PEMICU 2 REKAYASA GENETIKA

STRATEGI KLONING GEN -GLUKOSIDASE PADA BAKTERI

Escherichia coli

Disusun Oleh:
Kelompok 7
Cindyara Nayanda

1406573942

Ferizka Shalima

1406533440

Gugum Permana
1406567315
CCCChaeruniza
Nabila Putri Salsabila 1406533466
Ruth

1406533642

PROGRAM STUDI TEKNOLOGI BIOPROSES

DEPARTEMEN TEKNIK KIMIA
UNIVERSITAS INDONESIA
DEPOK
2016

KATA PENGANTAR

Puji syukur penulis panjatkan kehadirat Tuhan Yang Maha Esa karena berkat karunia-Nya lah
penulis dapat menyelesaikan makalah Rekayasa Genetika yang berjudul Strategi Kloning Gen Glukosidase pada bakteri Escherichia coli.
Dalam penulisan makalah ini, pertama tama penulis ingin menyampaikan rasa terima kasih
kepada Dr. Eng. Muhamad Sahlan, S.Si., M.Eng. yang telah memberikan kesempatan bagi penulis
untuk menuangkan pemikirannya melalui makalah ini. Penulis juga mengucapkan terima kasih
kepada teman teman penulis dari jurusan Teknologi Bioproses, yang telah bersedia mendukung
dan menyemangati penulis selama masa pengerjaan makalah serta berbagi pengetahuan.
Di akhir kata, tim penulis memohon maaf jika dalam makalah penulis terdapat kesalahan
ataupun kata kata yang tidak sesuai dengan hati dan pikiran pembaca. Tidak ada gading yang tak
retak, begitu juga dengan makalah tim penulis yang belum sempurna. Maka dari itu, tim penulis
mengharapkan adanya masukan dan kritik dari pembaca yang dapat memperbaiki makalah ini di
kemudian hari.
Semoga makalah hasil karya tim penulis bermanfaat, sehingga ilmu pengetahuan dan
wawasan para pembaca menjadi bertambah setelah membaca makalah ini.

Jakarta, 3 Oktober 2016

Tim Penulis

DAFTAR ISI

KATA PENGANTAR ............................................................................................................................2

DAFTAR ISI .........................................................................................................................................3
DAFTAR GAMBAR ..............................................................................................................................5
DAFTAR TABEL ..................................................................................................................................6
ABSTRAK ............................................................................................................................................7
BAB 1 PENDAHULUAN .......................................................................................................................8
1.1

Latar Belakang .........................................................................................................................8

1.2

Tujuan Penulisan......................................................................................................................8

BAB 2 TINJAUAN PUSTAKA .............................................................................................................10

2.1

Enzim -glukosidase: Karakteristik, Struktur, dan Fungsi.......................................................10

2.2

Gen BglX (Gen Pengkode Enzim -glukosidase) ...................................................................11

2.3

Rhizomucor miehei Sebagai Jamur Pengkode Enzim -glukosidase .....................................11

2.4

Bakteri Escherichia coli Sebagai Sel Inang ...........................................................................13

2.5

Pemilihan Strain E.coli ..........................................................................................................13

2.6

Faktor-faktor yang Mempengaruhi Pertumbuhan E.coli.........................................................14

2.7

Isolasi Gen dari Jamur ..........................................................................................................15

2.8

Polymerase Chain Reaction (PCR) .......................................................................................16

2.9

Inverse Polymerase Chain Reaction (IPCR) .........................................................................18

2.10

Desain Primer Untuk Kloning Gen Menggunakan PCR .........................................................18

2.11

Plasmid Sebagai Vektor ........................................................................................................19

2.12

Tiga Kegiatan Utama dalam Rekayasa Genetika ..................................................................20

2.12.1.

Pemotongan ..........................................................................................................20

2.12.2.

Modifikasi ..............................................................................................................22

2.12.3.

Penyambungan (Ligasi) .........................................................................................24

2.13

Sel Kompeten dan Transformasi Genetik ..............................................................................27

2.13.1

Metode Transformasi Genetik Langsung ...............................................................29

2.13.2

Metode Transformasi Genetik Tidak Langsung ......................................................32

2.14
2.14.1

Skrining dan Seleksi ..............................................................................................................32

Metode Inaktivasi Insersi Menggunakan Substrat Kromogenik (Skrining Biru-Putih

atau Blue-White Screening) ...............................................................................................................33

3

2.14.2
2.15

Metode Seleksi Resistensi Antibiotik......................................................................36

Pendeteksian Ekspresi Gen ..................................................................................................36

2.15.1

Deteksi Menggunakan Gel Esculin ........................................................................36

2.15.2

Deteksi Menggunakan pNPG ................................................................................38

2.16

Pengecekan Final .................................................................................................................39

2.16.1

Polyacrylamide Gel................................................................................................39

2.16.2

SDS (Sodium Dodecyl Sulphate) ..........................................................................40

2.16.3

Buffer....................................................................................................................40

BAB 3 STRATEGI KLONING .............................................................................................................42

3.1

Tahap Isolasi Gen dari Rhizomucor miehei ............................................................................42

3.2

Pencarian gen pengkode enzim -glukosidase ......................................................................43

3.3

Mendesain primer untuk kloning dengan metode PCR ...........................................................44

3.4

Melakukan PCR untuk Amplifikasi Gen -glukosidase............................................................44

3.5

Tahap Insersi Gen -glukosidase dari Rhizomucor miehei ke Plasmid pRADZ1 ....................45

3.6

Tahap Transformasi Genetik Menggunakan Metode Elektroporasi.........................................48

3.7

Tahap Pemilihan Klon yang Tepat Menggunakan Skrining Biru Putih (Blue White Screening)

dan Seleksi Resistensi Antibiotik........................................................................................................50

3.8

Tahap Persiapan Sebelum Pendeteksian Ekspresi Gen.........................................................52

3.9

Tahap Pendeteksian Ekspresi Gen dengan pNPG (p-Nitrofenil--D-glukopiranosida) ............53

3.10

Tahap Pengecekan Final dengan SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulphate

Polyacrylamide Gel Electrophoresis)..................................................................................................54

BAB 4 PENUTUP...............................................................................................................................56
Kesimpulan ........................................................................................................................................56
DAFTAR PUSTAKA ...........................................................................................................................57
LAMPIRAN ........................................................................................................................................60

DAFTAR GAMBAR

Gambar 1. Struktur 3D enzim -glukosidase ......................................................................................10

Gambar 2. Enzim -glukosidase ........................................................................................................11
Gambar 3. Rhizomucor miehei dilihat dalam mikroskop. ....................................................................12
Gambar 4. Bakteri Escherichia coli ....................................................................................................13
Gambar 5. Range pH yang tepat untuk medium kultur E.coli .............................................................14
Gambar 6. Contoh desain primer (Sumber : Addgene.org) ................................................................18
Gambar 7. Urutan basa yang simetris antara dua untai DNA pada plasmid. ......................................20
Gambar 8. Segmen DNA pada plasmid setelah dipotong oleh enzim restriksi ...................................20
Gambar 9. Cara kerja DNA polimerase dan eksonuklease untuk membentuk ujung tumpul ..............23
Gambar 10. Cara kerja eksonuklease ................................................................................................24
Gambar 11. Cara Kerja DNA ligase ...................................................................................................25
Gambar 12 Langkah-langkah transformasi DNA pada bakteri Gram positif dan negatif .....................27
Gambar 13. Prosedur transformasi DNA yang dilakukan oleh Griffith ................................................29
Gambar 14. E.coli sebaiknya dielektroporasi pada fase log ...............................................................29
Gambar 15. Prinsip transformasi plasmid rekombinan pada bakteri E.coli menggunakan metode
elektroporasi ......................................................................................................................................30
Gambar 16. Metode biolistik (particle bombardment) .........................................................................32
Gambar 17. Reaksi penguraian X-gal menjadi galaktosa dan 5,5-dibromo-4,4-dikloro-indigo ..........33
Gambar 18. Insersi gen yang diinginkan pada multiple cloning site gen LacZ ....................................34
Gambar 19. Bakteri E.coli yang telah mengalami transformasi genetik ..............................................35
Gambar 20. Template plasmid yang memiliki gen LacZ dan AmpR ....................................................36
Gambar 21. Senyawa Aesculin ..........................................................................................................37
Gambar 22. Reaksi esculin yang terhidrolisis oleh enzim -glukosidase dan berubah menjadi
esculetin yang berwarna coklat tua mendekati hitam .........................................................................37
Gambar 23. p-nitrofenil-alfa-D glukopiranosida (larutan tidak berwarna) ............................................38
Gambar 24. Reaksi hidrolisis pNPG yang menghasilkan glukosa dan warna kuning (p-nitrofenol) ....39
Gambar 25. Kegunaan SDS dalam melinearkan protein dan melapisi dengan muatan ......................40
Gambar 26. Efek Buffer pada SDS-PAGE .........................................................................................41
Gambar 27. Diagram alir strategi kloning gen -glukosidase dari Rhizomucor miehei ke bakteri
Escherichia coli ..................................................................................................................................42
Gambar 28. Daftar sekuens primer yang digunakan ..........................................................................43
Gambar 29. (a) Representasi skematik gen Bgl dan daerah utama pengkode protein. Tanda panah
menandakan posisi primer-primer untuk amplifikasi IPCR dan kloning. (b) Perbandingan motif
sekuens dari 3 kelompok glikosida hidrolase. ....................................................................................44
Gambar 30. Peta restriksi pRADZ1 ....................................................................................................46
5

Gambar 31. Peta Restriksi gen -glukosidase R.miehei ....................................................................47

Gambar 32. Ilustrasi elektroforesis gel agarosa untuk purifikasi pRADZ1 yang terpotong dan gen glukosidase ........................................................................................................................................48
Gambar 33. Sirkuit listrik dan konfigurasi elektroda yang digunakan dalam elektroporasi E.coli ........49
Gambar 34. Hasil blue-white screening: koloni bakteri berwarna biru dan putih.. ...............................50
Gambar 35. E.coli yang tidak memiliki gen AmpR dan memiliki gen AmpR. ........................................51
Gambar 36. Diagram French Pressure Cell Treatment ......................................................................52
Gambar 37. Pemisahan Protein dari DNA dan RNA ..........................................................................53
Gambar 38. Hasil deteksi menggunakan pNPG. ................................................................................54
Gambar 39. Penambahan amonium sulfat untuk purifikasi protein rekombinan .................................55
Gambar 40. Perkiraan hasil SDS-PAGE enzim -glukosidase dari Rhizomucor miehei .....................55

DAFTAR TABEL

Tabel 1. Komposisi dari Gel Esculin ...................................................................................................36

Tabel 2. Persen poliakrilamida yang dibutuhkan untuk massa protein yang berbeda .........................40

ABSTRAK
Enzim -1,4-glukosidase merupakan enzim yang mengkatalisis hidrolisis alkil- dan aril- -1,4glikosida pada di- dan oligosakarida. Enzim ini mempunyai banyak peran dalam proses biologis,
misalnya degradasi polisakarida struktural dan penyimpanan, interaksi inang-patogen, pensinyalan
pada tingkat seluler, dan onkogenesis. Enzim ini juga mempunyai banyak aplikasi di bidang industri,
misalnya dalam proses produksi bioetanol, enzim ini dapat menghidrolisis selulosa dan hemiselulosa
dari lignoselulosa dalam biomassa menjadi gula monomer yang dapat difermentasi (pada bioetanol
generasi kedua). Selain itu, enzim ini juga berperan sebagai pengkatalisis pelepasan aromatik dari
prekursor glikosidik yang ada pada buah, teh dan dalam produk fermentasi dalam pembuatan
minuman beralkohol dan juga sebagai agen pengubah isoflavon glikosidik menjadi isovlafon aglikon
pada makanan berbahan dasar kedelai. Sayangnya, biaya produksi enzim selulolitik ini masih cukup
tinggi dalam proses produksi di industri.
Dalam Rhizomucor miehei terdapat gen yang meyandi enzim -1,4-glukosidase yang stabil
pada temperatur tinggi hal ini membuat enzim tersebut sangat bermanfaat untuk diaplikasikan dalam
industri. Namun, dalam industri, alat kultur yang umumnya dimiliki adalah kultur E.coli. Disini gen
pengkode enzim -1,4-glukosidase akan disisipkan kedalam E.coli.
Teknik yang dapat digunakan pada proyek ini untuk isolasi gen beta-glikosidase Rhizomucor
miehei adalah dengan perlakuan alu dan mortar dalam nitrogen cair kemudian dimurnikan dalam 0,5
mg/mL bis-benzamida-CsCl untuk isolasi fragmen DNA. Pencarian gen beta-glikosidase yang spesifik
dapat menggunakan teknik IPCR. Kemudian gen yang sudah ditemukan dapat diperbanyak
menggunakan PCR dengan primer termodifikasi BglII dan XbaI. Sel inang yang digunakan adalah
E.coli yang mempunyai karakteristik yaitu pertumbuhannya cepat dan mudah untuk dikultivasi.
Strain yang digunakan dalam proyek ini adalah DH5alpha yang memiliki efisiensi transformasi
yang tinggidan dapat menstabilkan gen sisipan. Plasmid yang dapat digunakan adalah pRADZ1 yang
mempunyai jumlah salinan tinggi, cocok untuk strain DH5alpha, mempunyai ori, gen resisten
ampicillin, serta gen lacZ. Molekul yang digunakan untuk pemotongan adalah enzim BglII dan XbaI,
untuk modifikasi menggunakan metilase, untuk penyambungan menggunakan DNA ligase T4.
Setelah itu, transformasi plasmid dilakukan dengan teknik elektroporasi untuk plasmid besar. Teknik
skrining dilakukan setelahnya untuk mengetahui apakah plasmid sudah benar-benar masuk ke dalam
E.coli. Teknik yang digunakan yaitu skrining biru/putih, teknik seleksi yang digunakan yaitu seleksi
resistensi antibiotik. Untuk menguji keberhasilan ekspresi gen menggunakan PNPG dan SDS-PAGE.

BAB 1
PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Rekayasa genetika merupakan suatu cara memanipulasi gen untuk menghasilkan
makhluk hidup baru dengan sifat yang diinginkan, melalui proses identifikasi dan isolasi DNA dari
suatu sel hidup atau mati dan memasukkannya dalam sel hidup lainnya. Pada rekayasa
genetika, dilakukan kegiatan pencangkokan gen atau rekombinasi DNA. Prinsip dasar teknologi
rekayasa genetika adalah memanipulasi atau melakukan perubahan susunan asam nukleat sel
inang dengan menyelipkan gen baru ke dalam struktur DNA sel inang. Rekayasa genetika pada
bertujuan agar organisme yang menjadi inang dapat mengekspresikan sifat yang diinginkan.
Di sisi lain, enzim -1,4-glukosidase merupakan enzim yang mengkatalisis hidrolisis alkildan aril- -1,4-glikosida pada di- dan oligosakarida. Enzim ini mempunyai banyak peran dalam
proses biologis, misalnya degradasi polisakarida struktural dan penyimpanan, interaksi inangpatogen, pensinyalan pada tingkat seluler, dan onkogenesis. Enzim ini mempunyai banyak
aplikasi di bidang industri, misalnya dalam proses produksi bioetanol, enzim ini dapat
menghidrolisis selulosa dan hemiselulosa dari lignoselulosa dalam biomassa menjadi gula
monomer yang dapat difermentasi (pada bioetanol generasi kedua). Selain itu, enzim ini juga
berperan sebagai pengkatalisis pelepasan aromatik dari prekursor glikosidik yang ada pada
buah, teh dan dalam produk fermentasi dalam pembuatan minuman beralkohol dan juga sebagai
agen pengubah isoflavon glikosidik menjadi isovlafon aglikon pada makanan berbahan dasar
kedelai. Sayangnya, biaya enzim selulolitik ini masih cukup tinggi dalam proses produksi di
industri.
Pada tahun 2011, peneliti dari Jepang, M. Tako menemukan bahwa terdapat gen yang
menyandi pembentukan enzim -1,4-glukosidase yang stabil pada temperatur tinggi pada
Rhizomucor miehei, sehingga sangat bermanfaat dalam proses produksi di industri. Maka dari
itu, perlu dicari cara untuk mendapatkan dan memproduksi enzim ini dengan biaya rendah
menggunakan vektor berupa bakteri. Rencananya, sesuai prinsip rekayasa genetika, gen
pengkode enzim -glukosidase yang didapatkan dari Rhizomucor miehei akan disisipkan ke
dalam plasmid mengikuti protokol-protokol yang sesuai. Kemudian, plasmid yang sudah
direkayasa akan ditransformasi ke dalam bakteri E.coli agar bakteri tersebut mengekspresikan
enzim -glukosidase. Dengan melakukan rekayasa genetika dan merekombinan bakteri E.coli
untuk menghasilkan enzim -glukosidase, diharapkan proses produksi industri menggunakan
reaksi enzimatik -glukosidase menjadi lebih efektif, efisien, dan ekonomis.
1.2 Tujuan Penulisan
Adapun tujuan tim penulis membuat makalah ini, antara lain:
1. Mengetahui karakteristik, struktur, dan fungsi dari enzim -glukosidase.
8

2. Mengetahui aplikasi dari enzim -glukosidase.

3. Mengetahui teknik untuk mengisolasi gen pengkode enzim -glukosidase dari jamur Rhizomucor
miehei.
4. Mengetahui karakteristik sel inang Escherichia coli dan kondisi optimum pertumbuhannya.
5. Mengetahui plasmid yang tepat untuk dapat disisipi gen dari jamur Rhizomucor miehei.
6. Mengetahui molekul-molekul yang terlibat dalam pemotongan, modifikasi, dan ligasi (enzim
restriksi, enzim ligase, dan molekul modifikasi yang tepat) gen pengkode enzim -glukosidase ke
sel inang E. coli.
7. Mengetahui teknik transformasi yang tepat untuk mengintegrasikan plasmid rekombinan ke
E.coli.
8. Mengetahui teknik skrining dan seleksi yang tepat digunakan untuk mendapatkan bakteri E.coli
rekombinan.
9. Mengetahui apakah bakteri E.coli telah berhasil mengekspresikan gen pengkode enzim glukosidase.

BAB 2
TINJAUAN PUSTAKA
2.1 Enzim -glukosidase: Karakteristik, Struktur, dan Fungsi

Gambar 1. Struktur 3D enzim -glukosidase

(Sumber: www.3dprint.nih.gov)

Enzim -glukosidase (BGL, EC 3.2.1.21) merupakan salah satu enzim dari sistem enzim
selulase, selain endo-1,4--glukanase (1,4--D-glucan 4-glucanohydrolase, EC 3.2.1.4. cellulase)
dan

selobiohidrolase

(1,4--D-glucan

cellobiohydrolase,

EC

3.2.1.91,

cellulase

1,4--

cellobiosidase). Sejauh ini, organisme yang menghasilkan enzim -1,4-glukosidase adalah fungi
dan bakteri.
-glukosidase dari berbagai sumber telah diisolasi, dimurnikan, dikarakterisasi, dan dipelajari
sifat-sifatnya, di antaranya -glukosidase dari Saccharomyces lactis strain Y-123 (Marchin &
Duerksen

1968),

Flavobacterium M64(Sano,

circulans subsp.alkalophilus (Paavilainen,

Hellman

Amemura
&

&

Korpela

Harada

1975), Bacillus

1993),

Aureobasidium

pullulans (Saha, Freer & Bothast 1994), Xylaria regalis (Wei et al. 1996), Humicola grisea
(Takashima et al. 1999), Acetobacter xylinum (Tajima et al. 2001), Thermoascus aurantiacus (de
Palma-Fernandez, Gomes & da Silva 2002), dan Fomitopsis palustris (Yoon, Kim & Cha 2008).
Pada tahun 2011, peneliti dari Jepang, M. Tako menemukan bahwa terdapat gen yang menyandi
pembentukan enzim -1,4-glukosidase yang stabil pada temperatur tinggi pada Rhizomucor
miehei, sehingga sangat bermanfaat dalam proses produksi.
-glukosidase adalah enzim glukosidase yang memutus ikatan (1 4) glikosida antara 2
glukosa atau molekul pengganti glukosa yang lain seperti selobiosa. Enzim ini bertindak sebagai
katalis dalam proses hidrolisis residu ujung non-pereduksi pada -D-Glukosa, dengan
melepaskan unit glukosa. Selulosa adalah komponen utama yang memiliki polimer ikatan
antara molekul glukosa di dalamnya, dan enzim ini dibutuhkan oleh organisme tertentu seperti
jamur, bakteri, dan rayap untuk bisa mengkonsumsi selulosa tersebut. Contoh fungsi enzim ini
terdiri dari degradasi selulosa, pelepasan senyawa aromatik dengan aktivitas antioksidan dari
prekursor glukosida mereka, dan konversi selobiosa menjadi glukosa yang dapat bermanfaat
10

dalam memproduksi sumber energi terbarukan, glukosa yang dihasilkan oleh hidrolisis selobiosa
(langkah terakhir dalam hidrolisis lengkap selulosa) dapat difermentasi menjadi etanol (16).
Selulosa, sebuah polisakarida yang merupakan komponen utama dalam dinding sel
tanaman, mengandung jenis obligasi yang dapat terdegradasi oleh -glukosidase. Berbagai
bakteri dan jamur menghasilkan -glukosidase yang digunakan untuk mengkonsumsi selulosa
dan sakarida yang dihubungkan oleh ikatan beta.

Gambar 2. Enzim -glukosidase

(Sumber: www.proteopedia.org)

2.2 Gen BglX (Gen Pengkode Enzim -glukosidase)

Yang et al. menemukan sebuah gen tambahan di dalam E. coli yang mengkode glukosidase, bernama BglX. Produk yang dihasilkan dari gen BglX adalah -glukosidase. BglX
terletak di periplasma, yaitu daerah di antara membran dalam sitosol dan membran luar sel dari
sitoplasma. Data mengenai kloning, urutan DNA, kromosom pemetaan bglX, dan karakterisasi
BglX telah dilaporkan oleh Yang et al. Gen ini memiliki panjang sebesar 2.3 kb dan terletak di
47,8 menit pada kromosom E.coli. 765 residu asam amino urutan dari BglX ditentukan dari
sekuensing nukleotida. BglX dimurnikan dari periplasma dan dinyatakan bahwa protein yang
dihasilkannya berasal dari pembelahan sinyal peptidase pada panjang 20 residu.
Aktivitas enzim BglX dianalisis dengan substrat o-nitrophenyl--D-glucopyranoside.
BglX dilaporkan memiliki KM d18 mM dan Vmax 3 pM min-1. Meskipun begitu, substrat alami
untuk BglX tetap tidak diketahui. Alasan E. coli menghasilkan periplasmik -glukosidase juga
belum diketahui, namun, Yang et al. berspekulasi mungkin enzim ini akan membantu bakteri
untuk hidup dalam usus inang dengan memproduksi glukosa menjadi energi melalui hidrolisis
-glukosida. Meskipun E.coli telah memiliki gen BgIX, gen pengkode -glukosidase yang lebih
aktif ditemukan pada Rhizomucor miehei. Selain itu, enzim -glukosidase juga tahan digunakan
pada temperatur tinggi.
2.3 Rhizomucor miehei Sebagai Jamur Pengkode Enzim -glukosidase
Genus Rhizomucor terdiri dari 2 spesies jamur termofilik yaitu R. pusillus dan R.
miehei; di mana R. miehei banyak diteliti dari aspek bioteknologi. Rhizomucor miehei adalah
11

jamur saprofit, berfilamen, dan hidup di mana-mana. R. miehei dapat diperoleh dari tanah,
kompos, kotoran unggas, dan limbah rumah tangga. (Gomes, Lewis, dan Kontoyiannis, 2011)
Penelitian terhadap R. miehei didasari oleh produksi enzim ekstraselulernya; di antaranya yang
telah diproduksi secara komersil adalah protease aspartat untuk pembuatan keju skala industri
untuk menggantikan kimosin anak sapi (Eyzaguirre, 2005). Krisch dkk (2012) menyatakan
bahwa R. miehei mampu menggunakan selobiosa dan disakarida lainnya sebagai sumber
karbon melalui uji asimilasi sumber karbon. R. miehei membentuk zigospora, berwarna abu-abu
saat berada dalam koloni, dan berdiameter 50 mikrometer. Pertumbuhan R. miehei sangat
cepat dan bentuk koloni bertekstur seperti permen kapas. Warna permukaan koloni berwarna
abu-abu dan menjadi kuning kecoklatan seiring perubahan waktu. R. miehei dapat tumbuh
pada temperatur 50C atau lebih tinggi. Oleh karena itu, R.miehei banyak digunakan untuk
produksi enzim yang tahan terhadap temperatur tinggi.

Gambar 3. Rhizomucor miehei dilihat dalam mikroskop.

(Sumber: www.pendientedemigracion.ucm.es)

Menurut Tako (2011), R. miehei dapat menghasilkan enzim -glukosidase yang

bekerja secara optimal pada temperatur 650C dan memiliki rentang pH stabil 4.0 6.0. Jika
dibandingkan dengan enzim dari jamur lain, -glukosidase yang dihasilkan R. miehei lebih
tahan panas dan rentang pHnya lebih asam. Beberapa -glukosidase dari jamur lain bekerja
optimal pada temperatur sekitar 500C dan rentang pH stabil 4.5 7.0. -glukosidase dari R.
miehei memiliki rentang spesifisitas yang luas; yang mampu menghidrolisis p-nitrofenil- -Dgalaktopiranosida. Parameter kinetika dari -glukosidase yang dihasilkan oleh R. miehei juga
mengikuti plot Lineweaver-Burk saat menggunakan substrat p-nitrofenil- -D-galaktopiranosida.

12

2.4 Bakteri Escherichia coli Sebagai Sel Inang

Escherichia coli (E.coli) merupakan bakteri Gram negatif berbentuk batang yang tinggal di
saluran pencernaan bagian bawah hewan berdarah panas. Selain dapat hidup dalam usus besar,
E.coli juga dapat hidup di luar tubuh hewan, misalnya pada feses. E.coli telah menunjukkan
banyak bukti bahwa ia bisa bertahan hidup pada kondisi yang beragam, hal inilah yang
menyebabkan E.coli merupakan mikroorganisme model yang sering dijadikan percobaan saat
peneliti mempelajari suatu fenomena atau melakukan rekayasa genetika. E.coli merupakan salah
satu bakteri yang paling sering direkayasa untuk menghasilkan protein rekombinan, karena ia
memiliki karakteristik berikut:
1. Merupakan organisme sel tunggal sehingga tidak menimbulkan kontroversi etik saat
menumbuhkan, memanipulasi, maupun membunuhnya, tidak seperti organisme percobaan
multiseluler seperti tikus.
2. Mampu bereproduksi dan tumbuh dengan sangat cepat (E.coli mampu menggandakan
populasinya setiap 20 menit).
3. Mampu bertahan di segala kondisi dan tidak membutuhkan medium kultur yang sulit atau mahal;
sebagian besar E.coli tidak menimbulkan bahaya kesehatan
4. Genetikanya sudah dimengerti dengan baik sehingga mudah dimanipulasi menjadi apa yang
dinginkan.

Gambar 4. Bakteri Escherichia coli

(Sumber: www.upload.wikimedia.org )

2.5 Pemilihan Strain E.coli

Strain E. coli yang umum digunakan dalam pengkloningan didapat dari isolasi strain K12 dan strain B. K-12 mempunyai turunan yaitu MG1655 dan menurunkan lagi dua strain yaitu
DH5 dan DH10b. Sementara itu, turunan yang paling umum digunakan dari strain B adalah
BL21.

13

2.6 Faktor-faktor yang Mempengaruhi Pertumbuhan E.coli

Pertumbuhan sel E.coli dipengaruhi oleh berbagai faktor. Kondisi medium kultur dapat
menentukan kuantitas dari sel E.coli. Hasil dari plasmid dan protein rekombinan akan
berbanding lurus dengan kuantitas sel E.coli. Oleh karena itu, pengontrolan medium sangatlah
penting untuk kultur bakteri E.coli selanjutnya. Parameter medium kultur yang perlu
diperhatikan, antara lain:
1. pH
pH optimal dari E.coli untuk tumbuh adalah mendekati range pH netral. Bakteri E.coli
dapat tumbuh baik pada range pH sekitar 5.5 sampai 8.5. pH yang ekstrim di atas range ini
akan menyebabkan penurunan pertumbuhan sel dan juga dapat menyebabkan kematian
pada sel. pH minimum dan maksimum untuk pertumbuhan E.coli adalah 4.4 dan 9.0. Bakteri
E.coli lebih dapat mentoleransi pH rendah dibandingkan pH tinggi. Jika bakteri E.coli
terpapar pH yang cukup tinggi, dikhawatirkan selnya akan lisis. Pada fase stasioner, pH
dari medium kultur E.coli mendekati pH limit. pH yang tidak tepat merupakan faktor yang
menghambat pertumbuhan sel dan ditambah dengan akumulasi dari hasil metabolisme
toksik.

Gambar 5. Range pH yang tepat untuk medium kultur E.coli

(Sumber: www.exptec.com)

14

2. Kondisi Udara (Kadar Oksigen)

Bakteri E.coli dapat memproduksi banyak asam asetat jika mediumnya hanya mengandung
sedikit oksigen, sehingga ia tumbuh dengan lambat atau bahkan berhenti. Asam asetat
merupakan penghambat metabolik paling besar di bawah kondisi anaerob.
3. Temperatur
Habitat bakteri E.coli merupakan usus dalam tubuh manusia atau hewan yang bedarah
hangat (370C). Bakteri E.coli tidak dapat tumbuh pada temperatur diatas 420C. Namun, bakteri
E.coli dapat mentolerir temperatur rendah, meskipun laju pertumbuhan yang sangat rendah.
Sintesis protein juga akan melambat pada temperatur di bawah 370C. Pada banyak kasus,
temperatur yang digunakan menyusaikan dengan temperatur tumbuh E.coli.
Tinjauan mengenai faktor-faktor yang mempengaruhi pertumbuhan E.coli penting diketahui
dalam proses produksi selanjutnya (saat tahap pengkulturan E.coli untuk produksi skala
besar).
2.7 Isolasi Gen dari Jamur
Isolasi gen merupakan teknik untuk memisahkan DNA dalam suatu sel dari zat zat lain
selain DNA, seperti dinding sel, membran sel, dan membran inti. Salah satu prinsip isolasi DNA
yaitu dengan sentrifugasi. Sentrifugasi merupakan teknik untuk memisahkan campuran
berdasarkan berat molekul komponennya. Molekul yang mempunyai berat molekul besar akan
berada di bagian bawah tabung dan molekul ringan akan berada pada bagian atas tabung
(Mader, 1993). Molekul yang mempunyai berat molekul besar akan berada di bagian bawah
tabung dan molekul ringan akan berada pada bagian atas tabung. Terdapat beberapa metode
isolasi gen, yakni sebagai berikut (Triastuti, 2007):
1. Teknik Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD)
Teknik pengujian polimorfisme DNA berdasarkan pada amplifikasi dari segmen-segmen DNA
acak yang menggunakan primer tunggal yang sekuen nukleotidanya ditentukan secara acak.
Primer tunggal ini biasanya berukuran 10 basa. PCR dilakukan pada temperatur annealing yang
rendah yang memungkinkan primer menempel pada beberapa lokus pada DNA. Aturan
sederhana untuk primer adalah terdiri atas 18-28 susunan basa dengan persentase G+C 50-60%.
(Subandiyah,2006)
2. Metode CTAB
Menghasilkan pita DNA yang berukuran tebal dan dapat memisahkan DNA dari polisakarida
karena adanya perbedaan karakteristik kelarutan (differential of solubility). Di samping diperoleh
fragmen DNA, dari metode CTAB juga akan diperoleh RNA dengan pita tipis yang terletak jauh
berada di bawah pita DNA. Keberadaan pita RNA tergantung bahan yang diekstraksi. (Prasetyo,
2008)
3. Fenol : kloroform

15

Mengunakan senyawa fenol-kloroform-isoamil alkohol, yang merupakan metode standar untuk

ekstraksi DNA. Meskipun metode ini mulai ditinggalkan karena sifat toksik fenol.
4. Salting Out
Menggunakan garam konsentrasi tinggi (NaCl 6 M), untuk medenaturisasi protein menggunakan
proteinase K.
5. Guanidine isothiocyanate
Metode ini membutuhkan prosedur yang lebih cepat dibandingkan metode salting out dan metode
fenolkloroform. Thicoyanate yang digunakan dalam metode ini bersifat toksik dan mampu melisis
dinding sel. Metode ini membutuhkan kloroform untuk denaturasi protein.
6. Silica Gel
Silica gel dapat mengikat DNA dengan perantaraan garam/buffer tertentu (NaI). Metode ini cepat,
tetapi perolehan DNA-nya kurang (Barnum 2005).
7. PCR (Polymerase Chain Reaction)
Merupakan suatu teknik perbanyakan (amplifikasi) potongan DNA secara in vitro pada daerah
spesifik yang dibatasi oleh dua buah primer oligonukleotida. Primer yang digunakan sebagai
pembatas daerah yang diperbanyak adalah DNA untai tunggal yang urutannya komplemen
dengan DNA templatnya. Proses tersebut mirip dengan proses replikasi DNA secara in vivo yang
bersifat semi konservatif (Giri, 2004).
2.8 Polymerase Chain Reaction (PCR)
Polymerase Chain Reaction atau PCR adalah teknik atau metode penggandaan
(replikasi) DNA secara in-vitro. Teknik ini memungkinkan kita untuk melakukan replikasi DNA di
luar sel atau tubuh organisme hidup. Melalui teknik ini, DNA dapat dihasilkan dalam jumlah
melimpah dengan dalam waktu singkat sehingga bisa membantu pekerjaan peneliti atau bidang
lainnya terkait dengan penggunaan DNA sebagai objek kajian. Misalnya untuk , penentuan strain
atau spesies organisme tertentu, deteksi penyakit, deteksi atau kajian gen, terapi gen, serta di
bidang forensik.Teknik ini pertama kali ditemukan oleh Kary Mullis pada tahun 1983 sehingga
beliau memperoleh hadiah Novel atas temuannya tersebut.
Reagen yang digunakan :
1. DNA target hasil ekstraksi. Berdasarkan pengalaman penulis, DNA tersebut dapat diencerkan 510X, sesuai kebutuhan.
2. Sepasang primer yang komplementer dengan DNA target. Primer merupakan fragmen DNA
berukuran pendek dengan panjang 10-25 basa yang akan dijadikan sebagai mengawali proses
replikasi DNA sekaligus membatasi daerah DNA yang akan diamplifikasi,
3. DNA polymerase. Enzim ini berperan dalam mengamplifikasi DNA sesuai dengan urutannya.

16

4. dNTP, terdiri atas 4 macam sesuai dengan basa DNA, yaitu dATP,dGTP, dTTP, dan dCTP.
Berfungsi sebagai building block DNA yang baru dibentuk.
5. Buffer PC R (KCl, Tris-HCL, MgCl2). Buffer ini berfungsi untuk menjaga kestabilan reaksi agar
berjalan secara optimum.
6. ddH2O atau nuclease free water (merk dagang).Berfungsi sebagai pelarut.
Pada saat ini sudah tersedia berbagai macam kit-PCR yang sudah mengandung
reagen-reagen tersebut, kecuali primer dan DNA target tentunya, sehingga kita tidak perlu
mencampurkanya satu persatu.
Prinsip Kerja :
Secara prinsip, PCR merupakan reaksi berulang atau berantai yang melibatkan 20-40 siklus,
tergantung kebutuhan, yang terdiri atas 3 tahap sebagai berikut:
1. Tahap denaturasi (melting), pada suhu 94-960 C.
Pada tahap ini, ikatan hidrogen terputus dan DNA untai ganda masing-masing terpisah menjadi
untai tunggal. Pada proses replikasi DNA secara in-vivo, proses ini dibantu oleh sejumlah enzim
seperti enzim helikase dan girase. Karena sifatnya yang unik, dimana DNA terdenaturasi pada
suhu tinggi dan kemudian dapat terenaturasi kembali pada suhu rendah, maka sifat ini dijadikan
dasar untuk tahap denaturasi proses PCR dengan menggunakan pemanasan. Pemisahan ini
memungkinkan penempelan primer yang komplemen dengan DNA target pada sekuen yang
sesuai. Durasinya berkisar 1-5 menit, tergantung kandungan basa GC dari sekuen DNAnya.
Semakin tinggi GC nya, maka waktunya lebih lama. Sepertihalnya pernah disebutkan bahwa
ikatan GC (3 ikatan hidrogen) lebih kuat dibandingkan dengan AT.
2. Tahap penempelan (annealing), pada suhu 45-600 C
Setelah DNA terdenaturasi, kemudian suhu diturunkan sehingga primer dapat menempel pada
bagian DNA yang komplementer dengan urutan basanya. Penempelan tersebut sifatnya spesifik.
Suhu annealing yang tidak cocok menyebabkan kegagalan dalam replikasi DNA yang benar.
Suhu Annealing (TA) bisa dihitung berdasarkan suhu melting (TM). Jika suhunya terlalu tinggi
dari yang seharusnya, maka primer tidak dapat menempel pada DNA cetakan, sementara jika
suhunya terlalu rendah akan menyebabkan penempelan pada daerah atau sekuen DNA yang
tidak sesuai.
3. Tahap pemanjangan (elongasi), pada suhu 720 C (opsional).
Pada tahapan ini, enzim DNA polymerase melakukan sintesis DNA dengan menambahkan
pasangan basa yang tepat, satu demi satu secara cepat,

pada sisi 3 primer yang telah

menempel pada DNA cetakan. Suhu untuk tahap ini tergantung pada jenis enzim polimerase
yang digunakan. Khusus untuk Taq Polimerase, 720 C adalah suhu yang biasa digunakan.

17

2.9 Inverse Polymerase Chain Reaction (IPCR)

Metode ini digunakan ketika hanya ada satu sekuens internal yang diketahui. Template
didigesti dengan enzim restriksi yang memotong bagian luar daerah yang akan diamplifikasi,
fragmen restriksi yang dihasilkan ditempel dengan ligasi dan diamplifikasi menggunakan sekuens
primer yang memiliki titik ujung yang memiliki jarak yang jauh satu sama lain dengan segmen
eksternal yang telah tergabung. Metode ini khusus untuk mengidentifikasi sekuens antara dari
beragam gen.
2.10

Desain Primer Untuk Kloning Gen Menggunakan PCR

Primer PCR dasar untuk kebutuhan kloning meolekular mengandung :
Sekuens utama : pasangan basa ekstra terakhir dari primer 5 akan ditemani oleh enzim
restriksi (umumnya 3-6bp)
Lokasi restriksi : Lokasi restriksi untuk kloning ( umumnya 6-8bp)
Sekuens hibridisasi : area dari primer yang menempel dengan sekuens yang akan di amplifikasi
(umumnya 18-21bp)
Saat memilih lokasi restriksi, digunakan alat analisis DNA seperti Addegenes sequence
analyzer, untuk mengindentifikasi lokasi restriksi mana yang ada ari sequence yang diberikan.
Enzim yang dipilih memiliki kriteria :
Tidak memotong sisipan
Sesuai dengan lokasi yang diinginkan dalam plasmid penerima yang sudah dipilih
Selanjutnya kita mengamati sekuens DNA yang kita ingninkan untuk di amplifikasi dan
desain primer yang akan di tempel dan replikasi. Kemudian, kita mengamati sekuens DNA yang
akan di amplifikasi dan deasin primer yang akan di gabungkan dan di replikasi.

Gambar 6. Contoh desain primer (Sumber : Addgene.org)

Karena kita mengkloning ORF, kita akan meng-klon dari start kodon (ATG) ke stop kodon
(dalam contoh, TGA). Asumsikan bahwa proses amplifikasi dari plasmid DNA, secara kasar 1821 bp umumnya tidak cukup untuk memberikan secara spesifik dan juga kompatibel dangan
standar reaksi PCR. Maka dari itu, primer depan akan menggunakan sekuens 5'ATGTGGCATATCTCGAAGTAC-3' untuk area yang akan di gabung dengan ORF dan lalu
18

ditambahkan EcoRI restriction site (GAATTC) ke ahir primer 5. Dan menjadikan primer menjadi
Primer 5'-GAATTCATGTGGCATATCTCGAAGTAC-3'.
Untuk reverse primer, desainnya mirip, namun kita membutuhkan untuk me-reverse
pelengkap unuk mendapatkan amplifikasi PCR. Kita dapat memulai dengan mengambil 18 basa
ORF terakhir, termasuk stop kodon (5'-TGGCATATCTCGAAGTACTGA-3'), lalu menambahkan
Notl (GCGGCCGC) dan lalu TAAGCA untuk meningkatkan digestivitas enzim restriksi. Hal ini
akan

memberikan

kita

sebuah

sekuens

5'-

TGGCATATCTCGAAGTACTGAGCGGCCGCTAAGCA-3' ( 30bp dengan 18 bp homolog dengan

ORF). Kita lalu meregenerasi reverse-complement dari sekuens ini untuk mengamplifikasi ORF.
Proses generasi reverse-complemen dari sekuens dapat menggunakan software yang ada. Jika
kita

menaruh

sekuens

yang

kita

pilih

unutk

reverse

primer

(5-

TGGCATATCTCGAAGTACTGAGCGGCCGCTAAGCA-3) kedalam kalkulator maka kita akan

mendapatkan

sekuens

reverse

primer

akhir

dari

5-

TGCTTAGCGGCCGCTCAGTACTTCGAGATATGCCA-3.
2.11

Plasmid Sebagai Vektor

Vektor merupakan suatu molekul DNA yang membawa fragmen gen asing ke suatu
inang, bereplikasi di dalam tubuh inang dan memproduksi banyak salinan dari DNA itu sendiri
beserta gen asing yang tersisip. (McClean, 1997) Ada banyak macam vektor, namun yang
umum digunakan adalah plasmid, phage, cosmid, bacterial artificial chromosomes (BAC), dan
yeast artificial chromosomes (YAC). Walaupun jenisnya bermacam-macam, seluruh vektor
mempunyai tiga komponen berikut:

1. Sekuens yang membuat vektor dapat berpropagasi dalam tubuh (sel) inang.
2. Situs pengkloningan yang dapat disisipkan gen asing.
3. Metode seleksi bakteri; misalnya resistensi terhadap suatu antibiotik tertentu.
Macam-macam vektor beserta karakteristiknya adalah sebagai berikut:
1. Plasmid, merupakan DNA sirkuler ekstrakromosomal yang dapat bereplikasi secara mandiri,
mempunyai batas pengkloningan 0,1-10 kb.
2. Phage, merupakan turunan dari bakteriofag lambda, DNA yang berbentuk linear yang dapat
disisipi gen asing; mempunyai batas pengkloningan 8-20 kb.
3. Cosmid, merupakan DNA ekstrakromosomal yang berupa gabungan antara plasmid dan
phage, mempunyai batas pengkloningan 35-50 kb.
4. Bacterial Artificial Chromosomes (BAC), merupakan suatu struktur yang berdasarkan pada
plasmid mini-F. Batas pengkloningannya adalah 75-300 kb.
5. Yeast Artificial Chromosomes (YAC), berupa kromosom buatan yang mengandung telomer,
origin of replication, sentromer ragi dan selectable marker. Mempunyai batas kloning 1001000 kb.

19

Dalam penggunaannya untuk inang berupa bakteri, plasmid mempunyai beberapa

keunggulan yaitu umumnya tidak berpotensi membunuh sel inang, relatif mudah untuk
dipurifikasi (dimurnikan), dan berukuran kecil (atau dapat dibuat agar berukuran kecil).
Berikut adalah beberapa pertimbangan dalam memilih plasmid yang tepat untuk digunakan
dalam pengkloningan:
1. Ukuran gen yang disisipkan. Jika ukuran gen yang akan disisipkan sangat besar, ada baiknya
untuk menggunakan BAC dan YAC.
2. Jumlah salinan (copy). Untuk produksi protein hasil ekspresi gen asing yang diinginkan dalam
jumlah besar, sebaiknya memilih plasmid dengan jumlah salinan yang besar (high-copy
number). Jika fragmen DNA berpotensi toksik bagi sel jika berjumlah banyak, ada baiknya
menggunakan plasmid dengan low-copy number.
3. Kompatibilitas plasmid dengan enzim restriksi yang dipilih, apakah terdapat situs pemotongan
dari enzim restriksi yang dipilih pada plasmid yang diinginkan.
4. Resistensi antibiotik. Hal ini dapat membantu dalam seleksi bakteri yang mengandung
plasmid.
2.12

Tiga Kegiatan Utama dalam Rekayasa Genetika

Terdapat tiga langkah atau tiga kegiatan utama dalam menjalankan suatu rekayasa
genetika. Dalam kasus ini, rekayasa genetika dilakukan pada DNA plasmid. Tiga kegiatan
tersebut adalah pemotongan, modifikasi, dan penyambungan.
2.12.1. Pemotongan
Pemotongan merupakan kegiatan memotong DNA plasmid pada urutan basa tertentu. Urutan
basa ini tergantung pada jenis enzim restriksi yang digunakan pada saat memotong DNA
plasmid. Biasanya enzim-enzim ini mengenali suatu urutan basa palindrom tertentu (biasanya
pada enzim restriksi Tipe II yang akan dijelaskan kemudian), seperti yang ditunjukkan pada
gambar ini.

Gambar 7. Urutan basa yang simetris antara dua untai DNA pada plasmid.
(Sumber: Old dan Primrose, 2001)

Enzim restriksi, misalnya EcoRI, akan mengenali urutan basa seperti itu dan memotong di
antara basa G dan A pada kedua untai. Hasilnya, segmen tersebut akan menjadi seperti ini.

Gambar 8. Segmen DNA pada plasmid setelah dipotong oleh enzim restriksi

20

(Sumber: Old dan Primrose, 2001)

Jarak antara basa G dan A kemudian dapat disisipkan fragmen DNA lain dari organisme lain
yang sifatnya kita inginkan berada di organisme ini.
Sebenarnya, mekanisme pemotongan DNA ini sudah terjadi alami dalam tubuh bakteri
sebagai cara untuk mempertahankan diri. Mekanisme pemotongan ini menjadi semacam alat
bagi bakteri untuk memonitor setiap DNA baru yang masuk ke tubuh bakteri dan
menghancurkannya apabila DNA tersebut terbukti asing bagi bakteri. Enzim restriksi
endonuklease ini juga mengenali sekuens tertentu pada DNA baru dan menghancurkan DNA
asing dalam beberapa fragmen, bisa terjadi pada situs yang spesifik maupun penghancuran
secara acak. Ilmuwan yang merekayasa gen suatu bakteri tidak menginginkan fragmen asing
pengkode sifat yang diinginkan dihancurkan oleh bakteri itu sendiri saat fragmen itu
diintroduksi ke dalam bakteri, maka plasmid bakteri yang sudah terpotong terlebih dulu harus
menjalani modifikasi sebelum disisipkan fragmen DNA asing.
Molekul-molekul yang Terlibat
1. Enzim Restriksi Endonuklease
Seperti yang disinggung pada bagian sebelumnya, restriksi endonuklease
sebenarnya merupakan bagian dari mekanisme pertahanan bakteri dari DNA asing. Enzim
restriksi endonuklease, seperti disinggung pula pada bagian sebelumnya, berasosiasi dengan
enzim pemodifikasi yang memetilasi DNA. DNA akan selalu terlindungi dari degradasi bahkan
setelah replikasi. Hal ini disebabkan karena replikasi menggunakan prinsip semikonservatif.
Replikasi

semikonservatif

mereplikasi

molekul

yang

termetilasi

pada

kedua

untai,

menghasilkan dua molekul anak yang ter-hemimetilasi. Hemimetilasi sudah cukup untuk
mencegah pemotongan oleh enzim restriksi endonuklease.
Tipe II paling banyak digunakan dalam rekayasa genetika. Keuntungan dari
penggunaan Tipe II dibanding Tipe I dan Tipe III adalah restriksi dan modifikasi dilakukan
dengan enzim yang berbeda, maka pemotongan DNA dapat dilakukan tanpa modifikasi.
Keuntungan kedua adalah aktivitas restriksi tidak memerlukan kofaktor seperti ATP atau Sadenosilmetionin sehingga lebih mudah digunakan. Keunggulan yang terpenting adalah Tipe
II mengenali sekuens tertentu yang spesifik dan memotong di dalam sekuens tersebut. Tipe
IIs mempunyai kofaktor yang sama dengan Tipe II, namun enzim tipe ini memotong di titik
yang jauh dari sekuens pengenalan.
Sistem restriksi bersama dengan sistem modifikasi mempunyai empat tipe yang
berbeda berdasarkan cara kerjanya. Keempat tipe tersebut adalah Tipe I, Tipe II, Tipe III, dan
Tipe IIs. Tipe I memakai satu enzim dengan subunit berbeda-beda untuk pengenalan,
pembelahan (pemotongan), dan metilasi dengan kegiatan pengenalan dan metilasi pada
sekuens tunggal namun memotong DNA hingga 1000 bp. Tipe II menggunakan dua enzim
berbeda yang sama-sama melakukan pengenalan pada sekuens target yang sama dan
simetris, dan kedua enzim ini dapat memotong atau memodifikasi sekuens pengenalan. Tipe
21

III menggunakan satu enzim yang mengandung dua subunit berbeda, satu subunit untuk
pengenalan dan modifikasi, dan satu subunit lain untuk memotong DNA. Enzim ini mengenal
dan memetilasi pada sekuens yang sama namun memotong DNA hingga 24-26 bp. Tipe
terakhir yaitu tipe IIs menggunakan dua enzim yang berbeda dengan sekuens pengenalan
yang asimetrik; pemotongan berlangsung pada satu sisi dari sekuens pengenalan hingga 20
bp. Sistem-sistem ini juga dikenal dengan sistem R-M (Restriction-Modification).
2. DNA-ase
Pada kondisi tertentu di mana enzim restriksi endonuklease tidak dapat digunakan,
pemotongan DNA dapat menggunakan DNase. Hal ini bisa saja disebabkan karena suatu
DNA memiliki komposisi basa yang tak lazim sehingga mempunyai banyak sekuens
pengenalan. Atau misalnya ada kebutuhan untuk membagi DNA menjadi segmen-segmen
yang sangat banyak. Namun, penggunaan DNase menimbulkan satu masalah yaitu tidak
dihasilkannya sekuens untai tunggal yang unik pada ujung-ujung molekul. Semua ujung juga
tidak tumpul. Pengkloningan fragmen-fragmen yang terbentuk menjadi sulit, tapi hal itu dapat
diatasi dengan pemilihan DNA polimerase yang tepat.
2.12.2. Modifikasi
Modifikasi merupakan proses pengubahan pada DNA plasmid agar plasmid tersebut dapat
survive jika dipotong di tempat tertentu yang berpotensi mematikan. Modifikasi ini misalnya
metilasi basa-basa tertentu pada sejumlah urutan DNA atau pelibatan fosfatase untuk
menghilangkan fosfat yang dihasilkan dari proses pemotongan pada urutan basa tertentu
yang berpotensi mematikan.
Molekul-molekul yang Terlibat
1. Fosfatase
Fosfatase adalah enzim yang membuang fosfat dari DNA dan menggantinya dengan gugus
hidroksil. Fosfatase berperan dalam mengeblok reaksi penyambungan yang tidak diinginkan,
misalnya untuk mencegah plasmid yang sudah terpotong untuk menempel dengan ujung
lengketnya sendiri. Fosfatase biasa digunakan jika ujung dari pemotongan yang dihasilkan
adalah ujung tumpul atau pemotongan yang hanya memakai satu jenis enzim restriksi saja.
2. Polimerase
Polimerase yang digunakan pada proses modifikasi terdiri dari empat macam, yaitu DNA
polimerase bergantung-DNA, DNA polimerase bergantung-RNA, RNA polimerase bergantungDNA, dan polimerase tak bergantung-template.
a. DNA polimerase bergantung-DNA
Enzim ini mensintesis untai DNA dengan arah 5 ke 3 menggunakan template DNA.
Enzim ini juga dapat mempunyai aktivitas eksonuklease pada arah 3 ke 5 dan 5 ke 3.
Aktivitas DNA polimerase pada arah 5 ke 3 memungkinkan untai DNA komplementer
disintesis menggunakan template yang tepat, berupa segmen DNA untai tunggal dengan
22

primer yang menempel, atau bisa saja dua untai DNA yang menempel dengan salah satu
untai mempunyai suatu segmen di ujung 5 yang menggantung (tidak mempunyai
komplemen). Komplemennya dapat dibuat dengan menginkubasi DNA tersebut dengan DNA
polimerase dan deoksinukleosida trifosfat yang tepat, menghasilkan ujung DNA yang tumpul.
Proses ini disebut end-filling. Segmen di ujung 5 yang tidak mempunyai komplemen ini juga
dapat dihancurkan menggunakan 5-3 eksonuklease, menghasilkan ujung tumpul juga.
Proses ini dinamakan polishing. Ada juga kondisi di mana segmen di ujung 3 tidak
mempunyai komplemen, dan hal ini dapat diatasi dengan eksonuklease yang bekerja dari
ujung 3 ke 5.

Gambar 9. Cara kerja DNA polimerase dan eksonuklease untuk membentuk ujung tumpul
(Sumber: Howe, 2007)

b. DNA Polimerase Bergantung-DNA

Enzim ini juga disebut RTase (reverse transcriptase), yang bekerja dengan cara menyintesis
DNA dengan cetakan RNA, membalik urutan dari dogma sentral yaitu RNA yang dibuat
menggunakan cetakan DNA. RTase digunakan dalam pembuatan cDNA (complementary
DNA) dan pada proses sequencing. Secara alami, RTase dikodekan oleh retrovirus. RTase
bekerja dengan menyintesis DNA langsung dengan arah 5 ke 3, serta membutuhkan primer
dalam prosesnya.
c. RNA Polimerase Bergantung-DNA
Virus juga dapat mengkodekan RNA polimerasenya sendiri, tidak hanya DNA polimerase.
Pada saat menginfeksi inang, virus dapat menonaktifkan RNA polimerase inang dan
mengarahkan sel inang untuk menyalin genom virus itu sendiri. RNA polimerase ini dapat
digunakan secara in vitro ataupun in vivo.
d. Polimerase Tak Bergantung-Template
Enzim jenis ini tidak memerlukan cetakan (template) untuk menambahkan beberapa
nukleotida. Contohnya adalah transferase terminal yang dihasilkan dari timus anak sapi.
Transferase terminal ini dapat menambahkan satu persatu deoksiribonukleotida ke ujung 3
dari untai DNA. Enzim lain adalah Taq polimerase, yang menambahkan residu dA pada ujung
dari produk PCR.
3. Eksonuklease
Eksonuklease tidak mempunyai keterikatan dengan aktivitas polimerase, namun juga memiliki
kegunaan yang luas. Eksonuklease dimanfaatkan dalam penghancuran ujung yang beruntai
23

tunggal dan pemendekan DNA untai ganda. Dalam memendekkan DNA untai ganda,
eksonuklease dapat beraksi menggunakan dua cara.
a. Penghilangan Kedua Untai Secara Terpisah
DNA dipotong menggunakan enzim restriksi yang menghasilkan ujung 5 yang menonjol.
Ujung ini diperlakukan dengan dua enzim berbeda. Enzim exonuclease III (exoIII) yang
bekerja dari 3 ke 5 akan menghancurkan ujung 3 yang mundur, menghasilkan daerah yang
hanya mempunyai untai tunggal di kedua ujungnya. Molekul DNA ini kemudian akan
diperlakukan dengan eksonuklease spesifik untuk untai tunggal dan menghilangkan ujungujung untai tunggal.
b. Penghilangan Kedua Untai Secara Bersamaan
Pada metode ini, digunakan enzim BaI31 yang bekerja dari 3 ke 5 membentuk ujung dengan
untai tunggal. Ujung dengan untai tunggal ini kemudian didegradasi dengan enzim
endonuklease. Cara ini memungkinkan untuk penghilangan pada kedua ujung secara
simultan.

Gambar 10. Cara kerja eksonuklease

(Sumber: Howe, 2007)

Metilase
Metilase bekerja dengan cara mentransfer gugus metil ke DNA dari S-adenosil metionin. Hal
ini bertujuan agar fragmen DNA asing yang disisipkan ke DNA inang tidak dihancurkan oleh
sistem restriksi yang ada dalam tubuh inang.
2.12.3. Penyambungan (Ligasi)
Penyambungan adalah proses penggabungan fragmen DNA donor dengan fragmen DNA
inang pada urutan basa tertentu.. Ada 3 metode yang dapat digunakan untuk melakukan
melakukan penyambungan (ligasi). Metode pertama memanfaatkan kemampuan DNA ligase
untuk menggabungkan secara kovalen ujung-ujung lengket (kohesif) yang terbuka. Metode
24

kedua bergantung kepada DNA ligase bakteri E.coli yang terinfeksi T4 untuk membentuk
ikatan fosfodiester antar fragmen ujung tumpul. Metode ketiga memanfaatkan enzim
deoksinukleotidiltransferase terminal untuk sintesis ujung tunggal 3 homopolimer pada ujung
fragmen.
1.

Metode menggunakan DNA Ligase

Metode menggunakan DNA ligase dipakai pada E.coli maupun pada E.coli yang terinfeksi
bakteriofag T4. DNA ligase bekerja dengan menyegel nicks beruntai tunggal di antara
nukleotida berdekatan pada rantai DNA duplex. Meskipun reaksi yang dikatalisis oleh enzim
pada E.coli maupun pada E.coli yang terinfeksi T4 itu sama, namun enzim-enzim pada kedua
jenis E.coli tersebut memiliki kofaktor yang berbeda. Enzim T4 membutuhkan ATP sebagai
kofaktor, sementara enzim E.coli membutuhkan NAD+.

Pada kedua jenis E.coli tersebut,

kofaktor akan berpisah dan membentuk komplek enzim-AMP. Kompleks tersebut akan
berikatan dengan nick yang mengekspos 5 fosfat dan 3-OH, dan membuat ikatan kovalen
pada tautan fosfodiester.

Gambar 11. Cara Kerja DNA ligase

(Sumber: Old dan Primrose, 2001)

2.

Metode Pembentukan Ekor Homopolimer

Metode ini melibatkan penempelan ekor yang terdiri dari sekuens homopolimer yang
komplementer. Kemudian, dengan penambahan sekuens oligo(dA) pada ujung 3 pada satu
populasi molekul DNA dan sekuens oligo(dT) pada ujung 3 pada populasi molekul DNA yang
lain, maka kedua molekul DNA tersebut dapat menempel untuk membentuk lingkaranlingkaran dimerik.
Enzim deoksinukleotidiltransferase akan melakukan penambahan nukleotida secara berulang
pada ujung 3-OH jika disajikan dengan deoksinukleotida fosfat yang tunggal. DNA dengan
25

ujung 3-OH yang terekspos , yang dapat dihasilkan dari pra-perlakuan dengan
eksonuklease atau pemotongan dengan enzim restriksi seperti PstI, sangat cocok untuk
enzim transferase tersebut. Namun, ternyata cara ini juga dapat diterapkan pada DNA yang
dipotong oleh EcoRI.
3.

Metode Penggabungan Molekul DNA Tanpa Enzim Ligase

Shuman (1994) telah mendeskripsikan sebuah pendekatan untuk mensintesis molekulmolekul rekombinan di mana ia menggunakan enzim vaccinia DNA topoisomerase yang dapat
melakukan pemotongan dan penggabungan kembali dari molekul DNA. Kemudian Heyman
dkk. menerapkan sifat dari vaccinia topoisomerase untuk mengembangkan teknologi
penyambungan DNA secara kovalen tanpa memakai ligase. Jika biasanya penggunaan ligase
dapat memakan waktu semalaman, maka dengan teknologi ini penyambungan dapat
berlangsung dalam lima menit saja.
Molekul-molekul yang Terlibat

T4 DNA Ligase
T4 DNA ligase dikodekan oleh bakteriofag T4, dan dibuat dalam tubuh E.coli yang terinfeksi.
DNA ligase ini dapat mengerjakan penyambungan baik untuk ujung tumpul maupun ujung
lengket (sticky end) dan membutuhkan ATP agar bisa bekerja. Enzim ini juga membutuhkan
3-OH dan 5-fosfat agar dapat melakukan penyambungan.
DNA ligase E.coli
Merupakan enzim yang dihasilkan oleh bakteri itu sendiri, ia tidak dapat melakukan
penyambungan ujung tumpul. Juga membutuhkan 3-OH dan 5-fosfat seperti T4 DNA ligase
namun membutuhkan NAD+ alih-alih ATP.
Topoisomerase
Topoisomerase merupakan enzim lain yang mempunyai aktivitas penyambungan. Normalnya,
topoisomerase berfungsi untuk mempengaruhi derajat puntiran (supercoiling) dari molekul
DNA. Topoisomerase bekerja dengan memisahkan kedua untai DNA untuk menurunkan
tegangan kemudian menyatukan kedua untaian DNA itu lagi. Penyambungan dengan
topoisomerase memungkinkan proses yang lebih cepat dibanding jika menggunakan DNA
ligase konvensional.
Rekombinase
Banyak ragam dari sistem rekombinasi berbasis fag yang mengkatalisis pemisahan dan
penyambungan kembali dari molekul pada situs yang spesifik. Rekombinase dimanfaatkan
untuk modifikasi genetik dari hewan transgenik. Sistem rekombinasi ini salah satunya
digunakan pada bakteriofag lambda, di mana virus tersebut mempunyai sistem untuk
mengarahkan rekombinasi antara genom dari virus dengan kromosom dari inang dan
mengkatalisis proses insersinya.
Transposase
26

Elemen genetik yang transposable dapat berpindah-pindah dari satu titik di DNA ke titik lain
menggunakan enzim transposase. Enzim ini dapat digunakan untuk insersi origin of
replication atau gen yang resisten terhadap antibiotik.
2.13

Sel Kompeten dan Transformasi Genetik

Sel kompeten merupakan sel bakteri yang memiliki kemampuan untuk mengambil
DNA eksogenus dan mengintegrasikan DNA eksogenus tersebut ke dalam genomnya.
Kompetensi sel ini dapat diperoleh secara alami dan buatan, melalui transformasi DNA yang
dapat terjadi secara alami maupun melalui rekayasa manusia. Tidak semua bakteri mampu
mentransformasi DNA eksogenus ke dalam genom mereka. Bakteri disebut kompeten secara
alami apabila ia memiliki kemampuan untuk mengambil DNA eksogenus kedalam sel dan
mentransformasikannya ke dalam genom. Mekanisme transformasi DNA pada bakteri secara
umum meliputi langkah berikut:

1. Pengenalan dan penempelan dsDNA eksogenus pada dinding sel bakteri

2. dsDNA masuk ke dalam dinding dan membran sel melalui protein penyalur
3. dsDNA

mengalami

degradasi pada salah satu

untainya, sehingga dsDNA
terurai menjadi ssDNA dan
nantinya akan masuk ke
dalam sitoplasma

4. Di

sitoplasma,

ssDNA

eksogen

akan

menjadi

template

untuk

sintesis

dsDNA baru yang akan

terintegrasi
kromosom

dalam
atau

menjadi

plasmid baru
Fenomena

transformasi

DNA pada bakteri pertama

kali

ditemukan

oleh

F.

Griffith pada tahun 1928

yang menemukan dua tipe
Streptococcus
pneumoniae: tipe patogen
(yang

memiliki

kapsul

polisakarida; smooth; S) dan tipe non-patogen (tidak memiliki kapsul polisakarida; rough; R).
Gambar 12 Langkah-langkah transformasi DNA pada bakteri Gram

27

positif dan negatif

(Sumber: www.nature.com)

Griffith membunuh bakteri S dengan memanaskan dan menyuntikkan suspensi selnya pada
tikus, dan tikus tersebut tetap hidup. Hal ini menunjukkan bahwa sisa-sisa sel S yang telah
mati tidak virulen. Kemudian, Griffith mencoba mencampurkan sel S yang telah mati pada
suspensi sel non-patogen dan menyuntikkan campuran tersebut pada tikus uji, kemudian tikus
tersebut mati. Ternyata, perubahan pada sel R bukan hanya sifat virulensi. Griffith mengisolasi
bakteri R dari bangkai tikus, dan ternyata bakteri R yang morfologi koloninya kasar menjadi
halus. Dari percobaannya, Griffith menyimpulkan bahwa ada materi sisa dari bakteri S mati
yang diambil dan diekspresikan dalam bakteri R hingga bakteri R berubah menjadi virulen
(patogen). Fenomena yang ditemukan oleh Griffith inilah yang disebut sebagai transformasi
genetik.
Dapat disimpulkan bahwa, transformasi genetik merupakan proses perubahan genetik dari sel
bakteri sebagai hasil dari penyerapan langsung, penyatuan, dan ekspresi materi genetik
eksogenus dari lingkungan sel melalui membran sel. Materi genetik yang dimaksud dalam hal
ini adalah gen yang memiliki kode-kode DNA yang dibutuhkan untuk menghasilkan protein
tertentu, yang kemudian akan menghasilkan sifat baru. Transformasi (termasuk konjugasi
dan transduksi) dapat terjadi secara alami pada beberapa spesies bakteri. Dalam rekayasa
genetika, transformasi genetik merupakan tahap yang penting untuk mengintegrasikan
plasmid rekombinan ke sel inang dan mereplikasinya. Pada dasarnya, transformasi
merupakan proses yang sangat tidak efisien karena persentase sel bakteri kompeten yang
mengalami transformasi genetik sangat kecil, hanya sedikit fraksi DNA plasmid yang dapat
masuk ke dalam sel bakteri. Maka dari itu, dibutuhkan metode-metode buatan, baik secara
langsung atau tidak langsung untuk mengintegrasikan materi genetik ke bakteri.

28

Gambar 13. Prosedur transformasi DNA yang dilakukan oleh Griffith

(Sumber: Pearson Education, 2004)

2.13.1 Metode Transformasi Genetik Langsung

1. Metode Kejutan Panas (Heat-Shock)
Merupakan metode transformasi pada bakteri E.coli yang pertama kali dikembangkan pada
tahun 1970 oleh M. Mandel dan A. Higa. Metode ini merupakan metode paling sederhana di
mana bakteri E.coli yang akan ditransformasi diinkubasi pada larutan yang mengandung
kation divalen (umumnya magnesium klorida, kemudian kalsium klorida pada kondisi dingin,
yang kemudian dipaparkan pada pulsa heat shock).
Membran sel E.coli mempunyai ratusan pori-pori yang disebut dengan zona adisi, dan
tersusun dari molekul-molekul negatif. Bakteri E.coli memiliki permukaan yang bermuatan
negatif akibat adanya fosfolipid dan lipopolisakarida, sehingga digunakan kation divalen yang
berfungsi untuk melindungi muatan negatif DNA agar dapat melekat pada permukaan E.coli.
Walaupun ukuran zona adisi terbilang cukup besar untuk DNA yang akan masuk, karena
DNA juga bermuatan negatif, maka akan terjadi tolakan. Penggunaan larutan CaCl2 sebagai
medium akan menyumbangkan ion kalsiumnya yang bermuatan positif, sehingga keadaan
menjadi netral.
Penurunan temperatur sampai 00C menyebabkan molekul lipid menjadi lebih diam dan
keadaan menjadi lebih stabil. Selain itu, pemaparan E.coli pada larutan kation divalen yang
bertemperatur dingin akan melemahkan struktur permukaan E.coli dan mempengaruhi
porositas membran sel sehingga pada saat terjadi lonjakan temperatur, membran selnya
menjadi tidak selektif terhadap molekul asing (dan permeabel terhadap DNA plasmid). Akan
terjadi induksi untuk membuat celah sehingga DNA plasmid superkoil dapat masuk ke
bagian dalam sel. Selanjutnya, pemaparan heat shock akan membentuk ketidakseimbangan
termal pada kedua sisi membran sel, sehingga DNA plasmid dapat masuk melalui pori-pori
sel atau dinding sel yang dirusak tersebut.

Gambar 14. E.coli sebaiknya dielektroporasi pada fase log

(Sumber: Pearson Education, 2016)

Seperti yang sudah dijelaskan, bakteri yang mudah dilewati DNA disebut bakteri kompeten.
E.coli akan bersifat kompeten jika ia sedang tumbuh dengan sangat cepat (berada pada fase
log, dibanding pada fase-fase lainnya). Maka dari itu, tahap transformasi genetik sebaiknya
dilakukan saat E.coli berada dalam fase log.
29

2. Elektroporasi

Gambar 15. Prinsip transformasi plasmid rekombinan pada bakteri E.coli menggunakan metode
elektroporasi
(Sumber: www.btxonline.com)

Metode elektroporasi merupakan metode yang menggunakan kejutan listrik untuk

membentuk lubang-lubang pada membran sel, sehingga DNA plasmid dapat memasukinya.
Aliran listrik yang digunakan dalam elektroporasi akan menyebabkan membran sel
mengalami kerusakan dan terbentuknya pori sementara pada lapisan hidrofobik sekitar 2
nm, sehingga sel bakteri dapat menyerap DNA eksogenus dari larutan suspensi.
Sebagian sel akan bertransformasi dengan stabil, sehingga dapat diseleksi selanjutnya. Dua
mekanisme yang konsisten dalam elektroporasi adalah: pembukaan kompartemen baru
(interior dari sel) agar DNA dapat berdifusi secara pasif ke dalam sel bakteri, dan aliran ruah
dari medium yang mengandung DNA plasmid, menuju ke sel bakteri. Difusi molekul DNA
memang akan sedikit lambat, tetapi jarak antara sel dan DNA sangat kecil sehingga
mekanisme ini memungkinkan DNA plasmid untuk masuk dalam sel bakteri. Sel bakteri juga
dapat menerima 10% dari volume aliran ruah yang dipengaruhi oleh kekuatan osmotik
mediumnya.
Elektroporasi dilakukan dengan mengintroduksikan suspensi sel terkonsentrasi dan plasmid
DNA rekombinan pada medan listrik dengan amplitudo yang sangat tinggi. Proses
elektroporasi sangat bergantung pada dua karakteristik pulsa listrik: kekuatan medan listrik
dan

panjang

pulsa

(konstanta

waktu-hambatan-kapasitas).

Sedangkan,

efisiensi

elektroporasi bergantung pada banyak faktor, seperti temperatur, parameter medan listrik
(voltase, resistansi dan kapasitansi), bentuk topologis DNA, dan faktor sel inang (latar
belakang genetik, kondisi tumbuh, dan kondisi setelah kejutan listrik). Frekuensi transformasi
menunjukkan fungsi yang linear dengan konsentrasi DNA dalam enam tingkat orde.
Sedangkan, efisiensi transformasi merupakan fungsi dari konsentrasi sel bakteri. Sebagian
besar sel bakteri yang tetap hidup merupakan bakteri yang kompeten, dan 80% di antaranya
bertransformasi pada konsentrasi DNA yang tinggi.
30

Dari penelitian Dower et al., didapatkan hubungan sebagai berikut:

1. Besar pulsa terhadap panjang pulsa
Melemahkan medan listrik akan meningkatkan panjang pulsa yang dibutuhkan untuk
melakukan transformasi genetik pada sel bakteri secara maksimal, sedangkan
mengurangi panjang pulsa akan meningkatkan amplitudo yang dibutuhkan medan untuk
melakukan transformasi genetik. Kombinasi yang optimal antara kekuatan medan dan
panjang pulsa menghasilkan efisiensi transformasi sebanyak 2-3 x 109/g.
2. Frekuensi transformasi terhadap konsentrasi DNA
Konsentrasi DNA plasmid menentukan probabilitas sel yang akan ditransformasi.
Frekuensi transformasi bergantung pada volume (konsentrasi DNA) dan transforman
yang diperoleh merupakan produk hasil kali dari frekuensi dan jumlah sel bakteri.
3. Pengaruh pra- dan pasca-inkubasi sel bakteri dan DNA
Menambah waktu inkubasi DNA dengan sel bakteri sebelum diberi perlakuan
elektroporasi akan meningkatkan kemungkinan transformasi. Meskipun begitu, waktu
inkubasi yang berlebihan dapat menyebabkan terpotongnya plasmid rekombinan yang
diintroduksikan karena sel bakteri menghasilkan nuklease dalam suspensi sel.
Elektroporasi merupakan metode transformasi genetik dengan efisiensi transformasi tinggi
(efisiensi transformasi merupakan rasio yang menunjukkan jumlah bakteri yang dapat
menerima plasmid dengan sukses per total bakteri yang disebar). Selain itu, dari penelitian
Sheng, et al., diketahui bahwa elektroporasi merupakan langkah transformasi genetik yang
tepat apabila DNA plasmid yang diintroduksikan pada E.coli berukuran besar. Elektroporasi
memperbesar kemungkinan transforman dapat mengambil DNA plasmid berukuran besar
dengan gradien voltase dan konstanta waktu yang berbeda-beda. Efisiensi transformasi
DNA plasmid berukuran besar juga tetap tinggi dengan menggunakan metode elektroporasi.
3. Polyethylen glycol-mediated protoplast (PEG)
Merupakan proses introduksi DNA yang dilakukan tanpa melalui vektor perantara.
Transformasi protoplas umumnya dilakukan pada tanaman monokotil jenis serealia. Teknik
ini menggunakan senyawa polyethylen glycol (PEG) sebagai perantara masuknya DNA ke
dalam kromosom tanaman. Keberhasilan teknik transformasi dengan PEG masih rendah
karena regenerasi protoplas sangat bergantung pada jenis genotipe yang dipakai dan tidak
dapat diaplikasikan pada semua sel tanaman.
4. Biolistik (Particle Bombardment)
Metode biolistik (biolistic), particle bombardment, atau biolistic particle delivery system
merupakan metode transfer gen yang digunakan untuk melakukan transformasi sel secara in
situ. Metode ini diawali dengan proses pelapisan partikel macroprojectiles (seperti emas atau
tungsten atau logam berat lainnya) dengan plasmid DNA sebagai microprojectiles.

31

Gambar 16. Metode biolistik (particle bombardment)

(Sumber: Brooks, 2015)

DNA target akan diletakkan diatas permukaan emas sekitar 0.51.5 m, kemudian
dilakukan penembakan dengan perangkat gene gun yang menembak dengan tekanan tinggi.
Materi genetik yang dimasukkan ke dalam sel disebut sebagai trans gene. DNA yang sudah
terlapisi dengan emas akan masuk ke dalam jaringan dan melakukan integrasi ke dalam DNA
kromosom secara acak. Metode ini dirancang untuk transformasi sel tumbuhan, dan mampu
mentransformasi hampir semua jenis sel dan tidak terbatas pada materi genetik dari nukleus,
tetapi plastida dan organel yang memiliki materi genetik lainnya juga dapat ditransformasi.
2.13.2 Metode Transformasi Genetik Tidak Langsung
Agrobacterium tumefaciens merupakan bakteri Gram positif yang bersifat fitopatogen pada
tanaman dikotil. Bakteri tersebut mempunyai kemampuan yang secara alami dapat
mentransfer potongan DNA (transfer DNA) ke dalam genom tanaman dan menyebabkan
terbentuknya tumor (crown gall), yang merupakan sumber karbon bagi A. tumefaciens.
Kemampuan A. tumefaciens tersebut digunakan untuk menyisipkan gen bermanfaat ke
dalam tanaman seperti gen yang berperan dalam perbaikan sifat. Transformasi dengan A.
tumefaciens memiliki beberapa keuntungan, seperti mudah dilakukan, integrasi ke dalam
genom DNA yang stabil, dan efisiensi transformasi yang cukup tinggi. Transformasi dengan
A. tumefaciens juga memiki efisiensi transformasi dengan salinan gen tunggal yang
dihasilkan lebih tinggi. Akan tetapi, keberhasilan transformasi A. tumefaciens masih terbatas
pada genotipe tanaman tertentu.
2.14

Skrining dan Seleksi

Menurut Muladno (2002), ada tiga kemungkinan yang dapat terjadi setelah tahapan

transformasi dilakukan, antara lain:

32

a. Sel inang tidak dimasuki DNA apa pun. Hal ini mengindikasikan transformasi yang dilakukan
gagal.
b. Sel inang dimasuki vektor, tetapi tanpa fragmen sisipan yang diinginkan. Hal ini mengindikasikan
proses rekayasa gagal.
c. Sel inang dimasuki vektor rekombinan dengan fragmen sisipan yang diinginkan. Hal ini
mengindikasikan proses rekayasa berhasil.
Menemukan dan memisahkan bakteri yang mengandung hasil insersi yang diinginkan di antara
semua sel merupakan kerja yang sulit. Proses tersebut melibatkan penelusuran semua sel
rekombinan yang diperoleh dari transformasi untuk menemukan klon yang diinginkan. Proses ini
dinamakan dengan proses skrining dan seleksi. Metode skrining dan seleksi yang umum dilakukan
adalah inaktivasi insersi menggunakan substrat kromogenik (skrining biru-putih atau blue-white
screening) dan resistensi antibiotik.
2.14.1 Metode Inaktivasi Insersi Menggunakan Substrat Kromogenik (Skrining Biru-Putih atau
Blue-White Screening)
Skrining biru-putih (blue-white screening) merupakan salah satu teknik visual screening umum
pada bakteri Gram negatif seperti E.coli. Prinsip dari metode ini didasarkan pada reaksi
penguraian X-gal yang merupakan substrat kromogenik.

Gambar 17. Reaksi penguraian X-gal menjadi galaktosa dan 5,5-dibromo-4,4-dikloro-indigo

(Sumber: www.commons.wikimedia.org)

Penguraian X-gal dan peningkatan fenotipe Lac operon diinduksi oleh adanya isopropilthio--Dgalaktosida (IPTG) dan dikatalisis oleh enzim -galaktosidase yang dikode oleh gen LacZ, yang
merupakan gen pertama dalam Lac operon E.coli. Enzim -galaktosidase merupakan tetramer
yang menghidrolisis laktosa menjadi glukosa dan galaktosa, dan tiap-tiap monomer terdiri atas
2 bagian: LacZ- dan LacZ-. Jika dilakukan delesi pada fragmen DNA , maka fragmen
33

akan menjadi tidak berfungsi. Insersi fragmen gen penghasil -glukosidase dilakukan pada
residu asam amino 11-41 LacZ, yang akan mengganggu fragmen LacZ-, sehingga gen LacZ
menjadi inaktif atau tidak sempurna (maka dari itu, metode ini disebut inaktivasi insersi). Gen
LacZ yang tidak sempurna tidak bisa menyandi -galaktosidase yang dapat menghidrolisis Xgal pada medium menjadi galaktosida dan 5,5-dibromo-4,4-dikloro-indigo yang berwarna biru,
tetapi jika plasmid tidak mempunyai gen penghasil -glukosidase atau bakteri tidak mengalami
transformasi genetik dengan plasmid rekombinan, maka LacZ akan mengekspresikan enzim galaktosidase. Berarti, dalam skrining ini, gen -glukosidase merupakan marka seleksi.
Sehingga, pada medium padat, koloni bakteri E.coli yang menghasilkan enzim -galaktosidase
menjadi berwarna biru, sedangkan koloni yang tidak menghasilkan enzim tetap berwarna putih.

Gambar 18. Insersi gen yang diinginkan pada multiple cloning site gen LacZ mengganggu fragmen
LacZ- dan menghambat pembentukan peptida , sehingga enzim -galaktosidase tidak berfungsi
(Sumber: Nicholl, 2008)

Hal-hal yang Harus Diperhatikan

Meskipun prinsip teknik blue-white screening mudah, teknik ini mempunyai beberapa
kelemahan, antara lain: teknik blue-white screening merupakan teknik screening, bukan teknik
seleksi (pemilihan klon yang tepat). Selain itu, pembedaan bakteri hanya didasarkan pada
identifikasi warna koloninya saja. Hasil screening bisa saja menunjukkan false positive,
misalnya pada kasus gen LacZ yang tidak berfungsi dan tidak dapat mengkode galaktosidase, sehingga tidak dapat mengubah X-gal menjadi senyawa berwarna biru. Jadi,
koloni putih yang terlihat bukanlah koloni bakteri yang memiliki plasmid rekombinan, tetapi
hanya koloni bakteri yang gen LacZ-nya tidak berfungsi. Vektor-vektor yang terlinearisasi dan
tidak mengandung gen -glukosidase kemudian tidak sempat tersambung kembali karena telah
didegradasi nuklease terlebih dahulu juga memiliki LacZ- yang tidak berfungsi, sehingga tidak
dapat mengkode -galaktosidase dengan sempurna. Di sisi lain, false negative juga bisa terjadi.
Koloni bakteri yang berwarna biru juga mungkin telah mengalami transformasi genetik dengan
34

Plasmid rekombinan, tetapi insersi gen barunya berada di daerah koding peptida dan tidak
memiliki kodon stop, sehingga protein fusi yang masih bisa diekspresikan oleh LacZ- masih
bisa terbentuk (aktivitas -glukosidase hanya terinaktivasi sebagian), atau gen yang diinsersi
sangat pendek dan tidak sampai mengganggu fragmen LacZ-. Meskipun begitu, koloni false
negative umumnya berwarna biru muda, tidak seperti koloni true negative yang berwarna biru
tua. Maka dari itu, untuk mengetahui apakah insersi telah dilakukan dengan tepat, lebih baik
diperiksa kembali menggunakan pengurutan DNA (DNA sequencing). Terakhir, prosedur bluewhite screening sangat kompleks dan menggunakan substrat X-gal yang sangat mahal, tidak
stabil, dan rumit.

Gambar 19. Bakteri E.coli yang telah mengalami transformasi genetik dengan plasmid rekombinan akan
menghasilkan warna putih. Sedangkan, bakteri yang mengalami transformasi genetik dengan plasmid
yang tidak sukses terligasi gen yang diinginkan atau tidak mengalami transformasi genetik sama sekali
akan menghasilkan warna biru

35

(Sumber: www.oregonstate.edu)

2.14.2 Metode Seleksi Resistensi Antibiotik

Metode seleksi ditujukan untuk memilih klon yang tepat (bakteri yang telah ditransformasi oleh
plasmid rekombinan). Metode seleksi yang umum digunakan adalah resistensi antibiotik.
Antibiotik seperti ampicillin merupakan penisilin semisintetik yang stabil terhadap asam atau
amidase tetapi tidak tahan terhadap enzim -laktamase. Bakteri yang telah dimasukin plasmid
rekombinan dengan gen AmpR mampu menyandi enzim -laktamase yang menghidrolisis
ikatan 4-cincin betalaktam dari antibiotik beta-laktam seperti ampicillin, dan mendegradasinya
sehingga bakteri tidak akan mati karena keberadaan antibiotik tersebut. Maka dari itu, ketika
bakteri pembawa plasmid rekombinan ditumbuhkan dalam media yang mengandung ampicillin,
maka bakteri tersebut akan tetap tumbuh, sementara bakteri yang tidak membawa plasmid
rekombinan akan mati. Berarti, dalam seleksi ini, gen pembawa sifat resisten terhadap
ampicillin merupakan marka seleksi yang dapat membedakan bakteri yang berhasil melakukan
transformasi genetik dengan plasmid rekombinan dan yang tidak. Selain itu, metode seleksi
resistensi antibiotik merupakan metode yang cukup penting dilakukan untuk mempertahankan
gen AmpR yang terdapat dalam plasmid.

Gambar 20. Template plasmid yang memiliki gen LacZ dan Amp

(Sumber: www.discoveryandinnovation.com)

2.15

Pendeteksian Ekspresi Gen

Pada penelitian yang dilakukan Rajoka, dkk, 1997, Beliau dan kawan-kawannya
merekombinasi gen BgI ke dalam E.coli dan mendapatkan hasil bahwa rekombinanrekombinan tersebut menghitamkan gel esculin dan membentuk zona kuning pada gel pNPG.
Kedua gel ini ternyata memiliki keunikan untuk menganalisis apakah enzim -glukosidase
berada atau dihasilkan oleh bakteri yang telah dimasuki plasmid rekombinan.

2.15.1 Deteksi Menggunakan Gel Esculin

Gel esculin adalah gel yang mengandung senyawa Aesculin. Senyawa Aesculin ini
mempunyai ikatan -1,4-glikosida yang dapat diputus ikatannya oleh enzim -glukosidase.
Komposisi gel esculin disajikan pada tabel di bawah.
Tabel 1. Komposisi dari Gel Esculin

36

Oxbile (Oxgall)

40.0gm

Pancreatic Digest of Gelatin

5.0gm

Beef Extract

3.0gm

Esculin

1.0gm

Ferric Citrate

0.5gm

Agar

15.0gm

(Sumber: www.catalog.hardydiagnostics.com)

Gambar 21. Senyawa Aesculin

(Sumber: www.en.chembase.cn)

Apabila E.coli yang telah disisipkan gen -glukosidase mampu mengekspresikan gen dari
Rhizomucor miehei dan menghasilkan enzim tersebut ditempatkan pada gel esculin, maka
esculin yang ada akan terhidrolisis menjadi esculetin dan berubah warna menjadi coklat tua
mendekati hitam. Hal ini merupakan tanda keberadaan enzim -glukosidase.

Gambar 22. Reaksi esculin yang terhidrolisis oleh enzim -glukosidase dan berubah menjadi esculetin
yang berwarna coklat tua mendekati hitam
(Sumber: www.microbeonline.com)

Pada tabel tersebut, dapat dilihat bahwa gel esculin mengandung garam oxbile. Padahal,
karena adanya keberadaan garam oxbile ini, E.coli tidak dapat hidup, karena ia adalah bakteri
37

nonhalofilik. Maka dari itu, analisis keberadaan -glukosidase pada E.coli dilakukan dengan
menghilangkan terlebih dahulu kandungan garam oxbile dalam gel esculin.
2.15.2 Deteksi Menggunakan pNPG
Enzim -glukosidase hasil isolasi dapat dideteksi menggunakan substrat sintetik p-nitrofenilalfa-D-glukopiranosida (pNPG), yang dihidrolisis untuk melepaskan p-nitrofenol yang akan
mengeluarkan warna kuning pada larutan alkali.
Enzim selulobiase mengkatalisis hidrolisis ikatan -1,4-glikosidik yang ditemukan dalam
selulosa. Enzim ini dapat ditemukan pada organisme-organisme seperti fungi dan bakteri yang
dapat memecah selulosa. Untuk mengetahui keberadaan enzim ini dalam suatu larutan, maka
biasanya kita mengetahui keberadaan produk yang akan dihasilkan oleh enzim ini. Namun, baik
substratnya (selulosa) maupun produknya (glukosa) tidak berwarna, jadi sulit bagi kita
mengetahui keberadaan enzim ini secara kuantitatif.
Untuk mempermudahnya, kita tidak menggunakan selulosa sebagai substrat, melainkan
sebuah substrat artifisial yang lain, yaitu p-nitrofenil glukopiranosida. Substrat artifisial ini dapat
juga terikat pada enzim dan dipecah menjadi glukosa and p-nitrophenol. ketika p-nitrophenol
dicampur di dalam larutan alkali (atau stop solution), maka akan dihasilkan warna kuning pada
larutan tersebut.

Gambar 23. p-nitrofenil-alfa-D glukopiranosida (larutan tidak berwarna)

(Sumber: www.slideplayer.com)

38

Gambar 24. Reaksi hidrolisis pNPG yang menghasilkan glukosa dan warna kuning (pnitrofenol)
(Sumber: www.slideplayer.com)
Warna kuning dari p-nitrofenol dapat diukur menggunakan spektrofotometer, di mana jumlah pnitrofenol berhubungan dengan intensitas warna dan hubungannya linear.
2.16

Pengecekan Final
Pengecekan final dilakukan dengan SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulphate
Polyacrylamide Gel Electrophoresis). SDS-PAGE adalah metode membedakan protein
berdasarkan massa molekul. Cara memisahkannya adalah dengan menaruh protein ke dalam
gel poliakrilamida dan menempatkan gel tersebut di dalam buffer yang dialirkan arus listrik.
Protein yang pada dasarnya adalah molekul bermuatan yang akan bergerak apabila
ditempatkan pada medan listrik. Tujuan dilakukan SDS-PAGE adalah untuk memisahkan
protein berdasarkan ukuran mereka. Sama seperti prinsip pada elektroforesis asam nukleat,
kita bisa mengelektroforesis protein untuk memisahkan mereka berdasarkan massa
molekulnya. Senyawa yang memiliki muatan akan bermigrasi menyebrangi gel untuk menuju
tempat yang berbeda muatan dengannya. Prosedur pengerjaan metode ini adalah:
1. Mempurifikasi protein dari sel dan melarutkannya dalam buffer, yang mengandung SDS dan
komponen lainnya.
2. Membuat gel poliakrilamida dari bubuk poliakrilamida.
3. Mengaplikasian sampel yang telah dilarutkan di dalam buffer ke dalam sumur pada gel
poliakrilamida.
4. Menuangkan buffer pada masing-masing kutub, dan memasukan elektroda positif di bagian
seberang sumur dan negatif di bagian dekat sumur, kemudian menyalakan power.
5. Menunggu hingga protein terpisah-pisah membentuk band-band pada gel (ini dapat dilihat
lewat alat imaging).
Dalam SDS-PAGE, ada beberapa bahan utama yang akan digunakan: yaitu polyacrylamide
gel, buffer, dan detergent SDS.

2.16.1 Polyacrylamide Gel

Polyacrylamide gel merupakan polimer dari akrilamida dengan ikatan silang bis-akrilamida
yang akan membentuk gel apabila ditempatkan di dalam air. Gel ini digunakan karena
mempunyai pori yang lebih kecil dibandingkan dengan agarosa, sehingga pemisahan dapat
terjadi lebih baik, dan bersifat inert sehingga tidak akan bereaksi dengan protein yang
ditempatkan di dalamnya. Ketika protein berada dalam gel, mereka akan terpisah berdasarkan
massa molekul. Protein besar akan sulit untuk bermigrasi lewat media berpori (gel)
dibandingkan dengan protein kecil. Semakin kecil pori-pori, maka molekul yang dapat
bergerak hanya molekul yang kecil saja. Besar pori-pori dalam gel dapat disesuaikan
berdasarkan konsentrasi polikarilamida yang digunakan.
39

Tabel 2. Persen poliakrilamida yang dibutuhkan untuk massa protein yang berbeda

(Sumber: www.bitesizebio.com)

2.16.2 SDS (Sodium Dodecyl Sulphate)

SDS merupakan salah satu deterjen yang digunakan pada SDS-PAGE. Pergerakan spesies kimia
yang bermuatan dapat dibedakan dari muatan bersih dan jari-jari molekulnya. Muatan bersih
dalam protein ditentukan oleh jumlah muatan di dalam setiap asam amino pembentuk protein
tersebut. Bentuk molekul protein yang sama dengan jumlah muatan yang berbeda-beda akan
membuatnya bergerak dengan kecepatan yang berbeda. Padahal, kita ingin memisahkan protein
berdasarkan berat molekulnya saja. Untuk itu, kita harus menghancurkan struktur sekunder, tersier
dan kuartener dari protein tersebut dengan mereduksinya agar membentuk molekul linear,
sehingga jumlah muatannya sama.
SDS apabila dipanaskan dan dengan keberadaan agen pereduksi lainnya akan melinearkan
protein yang terlipat, dan melapisi protein dengan muatan negatif yang seragam, yang menutupi
muatan pada gugus alkil protein. SDS juga berfungsi untuk memastikan protein yang telah
dilinearisasi tetap dalam keadaannya (tidak kembali ke bentuk semula).

Gambar 25. Kegunaan SDS dalam melinearkan protein dan melapisi dengan muatan
(Sumber: www.bio.davidson.edu)

2.16.3 Buffer
Biasanya pada SDS-PAGE, digunakan gel Laemmli yang terdiri dari 2 gel berbeda dalam pH
(stacking dan running). Protein baru benar-benar terpisahkan ketka mencapai running gel. Saat
semua protein mencapai gel running pada waktu yang sama, pergerakan protein merupakan
fungsi berat molekul saja (tidak tergantung pada jumlah muatan), dan efek kesalahan dalam
loading sample atau kesalahan lain dapat dikurangi.

40

Gambar 26. Efek Buffer pada SDS-PAGE

(Sumber: www.bio-rad.com)

41

BAB 3
STRATEGI KLONING

Secara umum, strategi kloning gen -glukosidase dari Rhizomucor miehei ke bakteri Escherichia coli
meliputi:

Isolasi gen dari

Rhizomucor miehei

Insersi Gen -glukosidase

dari Rhizomucor miehei ke
Plasmid pRADZ1

Transformasi genetik
menggunakan metode
elektroporasi

Pemilihan klon tepat

dengan skrining biru putih
(blue white screening) dan
seleksi resistensi
antibiotik

Pendeteksian ekspresi gen

dengan pNPG (pNitrofenil--Dglukopiranosida)

Pengecekan final dengan

SDS-PAGE (Sodium
Dodecyl Sulphate
Polyacrylamide Gel Electro
phoresis)

Gambar 27. Diagram alir strategi kloning gen -glukosidase dari Rhizomucor miehei ke bakteri
Escherichia coli
(Sumber: Dokumentasi Penulis)

3.1 Tahap Isolasi Gen dari Rhizomucor miehei

Untuk mengisolasi gen -glukosidase, terlebih dahulu dilakukan pengkulturan R. miehei
untuk memperoleh konsentrasi sel yang tinggi sehingga ekstrak DNA yang didapat juga dalam
konsentrasi tinggi. Tipe liar R. miehei NRRL 5282 digunakan untuk kloning gen. Langkah
lengkap pengkulturannya meliputi: (Krisch dkk, 2012; Bhatia dkk, 2002; Eyzaguirre dkk, 2005;
Sofihidayati, 2007; Tako dkk, 2010; Tako, 2011):
1. Mengisolasi strain R. miehei yang ingin digunakan (NRRL 5282).
2. Mengkultur strain R. miehei yang ingin digunakan pada media yang cocok (dalam media cair
glukosa-ekstrak ragi5 g/L ekstrak ragi dan 20 g/L glukosa) pada temperatur 370C dengan
pengocokan kontinu 200 rpm selama 3 hari.
3. Mengambil sebagian spora (miselia) untuk dikultur kembali, sebagian lagi untuk diekstrak
DNAnya.
Metode ekstraksi DNA pada spora yang telah dikultivasi dapat dilakukan dengan menggunakan
alu dan mortar dalam nitrogen cair kemudian dimurnikan dalam 0,5 mg/mL bis-benzamida-CsCl

42

(Tako dkk, 2010). Setelah fragmen DNA genomik diperoleh, langkah selanjutnya adalah mencari
gen yang mengkode produksi enzim -glukosidase ekstraseluler (gen bgl).

3.2

Pencarian gen pengkode enzim -glukosidase

Pencarian gen ini didasari dari sekuens -glukosidase jamur yang diketahuiyaitu 2
primer degenerasi BgI1 dan BgI2. Dengan menggunakan kedua primer ini, fragmen DNA
genomik R. miehei dapat diamplifikasi menggunakan PCR agar dapat ditentukan sekuensnya.
Gambar di bawah merupakan daftar primer dan sekuens nukleotidanya yang digunakan dalam
pencarian gen, bagian yang digarisbawahi adalah lokasi restriksi pada primer. (Tako dkk, 2010)
Berdasarkan penelitian Tako dkk (2010), keseluruhan gen dapat ditentukan dengan
metode PCR invers (IPCR). Template DNA untuk IPCR (sebanyak 4 set) dapat diperoleh
dengan mencampur 10 g fragmen DNA genomik dengan enzim XbaI, HindIII, PstI, dan XhoI
(masing-masing dalam volume 120 L) agar terdigesti (terpotong-potong). DNA yang telah
terpotong kemudian dimurnikan dengan campuran fenol:kloroform:isoamil alkohol (PCI;
25:24:1) dilanjutkan dengan ekstraksi menggunakan campuran kloroform:isoamil alkohol (CI;
24:1). Setelah fasa cairnya diendapkan dengan etanol, sampel dikeringkan dan disuspensi
ulang dalam 17 L akuades. Fragmen-fragmen DNA yang diperoleh kemudian diligasi dengan
T4 ligase selama 18 jam pada 40C dan DNA yang melengkung kemudian diekstraksi kembali
dengan PCI dan CI. Sampel kemudian diendapkan dengan etanol dan dikeringkan, lalu
disuspensi kembali dalam 10 L akuades. Sampel akhir ini kemudian diambil sebanyak 50 ng
untuk direaksikan dalam IPCR.

Gambar 28. Daftar sekuens primer yang digunakan

(Sumber: Tako dkk, 2010)

Primer-primer IPCR dirancang pada arah berlawanan dengan PCR normal. Reaksi PCR
dilakukan dalam parameter berikut: denaturasi dilakukan pada temperatur 940C selama 2 menit,
diikuti oleh 10 siklus pada temperatur 940C selama 15 detik, 550C selama 30 detik, dan 680C
43

selama 3 menit, kemudian oleh 20 siklus pada temperatur 940C selama 15 detik, 550C selama
30 detik, dan 680C selama 3 menit dengan siklus elongasi (5 detik) untuk setiap siklus; siklus
terakhir diikuti dengan tahap ekstensi pada temperatur 680C selama 7 menit.

Gambar 29. (a) Representasi skematik gen Bgl dan daerah utama pengkode protein. Tanda panah
menandakan posisi primer-primer untuk amplifikasi IPCR dan kloning. (b) Perbandingan motif sekuens
dari 3 kelompok glikosida hidrolase.
(Sumber: Tako, dkk., 2010)

Setiap produk amplifikasi diklon ke plasmid menggunakan kit kloning produk PCR InsT/Aclone
dan disekuens pada kedua arah. Tiap produk amplifikasi kemudian dikloning ke dalam vektor
yang ditentukan.
3.3 Mendesain primer untuk kloning dengan metode PCR
Mengacu pada langkah-langkah yang telah diijabarkan pada tinjauan pustaka, primer yang
digunakan adalah sebagai berikut.
Forward primer : 5 TAAGCAAGATCTATGCTG CTTTGA CTGCGC 3
Reverse primer :
Awal : GCAGCCCGGGGGATCCACTCTAGATAAGAT
Akhir setelah di-reverse : 5 ATCTTATCTAGAGTGGATCCCCCGGGCTGC 3
Dengan basa yang digarisbawahi merupakan situs restriksi BglII untuk forward primer dan XbaI
untuk reverse primer.
3.4 Melakukan PCR untuk Amplifikasi Gen -glukosidase
Tipe PCR yang kami gunakan adalah two-step PCR, di mana tahap penempelan (annealing)
dan elongasi digabungkan karena Tm (temperatur leleh) yang dimiliki kedua primer cukup tinggi
(di atas 68oC). Temperatur leleh untuk masing-masing primer yang telah didesain dianalisis
menggunakan multiple primer analyzer dari Thermofischer (masing-masing 74,8 dan 77,2oC).
GC content dari kedua primer tersebut juga dalam rentang yang direkomendasikan (40-60%)
44

yaitu masing-masing 46,7% dan 56,7%. Kedua primer juga tak menimbulkan primer dimer baik
self-dimer maupun cross dimer (dapat menempel dengan primer lainnya). DNA polimerase yang
tepat digunakan untuk PCR pada suhu tinggi adalah Taq polimerase.
3.5 Tahap Insersi Gen -glukosidase dari Rhizomucor miehei ke Plasmid pRADZ1
Bahan-bahan yang Dibutuhkan
Ada pun bahan-bahan yang diperlukan untuk mengkloning gen -glukosidase dari Rhizomucor
miehei adalah sebagai berikut:
Strain E. coli
E. coli yang digunakan pada pengkloningan ini adalah E. coli strain DH5 electrocompetent.
Bakteri E.coli strain DH5 dipilih karena ia merupakan strain yang paling umum digunakan
dalam kloning gen secara umum. DH5 mempunyai mutasi recA1 dan endA1 yang dapat
menstabilkan gen sisipan dan meningkatkan kualitas plasmid secara keseluruhan. Selain itu,
karena jenis transformasi yang digunakan adalah elektroporasi, penggunaan strain DH5
akan memberikan efisiensi transformasi yang tinggi, sehubungan dengan sifatnya yang
electrocompetent.
Plasmid
Plasmid yang digunakan adalah pRADZ1 yang panjangnya 9988 bp (Meima et.al, 2000),
merupakan suatu plasmid yang biasa digunakan dalam kloning secara umum (general
cloning) dan dapat digunakan dalam pengkloningan menggunakan E. coli. pRADZ1
mempunyai ukuran 9988 bp, resisten terhadap antibiotik ampicillin, mempunyai ori yang
dapat membuat plasmid tersebut dikenali oleh E.coli sehingga tidak terestriksi oleh sistem
tubuh bakteri tersebut, mengandung gen LacZ, serta merupakan plasmid dengan jumlah
salinan yang tinggi (high-copy number). Plasmid ini dapat menampung sisipan gen dengan
ukuran maksimal 10-20 kb. Rencananya, gen akan disisipkan di bagian LacZ (membuang
lacZ).

45

Gambar 30. Peta restriksi pRADZ1

(Sumber: www.addgene.com)

Enzim Restriksi
Enzim restriksi yang digunakan adalah BglII yang spesifik memotong di basa ke-2182 dan
XbaI yang spesifik memotong di basa ke-5401. Kedua enzim ini umum digunakan dalam
proses pengkloningan. BglII mengenali sekuens A^GATCT, sementara XbaI mengenali
sekuens T^CTAGA. Kedua enzim tersebut juga merupakan enzim yang digunakan dalam
Sistem R-M Tipe II. Selain itu, tidak ditemukannya situs pengenalan dua enzim restriksi ini di
dalam gen -glikosidase R. miehei menjadikan dua enzim restriksi ini dapat digunakan
karena tidak akan memotong di daerah gen.
Molekul Modifikasi
Modifikasi yang digunakan adalah metilasi, dengan molekul yang digunakan adalah enzim
metilase.
Molekul Penyambungan
Molekul penyambungan yang digunakan adalah enzim DNA ligase T4. Enzim ini umum
digunakan pada usaha pengkloningan karena bisa menyambung baik ujung lengket (sticky
end/cohesive end) maupun ujung tumpul (blunt end). DNA ligase T4 disukai karena lebih
efisien dibanding DNA ligase E. coli.
Gen -glukosidase dari Rhizomucor miehei
46

Gen ini diperoleh dari proses PCR, di mana proses PCR memperbanyak gen -glukosidase
yang diperoleh dari ekstraksi Rhizomucor miehei NRRL 5282. Gen ini telah direstriksi ujungujungnya oleh enzim restriksi yang sama yang digunakan untuk memotong pRADZ1 yaitu
BglII dan XbaI.

Gambar 31. Peta Restriksi gen -glukosidase R.miehei (Diolah dengan menggunakan Addgene Sequence
Analyzer)

Isopropil -D-1-tiogalaktopiranosida (IPTG)

IPTG diperlukan karena pRADZ1 menggunakan promoter lac atau lac operon pada hulu dari
gen yang diinginkan. IPTG dapat memicu transkripsi dari gen yang pada hulunya terdapat
promoter lac. IPTG tidak ditambahkan pada plasmid, namun berupa molekul yang
ditambahkan pada E.coli nantinya.
Prosedur Pengerjaan
1.

Pemotongan plasmid pRADZ1

Pemotongan dilakukan dengan menggunakan enzim restriksi BglII dan XbaI untuk
membuang gen LacZ yang dimiliki plasmid. Pemotongan di bagian ini dimaksudkan agar
terjadi delesi pada fragmen DNA gen LacZ, sehingga fragmen LacZ tidak berfungsi.
Pemotongan fragmen gen penghasil -glukosidase dilakukan pada basa ke-2182 sampai
basa ke-5401 dari plasmid. Gen LacZ yang tidak sempurna tidak bisa menyandi galaktosidase, dan hal ini dapat mempermudah tahap screening selanjutnya. Komposisi
bahan untuk memastikan keberhasilan proses ini adalah plasmid sebanyak 1g dan gen glukosidase Rhizomucor miehei sebanyak 1,5 - 2g. Agar dapat bekerja dengan baik,
enzim restriksi membutuhkan buffer yang diantaranya berisi ion dan garam-garaman.

2.

Purifikasi pRADZ1 dan gen -glukosidase Rhizomucor miehei

Langkah ini diperlukan untuk memurnikan pRADZ1 dan gen -glukosidase dari enzim yang
merestriksinya dan juga dari potongan-potongan lain yang tidak diperlukan. Purifikasi
47

dilakukan dengan menggunakan elektroforesis gel agarosa. Plasmid yang diinginkan dan
fragmen gen yang diinginkan dapat terlihat sebagai pola pada gel.

Gambar 32. Ilustrasi elektroforesis gel agarosa untuk purifikasi pRADZ1 yang terpotong dan gen glukosidase
(Sumber: www.thermofisher.com)

3.

Modifikasi gen -glukosidase Rhizomucor miehei menggunakan metilase

Modifikasi dengan penambahan gugus metil dilakukan agar sistem restriksi E.coli nantinya
tidak akan memotong gen -glukosidase yang dianggap asing baginya.

4.

Penyambungan pRADZ1 dengan gen -glukosidase dari Rhizomucor miehei

Pada langkah ini, plasmid pRADZ1 yang sudah terpotong dicampurkan dengan gen glukosidase Rhizomucor miehei dan DNA ligase T4 dalam satu tabung untuk memperoleh
pRADZ1 yang mengandung gen yang diinginkan. Total DNA yang direkomendasikan oleh
Addgene adalah 100 ng, dengan perbandingan plasmid dan gen sisipan kira-kira 1:3.

3.6

Tahap Transformasi Genetik Menggunakan Metode Elektroporasi

Dalam kasus ini, transformasi genetik bertujuan untuk menggabungkan plasmid
rekombinan (plasmid pRADZ1 yang telah disisipi gen penghasil enzim -glukosidase) ke
bakteri E.coli sebagai sel inang. Karena tujuan yang ingin dicapai adalah produksi dengan
hasil maksimum, biaya minimum, dan waktu singkat, maka dibutuhkan transformasi genetik
terinduksi (buatan), sehubungan dengan transformasi genetik alami seperti transduksi atau
konjugasi sangat tidak mungkin dan tidak efisien untuk dapat menjadi alternatif tahapan.
Selain itu, pemilihan metode transformasi genetik juga didasarkan pada tipe sel inang dan tipe
vektornya. Sel inang dalam kasus ini adalah bakteri E.coli dan vektornya berupa plasmid
pRADZ1. Untuk vektor berupa bakteri, metode transformasi genetik yang sesuai adalah heatshock atau elektroporasi. Metode lain seperti biolistik, polyethylen glycol-mediated protoplast
(PEG), atau metode transformasi genetik tidak langsung lebih sesuai diaplikasikan pada sel
tanaman. Maka dari itu, menimbang dari banyak faktor, dipilih alternatif berupa metode
48

elektroporasi yang efisiensi transformasinya tinggi dibanding metode transformasi genetik

buatan lainnya.

Gambar 33. Sirkuit listrik dan konfigurasi elektroda yang digunakan dalam elektroporasi E.coli
(Sumber: Dower, et al. 1988)

Dengan menggunakan metode elektroporasi, E.coli yang merupakan bakteri Gram

negatif dapat ditransformasi dengan sangat efisien, efisiensi transformasinya bahkan
mencapai 109-1010 transforman/g plasmid pRADZ1.
Hal lain yang perlu diperhatikan adalah tahap preparasi. Preparasi yang baik akan
menghasilkan sel bakteri kompeten yang mampu memberi yield transforman sampai 108
koloni per g plasmid, sedangkan preparasi yang buruk hanya akan memberikan yield kurang
dari atau sama dengan 104 koloni per g plasmid.
Prosedur Pengerjaan
Tahap preparasi, yang meliputi:
1. Penumbuhan E.coli pada 370C dengan pengocokan dalam L-broth.
2. Pendinginan dan pemanenan ketika E.coli masih tumbuh dengan cepat (pada saat log phase).
3. Pencucian dan resuspensi sel dari 1 liter kultur. Konsentrasi E.coli seharusnya mencapai 2-4 x
1010/mL.
Setelah melewati tahap preparasi, langkah selanjutnya untuk melakukan elektroporasi adalah:
1. Penempatan E.coli pada temperatur ruang dan pada es. Kemudian, E.coli ditempatkan pada
tabung polipropilen dingin. Suspensi E.coli dan DNA ditambahkan ke dalam buffer
berkekuatan ionik rendah seperti TE.
2. Pengaturan generator pulsa: kapasitor 25 F, 2.5 kV, dan 200 ohm secara paralel dalam
ruang sampel.
3. Pemindahan campuran sel dan DNA ke kuvet dingin elektroporasi berukuran 0.2 cm, dan
pengocokan suspensi ke dasar kuvet.
4. Pemberian pulsa listrik sebesar 12.5 kV/cm dengan konstanta waktu 4.5-5 msec.
5. Penambahan medium SOC pada temperatur ruang ke kuvet dan resuspensi sel dengan pipet
Pasteur dengan segera.
49

6. Pemindahan suspensi sel pada tabung polipropilen dan inkubasi pada temperatur 370C
selama 1 jam, kemudian dilakukan pengocokan tabung pada kecepatan 225 rpm untuk
meningkatkan perolehan transforman.
3.7

Tahap Pemilihan Klon yang Tepat Menggunakan Skrining Biru Putih (Blue White
Screening) dan Seleksi Resistensi Antibiotik
Setelah plasmid rekombinan berhasil masuk dalam E.coli dan melakukan replikasi,
selanjutnya kita melakukan skrining dan seleksi untuk menentukan apakah gen yang diinginkan
(-glukosidase) telah sukses terligasi pada vektor E.coli dan mengetahui apakah E.coli berhasil
melakukan transformasi genetik dengan plasmid rekombinan, juga memilih klon mana yang tepat
untuk dikultur selanjutnnya. Metode ini dipilih karena plasmid yang digunakan (plasmid pRADZ1)
memiliki LacZ, tetapi pada tahap sebelumnya kita telah menginsersi gen -glukosidase pada
multiple cloning site gen LacZ yang mengganggu fragmen LacZ- dan menghambat
pembentukan peptida , sehingga enzim -galaktosidase tidak berfungsi sempurna dan tidak
dapat menguraikan substrat IPTG menjadi galaktosa dan senyawa berwarna biru. Berarti, bakteri
E.coli yang telah mengalami transformasi genetik dengan plasmid rekombinan akan
menghasilkan warna putih. Sedangkan, E.coli yang mengalami transformasi genetik dengan
plasmid yang tidak sukses terligasi gen yang diinginkan atau tidak mengalami transformasi
genetik sama sekali akan menghasilkan warna biru.

Gambar 34. Hasil blue-white screening: koloni bakteri berwarna biru dan putih. Koloni putih merupakan
koloni yang diperkirakan mengandung fragmen gen penghasil -glukosidase, sedangkan koloni biru
diperkirakan merupakan koloni yang tidak mengandung fragmen gen penghasil -glukosidase.
(Sumber: www.sigmaaldrich.com)

Selain itu, karena plasmid pRADZ1 yang memiliki gen pembawa sifat resistensi terhadap
terhadap antibiotik ampicillin (AmpR), maka metode inaktivasi insersi (skrining biru putih)
digabungkan dengan metode resistensi antibiotik. Gen AmpR yang terdapat dalam plasmid
pRADZ1 akan menyandi enzim -laktamase yang mampu menghidrolisis ikatan 4-cincin
betalaktam dari antibiotik beta-laktam seperti ampicillin, dan mendegradasinya sehingga bakteri
E.coli tidak akan mati karena keberadaan antibiotik tersebut. Maka dari itu, ketika E.coli pembawa
plasmid rekombinan ditumbuhkan dalam media yang mengandung ampicillin, maka E.coli
50

tersebut akan tetap tumbuh, sementara E.coli yang tidak membawa plasmid rekombinan akan
mati.
Seleksi dengan resistensi antibiotik merupakan metode yang cukup penting dilakukan untuk
mempertahankan gen AmpR yang terdapat di pRADZ1. Tanpa adanya ampicillin, E.coli cenderung
kehilangan resistensinya setelah beberapa kali pembelahan sel, padahal sifat resistensi ini
penting dalam proses produksi selanjutnya, agar E.coli tidak mudah mati dalam lingkungan yang
mengandung ampicillin di dalamnya.

Gambar 35. E.coli yang tidak memiliki gen Amp (tidak berhasil melakukan transformasi genetik) akan
tumbuh dalam medium yang tidak mengandung ampicillin, tetapi akan mati sepenuhnya dalam medium
yang mengandung ampicillin. Sedangkan, E.coli yang mengandung plasmid rekombinan (terdapat gen
R
Amp ) akan tumbuh dalam medium yang tidak mengandung ampicillin, dan masih dapat tumbuh dalam
medium yang mengandung ampicillin.
(Sumber: Pearson Education, 2016)

Setelah melewati tahap skrining dan seleksi, dapat diketahui bahwa E.coli yang berhasil
melakukan transformasi genetik dengan plasmid rekombinan adalah E.coli yang menghasilkan
warna putih ketika diskrining dan tetap hidup saat ditumbuhkan dalam medium yang mengandung
ampicillin.

Prosedur Pengerjaan
Langkah-langkah dalam melakukan skrining biru-putih dan seleksi resistensi antibiotik, meliputi:
1. Preparasi agar Luria-Bertani sebagai medium yang berisi nutrien pertumbuhan bakteri.
2. Penambahan substrat kromogenik (X-gal) dan IPTG.
3. Autoklaf medium (tahap ini opsional, tergantung strain E.coli yang digunakan).
4. Penambahan antibiotik ke dalam medium, berupa ampicillin.
5. Penempatan piringan dalam laminar flow chamber.
6. Penyebaran E.coli yang sudah melakukan transformasi genetik pada piringan agar LB
menggunakan sterile spreader.
51

7. Inkubasi piringan pada temperatur 370C selama 24-48 jam. Koloni biru dan putih akan muncul
pada permukaan agar, dan pilih koloni bakteri berwarna putih untuk selanjutnya dilakukan kultur.

3.8 Tahap Persiapan Sebelum Pendeteksian Ekspresi Gen

Preparasi Sampel
Sampel yang telah ditumbuhkan di dalam medium akan diambil. Pengambian sel dilakukan
dengan sentrifugasi 5,000 x g.
Purifikasi Soluble Recombinant Proteins dari sel
Langkah ini dapat ditempuh menggunakan: Sonikasi, lisozim, french pressure cell treatment
atau menggunakan detergent. Pada bagian ini kita akan menggunakan french pressure cell
treatment: Konsep alat ini adalah dengan memaksa sel untuk memasuki saluran kecil
(menggunakan tekanan), yang lebih kecil dari ukuran sel, sehingga sel akan rusak, dan isi sel
akan keluar.
Isolasi Protein
Isolasi protein dari debris sel, RNA dan DNA dapat dilakukan dengan :
Pertama, sentrifugasi: Dengan sentrifugasi, debris sel akan menjadi pelet dan kemudian DNA,
RNA dan protein akan menjadi satu di dalam larutan. Selanjutnya adalah memisahkan protein
dan DNA dari protein. Hal ini dapat dilakukan dengan menggunakan fenol yang akan
memisahkan mereka.

Gambar 36. Diagram French Pressure Cell Treatment

52

(Sumber: slideplayer.com)

Gambar 37. Pemisahan Protein dari DNA dan RNA

(Sumber: discoverbiotech.com)
3.9 Tahap Pendeteksian Ekspresi Gen dengan pNPG (p-Nitrofenil--D-glukopiranosida)
Kita tidak memilih analisis dengan esculin, karena sulit untuk mendapatkan agar esculin
saja. Kebanyakan di pasaran, yang dijual adalah agar esculin dengan garam oxbile. Padahal
dengan keberadaan bile salt di dalamnya, E.coli tidak dapat hidup. Maka dari itu, kita memilih
analisis menggunakan pNPG (p-Nitrofenil--D-glukopiranosida). Isolasi enzim harus dilakukan
terlebih dahulu sebelum mengaplikasikannya pada larutan pNPG.

Bahan-bahan yang Dibutuhkan

Ada pun bahan-bahan yang diperlukan untuk melakukan pendeteksian dengan pNPG adalah
sebagai berikut:
1. Buffer asetat, pH 5.0 (pada 25): 0.1M
2. Larutan PNPG: 20 mM (603 mg p-nitrophenyl--Dglucopyranoside/ 100ml H2O) (stabil dalam
waktu 2 minggu pada 05)
3. Larutan Na2CO3: 0.2 M (21.2 g Na2CO3/1,000ml H2O)
4. Diluen enzim: 10 mM buffer fosfat, pH 7.0 mengandung 0.2% of BSA.

Prosedur Pengerjaan
Langkah-langkah dalam melakukan pendeteksian dengan pNPG adalah sebagai berikut:
1.

Menyiapkan campuran reaksi di dalam tabung uji dan menginkubasinya pada 37 selama 5
menit, yang berisi reagen:

a. 1.0 mL 0.1M buffer asetat dengan pH 5.0

b. 0.5 mL larutan pNPG
2.

Menambahkan larutan enzim sebanyak 0.5ml dan mencampurkannya dengan reagen (enzim
terlebih dahulu sudah dilarutkan di 50mM buffer Tris-HCl dingin pH 7.8 (ca. 1mg/ml) dan 0.006
0.022 U/ml dengan diluen enzim segera sebelum dilakukan pendeteksian).
53

3.

Setelah 15 menit, pada temperatur 37, menambahkan 2.0 mL larutan Na2CO3 untuk
menghentikan reaksi dan mengecek OD pada 400nm.Sebelumnya, mempersiapkan blank dari
campuran satu yang ditambahkan 2.0 mL larutan Na2CO3.
Warna kuning dari p-nitrophenol diukur menggunakan spektrofotometer, di mana jumlah pnitrofenol berhubungan dengan intensitas warna, dan hubungannya linear.

Gambar 38. Hasil deteksi menggunakan pNPG:Larutan berwarna kuning (tabung kiri) yang
mengindikasikan enzim -glukosidase bekerja menghidrolisis pNPG menjadi glukosa dan pnitrofenol yang berwarna kuning. Berarti, E.coli berhasil mengekspresikan gen enzim pengkode glukosidase.
(Sumber: www.studyblue.com)

3.10

Tahap Pengecekan Final dengan SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulphate

Polyacrylamide Gel Electrophoresis)
Pengecekan final ditujukan untuk mengecek apakah enzim yang dihasilkan benarbenar merupakan keberhasilan ekspresi dari gen enzim pengkode -glukosidase dari jamur
Rhizomucor miehei, karena ada kemungkinan di tahap sebelumnya (tahap skrining dan
seleksi, atau tahap pendeteksian ekspresi gen) menunjukkan hasil yang false positive. Hal ini
dilakukan untuk menghindari hal-hal yang tidak diinginkan saat scale-up produksi, seperti
bakteri E.coli yang ternyata tidak menghasilkan enzim -glukosidase sesuai dengan kualitas,
kuantitas, atau kecepatan produksi yang diinginkan, padahal sudah dilakukan kultur skala
besar. Langkah-langkah dalam melakukan pendeteksian dengan pNPG adalah sebagai
berikut:

1. Pelarutan protein di dalam buffer yang mengandung SDS, agen pereduksi (seperti DTT), agen
chaotropic dan buffer serta garam
Pelarutan protein dalam buffer adalah kunci keberhasilan dari SDS-PAGE, protein harus
benar-benar terlarut di dalam buffer.

54

Gambar 39. Penambahan amonium sulfat untuk purifikasi protein rekombinan

(Sumber: www.phcogrev.com)

2. Pembuatan gel poliakrilamida

Pembuatannya menggunakan poliakrilamida bubuk. Karena perkiraan massa enzim glukosidase dari jamur Rhizomucor miehei sekitar 76.5 kDa (Y. Guo, dkk., 2015), maka kita
menggunakan 15% massa poliakrilamida
3. Pemasukan sampel ke dalam sumur poliakrilamida dan menuangkan buffer Tris-Glliserin pada
bagian katoda positif dan negatif, kemudian menyalakan power.
Setelah elektroforesis selesai dilakukan, kita dapat melihat pita-pita protein-protein
yang dihasilkan dari sampel enzim di bawah alat imaging. Keberadaan enzim -glukosidase
dari Rhizomucor miehei dapat dipastikan dengan melihat apakah ada pita pada massa protein
76.5 kDa. Hal ini dapat dilihat dari database yang sudah ada.

Gambar 40. Perkiraan hasil SDS-PAGE enzim -glukosidase dari Rhizomucor miehei (massa protein =
76.5 kDa) yang ditunjukkan oleh pita warna hitam (Sumber : bio-rad.com)

55

BAB 4
PENUTUP
Kesimpulan
1. Gen beta-glukosidase Rhizomucor miehei mempunyai karakteristik khas yaitu dapat bertahan
pada

suhu tinggi sehingga memudahkan proses produksi. Beta-glukosidase itu sendiri

merupakan enzim glukosidase yang memutus ikatan beta(1--> 4) glikosida antara dua glukosa
atau molekul pengganti glukosa misalnya selobiosa, bertindak sebagai katalis hidrolisis residu
ujung non-pereduksi pada beta-D-Glukosa.
2. Beta-glukosidase banyak digunakan pada industri keju.
3. Teknik yang dapat digunakan pada kasus / proyek ini untuk isolasi gen beta-glikosidase
Rhizomucor miehei adalah dengan perlakuan alu dan mortar dalam nitrogen cair kemudian
dimurnikandalam 0,5 mg/mL bis-benzamida-CsCl untuk isolasi fragmen DNA. Pencarian gen
beta-glikosidase yang spesifik dapat menggunakan teknik IPCR. Kemudian gen yang sudah
ditemukan dapat diperbanyak menggunakan PCR dengan primer termodifikasi BglII dan XbaI.
4. Sel inang yang digunakan adalah E.coli yang mempunyai karakteristik yaitu pertumbuhannya
cepat dan mudah untuk dikultivasi. Strain yang digunakan adalah DH5alpha yang memiliki
efisiensi transformasi yang tinggidan dapat menstabilkan gen sisipan.
5. Plasmid yang dapat digunakan adalah pRADZ1 yang mempunyai jumlah salinan tinggi, cocok
untuk strain DH5alpha, mempunyai ori, gen resisten ampicillin, serta gen lacZ.
6. Molekul yang digunakan untuk pemotongan adalah enzim BglII dan XbaI, untuk modifikasi
menggunakan metilase, untuk penyambungan menggunakan DNA ligase T4.
7. Transformasi yang digunakan adalah teknik elektroporasi untuk plasmid besar.
8. Teknik skrining yang digunakan yaitu skrining biru/putih, teknik seleksi yang digunakan yaitu
seleksi resistensi antibiotik.
9. Untuk menguji keberhasilan ekspresi menggunakan PNPG dan SDS-PAGE.

56

DAFTAR PUSTAKA
Addgene. 2015. Plasmid 101 : A Desktop Resource 2nd Edition. [ONLINE] Diakses dari
www.addgene.org pada 1 Oktober 2016.
Hawwa, R. 2015. How to Choose Restriction Enzyme. [ONLINE] Available at:
http://www.livestrong.com/article/373830-how-to-choose-restriction-enzymes/ [Accessed 25
September 2016].
Howe, C.J. (2007). Gene Cloning and Manipulation 2nd Edition. New York : Cambride University
Press.
Lodge, J., Lund, P., Minchin, S. 2006. Gene Cloning : Principles and Application. New York : Garland
Science.
New
England
Biolabs.
2016.
XbaI
|
NEB
.
[ONLINE]
Available
at:
https://www.neb.com/products/r018xbai. [Accessed 25 September 2016].
New
England
Biolabs.
2016.
BglII
|
NEB
.
[ONLINE]
Available
at:
https://www.neb.com/products/r0144-bglii. [Accessed 25 September 2016].
Primrose, S. B, Twyman, R.M, and Old, R.W. (2001). Principles Of Gene Manipulation. Oxford:
Blackwell Scientific.
Tak, M., Tth, A., G. Nagy, L., Krisch, J., Vgvlgyi, C. and Papp, T. (2009). A new -glucosidase
gene from the zygomycete fungus Rhizomucor miehei. Antonie van Leeuwenhoek, 97(1),
pp.1-10.
Translation and Open Reading Frames. 2016. Translation and Open Reading Frames. [ONLINE]
Available at: http://bioweb.uwlax.edu/genweb/molecular/seq_anal/translation/translation.html.
[Accessed 25 September 2016].
Oswald, Nick. 2015. How SDS-PAGE works.[ONLINE] Available at: http://bitesizebio.com/580/howsds-page-works/ [Accessed 30 September 2016]
Anonim. 2016. beta-Glucosidase.
https://calzyme.com/commerce/catalog/spcategory.jsp?category_id=1026. [Online]
You,Hyun Ju, et al. 2014. High Expression of -Glucosidase in Bifidobacterium bifidum BGN4 and
Application in Conversion of Isoflavone Glucosides During Fermentation of Soy Milk. Seoul.
[ONLINE]
Bile Esculin Hydrolisis Test. Anonim. 2016. [ONLINE] Available at:
http://spot.pcc.edu/~jvolpe/b/bi234/lab/differentialMedia/esculin.html. [Accessed 20September
2016]
Singh, Gopal. 2014. Catalytic properties, functional attributes and industrial applications of glucosidases. [ONLINE] Available at: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/. [Accessed 20September
2016]
Rajoka, M.I, et al. 1998. Cloning and Expression of 13-Glucosidase Genes in Escherichia coli and
Saccharomyces cerevisiae. Pakistan. [Accessed 20September 2016]
De Palma-Fernandez, E., Gomes, E. & Da Silva, R., 2002. Purification and characterization of two glucosidases from the thermophilic fungus Thermoascus aurantiacus. Folia Microbiologica,
47(6), 685-690.
Bhatia Y, Mishra S, Bisaria VS. Microbial -glucosidases: cloning, properties, and applications.
Critical Reviews in Biotechnology. 2002; 22:375-407.
Yoshioka H, Hayashida S. Production and purification of thermostable -glucosidase from Mucor
miehei YH-10. Agricultural Biology and Chemistry 1980; 44:2817-2824.
Characterization of the minimal replicon of a cryptic Deinococcus radiodurans SARK plasmid and
development of versatile Escherichia coli-D. radiodurans shuttle vectors. Meima R, Lidstrom
57

ME. Appl Environ Microbiol. 2000 Sep;66(9):3856-67. 10.1128/AEM.66.9.3856-3867.2000

PubMed 10966401
http://www.mclab.com/Dh5-Alpha-Competent-E.-Coli.html
http://www.mycology.adelaide.edu.au/Fungal_Descriptions/Zygomycetes/Rhizomucor/miehei.
html
AP Biology Lab Manual. (2001). Biotechnology: Bacterial Transformation. [ONLINE] College Board.
Tersedia
di:
http://media.collegeboard.com/digitalServices/pdf/ap/bio-manual/Bio_Lab8BiotechnologyBacterialTransformation.pdf. Diakses pada 25 September 2016.
Brown, T.A. (2010). Gene Cloning and DNA Analysis An Introduction. New York: Wiley-Blackwell.
Dower, W.J., Miller, J.F., dan Ragsdale, C.W. (1988). High Efficiency Transformation of E.coli by High
Voltage Electroporation. Nucleic Acid Research: 16 (13), 6127-6145.
Gaffen, Z. (2016). Is It Necessary to Add Ampicillin While Growing Bacteria Containing Ampicillin
Resistant
Plasmid?
[ONLINE]
Research
Gate.
Tersedia
di:
https://www.researchgate.net/post/Is_it_necessary_to_add_ampicillin_while_growing_bacteria_
containing_ampicillin_resistant_plasmid. Diakses pada 25 September 2016.
Griffiths, A.J.F. (2000). An Introduction to Genetic Analysis, 7th Edition. New York: W.H. Freeman.
Hartsock, A. (2016). Escherichia coli (E.coli) as a Model Organism or Host Cell. [ONLINE] Study.
Tersedia di: http://study.com/academy/lesson/escherichia-coli-e-coli-as-a-model-organism-orhost-cell.html. Diakses pada 25 September 2016.
Howe, C. (2007). Gene Cloning and Manipulation, 2nd Edition. New York: Cambridge University
Press.
Nicholl, D.S.T. (2008). An Introduction to Genetic Engineering, 3rd Edition. New York: Cambridge
University Press.
Padmanabhan, S., S. Banerjee, dan N. Mandi. (2011). Screening of Bacterial Recombinants:
Strategies and Preventing False Positives, Molecular Cloning Selected Applications in
Medicine
and
Biology.
[ONLINE]
InTechOpen.
Tersedia
di:
http://www.intechopen.com/books/molecular-cloning-selected-applications-in-medicine-andbiology/screeningof-bacterial-recombinants-strategies-and-preventing-false-positives. Diakses
pada 24 September 2016.
Pearson Education. (2016). Lab Bench Activity: Bacterial Transformation. [ONLINE] Tersedia di:
http://www.phschool.com/science/biology_place/labbench/lab6/design1.html. Diakses pada 25
September 2016.
Primrose, S.B., et al. (2001). Principles of Gene Manipulation, 6th Edition. Italy: Blackwell Science.
Sambrook, J., et al. (1989). Molecular Cloning. United States of America: Cold Spring Harbor
Laboratory.
Sandu, S.S. (2010). Recombinant DNA Technology. New Delhi: I.K. International Publishing House.
Sheng, Y., V. Mancino, dan B. Birren. (1995). Transformation of Escherichia coli with Large DNA
Molecules by Electroporation. Nucleic Acid Research: 23 (11), pp. 1990-1996.
The University of Texas at El Paso. (2016). Alpha Complementation. [ONLINE] Tersedia di:
http://utminers.utep.edu/rwebb/html/alpha_complementation.html. Diakses pada 24 September
2016.

58

Team Resources. (2016). Other Cloning Protocols: Blue-White Screening Protocols. [ONLINE] Oxford
Genetics. Tersedia di: http://www.oxfordgenetics.com/SiteContent/TeamResources/othercloning-protocols. Diakses pada 24 September 2016.
Welch, J. (2015). Plasmids 101: Blue-White Screening. [ONLINE] AddGene. Tersedia di:
www.addgene.org/plasmids-101-blue-white-screening. Diakses pada 25 September 2016.
Welch, J. (2015). Plasmid Protocols: Bacterial Transformation. [ONLINE] AddGene. Tersedia di:
https://www.addgene.org/plasmid-protocols/bacterial-transformation/.
Diakses
pada
25
September 2016.
Woodall, C.A., et al. (2003). E.coli Plasmid Vectors: Methods and Applications. New Jersey: Humana
Press.
Anonim.

2005.
Rhizomucor
Mold
Species.
[ONLINE]
http://www.mold.ph/rhizomucor.htm. Diakses 02 Oktober 2016.

Dapat

diakses

pada:

Krisch, J., dkk. 2012. Characterization of A B-Glucosidase with Transgalactosylation Capacity from
The Zygomycete Rhizomucor miehei. Bioresource Technology 114 (2012) 555560

59

LAMPIRAN
Sekuens lengkap -glukosidase R.miehei NRRL 5282 (nomor akses AM922334 dari situs NCBI)

60