LAPORAN PRAKTIKUM

TUGAS 7
FRAKSINASI DENGAN KROMATOGRAFI KOLOM

Disusun Oleh Kelompok 8

Dewi Novarina
Rizki Ilham Pratama
Dewi Sukmalini
Wulan Megasari
Nafiqotut Thoyyibah Kholil
Jihan Nur Chairini

201310410311042
201310410311192
201310410311286
201310410311287
201310410311292
201310410311294

PROGRAM STUDI FARMASI

FAKULTAS ILMU KESEHATAN
UNIVERSITAS MUHAMMADIYAH MALANG
2016

1. TUJUAN UMUM
Mahasiswa mampu melakukan fraksinasi suatu ekstrak menggunakan kromatografi
kolom.
2. PRINSIP TEORI
A. Tanaman (Psidium guajava)
Klasifikasi
Kingdom
: Plantae
Subkingdom : Tracheobionta
Super divisi : Spermtophyta
Divisi
: Magnoliophyta
Kelas
: Magnoliopsida
Subkelas
: Rosidae
Ordo
: Myrtales
Familia
: Myrtaceae
Genus
: Psidium
Spesies
: Psidium guajava L.
Nama Daerah : Jambu biji, Jambu klutuk
Simplisia
: Tanin 9-12%, minyak atsiri, minyak lemak, asam malat
Penggunaan : Antidiare
Kandungan
Mengandung Tanin 9-12%, minyak atsiri, minyak lemak, asam malat
(Materia Medica Jilid IV)
Jambu biji memiliki nama lain Psidium guajava L. adalah salah satu contoh
tanaman yang sering kita jumpai dialam sekitar kita seperti pekarangan rumah,
sekolah, atau pinggir jalan. Tanaman atau tumbuhan biji ini memiliki rasa yang enak
dan memiliki khasiat yang sangat banyak.
Khasiat atau manfaat dari daun jambu biji dikenal sebagai bahan tradisional
untuk batuk dan diare. Jus jambu biji juga di anggap berkhasiat untuk membantu
penyembuhan penderita demam berdarah dengue. Daun jambu biji sudah dikenal sejak
dahulu sebagai pencegah dan mengurangi diare. Selain iru, manfaat dan khasiat jambu
biji lainnya untuk kesehatan adalah mencegah terjadinya anemia pada ibu hamil, obat
diabetes mellitus, membantu melindungi selaput lendir usus, menjaga kesehatan
sistem pencernaan, mengobati diare, mencegah kanker, menurunkan hipertensi,
mengobati batuk dan flu, mencegah sembelit, diet, dan antioksidan.
Menurut Taiz dan Zeiger (2002) secara fitokimia, Pada Daun Jambu Biji
(Psidium guajava) mengandung senyawa metabolit sekunder yang dihasilkan
tumbuhan merupakan bagian dari sistem pertahanan diri. Senyawa tersebut berperan
sebagai pelindung dari serangan infeksi mikroba patogen dan mencegah pemakanan
oleh herbivora.
Menurut Direkbusarakom (1997) et al. dalam Sipahutar (2000) Tanaman jambu biji
banyak digunakan sebagai obat. Tanaman tersebut bersifat anti diare, anti radang
(inflamasi), dan menghentikan pendarahan (hemostatik). Daun segarnya dapat

digunakan untuk pengobatan luar pada luka akibat kecelakaan, pendarahan akibat
benda tajam, dan borok (ulcus) di sekitar tulang.
B. Kromatografi Kolom
Kromatografi kolom merupakan suatu metode pemisahan preparatif. Metode
ini memungkinkan untuk melakukan pemisahan suatu sampel yang berupa campuran
dengan berat beberapa gram. Pada prinsipnya kromatografi kolom adalah suatu teknik
pemisahan yang didasarkan pada peristiwa adsorpsi. Sampel yang biasanya berupa
larutan pekat diletakkan pada ujung atas kolom. Komponen tunggal yang ada pada
sampel dijerap oleh fase diam yang telah dibentuk atau biasa digunakan silica gel yang
terdapat pada kolom, namun apabila dialirkan pelarut secara kontinyu maka akan
terjadi migrasi senyawa dan senyawa tersebut terbawa oleh pelarut sesuai dengan
polaritasnya. Kecepatan eluasi sebaiknya dibuat konstan. Jika kecepatan eluasi terlalu
kecil maka senyawa-senyawa akan terdifusi ke dalam eluen dan akan menyebabkan
pita makin melebar yang akibatnya pemisahan tidak dapat berlangsung dengan
baik.Dan apabila kecepatan eluasi terlalu besar maka pemisahan kurang baik dan tidak
berdasarkan tingkat polaritasnya sehingga akan diperoleh fraksi yang sama dan
menyebabkan fase diam cepat menjadi kering dan dikhawatirkan terjadi cracking.
Permukaan adsorben harus benar-benar horizontal, hal ini dilakukan untuk
menghindari terjadinya cacat yang dapat terjadi selama proses eluasi berjalan.
Prinsip pemisahan kromatografi yaitu adanya distribusi komponen-komponen
dalam fase diam dan fase gerak berdasarkan perbedaan sifat fisik komponen yang
akan dipisahkan. Kromatografi kolom adalah kromatografi yang menggunakan kolom
sebagai alat untuk memisahkan komponen-komponen dalam campuran. Alatnya dapat
berupa pipa gelas yang dilengkapi kran dibagian bawah kolom untuk mengendalikan
aliran zat cair. Ukuran kolomnya tergantung dari banyaknya zat yang akan
dipindahkan. Meskipun tersedia berbagai macam kolom gelas namun kadang-kadang
buret juga dapat digunakan.
Metode pemisahan kromatografi kolom memerlukan bahan kimia yang cukup
banyak sebagai fasa diam dan fasa gerak, bergantung pada ukuran dari kolom gelas.
Untuk melakukan pemisahan campuran dengan metode kromatografi kolom
diperlukan waktu yang relative lebih lama, bisa berjam-jam hanya untuk memisahkan
satu campuran. Masalah waktu yang lama disebabkan laju alir fasa gerak hanya
dipengaruhi oleh gravitasi bumi. Ukuran diameter dari partikel yang cukup besar
membuat luas permukaan fasa diam relative kecil sehingga tempat untuk berinteraksi
antara komponen komponen dengan fasa diam menjadi terbatas. Apabila ukuran
diameter partikelnya diperkecil supaya luas permukaan fasa diam bertambah maka
akan menyebabkan semakin lambatnya aliran fasa gerak atau fasa gerak tidak
mengalir sama sekali. Selain itu fasa diam yang sudah terpakai tidak dapat digunakan
lagi untuk pemisahan campuran yang lain karena sukar meregenerasi fasa diam.
Alat kromatografi kolom yang sederhana terdiri dari kolom dan kaca yang ada
krannya atau bisa menggunakan buret. Fasa diam berupa adsorben yang tidak larut
dalam fase gerak ukuran partikel fasa diam yaitu silica gel harus seragam. Adanya
2

pengotor dalam fasa diam dapat menyebabkan adsorbansi tidak reversible. Dan juga
disiapkan Erlenmeyer yang berfungsi sebagai penampung eluen.

C. Jenis-Jenis lempeng KLT

Fasa diam dapat digunakan silika gel, alumina dan serbuk selulosa.
Partikel silika gel mengandung gugus hidroksil pada permukaannya yang akan
membentuk ikatan hidrogen dengan molekul polar air. Pada kromatografi lapis tipis,
sebuah garis digambarkan dibagian atas dan bawah lempengan dan setetes pelarut dari
campuran pewarna di tempatkan pada garis yang telah ditentukan. Diberikan
penandaan pada garis dilempengan untuk menunjukkan posisi awal dari tetesan. Jika
dilakukan dengan tinta, pewarna dari tinta akan bergerak selayaknya kromatogram di
bentuk (Roy J. 1991).
Alumina (Al2O3) dan silika gel (SiO 2). Alumina lebih polar daripada
silika gel, dan senyawa ini sering dinyatakan lebih aktif daripada silika gel.
Alumina lebih cocok untuk analisis senyawa-senyawa yang nonpolar atau kurang
polar (seperti hidrokarbon, eter, aldehida, keton, dan alkil halida) karena senyawasenyawa polar sangat kuat teradsorbsi pada adsorbent ini. Analisis KLT
senyawa-senyawa polar pada alumina umumnya menghasilkan harga Rf yang
rendah dan pemisahan yang minimal. Sebaliknya silika gel dipilih sebagai adsorbent
untuk senyawa-senyawa polar (asam karbokislat, alkohol, amina) karena senyawasenyawa non polar teradsorbsi lemah pada silika gel. Analisis KLT senyawa-senyawa
nonpolar pada silika gel umumnya memberikan harga Rf yang tinggi dan pemisahan
yang maksimal (Firdaus. 2011).
D. Polaritas Eluen
3

n-heksana

= 2.0

Heksana adalah sebuah senyawahidrokarbonalkana dengan rumus kimia C6H14

(isomer utama n-heksana memiliki rumus CH3(CH2)4CH3).Awalan heks- merujuk
pada enam karbon atom yang terdapat pada heksana dan akhiran -ana berasal
dari alkana, yang merujuk pada ikatan tunggal yang menghubungkan atom-atom
karbon tersebut.Senyawa ini beruwujud cairan tak berwarna. Massa Molar 86.18 g
mol1 .Densitas 0.6548 g/mL

etil asetat = 6.0

Senyawa

organik dengan

rumus

merupakan ester dari etanol dan asam

CH3CH2OC(O)CH3.
asetat.Senyawa

ini

Senyawa

ini

berwujud cairan tak

berwarna, memiliki aroma khas. Senyawa ini sering disingkat EtOAc, dengan Et
mewakili gugus etil dan OAc mewakili asetat. Etil asetat diproduksi dalam skala besar
sebagai pelarut, memiliki Mass Molar 88,12 g/mol. Memiliki densitas 0,897 g/cm3
dan titil lebur -83,60C serta titik didih 77,10C (Anonim,2012).

methanol = 30.0

Senyawa organic dengna rumus molekul CH3OH. Metaol berwujud cairan yang
ringan, mudah menguap, tidak berwarna, mudah terbakar, dan beracun dengan bau
yang khas (berbau lebih ringan daripada etanol).Dengan Massa Molar 32.04 g/mol.
Densitas 0.7918 g/cm. Titik lebur 97 C, -142.9 F (176 K).Titik didih 64.7 C,
148.4 F (337.8 K).
semakin tinggi nilai konstanta dielektrik suatu pelarut, maka semakin polar senyawa
pelarut tersebut.
3. BAHAN DAN ALAT
Alat
1. Batang pengaduk

2. Chamber
4

3. Gelas ukur
4. Kolom kaca
5. Lampu UV 254 nm dan 365 nm
6. Lempeng KLT
7. Penggaris
8. Pensil 2B
9. Pinset
10. Pipa kapiler
11. Vial
12. Pipet
4. PERHITUNGAN
13. Alumunium foil

14. Label
15. Tissue
16. Erlenmeyer
Bahan
1.
2.
3.
4.

Ekstrak
Silica gel
n-Heksan:etil asetat (3:2)
n-Heksan:etil asetat (4:1)

a. Preparasi silica gel

Silica gel : 50 gram
b. Preparasi ekstrak
1 % dari silica gel : 5 gram
c. Pembuatan eluen (kromatografi kolom)
1. Pembuatan eluen 1 (fase gerak) n-heksan-etil asetat (4:1) sebanyak 300 ml
- n-heksan : 4/5x300 ml=240 ml
- etil asetat : 1/5x300 ml = 60 ml
2. pembuatan eluen 2 (fase gerak) n-heksan-etil asetat (3:2) sebanyak 300 ml
- n-heksan : 3/5x300 ml=180 ml
- etil asetat : 2/5x300 ml = 120 ml
d. pembuatan eluen (kromatografi lapis tipis)
1. pembuatan pelarut n-heksan : etil asetat (4:1) sebanyak 10 ml
- n-heksan : 4/5x10 ml=8 ml
- etil asetat : 1/5x10 ml = 2 ml
2. pembuatan pelarut n-heksan : etil asetat (3:2) sebanyak 20 ml
- n-heksan : 3/5x20 ml=12 ml
- etil asetat : 2/5x20 ml = 8 ml
3. pembuatan pelarut n-heksan : etil asetat (4:1) sebanyak 20 ml
- n-heksan : 4/5x20 ml=16 ml
- etil asetat : 1/5x20 ml = 4 ml

5. PROSEDUR KERJA
1. PEMBUATAN KOLOM
1.
Larutkan 50g silica gel G60 dalam eluen H : EA 4 : 1
2.
Masukkan larutan silica gel tersebut sedikit demi sedikit ke dalam kolom
secara kontinyu, jangan sampai terjadi pemberhentian terlalu lama yang
menyebabkan pecahnya atau rusaknya pembentukan silica pada kolom akibat
adanya udara yang terjebak diantara silica tersebut.
3. Jika telah terbentuk fase diam silica yang baik maka eluen dialirkan kurang lebih
10 menit, hingga eluen mencapai posisi 1 cm diatas permukaan silica.
4. Hasil eluen yang ditampung tersebut ditampung dalam enlemeyer
2. PEMBUATAN EKSTRAK DAN PENAMPUNGAN
1. Larutkan 10% ekstrak dari jumlah silica gel di kolom, larutkan dengan sedikit
etanol, kemudian biarkan etanol menguap dan tambahkan silica gel sama banyak
dengan jumlah ekstraknya. Aduk ad homogen dan kering.
2. Masukkan ekstrak kering tersebut ke dalam kolom dan tambahkan eluen seperti
semula dengan kran kolom tetap dibuka agar eluen keluar dan mengalir. Hentikan
pengeluaran eluen / eluasi tersebut bila cairan dibagian atas telah menjadi bening.

3. Setelah itu tambahkan eluen dengan volume cukup, tampung tetesan eluen
tersebut dalam vial dengan volume 5 mL dengan kecepatan 1 tetes/2 detik
4. Tampung eluen yang mengandung ekstrak tersebut hingga kurang lebih 20 vial.
5. Kemudian ganti dengan eluen H:EA 3 : 2 dan dan tampug eluen tersebut hingga
kurang lebih 80 vial.
3. ANALISA PADA KLT
1. Larutkan sampel dalam vial yang akan diuji, bila eluen telah menguap maka
larutkan dengan sedikit eluen yang telah ditampung dalam enlemeyer.
2. Kemudian uji sampel tersebut pada vial fraksi 1, 2, 3, 4, 5, 6, dan 7.
3. Amati noda yang mempunyai penampakan yang sama secara visual maupun
secara UV 254
4. Gabungkan fraksi yang sama dalam satu vial
5. Analisa masing-masing fraksi pada plat KLT. Kemudian hitung harga Rf yang
terbentuk.

6. HASIL PRAKTIKUM
NO
1.

2.

GAMBAR

KETERANGAN
Kelompoan praktikum kami melanjutkan
kegiatan kelompok sebelumnya dan ini
kolom yang sudah siap di gunakan

Kami melanjutkan dengan menggunak

eluen n-heksan: etil asetat (4:1)

3.

Penampungan sampel di mulai dengan

keterangan vial no 81 karena melanjutkan
kelompok sebelumnya
Vial 81-96

4.

Di lanjutkan dengan penambahan eluen

n-heksan: etil asetat (3:2)

5.

Penampungan sampel dengan urutan vial

no 97-138

6.

Dilakukan penotolan pada plat KLT untuk

vial no 81,90,100,110,120,130

7.

Dilakukan eluasi menggunakan eluen

n-heksan: etil asetat (4:1)

8.

Diamati warna pada UV 365 pada setiap

spot noda jika ada yang bebeda perlu di

lakukan penotolan kembali diantara nya.
9.

NO
10.

11

12

Dilakukan berlulang ulang hingga di

dapat fraksi yang tepat
GAMBAR

KETERANGAN

7. PEMBAHASAN
Fraksinasi merupakan suatu prosedur yang digunakan untuk memisahkan
golongan utama kandungan yang satu dari kandungan golongan utama lainnya.
Fraksinasi merupakan prosedur pemisahan komponen-komponen berdasarkan
perbedaan kepolaran tergantung dari jenis senyawa kepolaran yang terkandung dalam
tumbuhan. Kromatografi kolom adalah salah satu metode yang digunakan untuk
pemurnian campuran dengan menggunakan kolom. Saat melakukan percobaan
kromatografi perlu dipastikan kondisi dari eluennya. Pada pemisahan menggunakan
kromatografi kolom, campuran yang akan dipisahkan diletakkan di bagian atas kolom
yang terlebih dahulu dibuat pelarut fase gerak dibiarkan (didiamkan) melewati kolom.
Pita senyawa larut bergerak melalui kolom dengan laju berbeda, memisah dan
dikumpulkan berupa fraksi-fraksi ketika keluar dari kolom (sidjadi,1986).
Pada praktikum ini dilakukan fraksinasi dengan kromatografi kolom yang mulamula silica gel dimasukkan kedalam erlemeyer dan ditambahkan eluen diatas
permukaan silica gel tersebut (silica gel dimasukkan sedikit demi sedikit ke dalam
elemeyer baru ditambahkan eluen secukupnya). Campuran dikocok perlahan dan
dimasukkan hati-hati ke dalam kromortografi kolom yang bagian bawah telah diberi
glass wol. Penuangan camuran silica gel dan eluen ke dalam kolom kromatografi tidak
boleh terlalu cepat atau terlalu lambat, tetapi sebaiknya konstan (tetap). Karena jika
ada udara yang terperangkap dalam kolom dapat menyebabkan kolom tersebut retak
atau pecah. Setelah semua silica gel telah masuk ke dalam kolom kromatografi maka
dilakukan penambahan eluen dengan kran bagian bawah dibuka selama 10 menit.
Menambahkan ekstrak Psidium guajava pada kolom kromatografi sebanyak 1% dari
sejumlah silica gel yaitu.Selama proses pemisahan dengan kromatografi kolom

berlangsung eluen harus tetap ditambahkan dan dijaga agar selalu berada di atas
permukaan sampel ekstrak, maka, kemungkinan terperangkap udara dalam kolom
menjadi semakin besar. Akibatnya, kolom menjadi retak. Silica gel berfungsi sebagai
fase diam sedangkan eluen n-heksan-etilasetat (4:1) dan n-heksan-etilasetat
(3:2)berfungsi sebagai fase gerak. Golongan senyawa yang lebih mudah terikat pada
fase gerak akan keluar lebih dahulu dari kolom kromatografi. Sebaliknya golongan
senyawa yang lebih mudah terikat pada fase diam akan keluar pada saat-saat terakhir.
Pada praktikum ini, kelompok kami melakukan penampungan sebanyak 80 vial
dengan kapasitas masing-masing vial 5 ml. Kelompok kami melanjutkan dari
kelompok sebelumnya pada penampungan vial nomor 81-96 setelah itu kami
mengganti dengan eluen n-heksan-etilasetat (3:2) yang sebelumnya menggunakan nheksan-etilasetat (4:1). Kemudian vial nomor 81, nomor 90, nomor 100, nomor 110,
nomor 120, nomor 130, nomor 140, nomor 150, nomor 160. Ditotolkan pada plat KLT
setelah dilarutkan dengan pelarut yang sesuai eluen yang digunakan pada saat
pemisahan dengan kromatografi kolom. Kemudian dieluasinya dengan cara melihat
warna atau Rf yang sama pada noda.Hal tersebut menunjukkan fraksi yang sama. Dan
sebaliknya apabila didapatkan atau Rf yang berbeda pada noda menunjukkan fraksi
yang berbeda. Sehingga dilakuan pengujian kembali menggunakan KLT pada nomor
vial antaranya : pada praktikum dilakukan pengujian menggunakan KLT sebanyak 5
kali yaitu : (1) Vial nomor 81, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160. (2) Vial nomor
86,105, 115, 125, 129, 145, 149. (3) Vial nomor 89, 103, 113, 123, 143. (4) Vial nomor
102, 112, 122, 142,. (5) Vial nomor 101, 111, 121, 141. Kemudian dieluasi dengan nheksan-etilasetat (4:1) didapatakan 7 fraksi dengan menggunakan vial nomor 81-89
(F1), 90-101 (F2), 102-110 (F3), 111-120 (F4), 121-140 (F5), 141-149 (F6), 150-160
(F7).
Setelah mendapatkan 7 fraksi dilakukan uji menggunakan kromatografi lapis tipis
dengan fase diam silica gel dan fase gerak n-heksan-etilasetat (4:1). Tujuh fraksi
tersebut ditotolkan pada plat KLT dan kemudian dieluasi, stetlah itu dilihat dibawah
sinar UV 254 dan 365 pada setiap raksi didapatkan 3 noda dimana noda satu dimiliki
ke-7 fraksi dengan harga Rf : 1,5 cm/8 cm = 0,1875 dan noda dua terdapat pada ke-7
dengan harga Rf : 1,0 cm/8 cm = 0,125 dan noda nomor tiga dimiliki oleh fraksi nomo
r 5, 6, 7 dengan harga Rf : 0,5 cm/8 cm = 0,062.
8. KESIMPULAN
Berdasarkan hasil praktikum dan pembahasan yang dilakukan maka dapat ditarik
kesimpulan sebagai berikut :

Fraksinasi adalah pemisahan suatu golongan senyawa dalam suatu simplisia menjadi
senyawa yang lebih sederhana.

Hasil praktikum fraksinasi secara kromatografi kolom dari ekstrak tanaman Psidium
guajava dengan eluen n-heksan : etil astetat dengan perbandingan 4:1 dan 3 : 2
didapatkan 7 fraksi.

 pada semua fraksi memiliki dua senyawa yang sama dengan ditunjukkayan adanya
warna noda yang sama dan nilai Rf yang sama
pada fraksi 5, 6, 7 memiliki satu senyawa yang sama dengan ditunjukkan adanya
warna noda yang sama berwarna hijau keabuan dan nilai Rf yang sama.
9. DAFTAR PUSTAKA
Anonim. 1998.
Indonesia

Materia Medika Indonesia. Jakarta: Departemen Kesehatan Republik

Day dan Underwood. 1992. Quantitative Analisis. Erlangga. Jakarta.

Harborne. J. B. 1996. Metode Fitokimia Terbitan Kedua. Bandung : ITB Bandung, Jawa
Barat
Khopkar, S.M. 2010. Konsep Dasar Kimia Analitik. Jakarta: Penerbit Universitas Indonesia.
Raymond G. Reid and Satyajit D. Sarker, 2006. Isolation of natural Product by Low-Pressure
Collum Chromatografi in Sharker SD., Latif,Z and Gray , Al (ED). Natural Product
Isolation Humana Press.Inc. Totowa New jersey
Stahl, E.1985. Analisis Obat Secara Kromatografi dan Mikroskopis. Terjemahan kosasih P.,
Iwang S., Penerbit ITB ;Bandung.
Soebagio, dkk. 2000. Kimia Analitik II. Malang: Universitas Negeri Malang.
Tim Dosen Kimia Organik. 2012. Penuntun Kimia Organik I. Makassar: Laboratorium
FMIPA UNM.