Karagenan Induced Paw Edema (Rat)

Induksi Carrageenan Terimbas Paw Edema di Rat:

Pada studi hari 0, binatang waktu tertutup pada satu menit interval dan kemudian disuntik
dengan karagenan (1,2% dalam garam) di kaki belakang tepat di sesuai interval 1 menit untuk
menginduksi edema.

Parameter penyakit:
The karagenan kaki assay edema telah lama digunakan untuk mendeteksi aktivitas anti-inflamasi
yang menekan produksi prostaglandin, 1,2,3 tapi mediator inflamasi lainnya yang penting dalam
patogenesis lesi. 4 Umumnya tes yang melibatkan injeksi perampok dari karagenan zat iritan ,
biasanya setengah jam sampai satu jam setelah dosis dengan senyawa uji. Namun, interval antara
dosis dan injeksi karagenan dapat bervariasi tergantung pada saat konsentrasi plasma puncak dari
senyawa terjadi. Tingkat jaringan senyawa juga dapat mempengaruhi keberhasilan dalam model
ini. 5

Dosis Paradigma:
Mulailah dosis 30 menit sampai 3 jam sebelum injeksi karagenan; nekropsi 4-4,5 jam setelah
injeksi karagenan. Rute pemberian: SC, PO, IP, IV

Penilaian klinis:
pengukuran caliper dari cakar diambil pada awal (hanya sebelum injeksi karagenan) dan lagi
antara 1 dan 4 jam injeksi pasca-karagenan. Empat sampai 4,5 jam setelah penyuntikan
karagenan, hewan eutanasia, dan belakangnya cakar yang transected pada tingkat malleoli dan
ditimbang. Perbedaan antara disuntikkan versus non-disuntikkan dan diperlakukan dibandingkan
cakar non-diobati ditentukan.
Data sampel (Klik pada Gambar untuk memperbesar):

Untuk contoh tambahan dari kontrol positif, silahkan hubungi kami.

opsional Endpoint

koleksi darah PK / PD

analisis sitokin / kemokin melalui Luminex (R)

ELISA Sandwich lainnya

CBC / analisis kimia klinis

koleksi jaringan lunak

analisis histopatologi

analisis imunohistokimia

Referensi:
1. Musim dingin CA, Risley EA, Nuss GW. Karagenan-diinduksi paw edema di kaki
belakang dari tikus sebagai uji untuk obat anti-inflamasi. Proc Soc Exp Biol Med. 1962;
111: 544-547.
2. Van Armen CG, Bengany AJ, Miller LM, Pless HH. Beberapa rincian radang yang
disebabkan oleh ragi dan karagenan. J Pharmacol Exp Ther. 1965; 150: 328-334.

3. Otterness IG, Bliven ML. model laboratorium untuk pengujian obat anti-inflamasi nonsteroid. Dalam: JG Lombardino, ed. Obat nonsteroid anti-inflamasi. New York, NY: John
Wiley & Sons; 1985: 116-129.
4. Cuka R, Truax JF, Selph JL, Johnston PR, Venable AL, McKenzie KK. Pathway
peradangan karagenan-diinduksi di kaki belakang dari tikus. Fed Proc. 1987; 46: 118126.
5. Bendele AM, Ruterbories KJ, Spaethe SM, Benslay DN, Lindstrom TD, Lee SJ, Naismith
RW. Korelasi aktivitas anti-inflammtory dengan puncak jaringan daripada kadar plasma
puncak BF389. J Pharm Exp Ther. 1992; 260: 1194-1198.

Karagenan diinduksi tikus kaki edema adalah biphasic, usia berat badan tergantung
dan menampilkan diferensial nitrat oksida cyclooxygenase-2 ekspresi

Abstrak
1. Injeksi karagenan 1% (50 l) di kaki tikus menyebabkan respon biphasic:
respon inflamasi awal yang berlangsung 6 jam dan respon akhir kedua yang
puncak pada 72 jam, menurun pada 96 h. Hanya tikus 7- atau 8-minggu tua,
dengan berat 32-34 g, ditampilkan respon yang konsisten di kedua fase.
2. Pada tikus 8-minggu-tua, myeloperoxidase (MPO) tingkat secara signifikan
meningkat pada tahap awal di 6 jam dan mencapai maksimal pada 24 jam
menurun ke nilai basal pada 48 h. Nitrat + nitrit (NO x) tingkat di cakar yang
maksimal setelah 2 jam dan perlahan-lahan menurun setelahnya berbeda
dengan prostaglandin E 2 tingkat puncak yang di tahap kedua pada titik 72
jam.
3. analisis Western blot menunjukkan bahwa sintasa oksida nitrat (iNOS) adalah
terdeteksi pada 6 jam dan siklooksigenase 2 (COX-2) pada 24 huruf h,
masing-masing. Analisis endotel nitrat oksida sintase (eNOS), iNOS dan COX-2
pada 6 dan 24 jam pada tikus 3-8 minggu-lama menunjukkan bahwa kedua
eNOS dan ekspresi iNOS tergantung pada usia-berat tikus, sebagai
berlawanan dengan COX-2 yang hadir hanya di tahap kedua edema dan tidak
terkait dengan tikus usia berat badan.
4. injeksi Subplantar karagenan untuk C57BL / 6J menyebabkan edema biphasic
yang signifikan berkurang sekitar 20% jika dibandingkan dengan tikus CD1.
Menariknya, pada tikus ini, ekspresi iNOS yang absen hingga 6 jam, sebagai
berlawanan dengan CD1, dan menjadi terdeteksi pada titik 24 jam.
Siklooksigenase (COX-1) ekspresi diregulasi antara 4 dan 24 jam setelah
injeksi karagenan, sedangkan di CD1 tikus COX-1 tetap tidak berubah setelah
injeksi agen iritan. tingkat MPO yang maksimal pada titik 24 jam dan mereka
secara signifikan lebih rendah, pada 6 huruf h, dari tingkat MPO terdeteksi
pada tikus CD1.

5. Kesimpulannya, mouse kaki edema adalah biphasic dan usia-berat

tergantung. Hasil ini adalah laporan pertama pada ekspresi diferensial dari
eNOS, iNOS, COX-1 dan COX-2 dalam menanggapi injeksi karagenan dalam
dua fase edema tikus kaki.
Kata kunci: Mouse, usia, kaki edema, eNOS, iNOS, COX-1, COX-2
Go to:

pengantar
respon inflamasi akut ditandai dengan peningkatan permeabilitas pembuluh darah dan infiltrasi
seluler yang mengarah ke pembentukan edema, sebagai akibat dari ekstravasasi cairan dan
protein dan akumulasi leukosit di lokasi inflamasi. Karagenan diinduksi tikus kaki edema adalah
tes secara luas digunakan untuk menentukan aktivitas anti-inflamasi, dan telah sepenuhnya
ditandai di masa lalu ( Di Rosa et al, 1971a. , 1971b ; 1972 , . Garcia Leme et al, 1973 ). Barubaru ini, telah menunjukkan bahwa COX-2 mencapai maksimal ekspresi 1 jam dari injeksi lokal
karagenan ( Nantel et al., 1999 ). Mouse kaki edema telah semakin digunakan untuk menguji
obat anti-inflamasi baru serta untuk mempelajari mekanisme yang terlibat dalam peradangan.
Dalam literatur, ada sekitar 400 makalah mana mouse kaki edema telah digunakan. Dari analisis
literatur saat ini, kami menemukan bahwa ada terutama tiga makalah metode yang banyak
dikutip, yang Levy (1969) ; Sugishita et al. (1981) ; Henriques et al. (1987) . Pada tahun 1969,
Levy menggambarkan bahwa injeksi karagenan 1% di cakar tikus menyebabkan edema yang
sama, karena kursus waktu, untuk tikus, tapi kurang kuat secara proporsional. Sekitar 12 tahun
kemudian, Sugishita et al. (1981) lebih lanjut ditandai fase akut mouse kaki edema menggunakan
karaginan 3%. Pada tahun 1987, Henriques dan rekan kerja menunjukkan bahwa injeksi
karagenan ke kaki tikus menginduksi edema biphasic. Tahap pertama ditandai dengan edema
sedikit intensitas dan tidak berhubungan dengan dosis karagenan digunakan, sedangkan tahap
kedua berkembang setelah 24 jam, menampilkan edema lebih jelas dengan efek maksimum
antara 48 dan 72 jam. Baru-baru ini, telah menunjukkan bahwa karaginan 1% menginduksi
edema kuat ditandai BALB / c tikus, tetapi dalam kasus ini hanya tahap kedua telah terbukti (
Ianaro et al., 1994 ). Dengan demikian, pada tahap ini, metode yang paling banyak digunakan
adalah yang dijelaskan oleh Levy (1969) dan Sugishita et al. (1981) .
Ada beberapa mediator yang terlibat dalam peradangan. Histamin, serotonin, bradikinin dan
prostaglandin (PG) yang terlibat dalam permeabilitas pembuluh darah meningkat. Mediator
penting dalam peradangan akut adalah oksida nitrat (NO) yang diproduksi dalam kondisi
fisiopatologis oleh tiga isoform yang berbeda dari nitrat oksida sintase (NOS): endotel NOS
(eNOS), neuronal NOS (nNOS) dan inducible NOS (iNOS) ( Moncada & Higgs, 1991 ). Di
lokasi peradangan, NO dibentuk oleh sejumlah sel yang berbeda, termasuk leukosit, sel endotel
dan sel-sel saraf sensorik ( Berguna & Moore, 1998 ). Menyusul peningkatan permeabilitas
pembuluh darah, ada infiltrasi sel, terutama neutrofil (pada fase akut), yang memberikan
kontribusi untuk respon inflamasi dengan memproduksi, antara mediator lainnya, oksigen radikal
bebas seperti anion superoksida (O 2 -) dan hidroksil radikal ( Fantone & Ward, 1982 ). tingkat

jaringan Myeloperoxidase adalah penanda baik-standar dari infiltrasi neutrofil dalam jaringan,
dan telah jelas terbukti berkorelasi dengan keparahan penyakit. Karagenan diinduksi tikus kaki
edema menampilkan semua fitur biokimia dan selular yang telah jelas diuraikan di masa lalu dan
terus diperbarui mengikuti penemuan-penemuan baru. Di sini, kami telah sepenuhnya dianalisa
kedua fase berikut karaginan administrasi 1% lokal di Swiss CD1 dan C57BL / 6J tikus kaki,
dengan mengambil dalam account usia-berat tikus serta peran eNOS, iNOS, COX-1 dan COX- 2,
dengan mengukur ekspresi protein dan produksi nitric oxide (NO) dan PGE 2, masing-masing.
infiltrasi seluler dievaluasi dengan menilai tingkat MPO.
Go to:

metode
Mouse kaki edema

Mencit Swiss (CD-1; Charles River, Italia) dari 3-minggu-tua (15,6 0,2 g), 4-minggu-tua (21,8
0,6 g), 5-minggu-tua (28,1 0,3 g), 6-minggu-tua (30,1 0,6 g), 7-minggu-tua (32,5 0,4 g)
dan 8-minggu-tua (34,5 0,6 g), dan laki-laki C57BL / 6J tikus (Charles River, Italia) 8minggu-tua (26,6 0,4 g), dibagi menjadi kelompok-kelompok (n = 10 masing-masing
kelompok) dan ringan dibius dengan enfluran 4% dicampur dengan O 2, 0,5 l min -1, n 2 O 0,5 l
min -1. Setiap kelompok hewan yang diterima administrasi subplantar dari 50 l saline atau 50 l
karagenan 1% (wv -1) dalam garam ( Henriques et al., 1987 ; Calhoun et al., 1987 ). cakar
ditandai untuk benamkan selalu di tingkat yang sama dalam ruang pengukuran. Volume diukur
dengan menggunakan hydropletismometer dimodifikasi khusus untuk volume kecil (Ugo Basile,
Milan, Italia; . Bucci et al, 2000 ) segera sebelum injeksi subplantar, dan 2, 4, 6, 24, 48, 72 dan
96 h setelahnya. Penilaian volume kaki dilakukan selalu buta ganda dan oleh operator yang
sama. Peningkatan volume kaki dihitung dengan mengurangkan volume kaki awal (basal)
dengan volume kaki diukur pada setiap titik waktu.
pengukuran MPO

Tikus dari kelompok yang berbeda tewas dengan karbon dioksida pada 2, 4, 6, 24, 48, 72 dan 96
jam setelah pemberian karagenan, dan cakar ditimbang, dipotong dan homogenated dalam 1 ml
heksadesiltrimetilamonium bromide (HTAB) buffer yang mengandung 5 g HTAB di 1L kalium
buffer fosfat 50 m M, pH 6,0. ( Bradley et al., 1982 ) menggunakan homogenizer Polytron (dua
siklus 10 s pada kecepatan maksimum). Setelah sentrifugasi pada 10.000 rpm selama 2 menit,
fraksi supernatan diuji untuk aktivitas MPO, sebagai indeks migrasi seluler, menggunakan
metode yang dijelaskan oleh Bradley et al. (1982) . Sampel (20 l) dicampur dengan dapar
fosfat (180 l) yang berisi 1 m M O -dianisidine dyhydrochloride dan 0,001% hidrogen
peroksida dalam piring microtiter. Absorbansi diukur pada 450 nm, mengambil tiga bacaan di
30-s interval. Perhitungan unit MPO disadari mengingat 1 U MPO = 1 mol H 2 O 2 split dan 1
mol H 2 O 2 memberikan perubahan absorbansi 1,13 10 -2 (perubahan absorbansi = nm min
-1)
.

NO x dan PGE tingkat

eksudat

Tikus dari kelompok yang berbeda tewas dengan karbon dioksida 2, 4, 6, 24, 48, 72 dan 96 jam
setelah pemberian karagenan. Paws dipotong dan disentrifugasi pada 4000 rpm selama 30 menit.
Eksudat (supernatan) dikumpulkan dengan 100 l garam dan digunakan untuk NO x (nitrit
ditambah nitrat) dan PGE 2 kuantifikasi. Untuk menentukan NO tingkat x, eksudat yang
deproteinized dengan ZnSO 4 30% selama 15 menit ( Thomsen et al., 1990 ). Supernatan dan
kurva standar natrium nitrat diinkubasi dalam lempeng dengan kadmium (50 mg baik -1) selama 1
jam untuk mengkonversi NO 3 - untuk NO 2 - ( Thomsen et al, 1990. ). Setelah sentrifugasi pada
14.000 rpm selama 15 menit, jumlah nitrit (NO x) konten ditentukan fluorometrically di piring
mikro menggunakan kurva standar natrium nitrit ( Misko et al., 1993 ). NO x konten dihitung
dengan menggunakan kurva standar internal. PGE 2 tingkat ditentukan dalam eksudat
deproteinized oleh radioimmunoassay ( Sautebin et al., 1999 ).
analisis Western blot

Karagenan-disuntikkan dan cakar garam-disuntikkan dari tikus dari berbagai usia dan pada titik
waktu yang berbeda homogen dalam 10 m M HEPES pH 7,4. buffer yang mengandung sakarosa
(0,32 M), EDTA (100 M), dithiothreitol (1 m M), phenylmethylsulphonyl fluoride (1 mg ml -1)
dan leupeptin (10 g ml -1) ( Knowles dan Moncada, 1994 ), menggunakan homogenizer
Polytron (tiga siklus 10 s pada kecepatan maksimum). Setelah sentrifugasi pada 3000 rpm
selama 15 menit, kandungan protein supernatan diukur dengan Bradford reagen, dan konsentrasi
protein disesuaikan pada 1 g ml -1. Sampel protein (50 g) yang dimuat pada 10% SDS-PAGE
dan ditransfer ke membran nitroselulosa selama 45 menit pada 250 mA. Membran diblokir di
PBS-Tween 20 (0,1%) yang mengandung susu tanpa lemak 5% dan 0,1% BSA selama 30 menit
pada 4 C. Membran dicuci dengan PBS-Tween 20 (0,1%) pada interval 5-menit selama 30
menit, dan diinkubasi dengan anti-COX1, anti-COX-2, anti-iNOS atau anti-eNOS poliklonal
antibodi (pengenceran 1: 1000 di semua kasus) semalam pada 4 C. Untuk COX-1 deteksi,
bercak dicuci dengan PBS-Tween 20 (0,1%) pada interval 5-menit selama 30 menit dan
diinkubasi dengan HRP-anti-kambing IgG (1: 10.000) selama 2 jam pada suhu 4 C. Untuk
COX-2 deteksi, bercak dicuci dengan PBS-Tween 20 (0,1%) pada interval 5-menit selama 30
menit dan diinkubasi dengan HRP-anti-rabbit IgG (1: 10.000) selama 2 jam pada suhu 4 C.
Untuk iNOS dan eNOS deteksi, bercak dicuci dengan PBS-Tween 20 (0,1%) pada interval 5menit selama 30 menit dan diinkubasi dengan HRP-anti-IgG (1: 10.000) selama 2 jam pada suhu
4 C. Band immunoreactive divisualisasikan menggunakan sistem chemiluminescence
ditingkatkan (ECL; Amersham Pharmacia Biotech, USA), sesuai dengan instruksi pabrik.
Obat-obatan dan reagen

Bradford reagen adalah dari Bio-Rad (Bio-Rad Laboratories, Segrate, Milan, Italia). [3 H-PGE 2]
adalah dari Nen Du Pont (Milan, Italia). membran nitroselulosa berasal dari Protran, Schleicher
& Schuell (Jerman). Antibodi terhadap PGE 2 yang ramah diberikan oleh Profesor Ciabattoni,

Chieti University, Italia. Antibodi terhadap COX-1 adalah dari Santa Cruz Bioteknologi, Inc
(Milan, Italia). Antibodi terhadap COX-2 adalah dari Cayman-Kimia (USA). Antibodi terhadap
eNOS atau iNOS berasal dari Transduksi Laboratory (USA). Antibodi IgG HRP-terkonjugasi
yang dibeli dari Dako (Copenhagen, Denmark). Semua reagen lain dan senyawa yang digunakan
diperoleh dari Sigma-Aldrich (Milan, Italia).
Analisis statistik

Data dinyatakan sebagai mean sem Tingkat signifikansi statistik ditentukan dengan satu arah
analisis varians (ANOVA) diikuti oleh Bonferroni t-test untuk beberapa perbandingan,
menggunakan software GraphPad Prism.
Go to:

hasil
Mouse kaki edema

Dalam rangka untuk menentukan apakah perkembangan edema adalah tergantung pada tikus
usia-berat, kami menguji efek dari karagenan dalam berbagai kelompok tikus penuaan 3, 4, 5, 6,
7 dan 8 minggu. Pada tahap pertama (0-6 jam), injeksi karagenan memicu edema substansial
pada tikus berusia 8 minggu 6-, 7- atau (berat 30,1 0,6-34,5 0,6 g), yang secara signifikan
lebih rendah pada tikus 3 (15,6 0,2 g), 4 (21,8 0,6 g) dan 5 (28,1 0,3 g) -week tua ( Gambar
1a ). Pada tahap kedua (24-96 h,) tidak ada perbedaan yang ditemukan antara kelompok hewan
penuaan dari 5 sampai 8 minggu, sedangkan tikus 3 dan 4 minggu tua ditampilkan respon
berkurang signifikan untuk karaginan ( Gambar 1b ). Dari analisis data sebagai daerah di bawah
kurva, tampak jelas bahwa tikus 3 (15,6 0,29 g) atau 4 (21,8 0.69 g) tampilan lama -week
formasi edema yang lebih rendah yang signifikan.

Gambar 1
Mouse kaki edema adalah biphasic dan usia tergantung. Panel (a) menunjukkan
fase pertama (0-6 jam) dari karagenan diinduksi edema kaki di CD1 tikus dari 3
sampai 8 minggu tua. Panel (b) menunjukkan fase kedua dari kaki edema
karagenan-diinduksi pada tikus dari ...
aktivitas MPO di kaki tikus

Dalam rangka untuk mengevaluasi infiltrasi neutrofil pertama, kita mempelajari perjalanan
waktu aktivitas MPO dalam menanggapi injeksi karagenan pada tikus 8-minggu tua. Hasil
penelitian kami menunjukkan bahwa suntikan agen iritasi yang disebabkan peningkatan aktivitas
MPO yang memuncak antara 6 dan 24 jam setelah pemberian karagenan ( Gambar 2a ). Untuk
alasan ini, dua titik waktu ini dipilih untuk mempelajari aktivitas MPO. Kegiatan MPO terdeteksi
di kedua karagenan-disuntikkan dan cakar garam-disuntikkan hewan dari 3 sampai 8 minggu tua,
tingkat basal aktivitas MPO yang serupa dalam semua kelompok belajar ( Gambar 2b , garis
padat). Pada tahap pertama dari edema (6 jam), tingkat MPO diukur dalam cakar disuntikkan
tikus dari 3 sampai 6 minggu tua secara signifikan lebih kecil dari aktivitas MPO terdeteksi di
cakar disuntikkan tikus 7- atau 8-minggu tua. Namun, pada tahap kedua (24 jam), tidak ada
perbedaan signifikan yang ditemukan antara semua kelompok belajar ( Gambar 2b ), yang
menunjukkan bahwa pada tahap kedua migrasi seluler independen dari usia hewan.

Gambar 2
Aktivitas MPO dan NO x dan PGE 2 tingkat diukur dalam homogenat kaki dari cakar
saline- dan karagenan-disuntikkan tikus CD1 8-minggu-tua. Panel (a) menunjukkan
ketergantungan waktu dari aktivitas MPO pada tikus CD1 8-minggu-tua yang puncak
pada 6 jam dan tetap tinggi sampai dengan ...
NO x dan PGE

tingkat di eksudat paw

Untuk lebih mencirikan model ini, tikus berusia 8 minggu tewas pada 2, 4, 6, 24, 48, 72 dan 96
h. Karagenan-disuntikkan dan cakar garam-disuntikkan dipotong dan disentrifugasi pada 4000
rpm selama 30 menit. Supernantants dikumpulkan dan deproteinized dengan ZnSO 4 30% dan
digunakan untuk mengevaluasi NO x dan PGE 2 konten. Administrasi karagenan menyebabkan
peningkatan NO x produksi yang maksimal pada 2 h titik ( Gambar 2c ). Pada tahap kedua, NO
tingkat x selalu lebih rendah dari pada fase pertama ( Gambar 2c ). PGE 2 tingkat di tahap
pertama yang maksimal pada titik 2 jam, sedangkan di tahap kedua mencapai puncaknya pada 72
h titik ( Gambar 2d ).
Tentu saja waktu eNOS, iNOS, COX-1 dan COX-2 di CD1 tikus 8-minggu tua

Untuk menentukan yang merupakan isoform dari NOS dan COX terlibat dalam NO x dan
produksi PGE 2, ekspresi eNOS (140 kDa), iNOS (130 kDa), COX-1 (70 kDa) dan COX-2 (72
kDa) dipelajari di homogenates karagenan-disuntikkan dan cakar garam-disuntikkan dari tikus
berusia 8 minggu menewaskan 2, 4, 6, 24, 48, 72 dan 96 jam setelah pengobatan. Karagenan
injeksi tidak mengubah ekspresi protein eNOS pada 2 dan 4 jam. Namun, ada peningkatan
bertahap dalam ekspresi protein eNOS yang memuncak antara 48 dan 72 jam ( Gambar 3 ).

Seperti yang diharapkan, ekspresi protein iNOS tidak terdeteksi dalam cakar garam-disuntikkan
tikus CD1, sedangkan injeksi karagenan diinduksi ekspresi iNOS yang mulai terdeteksi pada 6
jam dan semakin meningkat memuncak pada 72 h ( Gambar 3 ). Isoform konstitutif
cyclooxygenase (COX-1) terdeteksi pada garam serta cakar karagenan-disuntikkan; tingkat
ekspresi protein ini tidak diubah setelah injeksi karagenan ( Gambar 3 ). Isoform diinduksi
siklooksigenase (COX-2) tidak terdeteksi dalam tahap pertama pembangunan edema sementara,
di tahap kedua, ekspresinya terdeteksi pada 24 jam dan mencapai puncaknya pada 72 h titik (
Gambar 3 ).

Gambar 3
Tentu saja waktu eNOS, iNOS, COX-1 dan COX-2 di cakar garam-disuntikkan (s) dan
karagenan-disuntikkan dari CD1 tikus 8-minggu tua. Panel (a) menunjukkan analisis
densitometri, sementara panel (b) menunjukkan perwakilan blot dari tiga percobaan
terpisah. Nilai ...
Usia ketergantungan eNOS, iNOS dan COX-2 pada tikus CD1

Untuk mempelajari ketergantungan usia eNOS, iNOS dan COX-2 pada tikus CD1, kami memilih
dua titik waktu perwakilan dari setiap tahap perkembangan edema. Kami memilih 6 h karena ini
adalah titik waktu di mana protein eNOS itu diekspresikan secara signifikan pada tahap pertama.
Selain itu, pada 6 jam, aktivitas MPO juga secara signifikan lebih tinggi dari tingkat basal,
menunjukkan infiltrasi meningkat dari sel ke dalam jaringan yang rusak. Mengenai tahap kedua,
kami memilih 24 h sejak eNOS, iNOS dan COX-2 protein yang semua terdeteksi serta, hanya
pada titik waktu ini, aktivitas MPO secara signifikan lebih tinggi daripada tingkat basal.
Tingkat basal ekspresi eNOS, terdeteksi di kaki kontrol, menunjukkan bahwa tikus termuda 3minggu-tua dipamerkan ekspresi berkurang dari protein ini jika dibandingkan dengan tikus 8minggu-tua ( Gambar 4a ). Karagenan injeksi menginduksi berlebih dari eNOS pada 6 h (
Gambar 4a ) serta pada 24 jam ( Gambar 4a ) pada tikus 7- atau 8-minggu-tua.

Gambar 4
Usia ketergantungan eNOS, iNOS dan COX-2 dalam garam-disuntikkan dan cakar
karagenan-disuntikkan tikus CD1 berusia 3-8 minggu pada 6 dan 24 jam. Panel (a)

menunjukkan eNOS ekspresi (perwakilan blot) bersama-sama dengan analisis

densitometri relatif ...

Dalam cakar kontrol, iNOS tidak terdeteksi, sedangkan injeksi karagenan diinduksi ekspresi
protein ini di semua kelompok belajar baik di 6 dan pada 24 jam ( Gambar 4b ). Analisis
densitometri menunjukkan bahwa, pada tahap pertama dari edema, ekspresi protein iNOS
menurun secara usia berat badan tergantung, sedangkan, di tahap kedua, meningkat secara usia
berat badan tergantung ( Gambar 4b ).
Siklooksigenase 2 ekspresi, belajar di homogenates karagenan-disuntikkan dan garamdisuntikkan cakar, tidak terdeteksi dalam sampel yang diperoleh sampai dengan 6 jam setelah
karagenan atau kendaraan administrasi, sedangkan, di tahap kedua pembentukan edema (24 jam),
adalah serupa di semua kelompok belajar ( Gambar 4c ).
C57BL / 6J tikus

Respon inflamasi untuk karaginan juga dipelajari di C57BL / 6J tikus 8-minggu tua. Dalam
Gambar 5a , perkembangan edema dalam menanggapi injeksi karagenan di CD1 dan C57BL / 6J
tikus 8-minggu tua ditampilkan; kedua strain hewan mengembangkan edema biphasic, tapi
C57BL / 6J menunjukkan formasi edema berkurang secara signifikan dalam menanggapi
karaginan. Dalam Gambar 5b , tingkat MPO terdeteksi di cakar disuntikkan dari CD1 dan
C57BL / 6J tikus 8-minggu tua yang akan ditampilkan. Karagenan injeksi di C57BL / 6J tikus
diinduksi peningkatan aktivitas MPO, yang tergantung waktu, memuncak pada 24 jam.
Sebaliknya, seperti yang telah kita dijelaskan sebelumnya, injeksi karagenan pada tikus CD1
diinduksi peningkatan aktivitas MPO mencapai dataran tinggi antara 6 dan 24 jam.

Gambar 5
Pengembangan edema karagenan-diinduksi dalam C57BL / 6J tikus berusia 8
minggu dibandingkan dengan CD1 tikus ditunjukkan pada panel (a). Panel (b)
menunjukkan aktivitas MPO diukur dalam kaki karagenan-disuntikkan dari CD1 dan
C57BL / 6J tikus 8-minggu-tua di 6 dan 24 ...

Selanjutnya, kami juga telah mengevaluasi NO x dan PGE 2 tingkat di eksudat cakar C57BL / 6J
tikus serta perjalanan waktu eNOS, iNOS, COX-1 dan COX-2 dalam menanggapi injeksi
karagenan.
Administrasi agen iritan ke dalam C57BL / 6J tikus paw diinduksi peningkatan NO x produksi
yang mencapai puncaknya pada 4 jam dan menurun pada 24 huruf h, yang tersisa di tingkat yang

sama sampai dengan 96 h titik ( Gambar 5c ). Tingkat PGE 2 secara signifikan ditingkatkan 4 jam
setelah injeksi karagenan dan mencapai dataran tinggi di 96 h ( Gambar 5d ). Di sisi lain, studi
tentang ekspresi protein di cakar tikus menunjukkan bahwa ekspresi eNOS memuncak antara 2
dan 4 jam, penurunan sesudahnya ( Gambar 6 ), menunjukkan profil ekspresi yang berbeda
eNOS jika dibandingkan dengan CD1 tikus ( Gambar 3 ). Karagenan injeksi diinduksi
peningkatan yang signifikan dalam COX-1 ekspresi protein antara 4 dan 24 jam setelah injeksi
agen iritan, dibandingkan dengan kelompok saline-disuntikkan ( Gambar 6 ). Isoform diinduksi
dari iNOS dan COX-2 yang terdeteksi 24 jam setelah injeksi karagenan, mengembangkan profil
mirip dengan tikus CD1 dengan tingkat maksimal ekspresi pada titik 72 h ( Gambar 6 ).

Gambar 6
Tentu saja waktu eNOS, iNOS, COX-1 dan COX-2 ekspresi dan analisis densitometri
dari cakar garam-disuntikkan dan karagenan-disuntikkan dari C57BL / 6J tikus 8minggu tua. Angka-angka mewakili tiga percobaan serupa. Nilai mean sem ...
Go to:

Diskusi
Karagenan tikus kaki edema sebagian telah ditandai dan dijelaskan dalam tiga makalah yang
berbeda ( Levy, 1969 ; Sugishita et al, 1981. ; . Henriques et al, 1987 ), dan beberapa obat antiinflamasi nonsteroid telah terbukti aktif dalam mouse model di tingkat yang sama seperti pada
model tikus ( Calhoun et al., 1987 ). Dalam sebagian besar makalah yang diterbitkan, ketika
sebuah zat baru, dengan aktivitas anti-inflamasi potensi, telah dipelajari dalam mouse kaki
edema, protokol dijelaskan oleh Levy (1969) atau Sugishita et al. (1981) telah diikuti. Dengan
demikian, pada tahap ini, banyak kebingungan yang dihasilkan oleh fakta bahwa ada banyak
kertas di mana hanya satu fase dianggap baik pertama (misalnya, Njamen et al., 2003 ) atau
kedua (misalnya, Wu et al. 2002 ) dan berbagai dosis karagenan digunakan. Selain itu,
tergantung pada protokol diikuti, karagenan 1% ( Levy, 1969 ; . Henriques et al, 1987 ) atau
karaginan 3% ( . Sugishita et al, 1981 ) digunakan. Hasil akhir adalah bahwa data yang diperoleh
tidak sebanding baik untuk dosis karagenan digunakan atau untuk fase yang dipelajari atau untuk
strain tikus yang dipilih.
Penelitian ini telah dilakukan dengan menggunakan dosis karagenan yang memberikan edema
maksimal di kedua fase menurut Henriques et al. (1987) . Hasil yang diperoleh menunjukkan
bahwa berat badan dan usia tikus merupakan masalah penting. Memang, hanya 7- atau 8minggu-tua tikus (32-35 g) menanggapi dengan pola inflamasi yang konsisten untuk karaginan,
menampilkan edema biphasic yang berkembang di 6 jam pertama, diikuti dengan tahap kedua

yang dimulai pada 24 jam. Dengan demikian, temuan bahwa, berikut karagenan subplantar
injeksi, ada edema lemah dan tidak terkait pada tahap pertama adalah untuk dianggap berasal
usia-berat tikus yang digunakan, yaitu, 20 g, sesuai sekitar 4-5 minggu usia ( Henriques et al.,
1987 ). Hal ini dikonfirmasi oleh penelitian kami di mana kami telah jelas menunjukkan bahwa
tikus 3-, 4- dan 5-minggu tua, di fase awal, mengembangkan sedikit edema. Pengukuran tingkat
MPO menunjukkan bahwa puncak infiltrasi sel antara 6 dan 24 jam pada semua kelompok. Data
ini menunjukkan bahwa, pada titik 6 jam, meskipun volume kaki berkurang, ada infiltrasi sel
konsisten yang disimpan pada tingkat yang sama hingga 24 jam. tingkat MPO tergantung pada
tikus usia-berat pada fase awal akut, hanya. Memang, pada fase akut (tahap pertama), tingkat
MPO secara konsisten lebih rendah pada tikus 3-, 4-, 5-minggu tua jika dibandingkan dengan
tikus yang lebih tua (7-, 8-minggu tua). Menariknya, di tahap kedua, tidak ada perbedaan yang
signifikan antara kelompok usia yang berbeda.
Selanjutnya, kita ditentukan NO x dan PGE 2 tingkat di kaki tikus 8-minggu-tua di mana kedua
fase edema secara konsisten hadir. Dalam model tikus, PGE 2 jelas memainkan peran kunci dan
keduanya eNOS dan iNOS berperan di awal dan akhir fase, masing-masing ( Salvemini et al.,
1996 ; Berguna & Moore, 1998 ; Omote et al, 2001. ) . Dalam model tikus, NO tingkat x
memuncak pada 2 jam, perlahan-lahan menurun setelahnya. NO tingkat x di tahap pertama jelas
diproduksi oleh eNOS, seperti yang ditunjukkan oleh studi Western Blot menunjukkan bahwa
iNOS yang absen hingga 6 jam. PGE 2 di tahap pertama, hingga 6 jam, diproduksi oleh COX-1
sejak COX-2 tidak terdeteksi sampai ke titik 6 jam. PGE 2 tingkat memuncak pada 2 jam dalam
tahap pertama, diikuti dengan puncak kedua, di tahap kedua, pada titik 72 jam. Dengan
demikian, NO tingkat didorong oleh eNOS di bagian akut edema ini, sementara mereka
diproduksi oleh iNOS dan eNOS di tahap kedua. Demikian pula, PGE 2 diproduksi oleh COX-1
di tahap pertama, sedangkan COX-2 yang diturunkan PGE 2 terlibat dalam tahap kedua.
MPO dianggap sebagai ciri dari infiltrasi sel (terutama neutrofil) peradangan. MPO tingkat
puncak pada 6 dan berkelanjutan hingga 24 jam. Dengan demikian, dua titik waktu kunci dari
edema ini adalah 6 dan 24 jam; memang, pada saat titik-titik ini, juga memungkinkan untuk
memantau eNOS, iNOS dan COX-2.
tingkat basal eNOS secara signifikan meningkat, oleh karagenan, di 7- atau 8-minggu-tua tikus
kedua pada 6 dan 24 jam. Sebaliknya, tingkat iNOS pada 6 h titik (tahap pertama) secara
signifikan lebih rendah pada tikus penuaan 7 atau 8 minggu, bila dibandingkan dengan 3-, tikus
4-, 5-minggu-tua. Pada 24 h titik (tahap kedua), tingkat iNOS secara signifikan lebih tinggi di 7atau 8-minggu-tua tikus bila dibandingkan dengan tikus berusia 3-6 minggu, mirip dengan
eNOS. Data ini menunjukkan bahwa pada tikus ada peraturan yang jauh lebih kompleks dari
produksi NO bila dibandingkan dengan PG. Memang, pada fase akut, hanya ada COX-1 yang
tidak diekspresikan setelah injeksi karagenan, sedangkan pada tahap kedua COX-2 protein
menjadi terdeteksi 24 jam setelah pemberian agen iritan. Sebaliknya, NO rilis diatur oleh iNOS
dan eNOS yang baik diregulasi selama pengembangan edema. Jadi, dengan menggunakan tikus

CD1 berusia 8 minggu 7- atau, adalah mungkin untuk secara jelas mempelajari peran iNOS,
eNOS, COX-1 dan COX-2 in vivo di kaki tikus.
Sejak perbedaan antara entitas dan terjadinya edema telah dijelaskan tergantung pada strain tikus
digunakan, kami menyelidiki edema yang disebabkan oleh karagenan di C57BL / 6J tikus.
Alasan di balik pilihan ini adalah bahwa tikus ini banyak digunakan sebagai tikus latar belakang
untuk menghasilkan tikus yang direkayasa genetik. Subplantar injeksi karagenan untuk C57BL /
6J menyebabkan edema yang signifikan berkurang sekitar 20%, jika dibandingkan dengan tikus
CD1. Menariknya, pada tikus ini, iNOS adalah absen hingga 6 jam, sebagai berlawanan dengan
CD1 mana iNOS sudah terdeteksi pada titik 6 jam. Demikian pula, injeksi karagenan
menginduksi ekspresi peningkatan yang signifikan dari COX-1 antara 4 dan 24 jam setelah itu,
sebagai berlawanan dengan tikus CD1. Selain itu, tingkat MPO yang maksimal pada titik 24 jam
dalam C57BL / 6J, sedangkan pada titik 6 jam mereka lebih rendah dari tingkat MPO terdeteksi
pada CD-1 tikus. Dengan demikian, ada perbedaan yang jelas dalam pembentukan edema,
distribusi enzim dan regulasi terkait dengan jenis tikus digunakan.
Hasil kami jelas menunjukkan bahwa tikus kaki edema adalah biphasic, sebagai berlawanan
dengan edema tikus yang hanya menampilkan fase akut. Selain itu, hasil ini adalah laporan
pertama pada ekspresi yang berbeda dari eNOS, iNOS, COX-1 dan COX-2 dalam menanggapi
injeksi karagenan pada tikus kaki edema berhubungan dengan usia dan untuk fase pembentukan
edema. Kesimpulannya, untuk mendapatkan hasil yang direproduksi, maka perlu menggunakan
tikus 7- atau 8-minggu tua, yaitu, dengan berat lebih dari 30 g. Selanjutnya, ketika strain baru
dari tikus yang digunakan, harus diperhitungkan bahwa enzim distribusi dan onset mediator
dapat berubah secara konsisten.
Go to:

Ucapan Terima Kasih

Inmaculada Posadas adalah rekan post-doktoral dari Ministerio de Educacion, Ciencia y Deporte
(MECD) dari Spanyol.
Go to:

singkatan
BSA

bovine serum albumin

COX-1

siklooksigenase 1

COX-2

siklooksigenase 2

NO

nitrat + nitrit

eNOS

endotel nitrat oksida sintase

ECL

ditingkatkan sistem chemiluminescence

HTAB

heksadesiltrimetilamonium bromide

iNOS

sintasa oksida nitrat

MPO

mieloperoksidase

nNOS

neuronal nitrat oksida sintase

TIDAK

oksida nitrat

PBS

buffer fosfat saline

PGE

prostaglandin E

Go to:

Referensi

BRADLEY PP, PRIEBAT DA, CHRISTENSEN RD, Rothstein G. Pengukuran

peradangan kulit. Estimasi konten neutrofil dengan penanda enzim J.
Menginvestasikan. Dermatol 1982; 78:.. 206-209 [ PubMed ]

BUCCI M., ROVIEZZO F., Cicala C., SESSA WC, Cirino G. Geldanamicyn,
penghambat heat shock protein 90 (Hsp90) sinyal dimediasi transduksi
memiliki efek anti-inflamasi dan berinteraksi dengan reseptor glukokortikoid
in vivo. Br. J. Pharmacol 2000; 131:. 13-16 [. PMC gratis artikel ] [ PubMed ]

CALHOUN W., CHANG J., CARLON RP Pengaruh agen antiinflamasi dipilih dan
obat lain pada zymosan, asam arakidonat, PAF dan karagenan diinduksi kaki
edema pada tikus Agen Tindakan 1987; 21:... 306-309 [ PubMed ]

Sifat DI ROSA M. Biologi karaginan. J. Pharm. Pharmacol 1972; 24:.. 89-102 [

PubMed ]

DI ROSA M., Giroud JP, WILLOUGHBY DA Studi pada mediator dari respon
inflamasi akut yang diinduksi pada tikus di situs yang berbeda dengan
karagenan dan terpentin. J. Pathol 1971a; 104:.. 15-29 [ PubMed ]

DI ROSA M., Papadimitriou JM, WILLOUGHBY DA Sebuah analisis histopatologi

dan farmakologi dari modus kerja obat anti-inflamasi non-steroid. J. Pathol
1971b; 105:.. 239-256 [ PubMed ]

FANTONE JC, WARD PA Peran oksigen radikal bebas dan metabolit dalam
reaksi inflamasi leukosit-dependent. Am. J. Phatol 1982; 107:. 395-418 [. PMC
gratis artikel ] [ PubMed ]

GARCIA Leme J., Hamamura L., Leite MP, Rocha E Silva M. analisis farmakologi
dari proses inflamasi akut yang disebabkan di kaki tikus dengan suntikan

lokal carrageenin dan dengan pemanasan. Br. J.Pharmacol 1973; 48:. 88-96 [.
PMC gratis artikel ] [ PubMed ]

HANDY RL, MOORE PK Perbandingan efek L-NAME, 7NI, dan L-NIL pada
karagenan diinduksi hindpaw edema dan aktivitas NOS Br.J.Pharmacol 1998;
123:... 1119-1126 [ PMC gratis artikel ] [ PubMed ]

Henriques MGMO, SILVA PMR, MARTINS MA, FLORES CA, CUNHA FQ, ASSREUYFilho J., Cordeiro RSB Tikus kaki edema. Sebuah model baru untuk
peradangan. Braz. J. Med. Biol. Res 1987; 20:.. 243-249 [ PubMed ]

IANARO A., O'Donnell CA, DI ROSA M., Liew TA A inhibitor oksida nitrat
mengurangi peradangan, turun mengatur sitokin inflamasi dan meningkatkan
interleukin-10 produksi edema carrageenin diinduksi pada tikus Imunologi
1994; 82:.. 370-375 . [ PMC gratis artikel ] [ PubMed ]

KNOWLES RG, Sintase oksida Moncada S. nitrat pada mamalia. Biochem. J.

1994; 298: 833-836.

RETRIBUSI L. Carrageenan kaki edema di mouse Hidup Sci 1969; 8:... 601-606
[ PubMed ]

Misko TP, Schilling RJ, Salvemini D., MOORE WM, CURRIE MG Sebuah uji
fluorometric untuk pengukuran nitrit dalam sampel biologis. Anal. Biochem
1993; 214:.. 11-16 [ PubMed ]

Moncada S., HIGGS EA endogen oksida nitrat. Fisiologi, patologi dan relevansi
klinis Eur. J. Clin. Berinvestasi 1991; 21:.. 361-374 [ PubMed ]

Nantel F., DENIS D., GORDON R., Northey A., Cirino M., Metters KM, CHAN CC
Distribusi dan regulasi siklooksigenase-2 peradangan karagenan diinduksi. Br.
J. Pharmacol 1999; 128:. 853-859 [. PMC gratis artikel ] [ PubMed ]

NJAMEN D., Talla E., MBAFOR JT, FOMUM TF, KAMANYI A., MBANYA J.-C., CerdaNICOLAS M., Giner RM, RECIO CM, aktivitas RIOS JL Anti-inflamasi
erycristagallin sebuah pterocarpene dari Erythrina mildbraedii . Eur. J.
Pharmacol 2003; 468:.. 67-74 [ PubMed ]

Omote K., Hazama K., Kawamata T., NAKAYAKA Y., TORIYABE M., Namiki A.
Peripheral oksida nitrat dalam karagenan-menginduksi peradangan otak Res
2001; 912:... 171-175 [ PubMed ]

Salvemini D., WANG ZQ, WYATT PS, Bourdon DM, MARINO MH, Manning PT,
CURRIE MG Nitric oxide:.. Mediator kunci dalam fase awal dan akhir tikus kaki
peradangan karagenan diinduksi Br.J.Pharmacol 1996; 118 :. 829-838 [ PMC
gratis artikel ] [ PubMed ]

SAUTEBIN L., IANARO A., ROMBOLA L., IALENTI A., SALA A., DI ROSA M.
generasi Siklooksigenase-2 tergantung dari 8-epiprostaglandin F2alpha oleh

makrofag J774 lipopolisakarida-diaktifkan. Inflamm. Res 1999; 48:.. 503-508 [

PubMed ]

SUGISHITA E., AMAGAYA S., Ogihara Y. Anti-inflamasi metode pengujian:.

Evaluasi komparatif dari tikus dan tikus J. Pharmacobiodyn 1981; 8:.. 565-575
[ PubMed ]

Thomsen LL, CHING LM, Baguley BC Bukti untuk produksi oksida nitrat oleh
makrofag diaktifkan diperlakukan dengan agen antitumor flavon-8-acetic acid
dan asam xanthenone-4-asetat Kanker Res 1990; 50:.. 6966-6970 [. PubMed ]

WU WP, HAO J.-X., HALLDNER-Henriksson L., XU X.-J., JACOBSON MA,

Wiesenfeld-Hallin Z., Fredholm BB Penurunan nyeri inflamasi karena
berkurangnya peradangan karaginan yang diinduksi pada tikus kekurangan
reseptor adenosin A3 .. Neuroscience 2002; 114: 523-527 [. PubMed ]