HPLC (High Performance Liquid Chromatography) DAN GC

(Gas Chromatography)
Laina Radestiani, Muhammad Kafillah, Tri Morti, Kristina Novi, Selvia
Ulta, Rohana Widyaningrum, Mita Yuspitasari, Pholan Maulana,
Muhammad Rohim

1. HPLC

Kromatografi adalah teknik pemisahan campuran didasarkan atas perbedaan

distribusi dari komponen-komponen campuran tersebut diantara dua fase, yaitu fase
diam (padat atau air) dan fase gerak (cair atau gas). Bila fase diam berupa zat padat
yang aktif, maka dikenal istilah kromatografi penyerapan (adsorption
chromatography). Bila fase diam berupa zat cair, maka teknik ini disebut
kromatografi pembagian (partition chromatography) (Khopkar,1990). Teknik
kromatografi yang umum digunakan dibidang farmasi yaitu kromatografi kolom,
kromatografi kertas, kromatografi lapis tipis, kromatografi gas, dan high performance
liquid chromatography (kromatografi cair kinerja tinggi / KCKT). HPLC adalah
singkatan dari High Chromatography, yaitu alat yang berfungsi mendorong analit
melalui sebuah kolom dari fase diam ( yaitu sebuah tube dengan partikel bulat kecil
dengan permukaan kimia tertentu) dengan memompa cairan (fase bergerak) pada
tekanan tinggi melalui kolom. HPLC secara mendasar merupakan perkembangan
tingkat tinggi dari kromatografi kolom. Selain dari pelarut yang menetes melalui
kolom dibawah gravitasi, didukung melalui tekanan tinggi sampai dengan 400 atm
(Skog,1993).
Alat HPLC dapat memisahkan sejumlah senyawa organik, anorganik,
maupun senyawa biologis, analisis ketidakmurnian, dan analisis senyawa nonvolatil.
Kelebihan HPLC antara lain mudah dalam pelaksanaan, kemampuan resolusi yang
baik, kecepatan analisis dan kepekaan yang tinggi, mudah dalam pelaksanaan, dan
tidak menimbulkan kerusakan bahan yang dianalisis. Komponen yang terdapat dalam
HPLC adalah solvent reservoir, pompa, injektor, kolom, dan detektor (Rohman,
2009).
 Gambar 1.1 Tampilan Awal HPLC Simulator
Pada saat memasuki HPLC simulator kita akan mendapatkan tampilan awal seperti
pada gambar di atas. Dimana pada tampilna tersebut terdapat sample, solvents,
control panel colums detector computer data system. Pada tahap awal penggunaan
HPLC simulator ini, hal pertama yang dilakukan yaitu memilih atau memasukan
sampel.

Gambar 1.2 Tampilan pada Komponen Samples

Pemilihan sampel dilakukan dengan enklik sample pada tampilan awal
sehingga muncul lah tampilan seperti gambar di atas. Kemudian klik new vials dan
akan muncul gambar seperti di bawah ini:
 Gambar 1.3 Tampilan New Vial
setelah muncul tampilan dan gambar seperti di atas, kemudian masukan nama sample
atau standarnya kemudian klik ok. Setelah itu, klik add standards untuk memasukkan
larutan standar seperti ditunjukkan gambar di bawah ini:

Larutan standar yang digunakan adalah fenol dengan konsentrasi

Gambar 10 mg/mL;
1.4 Pemilihan Larutan Standar
metil benzoat dengan konsentrasi 8 mg/mL; dan benzen dengan konsentrasi 5
mg/mL. Fenol merupakan padatan kristal transparan dengan rumus kimia C 6H6O
yang memiliki massa molar 94,11 g/mol; densitas 1,07 g/cm 3. Metil benzoat
merupakan senyawa organik yang termasuk di dalam senyawa ester dengan rumus
kimia C8H8O2 yang memiliki massa molar 136,15 g/mol; densitas 1,0873 g/cm 3; titik
lebur -12,5oC; titik didih 199,6oC. Benzena merupakan senyawa organik berupa zat
cair tak berwarna yang mudah terbakar dengan rumus kimia C 6H6 yang memiliki
massa molar 78,1221 g/mol; densitas 0,8786 g/ml; titik lebur 5,5 oC; titik didih 80,1oC
(Martin, 2012). Setelah itu, larutan yang komponennya akan dipisahkan dibuat
dengan cara mengklik unknown. Kemudian ketik nama komponen yang akan
dipisahkan. Larutan yang digunakan adalah air gambut, yang merupakan salah satu
sumber air permukaan yang memiliki warna coklat tua sampai kehitaman. Daerah
yang berair gambut biasanya daerah berawa yang memiliki kadar organik yang tinggi
dan bersifat asam (jika berada pada pH 3,75,3). Setelah memilih larutan yang akan
dipisahkan, dipilih juga banyaknya komponen yang akan dipisahkan, yaitu sebanyak
3 komponen seperti larutan standar, seperti gambar di bawah ini:

Gambar 1.5 Pemilihan Larutan Sampel dan Jumlah

Komponen yang akan Dipisahkan
Setelah membuat larutan sampel dan memilih jumlah komponen yang akan
dipisahkan, kemudian klik sample drawer untuk melihat jumlah komponen yang
terdapat pada larutan standar dan larutan sampel, dapat dilihat paga gambar dibawah
ini :

Gambar 1.6 Komponen pada Larutan Standar

 Gambar 1.7 Komponen pada Larutan Sampel
Pada gambar di atas, air gambut mengandung beberapa komponen yaitu, p-
nitrophenol, benzene, dan toluene. Komponen-komponen tersebut memiliki
konsentrasi yang berbeda yaitu p-nitrophenol memiliki konsentrasi 7,99 mg/mL;
benzene memiliki konsentrasi 14,54 mg/mL; dan toluene memiliki konsentrasi 14,61
mg/mL. p-nitrophenol adalah senyawa kristalin berwarna kuning dengan rumus kimia
C6H5NO3 p-nitrophenol memiliki massa molar 139,11 g/mol dan titik lebur 114 oC,
setra titik didih 279oC. Benzena adalah senyawa organik berupa zat cair tak berwarna
yang mudah terbakar dengan rumus kimia C6H6, serta memiliki massa molar 78,1221
g/mol. Benzene memiliki densitas 0,8786 g/ml dengan titik lebur 5,5oC dan titik didih
80,1oC. Toluene merupakan zat cair tak berwarna dengan rumus kimia C 6H5CH3 yang
memiliki massa molar 92,14 g/mol; densitas 0,8669 g/ml; titik lebur -93 oC; titik didih
110,6oC (Martin, 2012; Daintith, 1994).

Setelah memilih sampel dan komponen yang akan dipisahkan serta melihat
berapa kompone yang akan dipisahkan, kemudian dilakukan pemilihan kolom
yangakan digunakan dengan cara mengklik columns dan pilih colom DuPont C-18.
Penggunaan column DuPont C-18 dikarenakan fase diam yang paling banyak
digunakan karena mampu memisahkan senyawa-senyawa dengan kepolaran yang
rendah, sedang, maupun tinggi. Seperti , yang merupakan tempat pemisahan sampel.
Kolom yang dipilih memiliki beberapa jenis, namun kolom yang digunakan adalah
DuPont C-18 yang merupakan fase diam yang paling banyak digunakan karena
mampu memisahkan senyawa-senyawa dengan kepolaran yang rendah, sedang,
maupun tinggi. Pemilihan kolom pada HPLC Simulator ini dapat dilihat pada gambar
berikut:
 Gambar 1.8. Pemilihan Kolom
Setelah pemilihan kolom dilakukan, kemudian
dipilih solvent yang akan digunakan sewaktu pemisahan. Solvent yang dipilih ini
akan bertindak sebagai fase gerak . Solvent yang digunakan adalah metanol. Metanol
merupakan senyawa alkohol paling sederhana berupa zat cair tak berwarna dengan
rumus kimia CH4O. Metanol memiliki massa molar 32,04 g/mol dengan densitas
791,80 kg/m3, serta memiliki titik lebur -97,6 oC dan titik didih 64,7oC (Martin,
2012). Pemilihan solvent yang akan digunakan dapatdilihat pada gambar di bawah
ini:

Gambar 1.9 Pemilihan Solvent

Setelah dilakukan pemilihan solvent,
kemudian klik detector yang ada pada tampilan awal. Detektor berfungsi untuk
mendeteksi/ mengidentifikasi sampel. Detektor yang digunakan harus memiliki
sensitivitas yang tinggi, linear untuk jangka konsentrasi tertentu, dan dapat mendekati
eluen tanpa mempengaruhi resolusi kromatografi. Detektor yang digunakan pada
HPLC Simulator ini adalah diode array. Detektor diode array merupakan jenis
detektor yang paling umum digunakan untuk merekan sinar ultraviolet (UV) dan
dapat terlihat spektrum penyerapan sampel yang melewati HPLC. Keuntungan dari
penggunaan detektor jenis ini adalah mampu untuk memilih panjang gelombang
terbaik untuk menganalisis agar didapat hasil yang sangat baik. Panjang gelombang
yang digunakan adalah 265 nm. Serta selektivitas yang di unakan yaitu 500.
Pengaturan detector ini dapat dilihat pada gambar di bawah ini:
 Gambar
Setelah pemilihan 1.10 Pemilihan
pengaturan detektor,Detector
kemudian dilakukan pengaturan
HPLC dengan mengklik control panel pada HPLC Simulator. Pengaturan control
panel HPLC berfungsi untuk menghidupkan pompa, mengatur mode, tekanan, laju
aliran, %B, dan volume larutan yang diinjeksikan. Pompa berfungsi untuk
mengalirkan pelarut sebagai fase gerak dengan kecepatan dan tekanan yang tetap.
Pengaturan control panel dapat dilihat pada gambar dibawah ini:

Gambar 1.11 Pengaturan Control Panel

Setelah pengaturan pada HPLC Simulator telah diatur, kemudian dilihat hasil
kromatogram dengan mengklik computer data system, dan klik inject sample pada
instrument yang dapat dilihat pada gambar dibawah ini:

Gambar 1.12 Penginjeksian Sampel

Setelah sampel diinjeksikan, kemudian dilihat hasil kromatogram dengan cara
mengklik compare two chromatogram pada data yang dapat dilihat pada gambar
dibawah ini:

Gambar 1.13 Cara Melihat dan Hasil Kromatogram

Grafik di atas menunjukkan hasil pemisahan berupa kromatogram, dimana pada
larutan standar senyawa benzen memiliki tinggi puncak yang lebih rendah daripada
fenol dan metil benzoate. Hal ini disebabkan karena konsentrasi pada masing-masing
larutan. Sedangkan pada larutan sampel air gambut, luas kromatogram pada larutan
toluen lebih besar daripada p-nitrofenol dan benzen yang disebabkan oleh konsentrasi
pada masing-masing larutan.

Daftar Pustaka

Daintih J, 1994, Oxford Kamus Lengkap Kimia, Erlangga, Jakarta

Khopkar ,1990, Dasar- dasar Kimia Analitik, UI press, Jakarta

Martin, E.A., 2012, Kamus Sains, Pustaka Pelajar, Yogyakarta

Rohman A,2009,Kromatografi untuk Analisis Obat, Graha Ilmu, Yogyakarta.

2. GC

Kromatografi gas merupakan metode yang tepat dan cepat untuk

memisahkan campuran yang rumit. Waktu yang dibutuhkan beragam, mulai dari
beberapa detik untuk campuran yang sederhana sampai berjam-jam untuk campuran
yang mengandung 500-1000 komponen (Khopkar, 2008). Analisis dengan
menggunakan kromatografi gas merupakan salah satu teknik analisis yang memiliki
tingkat kepekaan yang sangat tinggi, sehingga dapat digunakan untuk analisis dengan
rentang yang sangat luas kepekaan dari kromatografi gas adalah dapat mendeteksi
sampai satuan ppb (part per billion). Keuntungan tambahan dari tingkat kepekaan
yang tinggi adalah cuplikan yang diperlukan sangat sedikit sekali dengan beberapa
mikroliter saja, sudah mampu untuk menganalisis secara lengkap. Komponen-
komponen kromatografi gas umumnya terdiri atas tangki gas pembawa, injector,
kolom, oven, detector dan system pengolah data. Kromatografi gas-cair (biasa disebut
kromatografi gas) merupakan analisis yang sangat bermanfaat (Gritter, 1991). Sistem
peralatan dari kromatografi gas terdiri dari 7 bagian utama diantaranya :

1) Tabung gas pembawa

2) Pengontrolanalirandan regulator tekanan
3) Injection port (tempatinjeksicuplikan)
4) Kolom
5) Detektor
6) Rekorder (pencatat)
Ini merupakan tampilan awal untuk aplikasi GC, dimana untuk langkah selanjutnya
dalam penggunaan aplikasi GC ini dengan mengklik menu GO.

Percobaan ini menggunakan toulen sebagai sampelnya. Toluen dikenal juga

sebagai metil benzene ataupun fenilmetana yang merupakan cairan bening tak
berwarna yang tak larut dalam air dengan aroma seperti pengencer cat dan berbau
harum seperti benzene titik didih 110,6 C, kepadatan 866,90 kg/m dan massa molar
92,14 g/mol (Daintith, 1994). Sejumlah kecil sampel yang akan dianalisis
diinjeksikan pada mesin menggunakan semprit kecil. Jarum semprit menembus
lempengan karet tebal (Lempengan karet ini disebut septum) yang mana akan
mengubah bentuknya kembali secara otomatis ketika semprit ditarik keluar dari
lempengan karet tersebut,
 Injektor berada dalam oven yang mana temperaturnya dapat dikontrol. Oven
tersebut cukup panas sehingga sampel dapat mendidih dan diangkut ke kolom oleh
gas pembawa misalnya helium atau gas lainnya. Fase bergerak dalam kromatografi
ini adalah gas, yang paling lazim adalah helium, hidrogen, atau nitrogen. Kompenen
pilihan gas pembawa terutama tergantung pada karakteristik detektor. Kromatografi
gas komersial biasanya menyediakan katup pengatur tambahan untuk pengendalian
tekanan yang baik pada inlet kolom. Dekat inlet kolom ada suatu alat dimana sampel-
sampel dapat dimasukkan ke dalam aliran gas pembawa. Sampel-sampe ltersebut bisa
berupa gas atau cairan yang mudah menguap. Lubang injeksi dipanaskan agar sampel
cair teruapkan dengan cepat. Praktikan menggunakan gas Helium.

Aliran gas selanjutnya menemui kolom yang diletakkan dalam oven

bertemperatur konstan. Ini adalah jantung instrument tesebut, tempat dimana proses
kromartgrafi dasar berlangsung. Kolom memilki variasi dalam hal ukuran dan bahan
isian. Tabung diisi dengan bahan padat halus dengan luas permukaan besar yang
relatif inert. Padatan iitu sebenarnya hanya sebuah penyangga mekanik untukcairan,
sebelum diisi ke dalam kolom, padatan tersebut diimpregnasi dengan cairan yang
diinginkan yang berpareran sebagai fasa stasioner sesungguhnya. Cairan ini harus
stabil dan nonfolatil pada temperature kolom, pemisahan dan haru ssesuai untuk
pemisahan tertentu, temperature kolom yang digunakanialah 300oC.
 Setelah muncul dari kolom itu, aliran gas lewat melalui sisi lain detektor.
Maka elusi zat terlarut dari kolom itu mengatur ketidakseimbangan antara dua sisi
detektor yang direkam secara elektrik. Laju aliran gas pembawa adalah hal yang
sangat penting, dan biasanya pengukur aliran untuk itu tersedia. Secara normal gas-
gas yang muncul dialirkan keluar pada tekanan atmosfir. Karena pekerja laboratorium
secara terus menerus terpapar oleh uap senyawa-senyawa yang terkromatogafi yang
mungkin tak baik walaupun kadarnya biasanya kecil maka ventilasi pada keluaran
instrument harus diperhatikan. Ketentuan bisa dibuat untuk menjebak zat terlarut
yang dipisahkan setelah muncul dari kolom jika hal ini dibutuhkan untuk
penyelidikan lebih lanjut.

Hasil ini diperoleh dari detector dan selanjutnya dicatat oleh pendeteksi atau
pendetektor. Fungsi recorder sebagai alat untu kmencetak hasil percobaan pada
sebuah kertas yang hasilny adisebut kromatogram (kumpulan puncak grafik). Hasil
akan direkam sebagai urutan puncak-puncak; setiap puncak mewakili satu senyawa
dalam campuran yang melalui detektor. Sepanjang anda mengontrol secara hati-hati
kondisi dalam kolom, anda dapat menggunakan waktu retensi untuk membantu
mengidentifikasi senyawa yang tampak-tentu saja anda atau seseorang lain telah
menganalisa senyawa murni dari berbagai senyawa pada kondisi yang sama.Perlu
dicatat bahwa tinggi puncak tidak merupakan masalah, tetapi total area dibawah
puncak. Dalam beberapa contoh tertentu, bagian kiri gambar adalah puncak tertinggi
dan memiliki area yang paling luas. Hal ini tidak selalu merupakan hal seharusnya.
Mungkin saja sejumlah besar satu senyawa dapat tampak, tetapi dapat terbukti dari
kolom dalam jumlah relatif sedikit melalui jumlah yang lama. Pengukuran area selain
tinggi puncak dapat dipergunakan dalam hal ini.
 Waktu retensi, waktu yang digunakan oleh senyawa tertentu untuk bergerak
melalui kolom menuju ke detektor disebut sebagi waktu retensi. Waktu ini diukur
berdasarkan waktu dari saat sampel diinjeksikan pada titik dimana tampilan
menunujukkan tinggi puncak maksimum untuk senyawa itu. Setiap senyawa memiliki
waktu retensi yang berbeda. Untuk senyawa tertentu, waktu retensi sangat bervariasi
dan bergantung pada: Titik didih senyawa. Senyawa yang mendidih pada temperatur
yang lebih tinggi daripada temperatur kolom, akan menghabiskan hampir seluruh
waktunya untuk berkondensasi sebagai cairan pada awal kolom. Dengan demikian,
titik didih yang tinggi akan memiliki waktu retensi yang lama. Kelarutan dalam fase
cair. Senyawa yang lebih mudah larut dalam fase cair, akan mempunyai waktu lebih
singkat untuk dibawa oleh gas pembawa. Kelarutan yang tinggi dalam fase cair
berarti memiiki waktu retensi yang lama.

Temperatur kolom. Temperatur tinggi menyebakan pergerakan molekul-

molekul dalam fase gas; baik karena molekul-molekul lebih mudah menguap, atau
karena energi atraksi yang tinggi cairan dan oleh karena itu tidak lama tertambatkan.
Temperatur kolom yang tinggi mempersingkat waktu retensi untuk segala sesuatunya
di dalam kolom. Untuk memberikan sampel dan kolom, tidak ada banyak yang bisa
dikerjakan menggunakan titik didih senyawa atau kelarutannya dalam fase cair, tetapi
anda dapat mempunyai pengatur temperatur.

Semakin rendah temperatur kolom semakin baik pemisahan yang akan anda
dapatkan, tetapi akan memakan waktu yang lama untuk mendapatkan senyawa karena
kondensasi yang lama pada bagian awal kolom.
Wakturetensi yang didapatyakni 3,89 ; 7,01; 7,85.

Daftar Pustaka

Daintith, J., 1994, Kamus Lengkap Kimia, Erlangga, Jakarta

Gritter, 1991, Kromatogrfi, ITB, Bandung

Khopkar, S,M., 2003, Konsep Dasar Analitik, UI, Jakarta