LAPORAN PRAKTIKUM INSTRUMEN DAN TEKNOLOGI ANALISIS

ELISA METODE SANDWICH

PEMERIKSAAN KUANTITATIF TNF

Oleh :
Yulia Dwi Setia
NIM 156070100111002

KEMENTERIAN RISET, TEKNOLOGI DAN PENDIDIKAN TINGGI

FAKULTAS KEDOKTERAN UNIVERSITAS BRAWIJAYA

2015

PENDAHULUAN
a. Dasar Teori
Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) adalah suatu teknik biokimia yang
terutama digunakan dalam bidang imunologi untuk mendeteksi kehadiran antibodi atau
antigen dalam suatu sampel. ELISA telah digunakan sebagai alat diagnostik dalam
bidang medis, patologi tumbuhan, dan juga berbagai bidang industri.
Umumnya ELISA dibedakan menjadi dua jenis, yaitu competitive assay yang
menggunakan konjugat antigen enzim atau konjugat antibodi enzim, dan noncompetitive assay yang menggunakan dua antibodi. Pada ELISA non-competitive assay,
antibodi kedua akan dikonjugasikan dengan enzim sebagai indikator. Teknik kedua ini
seringkali disebut sebagai "Sandwich" ELISA.
Tumor Necrosis factor alpha (TNF ) merupakan molekul yang memiliki peran
penting dalam inflamasi, perkembangan sistem imun, apoptosis, dan metabolisme lemak.
TNF juga memiliki peran dalam berbagai macam penyakit seperti asthma, Crohns
disease, rheumatoid arthritis, nyeri neuropatik, obesitas, diabetes tipe 2, syok septic,
autoimunitas dan kanker.
b. Tujuan kegiatan
1. Memahami prinsip kerja teknik ELISA
2. Mampu melakukan pemeriksaan kuantitatif TNF dengan teknik Elisa
3. Mampu membuat grafik dari pengenceran standar dan memperoleh rumus
persamaan perhitungan konsentrasi sampel dengan regresi linier
4. Mampu menentukan kadar TNF pada sample.
c. Pelaksanaan Kegiatan
Praktikum dilaksanakan di Laboratorium Biomedik FKUB pada tanggal 21 September
2015 pukul 09.40 14.30
d. Alat dan Bahan :
a)
Human TNF Immunoassay kit
b)
Vortex
c)
Micropipette
d)
Aquades
e)
ELISA reader
e. Prosedur kerja
a)

Menyiapkan reagen sample dan standart

b)

Menambahkan 50 L Assay Diluent RD1F di masing masing well

c)

Menambahkan 200 L dari Standart dan sample di masing masing well,

inkubasi pada suhu ruangan selama 2 jam

d)

Mencuci dengan menggunakan wash buffer sebanyak 400 L selama 4 kali

pencucian.

e)

Menambahkan 200 L TNF conjugate di masing masing well, tutup dengan

adhesive strip. Inkubasi selama 1 jam pada suhu ruangan.

f)

Mencuci menggunakan wash buffer sebanyak 400 L selama 4 kali

pencucian.

g)

Menambahkan 200 L substrate solution, inkubasi 20 menit pada suhu ruang

dan jauhkan dari cahaya

h)

Menambahkan 50 L stop solution di masing masing well. Warna dari well

harus berubah dari biru ke kuning

i)

Membaca hasil ELISA menggunakan microplate reader pada gelombang 450

nm

j)

Membuat grafik standar, memasukkan absorbansi sample ke rumus kurva

standard dan menentukan kadarnya.

HASIL
a. Hasil pengukuran standar
No
1
2
3
4
5
6
7

Konsentrasi
1000 pg/mL
500 pg/mL
250 pg/mL
125 pg/mL
62,5 pg/mL
31,2 pg/mL
15,6 pg/mL

Absorbansi
1,658
0,982
0,387
0,250
0,182
0,096
0,062

b. Grafik standar menggunakan regresi linier

c.

Nilai absorbansi dan kadar sampel

No
1
2
3
4

Sampel 1
Sampel 1
Sampel 2
Sampel 2

Absorbansi
2,199*
2,125*
1,990*
2,017*

kadar
2149 pg/mL*
2075 pg/mL*
1940 pg/mL*
1967 pg/mL*

Rata rata
2112 pg/mL*

Standar deviasi
52,3259*

1953,5 pg/mL*

19,09*

Keterangan : * absorbansi sampel lebih tinggi dari absorbansi standar yang terbesar

d.

Well di dalam mikroplate yang akan dibaca di ELISA reader

Keterangan : kolom 1 berisi standar, sedangkan kolom 2 berisi sampel. Well A1 tidak
diisi standar karena akan mengacaukan pembacaan. Well A2 dan B2 berisi sampel 1,
sedangkan well C2 dan D2 berisi sampel 2 (duplo)

PEMBAHASAN
Dari tabel hasil pengukuran standar dapat dibuat grafik dimana sumbu x adalah
konsentrasi (pg/ml) dan y adalah nilai absorbansi. Dari grafik standar dapat diketahui
persamaan regresi linier dari standar yaitu y=0,001x + 0,050. Persamaan tersebut akan
digunakan untuk menghitung konsentrasi sampel. Contohnya pada sampel 1 diketahui
bahwa absorbansi sebesar 2,199, maka cara menghitung kadarnya adalah (2,199 0,050) /
0,001 dan didapatkan hasil 2149pg/mL. Pada tabel nilai absorbansi dan kadar sampel
ditunjukkan nilai absorbansi, kadar sampel yang diketahui dari memasukkan persamaan
pada kurva standar, rata rata kadar serta standar deviasi.
Dari hasil pengukuran absorbansi sampel, diketahui bahwa besarnya absorbansi
sampel berada di atas dari nilai absorbansi standar yang tertinggi (ditandai dengan tanda *).
Hal tersebut mengakibatkan absorbansi sampel tidak terletak di dalam grafik standar.
Apabila hal tersebut terjadi, maka diperlukan pengenceran sampel terlebih dahulu agar
absorbansi sampel bisa berada di dalam grafik standar, sehingga bisa dihitung
menggunakan persamaan dari standar.

KESIMPULAN DAN SARAN

a) Kesimpulan
-

prinsip kerja pemeriksaan ELISA pada praktikum ini adalah reaksi antigen-antibodi
dengan teknik kuantitatif baerdasarkan jumlah ikatan antigen-antibodi yang spesifik
yang ditentukan dengan nilai absorbansi

Dari grafik standar diperoleh persamaan regresi linier y=0,001x + 0,050 dengan
R =0,990.
2

Nilai absorbansi dari sampel 1 dan sampel 2 lebih tinggi dari nilai absobansi tertinggi
standar. Hal tersebut menunjukkan bahwa sebelum dilakukan pemeriksaan ELISA
maka sampel perlu diencerkan terlebih dahulu supaya absorbansi sampel terletak di
dalam grafik standar sehingga dapat dihitung kadarnya menggunakan persamaan
regresi linier pada grafik standar.

b) Saran
-

Pemeriksaan dengan metode ELISA memerlukan ketelitian yang tinggi terutama

dalam hal pengenceran standar (proses pemipetan) karena apabila ada kesalahan
pada konsentrasi standar akan berdampak pada perhitungan konsentrasi sampel
selanjutnya

Diperlukan pengenceran sampel terlebih dahulu supaya absorbansi sampel tidak

lebih tinggi dari absorbansi standar yang terbesar