadi kesalahpahaman untuk para ilmuwan, peneloti, serta
pabrik-pabrik industri. Mereka menganggap bahwa metode absorpsi atomik
sangatlah tepat dan meninggalkan metode spektroskopi pancaran nyala.
Spektroskopi pancaran nyala memang tidak lagi merupakan suatu sumber eksitasi,
akan tetapi masih dapat diharapkan untuk pengaruh-pengaruh yang berhubungan
dengan penguapan dan disosiasi.

Terdapat 3 metode dalam spektrofotometer, yaitu :

10

a. Metode standar tunggal

Metode ini sangat praktis sebab hanya menggunakan satu larutan standar
yang telah diketahui konsentrasinya. Absorbsi larutan standar dan absorbsi
larutan sampel diukur dengan Spektrometri. Konsentrasi larutan sampel
dapat dihitung, dengan mengukur Absorbansi larutan sampel dan standar.
b. Metode kurva kalibrasi
Membuat larutan dengan berbagai konsentrasi dan absorbansi dari larutan.
Lalu membuat grafik antara konsentrasi

dengan absorbansi tersebut

diukur dengan AAS. Kemudian, absorbansi larutan sampel yang telah

diukur diintrapolasikan ke dalam persamaan garis lurus menggunakan
regresi linear.
c. Metode adisi standar
Kesalahan yang disebabkan oleh perbedaan kondisi lingkungan sampel
dan standar dapat diminimalisir

Selain 3 metode di atas, terdapat metode konvensional. Metode

konvensional yaitu metode yang eksitasinya bergantung pada temperatur apabila
eksitasi dilakukan secara termal. Sumber dari eksitasi termal tidak selalu spesifik.
5.

Contoh-contoh Analisis Sel Oleh Teknik Spektrofotometri

Spektrofotometri UV-Vis adalah metode analisis spektroskopi yang

memakai sumber REM (radiasi elektromagnetik) ultraviolet dekat (190-380 nm)

dan sinar tampak (380-780 nm) dengan menggunakan spektrofotometer. Guna
spektrofotometer UV-Vis adalah untuk menghitung jumlah sel mikroorganisme.
Panjang gelombang untuk sinar ultraviolet antara 200-400 nm sedangkan panjang
gelombang untuk sinar tampak/visible antara 400-750 nm. Spektrofotometri
elektromagnetik monokromatik, yang diserap zat.
Spektrofotometer pada dasarnya terdiri atas serapan panjang adalah
gelombang pengukuran tertentu yang sumber sinar monokromator, tempat sel

11

untuk zat yang diperiksa, detektor, penguat arus dan alat ukur atau
pencatat.Larutan yang berwarna akan menyerap panjang gelombang sinar tertentu.
Setiap larutan akan menyerap panjang gelombang tertentu secara maksimal.
Semakin banyak zat terlarut akan menyerap panjang gelombang tertentu lebih
besar. Dengan demikian perbedaan serapan sinar menunjukkan intensitas zat
terlarut yang diukur. Ada hubungan antara penyerapan sinar atau panjang
gelombang tertentu denan konsentrasi larutan. Besarnya sinar diserap larutan
disebut Optical Density (OD) atau nilai Absorbansi (Suyitno, 2008).
Sebagian sinar yang tidak terserap merupakan sinar yang dilewatkan
(transmit), disebut nilai transmitan (Suyitno, 2008). Biasanya dinyatakan dalam
persen (%) yaitu menggunakan rumus :
T = Is/Io.
Nilai absorbansi merupakan negatif dari log transmitansinya.
OD [A] = - log T

Nilai A (absorbansi) atau Optical density memiliki hubungan linier dengan

konstanta (k), tebal larutan yang dilalui (b) dan konsentrasi (Suyitno,
2008). Hubungan itu dapat dinyatakan dalam persamaan berikut :
A = k. b. c
Pada percobaan ini hanya akan dilakukan kuantifikasi sel menggunakan
spektrofotometer saja, sedangkan hemasitometer tidak dilakukan dalam percobaan
kali ini.
Prinsip kerja dari spektrofotometer adalah apabila ada sebuah berkas
cahaya akan jatuh pada suatu medium homogen, sebagian sinar yang masuk akan
dipantulkan dengan sudut yang berbeda-beda, ada sebagian lagi yang diserap oleh
medium yang dilalui oleh berkas cahaya itu dan sisanya akan diteruskan. Nilai
yang diperoleh adalah nilai tidak diserap maupun yang tidak dipantulkan oleh
medium, dan selanjutnya dinamakan nilai absorbansi atau Optical Density (OD).

12

Hukum Beer menyatakan bahwa absorbansi cahaya pada spektrofotometer

berbanding lurus dengan konsentrasi dan ketebalan bahan atau medium. Dengan
hukum Beer itu dapat disimpulkan bahwa nilai OD yang terukur sebanding
dengan jumlah sel yang ada dalam kultur yang diujikan dalam spektrofotometer.

Contoh Kasus
Pada percobaan kali ini juga dilakukan pendekatan untuk menghitung
jumlah sel

Saccharomyces cerevisiae dengan spektrofotometer pada panjang

gelombang 600 nm. Pada panjang gelombang tersebut, dapat teramati nilai
absorbansi berbeda untuk setiap konsentrasi sampel.
Serial dilution atau pengenceran berseri dilakukan agar didapatkan
konsentrasi berbeda dari sampel , sehingga didapatkan nilai absorbansi berbeda
pula dari analisis menggunakan spektrofotometer. Dengan nilai absorbansi yang
berbeda tersebut, kurva baku dapat dibuat, untuk kemudian dicari persamaan
kurva bakunya. Persamaan kurva baku tersebut selanjutnya dapat dijadikan
sebagai formulasi untuk menentukan konsentrasi bakteri yang tidak diketahui.
Untuk menghitung jumlah sel Saccharomyces cerevisiae digunakan
beberapa jenis metode perhitungan, antara lain :
1. Penghitungan mikroskopis langsung, elektronik sel counter seperti
misalnya Coulter counter,
2. Metode kimiawi untuk mengetahui massa sel atau penyusun seluler
3. Pengukuran turbidimetri untuk peningkatan massa sel
4. Penghitungan total koloni pada cawan yang menggunakan metode
pengenceran seri-agar cawan.

13

Kesimpulan
Analisis sel menggunakan spektrofotometri merupakan bentuk analisis sel
tidak langsung dengan mengandalkan pengukuran absorbansi atau optical density.
Data yang diperoleh diolah menggunakan persamaan Lambert-Beer. Beberapa
komponen penting dalam spektrofotometri adalah sumber cahaya, monokromator,
kuvet, dan detektor. Metode-metode yang digunakan adalah standar tunggal,
kurva kalibrasi, adisi standar, serta metode konvensional. Salah satu aplikasi
metode

analisis

spektrofotometer

dengan

spektrofotometri

adalah

dengan

menggunakan
UV-Vis.

14

Daftar Pustaka
Campbell. 2002. Biologi. Jakarta: Erlangga
Underwood, Day. 1993. Analisa Kimia Kuantitatif,. Jakarta: Erlangga
Harvey. 2000. Modern Analytical Chemistry. USA: The McGraw-Hill
Companies, Inc.

15