Biosensor Enzim Butiriklonesterase untuk Mendeteksi Residu Pestisida Organofosfat

(Diazinon) dalam Tanaman Kubis (Brassica Olarecea)

Metodologi Penelitian
A. Alat
pH meter Oreon Model 710A/potensiometer, Voltametri siklik, pengaduk magnetik, neraca
analitik, alat-alat gelas yang lazim digunakan di laboratorium, elektroda, pisau pemotong
sayuran kubis.
B. Bahan
Enzim butirilkholinesterase (BChE), substrat butirilkholin klorida, diazon, KOH, H2SO4,
bufer fosfat, selulosa asetat (SA), glutaraldehid (GA), kawat tembaga (Cu), kawat platina
(Pt), kawat timah, tip biru, parafilm, n-heksan p.a, aquades, sayuran kubis.
C. Prosedur
1. Preparasi Sampel
Sampel sayuran yang disemprot pestisida diambil dari kebun pertanian dengan variasi waktu
pengambilan. Variasi yang digunakan adalah 0, 5, 10 dan 15 hari setelah disemprot dengan
pestisida. Pestisida disemprotkan 4 kali dalam seminggu.
2. Ekstraksi Sampel
100 gram sayuran dipotong kecil-kecil, sampel tersebut kemudian dimasukkan ke dalam 250 ml
larutan n-heksan dan didiamkan selama 24 jam. Sampel yang sudah didiamkan selanjutnya
disaring, filtrat yang diperoleh dikumpulkan dan ditambah dengan natrium karbonat untuk
diuapkan sampai volumenya menjadi kurang lebih 50 ml.
3. Pembuatan Larutan Standar
Larutan standar dibuat dari butirilkolin klorida 1,0 x 10 -3 M. Larutan 1,0 x 10-3 M dibuat dengan
mengambil 1,048 gram butirilkolin dan dimasukkan ke labu ukur 50 mL. Kemudian ditambah
pelarut berupa buffer fosfat pH 6,5. Setelah selesai dilakukan pengenceran pada larutan ini
dengan variasi konsentrasi 1,0 x 10 -3 M ; 1,0 x 10-9 M.
4. Preparasi Enzim Butirilkolinesterase (BChE)
24 mg padatan enzim Butirilkolinesterase dilarutkan dalam 6,32 ml buffer fosfat pH 6,5 dan 1 ml
KCl 0,1 M.
5. Preparasi Glutaraldehid (GA) 10 %, 15% dan 20%
Larutan GA 25% disediakan dengan membeli dari Sigma Aldrich. Selanjutnya larutan GA 25%
diencerkan untuk mendapatkan larutan GA 10%; 15% dan 20%.
6. Pembuatan Selulosa Asetat (SA) 5 %, 7,5% dan 10%
Larutan selulosa asetat 5% disiapkan dengan menimbang 0,5 gram selulosa asetat dan dilarutkan
dalam 10 mL aseton, untuk larutan 7,5% ditimbang 0,75 gram dengan volume pelarut yang sama
dan larutan SA 10% disiapkan dengan menimbang 1,0 gram kemudian dilarutkan dengan volume
aseton yang sama.
7. Disain Elektroda Biosensor Kawat Terlapis
Kawat tembaga (Cu) terlapis dengan ukuran 5 cm dan diameter 1,5 mm disambungkan dengan
menggunakan kawat timah pada 2,5 cm kawat platina dengan diameter 0,4 mm dengan cara dan
dimasukkan ke dalam tip biru dengan posisi emas menonjol ke luar 1 cm dari ujung runcing.
Ujung badan elektroda dililit dengan plastik parafin sebagai penahan kawat Cu dan kawat Pt.

Elektroda (Pt) yang telah dibuat dicelupkan bagian ujungnya ke dalam bahan membran dalam
larutan homogen selulosa asetat sampai terbentuk lapisan selulosa asetat. Kemudian, elektroda
dibilas tiga kali dengan aquades. Selanjutnya bagian nomor 6 pada gambar (kawat Pt yang telah
dilapis dengan membran) dicelupkan 6 jam ke dalam larutan glutaraldehid. Setelah membentuk
lapisan, elektroda membran dicelupkan 48 jam dalam buffer fosfat pH 6,5% yang mengandung
enzim butirilkholinesterase. Elektroda membran yang belum digunakan dicelupkan ke dalam
buffer fosfat pH 6,5 pada tempratur 4 oC.
8. Pengukuran Limit Deteksi Pestisida Diazinon dengan Biosensor Voltametrisiklik
Elektroda yang akan digunakan terlebih dahulu dicelup ke dalam larutan buffer fosfat pH 6,5 dan
larutan substrat butirikolin klorida pada konsentrasi 10 -5 M. Kemudian digunakan untuk
mengukur larutan diazinon dari konsentrasi 10 -9 M 10-3 M. Setelah didapat respon yang konstan
dicatat sebagai nilai potensial atau kuat arus. Waktu respon dicatat mulai dari kontaknya
elektroda biosensor dengan larutan yang diukur hingga mencapai potensial yang konstan.
Hasil dan Pembahasan
1. Imobilisasi Enzim Butirilklonesterase (BChE)
Imobilisasi enzim dapat dianggap sebagai metode yang merubah enzim dari bentuk larut
dalam air bergerak menjadi keadaan tidak bergerak. Imobilisasi enzim dilakukan dengan
maksud agar enzim dapat digunakan kembali. Enzim butirilklonesterase (BChE) diimobilisasi
pada permukaan elektroda yang kemudian dilapisi oleh membran. Fungsi dari membran disini
adalah menstabilkan konfigurasi elektroda dan juga mencegah jika terdapat senyawa pengganggu
yang masuk agar tidak bereaksi dengan enzim. Elektroda akan ditempatkan dalam larutan
diazinon yang berfungsi sebagai selanjutnya akan berdifusi melewati membran menuju lapisan
enzim.
Metoda yang digunakan pada proses imobilisasi ini adalah pembentukan ikatan silang atau
crosslinking oleh uap glutaraldehid. Lapisan atau matriks akan terbentuk sehingga enzim yang
ada pada permukaan elektroda tadi akan terjebak. Sensor yang telah dilapisi dengan enzim
diletakkan di atas uap glutaraldehid selama 6 jam sampai permukaannya kering. Biosensor
elektrokimia BChE dengan hasil yang terbaik selanjutnya dikarakterisasi dengan menguji
kualitas biosensor yang meliputi harga Faktor Nernst, kisaran pengukuran dan juga limit deteksi.
2. Faktor Nernst dan Kisaran Pengukuran Menggunakan Voltametrisiklik
Pengukuran respon kuat arus secara voltametri siklik larutan diazinon berbagai konsentrasi
kontak dengan elektroda kerja dilapisi membran SA 10 % GA 10 %, 15 % dan 20 % pada rentang
potensial -700 mV 700 mV dengan scan rate 25 mV/detik menghasilkan voltamogram seperti
gambar di bawah ini. Pada gambar tersebut (a1), (b1) dan (c1) adalah plot kuatarus terhadap
konsentrasi diazinon (a2), (b2) dan (c2) adalah voltamogram siklik diazinon diukur pada
elektroda kerja platina.

Gambar 2. Voltamogram
Voltamogram tersebut menunjukkan adanya satu puncak arus oksidasi pada 0,506 volt;
0,523 volt; 0,506 volt. Reaksi oksidasi dapat diamati pada proses ini dengan adanya arus yang
terukur pada working elektroda. Satu puncak oksidasi juga dapat terlihat pada titik 0,512 volt;
0,506 volt dan 0,543 volt. Hal ini menunjukkan bahwa substrat butirilkolin klorida mengalami
reaksi oksidasi yang tidak dapat balik.
Dari kurva standar di atas garis linear pada -log [Diazinon] rentang konsentrasi 10 -9 10-6
M dan 10-6 10-3 M, diperoleh faktor Nernst ketiga elektroda masing-masing 25,18 A/dekade,
22,49 A/dekade dan 11,63 A/dekade. Pada rentang konsentrasi diazinon 10 -9 10-6 M,
elektroda membran SA 10 % GA 20 % menghasilkan sensivitas yang lebih besar yaitu 25,18
A/dekade dan paling mendekati harga faktor Nernst teoritis (29,6A/dekade). Pada Tabel 1
dapat dilihat bahwa nilai kuat arus (A) pada daerah linier mengalami kenaikan sesuai dengan
bertambahnya konsentrasi diazinon. Berikut adalah Tabel Faktor Nernst dan kisaran biosensor
untuk komposisi membran SA 10% dan GA 10, 15 dan 20% pada 5% substrat.

Limit deteksi ditentukan dengan membuat garis singgung pada fungsi linear yang Nernstian dan
non Nernstian. Titik potong kedua garis diekstrapolasikan ke sumbu x sehingga dapat diperoleh
konsentrasi limit deteksi. Hasil pengukuran limit deteksi pada berbagai komposisi disajikan
dalam Gambar 3.
Nilai limit deteksi diperoleh dari ekstrapolasi terhadap sumbu x terhadap -log [Diazinon],
pengukuran menggunakan voltametri siklik untuk komposisi membran (a) SA 10% GA 10%; (b)
SA 5,0% GA 15% dan SA 5,0% GA 20%. dari masing masing komposisi adalah 2,23 x 10 -6 M;
3,93 x 160 10-6 M dan 1,37 x 10-6 M. Untuk komposisi membran SA 10 GA 20% memiliki batas
deteksi yang paling rendah yaitu 1,37 x 10 -6 M.
3.2.3. Waktu Respon
Kestabilan elektroda enzim butirikholinesterase terlihat dari waktu respon yang lebih singkat.
Makin tinggi konsentrasi diazinon dalam larutan, makin singkat waktu respon elektroda. Tabel 2
dan Gambar 4 memperlihatkan waktu respon masing-masing komposisi membran.

Kurva hubungan antara potensial dan waktu respon, seperti diperlihatkan pada Tabel 2 dan
Gambar 4 tersebut tidak memberikan perbedaan yang signifikan waktu respon yang cukup stabil
dalam waktu cukup lama untuk konsentrasi 10 -9 - 10-6 M. Semakin sensitif suatu biosensor
semakin cepat waktu responnya.
Tabel 2. Waktu respon biosensor-diazinon terhadap pengukuran larutan standar untuk komposisi
membran (selulosa asetat 10 % dan glutaraldehid 10 %; 15 % dan 20 %) konsentrasi substrat 10 -5
M

Waktu respon dipengaruhi oleh beberapa faktor antara lain adanya ion pengganggu dalam larutan
dan melarutnya nahan aktif ke dalam fase air akan memperlambat waktu respon. Pengadukan
akan mempercepat waktu respon, selain itu waktu juga dipengaruhi oleh struktur biosensor
seperti penggunaan komposisi pada tanaman adalah pada komposisi membran SA 10 % dan GA
20%. Untuk kinerja biosensor voltametri siklik adalah limit deteksi 1,37 x 10 -6 M pada
komposisi SA 10 % dan GA 20 % sedangkan waktu respon rata-rata 8-24 detik.