Inokulasi Virus pada Telur Ayam Berembrio

Virus adalah penyebab infeksi terkecil berdiameter 20-300 nm. Genom virus hanya
mengandung satu macam asam nukleat yaitu RNA/DNA. Asam nukleat virus terbungkus dalam
suatu kulit protein yang dapat dikelilingi oleh selaput yang mengandung lemak. Seluruh unit
infektif disebut virion. Virus hanya bereplikasi dalam sel hidup. Replikasinya dapat intranuklear
atau intrasitoplasmik (Jawetz, 1996). Diluar sel hidup partikel virus tidak dapat melakukan
metabolisme, itu merupakan masa transisi dari virus. Fase transmisi diluar sel ini diselingi oleh
fase reproduksi dalam sel, ketika itu virus terdiri atas gen virus aktif yang dengan menggunakan
metabolisme inangnya menghasilkan genom turunan dan protein virus untuk dirakit menjadi
virion baru (Fenner, 1993).
Telur ayam berembrio telah lama merupakan sistem yang telah digunakan secara luas
untuk isolasi. Embrio dan membran pendukungnya menyediakan keragaman tipe sel yang
dibutuhkan untuk kultur berbagai tipe virus yang berbeda. Membran kulit telur yang fibrinous
terdapat di bawah kerabang. Membran membatasi seluruh permukaan dalam telur dan
membentuk rongga udara pada sisi tumpul telur. Membran kulit telur bersama dengan cangkan
telur membantu mempertahankan intregitas mikrobiologi dari telur, sementara terjadinya difusi
gas kedalam dan keluar telur. Distribusi gas di dalam telur dibantu dengan pembentukan CAM
yang sangat vaskuler yang berfungsi sebagai organ respirasi embrio (Purchase, 1989).
Pembentukan membran ini terjadi berdekatan dengan membran telur sepanjang telur.
Selama pembentukan, membran membentuk ruangan yang relatif besar disebut kantong allantois
yang mengandung 5-10 ml cairan allantoic. Embrio secara langsung dikelilingi oleh membran
amnion yang membentuk kantong amnion yang berisi 1-2 ml cairan amnion. Embrio melekat
pada kantong kuning telur yang berlokasi kira-kira ditengah telur dan menyuplai kebutuhan
nutrisi untuk perkembangan embrio (Purchase, 1989). Telur sebaiknya berasal dari kelompok
yang bebas dari patogen spesifik (spesific pathogen free flock) atau jika tidak mungkin dapat
menggunakan telur dari kelompok bebas antibodi ND Virus. Penggunaan telur dari kelompok
antibodi positif akan mengurangi kemampuan virus untuk tumbuh dan berhasilnya isolasi virus
(Purchase, 1989).
Newcastle Disease atau disebut juga penyakit Tetelo, Pseudofowl pest, Pseudovogel pest,
avian distemper, avian pneumoenchephalitis, pseudopoultry plague dan ranikhet disease.
Newcastle Disease (ND) merupakan penyakit viral yang sangat menular pada unggas, bersifat
sistemik yang melibatkan saluran pernafasan dan menyerang berbagai jenis unggas terutama
ayam serta burung-burung liar dengan angka mortalitas yang tinggi 80-100% (Alexander, 1991).
Penyakit ini disebabkan oleh virus Paramixovirus dan memiliki kemiripan gejala dengan
penyakit Avian Influenza dalam memicu pendarahan di bawah kulit dengan indikasi jengger dan
kaki ayam berwarna kebiruan. Kemiripan gejala ini bisa dibedakan dengan cara melakukan
bedah bangkai dan pemeriksaan laboratorium oleh ahli patologi. Gejala klinis pada penyakit
terbagi menjadi tiga bentuk: Mildly Pathogenic (lentogenic), Moderately Pathogenic
(mesogenic), dan Higly Pathogenic (velogenic). Velogenic gejala klinis yang tampak adalah
adanya gangguan pernapasan, diare denganfeses hijau, dan kepala berputar (torticolis) (Haryanto
2006).
Paramyxovirus mempunyai genom virus ssRNA berpolaritas negatif, panjangnya 15-16
kb dan mempuyai kapsid simetris heliks tidak bersegmen, berdiameter 13-18 nm. Genom virus
Newcastle Disease membawa sandi untuk 6 protein virus yaitu protein L, Protein H
(hemaglutinin), protein N (neuraminidase), protein F (fusi), protein NP (nukleokapsid), protein P
(Fosfoprotein), dan protein M (matik). Masa inkubasi penyakit ini bervariasi: antara 2-15 hari
tergantung dari virus yang menginfeksi, umur dan status kekebalan ayam, infeksi dengan
mikroorganisme lain, kondisi lingkungan, dan jalur penularan. Kejadian infeksi oleh virus
Newcastle Disease (ND) terutama terjadi secara inhalasi (Admin, 2008).
Tujuan praktikum inokulasi virus pada telur ayam berembrio adalah memberikan
pemahaman tentang macam-macam inokulasi virus, mengetahui bagaimana cara menginokulasi
virus pada telur ayam berembrio, dan mengetahui ciri-ciri embrio ayam yang terinfeksi virus
Newcastle Disease (ND).
1. Menggunakan embrio ayam dengan umur 10-12 hari.
2. Peneropongan dilakukan pada telur yang digunkan.
3. Batas kantung udara dan letak kepala embrio ditentukan lalu diberi tanda.
4. Alkohol 70% dioleskan lalu suspensi virus diinokulasikan ke dalam ruang alantois (melewati batas kantung
udara) dengan cara jarum dimasukkan inci dengan sudut 45
o
dan diinjeksikan 0,1-0,2 cc virus yang
akan diinokulasikan.
5. Lubang ditutup kembali dengan lilin.
6. Lalu diinkubasi dengan suhu 38
o
-39
o
C selama 2-4 hari.
7. Hari ke-4 diamati embrio tersebut dan dibandingkan dengan telur yang tidak diinokulasikan virus.
Newcastle Disease virus merupakan anggota pertama dari genus Paramyxovirus (PMV) yang
diisolasi dari unggas pada tahun 1926. Virus yang tergolong genus Paramyxovirus dapat
dibedakan dari virus lainnya oleh karena adanya aktifitas neuraminidase yang tidak dimiliki oleh
virus lain pada famili Paramyxoviridae. Virus ND mempunyai aktifitas biologik yaitu
kemampuan untuk mengaglutinasi dan menghemolisis sel darah merah atau fusi dengan sel-sel
tertentu, mempunyai kemampuan neuraminidase dan kemampuan untuk bereplikasi di dalam sel-
sel tertentu (Fenner,1993).
Inokulasi dilakukan pada ruang korio-alantois, dan hasil yang didapatkan jika positif atau
terdapat adanya virus ND adalah embrio pada telur ayam akan menunjukkan gejala adanya
hemoragi pada daerah kepala dan leher serta terlihat kerdil atau kecil embrionya, dibanding
dengan normalnya.Pertama kali yang harus dilakukan adalah telur berembrio yang berumur 911
hari diteliti dengan lampu teropong di kamar gelap untuk mengetahui apakah embrio tersebut
masih hidup atau sudah mati, indikasi bahwa embrio tersebut masih hidup adalah adanya gerakan
embrio di dalam telur (embrio akan menjauhi sinar), dan adanya pembuluh darah. Digunakan
TAB umur 911 hari karena, pada saat itu ruang dan cairan korio-alantoisnya sedang
berkembang sehingga daerahnya menjadi luas, maka inokulasi pada ruang alantois ini akan lebih
mudah dan mengurangi resiko.
Kemudian bagian atas dan rongga hawa embrio diberi tanda pada kulit telurnya. Kedua
tanda ini dilubangi setelah kulit telur didesinfeksi dengan menggunakan alkohol dan iodium
untuk menjaga agar daerah sekitar lubang tetap aseptis. Kemudian inokulasi virus dilakukan
dengan cara memasukkan suspensi virus ke dalam lubang yang berada di atas embrio dengan
menggunakan spuit 1 cc. Penyuntikan dilakukan dengan sudut 45
0
ke arah bagian runcing telur
agar tidak mengenai embrio. Injeksi dilakukan ke dalam cairan corioalantois untuk membuat
daerah aman sehingga lingkungan internal embrio tidak terganggu dan agar virus mudah
menyebar dan melekat pada sel yang mempunyai reseptor yang cocok dengan virus.
Penambahan bahan ke dalam telur akan meningkatkan tekanan di dalam telur yang dapat
mempengaruhi pertumbuhan embrio dan virus, oleh karena itu dibuatlah lubang pada kulit telur
di atas rongga hawa untuk membuat jalan keluar sedikit udara sehingga tekanan dalam telur tetap
konstan saat diinokulasi. Kemudian kedua lubang ditutup dengan menggunakan parafin solidum
atau lilinuntuk mengembalikan kondisi dalam telur yang steril, terhindar dari kontaminasi
lingkungan luar. Inokulasi ini dilakukan di dalam safety cabinet bertujuan untuk mengurangi
kontaminasi. Telur yang telah diinokulasi kemudian dieramkan pada suhu 37
0
C selama 23 hari
untuk kemudian diamati pertumbuhan embrio, perubahan yang terjadi, dan dilakukan panen
virus.
Ayam yang pernah terinfeksi Newcastle Disease (ND) dan tidak mengalami kematian akan
memiliki kekebalan selama 6-12 bulan terhadap ND. Demikian juga dengan kekebalan yang
diperoleh dari vaksinasi. Sifat spesifik virus ND antara lain mempunyai kemampuan untuk
mengaglutinasi dan melisikan eritrosit ayam. Selain eritrosit ayam, virus ND juga mampu
mengaglutinasi eritrosit mamalia dan unggas lain serta reptilia. Virus Newcastle Disease bila
dipanaskan pada suhu 56
o
C akan kehilangan kemampuan untuk mengaglutinasi eritrosit ayam,
karena protein hemaglutininnya rusak. Selain itu juga akan merusak infektivitas dan
imunogenesitas virus (Alexander, 1991).
Gejala Klinis Penyakit Newcastle Disease beragam dalam hal keganasan klinis dan
kemampuan menyebarnya. Sejumlah wabah khususnya pada ayam dewasa, gejala klinis
mungkin ringan. Gejala ringan ini tidak diikuti gangguan syaraf. Virus yang menyebabkan
bentuk penyakit ini disebut lentogenik. Wabah lain, penyakit ini dapat mempunyai angka
mortalitas sampai 25%, seringkali lebih tinggi pada unggas muda; virus yang demikian ini
disebut mesogenik. Tipe mesogenik menimbulkan gangguan pernapasan antara lain sesak nafas,
megap-megap, batuk dan bersin serta penurunan produksi telur dan penurunan daya tetas. Wabah
lainnya lagi terdapat angka kematian yang sangant tinggi kadang-kadang mencapai 100% yang
disebabkan oleh virus velogenik. Infeksi velogenik menyebabkan ayam kehilangan nafsu makan,
diare kehijauan, lesu, sesak nafas, megap-megap ngorok dan bersin. Ayam juga bias mengalami
kelumpuhan pada sebagian atau total. Kemampuan menyibak virus F merupakanan faktor utama
yang mempengaruhi virulensi.hemoragi pada Intestinum Gejala klinis ND dibedakan menjadi 5
patotipe :
1. Bentuk Doyle merupakan bentuk per akut atau akut, menimbulkan kematian pada ayam segala umur
dengan mortalitas 100%. Lesi menciri dengan adanya perdarahan pada saluran pencernaan. Bentuk
ini disebabkan oleh virus strain velogenik. Penyakit ini terjadi secara tiba-tiba, ayam mati tanpa
menunjukkan gejala klinis, ayam kelihatan lesu, respirasi meningkat, jaringan sekitar mata bengkak,
diare dengan feses hijau atau putih dapat bercampur darah, tortikalis, tremor otot, paralisa kaki dan
sayap.
2. Bentuk Beach atau velogenic neitropic Newcastle disease (VVND) bersifat akut, menimbulkan gejala
pernafasan dan syaraf, dan menimbulkan kematian ayam segala umur dengan angka mortalitas 50
% pada ayam dewasa dan 90 % pada ayam muda.
3. Bentuk Baudette, kurang ganas dibandingkan bentuk Beach menyebabkan kematian pada ayam
muda, bentuk ini disebabkan oleh virus galur mesogenik. Pada ayam dewasa ditandai dengan
penurunan produksi telur biasanya terjadi 1-3 minggu.
4. Bentuk Hitchner disebabkan oleh virus ND galur lentogenik, gejala klinisnya bersifat ringan atau tidak
tampak jelas, tidak menimbulkan kematian pada ayam dewasa dan biasanya dipakai sebagai vaksin.
5. Bentuk enteric asimptomatik merupakan bentuk yang tidak menunjukkan gejala klinis dan gambaran
patologis, tetapi ditandai dengan infeksi usus oleh virus-virus galur lentogenik yang tidak
menyebabkan penyakit (Alexander, 1991).
Newcastle disease adalah penyakit yang tersifat kompleks sehingga isolat strain virus
berbeda dapat menimbulkan variasi yang besar dalam derivat keparahan dari penyakit, termasuk
pada spesies unggas yang sama. Patogenesis Ayam yang terinfeksi mempunyai peranan penting
dalam penyebaran penyakit dan sebagai sumber infeksi. Mulanya virus bereplikasi pada epitel
mukosa dari saluran pernafasan bagian atas dan saluran pencernaan; segera setelah infeksi virus
menyebar lewat aliran darah ke ginjal dan sumsum tulang yang menyebabkan viremia skunder,
ini menyebabkan infeksi pada organ seperti paru-paru, usus, dan system syaraf pusat. Kesulitan
bernafas dan sesak nafas timbul akibat penyumbatan pada paru-paru dan kerusakan pada pusat
pernafasan di otak (Alexander, 1991).
Keberhasilan dalam mengisolasi dan mengembangkan virus tergantung pada beberapa kondisi
yaitu : rute inokulasi, umur embrio, temperatur inkubasi, waktu inkubasi setelah inokulasi,
volume dan pengenceran dari inokulum yang digunakan, status imun dari kelompok dimana telur
ayam berada. Sejalan dengan banyaknya sistem untuk isolai virus, dibutuhkan cara untuk
mendeteksi infeksi virus. Bukti tidak langsung dari infeksi virus pada embrio ayam dapat
diketahui dari satu atau lebih kejadian berikut yaitu kematian embrio, pembentukan lesi pada
CAM seperti edema atau perkembang plak, lesi pada embrio seperti kekerdilan, hemoragi
cutaneus, perkembangan otot dan buku yang abnormal, abnormalitas pada organ visceral
termasuk pembesaran hepar dan lien, perubahan warna kehijauan pada kaki, foci nekrotik pada
hepar. Metode yang langsung dan pasti untuk infeksi virus pada embrio ayam meliputi
kemampuan cairan corioallantois dan untuk menyebabkan hemaglutinasi dari RBC ayam,
penggunaan teknik serologis dan molekular, mikroskop elektron. Harus diperhatikan untuk dapat
membedakan lesi yang mungkin disebabkan oleh adanya bakteri dan agen lain (Purchase, 1989).
Macam-macam cara menginokulasikan virus ke embrio ayam yaitu :
1. In Ovo
Metode ini merupakan penanaman virus pada telur ayam yang berembrio. Metode ini dapat
dilakukan dengan berbagai cara antara lain:
Inokulasi pada ruang chorioalantois
Biasanya digunakan embrio ayam dengan umur 10-12 hari. Jarum dimasukkan inci
dengan sudut 45 dan diinjeksikan 0,1-0,2 ml virus yang akan diinokulasikan. Setelah 40-48 jam
cairan telur yang sudah diinkubasi dapat diuji untuk hemaglutinasi dengan membuat lubang kecil
pada kerabang di pinggir dari rongga udara. Dengan alat semprot yang steril dan jarumnya,
diambil 0,1-0,2 ml cairannya. Campur 0,5 cairan telur dengan perbandingan yang sama dari 10%
suspensi dari sel darah yang di cuci bersih dalam plate. Putar plate dan lihat aglutinasi setelah 1
menit. Cairan alantois yang terinfeksi dipanen setelah 1-4 hari inokulasi. Untuk mencegah darah
dalam cairan, embrio disimpan semalam dalam suhu 4C kemudian injeksi kerabang dekat
rongga udara dan buka kerabang tersebut dengan pinset steril. Membran ditekan ke atas yolk sac
dan cairan diambil dengan spuit dan dimasukkan ke dalam cawan petri. Kultur cairan tersebut
untuk menghindari cairan terkontaminasi bakteri (Stephen,1980). Contoh virus yang
diinokulasikan pada ruang chorioalantois ini antara lain, virus ND dan virus influenza.
Inokulasi pada membran chorioalantois
Inokulasi pada embrio umur 10-11 hari adalah yang paling cocok. Telur diletakkan
horizontal di atas tempat telur. Desinfektan kerabang disekitar ruang udara dan daerah lain di
atas embrio telur. Buat lubang pada daerah tersebut dan diperdalam lagi hingga mencari
membran kerabang. Virus diinokulasikan pada membran korioalantois dan lubang ditutup
dengan lilin dan diinkubasi. Setelah 3-6 hari korioalantois membran yang terinfeksi dapat di
panen dengan mengeluarkan yolk sac dan embrio secara hati-hati tanpa membuat membran lepas
dari kerabang. Area inokulasi dapat di lihat dengan adanya lesi pada CAM sebelum dilepas dari
kerabang (Stephen, 1980).
Inokulasi pada yolk sac
Inokulasi dilakukan pada embrio umur 5-7 hari. Post inokulasi diinkubasi selama 3-10
hari. Virus diinokulasikan pada bagian yolk sack dan dijaga jangan sampai terkontaminasi
bakteri (Stephen, 1980). Virus yang biasa diinokulasikan di bagian ini adalah virus rabies.
2. In Vitro
Inokulasi virus dengan metode ini dilakukan dengan menanam virus pada kultur jaringan.
Kultur jaringan virus dimulai dengan kultivasi embrio anak ayam cincang didalam serum atau
larutan-larutan garam. Ini menuntun ke arah penggunaan kultur jaringan murni sel-sel hewan
yang dapat ditumbuhi virus. Kini sel hewan dapat ditumbuhkan dengan cara yang serupa seperti
yang digunakan untuk sel bakteri. Bila sel-sel hewan dikulturkan di wadah-wadah plastik atau
kaca, maka sel-sel tersebut akan melekatkan dirinya pada permukan wadah itu dan terus-menerus
membelah diri sampai seluruh daerah permukaan yang tertutupi medium terisi. Terbentuklah
suatu lapisan tunggal sel dan dipergunakan untuk mengembangkan virus. Sel-sel jaringan yang
berbeda-beda lebih efektif untuk kultivasi beberapa virus ketimbang yang lain. Pendekatan ini
telah memungkinkan kultivasi banyak virus sebagai biakan murni dalam jumlah besar untuk
penelitian dan untuk produksi vaksin secara komersial. Juga luas penggunaannya untuk isolasi
dan perbanyakan virus dari bahan klinis. Vaksin yang disiapkan dari kultur jaringan mempunyai
keuntungan dibandingkan dengan yang disiapkan dari telur ayam berembrio dalam hal
mengurangi kemungkinan seorang pasien untuk mengembangkan hipersensitivitas atau alergi
terhadap albumin telur (Merchant and Packer, 1956).
3. In Vivo
Virus dapat ditanam pada hewan laboratorium yang peka. Metode ini merupakan metode
yang pertama kali dalam menanam virus. Metode ini dapat digunakan untuk membedakan virus
yang dapat menimbulkan lesi yang hampir mirip misalnya FMDP atau Vesikular Stomatitis pada
sapi. Hewan laboratorium yang digunakan antara lain mencit, tikus putih, kelinci ataupun
marmut (Merchant and Packer, 1956)