PRODUKSI DAN UJI AKTIVITAS ENZIM -AMILASE

I.

TUJUAN
Mampu memahami prinsip dari proses produksi dan uji aktivitas enzim
Mampu menentukan aktivitas enzim

II.

ALAT DAN BAHAN

A. Alat:
Erlenmeyer
Timbangan
Gelas kimia kaca
Gelas kimia plastik
Spatula
Batang pengaduk
Tabung reaksi + Rak
Jarum ose
Pipet ukur
Mikropipet + Tip
Corong kaca
Hotplate
Penagas air
Sektofometer
Alat sterilisasi

B. Bahan:
Mikroba Endomycopsis
KH2PO4
Ekstak ragi
Glukosa
Pati sagu
Agar
I2
KI
HCL 1 N

 Aquadest
Tissu

III.

DASAR TEORI
Penggunaan mikroba sebagai penghasil enzim memiliki beberapa

keuntungan, yaitu diantaranya biaya produksi relatif murah, dapat diproduksi

dalam waktu singkat sesuai dengan permintaan, mempunyai kecepatan tumbuh
yang tinggi serta mudah dikontrol (Fogarty and Weshoff, 1983). Salah satu cara
yang digunakan untuk menghasilkan enzim adalah dengan fermentasi. Fermentasi
ialah proses baik secara aerob maupun anaerob yang menghasilkan berbagai
produk yang melibatkan aktivitas mikroba atau ekstraknya dengan aktivitas
mikroba terkontrol.

Enzim adalah molekul biopolimer yang tersusun dari serangkaian asam

amino dalam komposisi dan susunan rantai yang teratur dan tetap. Enzim
memegang peranan penting dalam berbagai reaksi di dalam sel. Sebagai protein,
enzim diproduksi dan digunakan oleh sel hidup untuk mengkatalisis reaksi, antara
lain konversi energi dan metabolisme pertahanan sel.
Amilase (alfa, beta, glukoamilase) merupakan enzim yang penting dalam
bidang pangan dan bioteknologi. Amilase mengacu pada sekelompok enzim
katalis yang berfungsi untuk menghidrolisis gula dan pati. Amilase mencerna
karbohidrat (polisakarida) menjadi unit-unit disakarida yang lebih kecil dan
mengubahnya menjadi monosakarida seperti glukosa (Anonim, 2008). Amilase
dapat diperoleh dari

berbagai

sumber seperti tanaman, binatang

dan

mikroorganisme. Enzim pada umumnya diproduksi oleh mikroorganisme melalui

proses fermentasi. Amilase yang berasal dari mikroorganisme banyak digunakan
dalam industri, hal ini dikarenakan mikroorganisme periode pertumbuhanya
pendek. Amilase pertama kali yang diproduksi adalah amilase yang berasal dari
fungi pada tahun 1894 (Oliveira, 2004).
Produksi enzim amilase dapat menggunakan berbagai sumber karbon.
Contoh-contoh sumber karbon yang murah adalah sekam, molase, tepung jagung,
jagung, limbah tapioka dan sebagainya. Jika digunakan limbah sebagai substrat,
maka limbah tadi dapat diperkaya nutrisinya untuk mengoptimalkan produksi
enzim. Sumber karbon yang dapat digunakan sebagai suplemen antara laian: pati,
sukrosa, laktosa, maltosa, dekstyrosa, fruktosa, dan glukosa. Sumber nitrogen
sebagai suplemen antara lain: pepton, tripton, ekstrak daging, ekstrak khamir,
amonium sulfat, tepung kedelai, urea dan natrium nitrat.
Faktor-faktor yang dapat mempengaruhi fungsi enzim diantaranya adalah
(Dwidjoseputro, 1992) :

Suhu
Oleh karena reaksi kimia itu dapat dipengaruhi suhu maka reaksi menggunakan
katalis enzim dapat dipengaruhi oleh suhu. Enzim bekerja pada suhu optimum.
Di samping itu, karena enzim adalah suatu protein maka kenaikan suhu dapat

menyebabkan denaturasi dan bagian aktif enzim akan terganggu sehingga

konsentrasi dan kecepatan enzim berkurang.

Ph
Umumnya enzim efektifitas maksimum pada ph optimum, yang lazimnya
berkisar antara ph 4,5-8.0. Pada ph yang terlalu tinggi atau terlalu rendah
umumnya enzim menjadi non aktif secara irreversible.

Konsentrasi enzim
Seperti pada katalis lain, kecepatan suatu reaksi yang menggunakan enzim
tergantung pada konsentrasi enzim tersebut. Pada suatu konsentrasi substrat
tertentu, kecepatan reaksibertambah dengan bertambahnya konsentrasi enzim.

Konsentrasi substrat
Hasil eksperimen menunjukkan bahwa dengan konsentrasi substrat akan
menaikkan kecepat reaksi. Akan tetapi, pada batas tertentu tidak terjadi
kecepatan reaksi, walaupn konsenrasi substrat diperbesar.

Zat-zat penghambat
Hambatan

atau

inhibisi

suatu

reaksi

akan

berpengaruh

terhadap

penggabungan substrat pada bagian aktif yang mengalami hambatan.

Suatu enzim hanya dapat bekerja spesifik pada suatu substrat untuk suatu
perubahan tertentu. Misalnya, sukrase akan menguraikan rafinosa menjadi
melibiosa dan fruktosa, sedangkan oleh emulsin, rafinosa tersebut akan
terurai menjadi sukrosa dan galaktosa.
Aktivitas amilase dilakukan oleh enzim bakteri dan terlihat berwarna biru
di dalam iodin. Apabila iodin menyebabkan media pati berwarna biru pada koloni
bakteri maka tidak ada amilase yang diproduksi. Molekul maltosa yang kecil
dapat masuk ke dalam sel untuk digunakan sebagai energi. Interaksi iodin dengan
pati membuat media berwarna biru gelap. Menurut Ekunsaumi, produksi enzim
amilase oleh koloni bakteri pada media ditunjukkan adanya zona bening dengan
penambahan larutan iodin di sekitar koloni bakteri (Mahbub, 2008).
Menurut Biogen (2008), secara umum amilase dibedakan menjadi tiga
berdasarkan hasil pemecahan dan letak ikatan yang dipecah, yaitu:

 Enzim alfa-amilase
merupakan endoenzim yang memotong ikatan alfa-1,4 amilosa dan amilopektin
dengan cepat pada larutan pati kental yang telah mengalami gelatinisasi. Proses
ini juga dikenal dengan nama proses likuifikasi pati. Produk akhir yang dihasilkan
dari aktivitasnya adalah dekstrin beserta sejumlah kecil glukosa dan maltosa. Alfaamilase akan menghidrolisis ikatan alfa-1-4 glikosida pada polisakarida dengan
hasil degradasi secara acak di bagian tengah atau bagian dalam molekul.
Enzim beta-amilase
atau disebut juga alfa-l,4-glukanmaltohidrolas E.C. 3.2.1.2. bekerja pada ikatan
alfa-1,4-glikosida dengan menginversi konfigurasi posisi atom C(l) atau C nomor
1 molekul glukosa dari alfa menjadi beta. Enzim ini memutus ikatan amilosa
maupun amilopektin dari luar molekul dan menghasilkan unit-unit maltosa dari
ujung non-pereduksi pada rantai polisakarida. Bila tiba pada ikatan alfa-1,6
glikosida aktivitas enzim ini akan berhenti.
Enzim beta-amilase banyak ditemukan pada tanaman tingkat tinggi, seperti
gandum, ubi, dan kacang kedelai. Disamping itu, beta-amilase juga dapat ditemui
pada beberapa mikroorganisme, antara lain Pseudomonas sp, Bacillus sp,
Streptococcus sp, dan Clostridium thermosulfurigenes.

Glukoamilase
dikenal dengan nama lain alfa-1,4- glukan glukohidro-lase atau EC 3.2.1.3. Enzim
ini menghidrolisis ikatan glukosida alfa-1,4, tetapi hasilnya beta-glukosa yang
mempunyai konfigurasi berlawanan dengan hasil hidrolisis oleh enzim alfaamilase. Selain itu, enzim ini dapat pula menghidrolisis ikatan glikosida alfa-1,6
dan alfa-1,3 tetapi dengan laju yang lebih lambat dibandingkan dengan hidrolisis
ikatan glikosida a-1,4.
Enzim amilase banyak digunakan pada industri makanan. Amilase dapat
digunakan sebagai pengontrol viskositas sirup cokelat dan minuman beralkohol
(brewing). Amilase diproduksi oleh banyak jenis mikrobia, akan tetapi mikrobia

yang sering digunakan dalam skala industri adalah Bacillus subtilis, Bacillus
licheniformis, Bacillus amyloquaifaciens dan Aspergillus niger (Inchem, 2008).

IV.

PROSEDUR KERJA
A. Pembuatan Media Peremajaan Mikroba
Ditimbang KH2PO4 sebanyak 0,1 gram
Ditimbag ekstrak ragi sebanyak 1 gram
Ditimbang glukosa sebanyak 0,5 gram
Ditimbang agar sebanyak 2 gram
Dituangkan seluruh bahan tersebut ke dalam gelas kimia kaca dan
dilarutkan dalam 100 ml aquadest
Dilarutkan seluruh bahan dalam aqudest dengan proses pemasan
hingga mendidih
Dituangkan larutan tersebut ke dalam tabung reaksi
Disterilisasi pada suhu 1210c dalam waktu 15 menit
Dimiringkan media yang telah sterilkan hingga beku dengan baik
B. Pembuatan Media Inokulum
Ditimbang KH2PO4 sebanyak 0,1 gram
Ditimbag ekstrak ragi sebanyak 1 gram

 Ditimbang pati sagu sebanyak 0,5 gram

Dituangkan seluruh bahan tersebut ke dalam gelas kimia kaca dan
dilarutkan dalam 100 ml aquadest
Dilarutkan seluruh bahan dalam aqudest dengan proses pemasan
hingga mendidih
Dituangkan larutan tersebut ke dalam Erlenmeyer
Disterilisasi pada suhu 1210c dalam waktu 15 menit
C. Pembuatan Media Produksi Enzim
Ditimbang KH2PO4 sebanyak 0,1 gram
Ditimbag ekstrak ragi sebanyak 1 gram
Ditimbang pati sagu sebanyak 1-1,5 gram
Dituangkan seluruh bahan tersebut ke dalam gelas kimia kaca dan
dilarutkan dalam 100 ml aquadest
Dilarutkan seluruh bahan dalam aqudest dengan proses pemasan
hingga mendidih
Dituangkan larutan tersebut ke dalam Erlenmeyer
Disterilisasi pada suhu 1210c dalam waktu 15 menit
D. Isolasi Enzim dari Mikroba
Diremajakan mikroba endomycopsis pada media peremajaan mikroba
dengan menggunakan jarum ose dalam ruang Ences
Ditumbuhkan mikroba tersebut pada media peremajaan selama 2-3
hari
Dipindahkan mikroba yang telah tumbuh dalam media peremajaan ke
dalam media inokulum dengan menggunakan jarum ose dalam ruang
Ences
Dishaker media inokulum tersebut selama 2 hari dengan bantuan alat
shaker
Setelah mencapai 2 hari, dipindahkan media inokulum tersebut ke
dalam media produksi enzim sebanyak 10 ml atau 10% dari volume
media produksi enzim
Dishaker kembali media produksi enzim selama 3 hari
Setelah mencapai 3 hari, disaring media produksi tersebut dengan
menggunakan corong kaca dan kertas saring atau kapas ke dalam
Erlenmeyer
E. Uji akivitas enzim

a. Perakuan terhadap sampel

Dipipet 0,25 enzim kasar (hasil penyaringan) ke dalam tabung

reaksi
Ditambahkan 0,25 ml pati larut 1%
Diinkubasi selama 15 menit dalam suhu 500c
Ditambahkan 0,25 ml HCL 1 N
Ditambahkan 0,25 ml KI
Ditambahkan 1 ml aquadest
Dihitung serapannya dengan menggunakan spektofometer pada

=600 nm
b. Perakuan terhadap control
Dipipet 0,25 enzim kasar (hasil penyaringan) ke dalam tabung

reaksi
Ditambahkan 0,25 ml pati larut 1%
Ditambahkan 0,25 ml HCL 1 N
Diinkubasi selama 15 menit dalam suhu 500c
Ditambahkan 0,25 ml KI
Ditambahkan 1 ml aquadest
Dihitung serapannya dengan menggunakan spektofometer pada
=600 nm

V.

DATA PENGAMATAN DAN PERHITUNGAN

A. Data Pengamatan
Serapan sampel (S) = 0,648 abs
Serapan control (K) = 1,395 abs

B. Perhitungan
Penentuan aktivitas enzim
K S
x fp x 10
DP =
K
=

1,3950,648 100
x
x 10
1,395
0,25

= 0,535 x 400 x 10%

= 2140 %
= 21,4 ml-1

VI.

PEMBAHASAN
Enzim merupakan molekul biopolymer yang berperan sebagai katalisator

dalam suatu reaksi. Keberadaan enzim sangat dibutuhkan oleh masyarakat, sesuai
dengan fungsi yang dimiliki yaitu untuk mempercepat terjadinya suatu reaksi
sehingga dapat menghasilkan suatu produk yang diharapkan. Enzim umumnya
hanya dapat diperoleh dalam jumlah yang sedikit, namun memerlukan biaya yang
sangat mahal karena proses produksi dari enzim tersebut yang cukup rumit dan
memerlukan alat dan bahan yang cukup mahal dan sulit diperoleh.
Pada praktikum ini, kami melakukan peremajaan terlabih dahulu pada
mikroba yang diyakini mengandung enzim alfa amylase yaitu mikroba
endomycopsis. Peremajaan yang kami lakukan yaitu menggunakan media agar
miring dengan lama penumbuhan mikroba selama 2-3 hari. Mikroba yang telah
kami remajakan, dipindahkan ke media inokulum dan dishaker selama 2 hari,

setelah itu dipindahkan ke media produksi enzim dan dishaker selama 3 hari. Pada
media produksi enzim memerlukan waktu shaker yang lebih lama dibandingkan
dengan media inokulum disebabkan oleh proses pembentukan enzim yang
memang cukup lama. Selain itu, media produksi enzim juga memerlukan oksigen
yng cukup banyak agar enzim dapat tumbuh dengan baik sehingga penutup media
cukup dengan sumbatan kain kasa.
Penentuan

uji

aktivitas

dari

enzim

dilakukan

dengan

metode

sperktofotometri pada =600 nm. Uji aktivitas dilakukan untuk mengetahui

apakah pada mikroba tersebut memang mengandung enzim alfa amylase atau
tidak, serta dapat mengetahui tingkat aktivitasnya melalui analisa kuantatif. Uji
aktivitas enzim yang kami lakukan hanya secara analisa kuantitatif, namun
sebenarnya secara analisa kualitatif dapat juga dilakukan karena hanya
memerlukan beberapa perlakuan yang cukup mudah. Uji aktivitas ini dilakukan
secara kualitatif karena pada analisa ini kita juga dapat langsung melakukan
anaisa kualitatif melalui pengamatan perbedaan warna sampel dan kontol setelah
berakhirnya proses inkubasi dan ditambahkan beberapa senyawa tertentu.
Hasil yang kami peroleh, pada uji aktivitas enzim cukup besar karena
konsentrasi pati larut dan KI yang digunakan cukup tinggi. Pada praktikum ini,
kami sudah mencoba beberapa kali pengenceran terhadap senyawa pati larut 1%(1
gram pati dalam 100 ml aquadest) dan KI 1%. Namun, kami hanya sempat
melakukan 2 kali pengenceran sehingga larutan kontrol tetap mengasilkan nilai
absorbansi yang tinggi. Melalui hal tersebut perlu diketahui bahwa untuk
mendapat nilai absorbansi yang lebih tepat sebaiknya dilakukan 3 kali
pengenceran pada pati larut dan KI.
Nilai absorbansi pada kontrol akan lebih besar dibandingkan nilai
absorbansi pada sampel karena jumlah molekul-molekul pati yang terurai pada
sampel lebih banyak dibandingkan pada kontrol. Hal ini disebabkan karena pada
larutan sampel enzim terlebih dahulu dapat mengurai pati secara optimum, setelah
itu baru enzim dimatikan aktivitasnya sehingga pati yang terurai akan lebih
banyak dibandingkan dengan larutan kontrol yang aktivitas enzim dimatikan

terlebih dahulu sebelum sempat menguraikan pati. Warna yang terbentuk pada
sampel akan tetap seperti semula (kuning),sedangkan pada kontrol akan berubah
menjadi biru karena adanya reaksi antara pati dan larutan KI.

VII. KESIMPULAN
Prinsip dari isolasi enzim yaitu meremajakan mikroba, lalu mengisolasi
enzim yang terdapat dalam mikroba tersebut dengan menggunkan media
inokulum dan media produksi enzim. Aktivitas dari enzim tersebut dapat
ditentukan dengan analisa kuantitaif menggunakan metode sektofotometri.
Aktivitas enzim yang diperoleh yaitu 21,4 ml-1

DAFTAR PUSTAKA
Jobsheet laboratorium Teknologi Bioproses
http://ptp2007.wordpress.com/2008/05/15/amilase/
http://novyjuli.blogspot.com/2012/02/fishe-aktivitas-enzim-amilase.html
http://teenagers-moslem.blogspot.com/2011/05/uji-aktivitas-enzim-

glukoamilase.html
www.wikipwedia.com