Pemeriksaan GeneXpert

GeneXpert MTB/RIF adalah suatu alat uji yang menggunakan catridge berdasarkan

Nucleic Acid Amplification Test (NAAT) secara automatis untuk mendeteksi kasus TB dan

resistensi rifampisin, cocok untuk negara endemis, (WHO, 2013a) dan dapat dilakukan

walaupun sampel sputum hanya 1 ml (Hakeem et al, 2013). Uji konvensional untuk

mendiagnosa TB resisten OAT yang mengandalkan kultur bakteri dan uji kepekaan obat yang

telah lama digunakan merupakan proses yang lama dan tidak praktis. Pada saat ada

kemungkinan pasien menerima pengobatan yang tidak tepat, strain M. tuberculosis yang

resisten obat dapat menyebar dan resistensi dapat menjadi lebih luas.

Meskipun metode molekuler yang telah ada sebelumnya untuk mendiagnosa TB

resisten OAT, tetapi alat uji yang ada seperti PCR konvensional atau LPA, memakai metode

yang terlalu rumit untuk selalu dilakukan di negara berkembang. Sampel yang selalu diproses

dan DNA yang diekstraksi menambah kesulitan untuk dilakukan karena sumber daya

manusia kurang. GeneXpert, suatu perangkat platform, yang diluncurkan oleh Cepheid pada

tahun 2004 dan menyederhanakan uji molekuler yang terintegrasi dan automatis dengan 3

proses (persiapan sampel, amplifikasi, dan deteksi) berdasarkan real time PCR Uji Xpert

MTB/RIF dikembangkan oleh Foundation for Inovative New Diagnostic (FIND), Chepeid,

University of Medicine and Dentistry of New Jersey yang dipimpin oleh David Alland dengan

pembiayaan dari National Institutes of Health (NIH) Amerika Serikat dan the Bill and

Melinda Gates Foundation. GeneXpert sebagai alat uji diagnostik TB dan resistensi

rifampisin terus mengalami perkembangan diantaranya yaitu:

Mei 2006: FIND berkerjasama dengan Chepeid untuk mengembangkan suatu alat uji

diagnostik cepat serta praktis dilakukan yang dapat mendeteksi M. tuberculosis dan

resistensi rifampisin dari sampel sputum.

 April 2009: uji cepat baru, Xpert MTB/RIF, diterima Conformite Europeene In Vitro

Diagnostic (CE IVD) marking.

Mei 2009: berlangsungnya penelitian yang dilakukan oleh FIND.

September 2010: New England Journal of Medicine mempublikasi data; Expert

Group merekomendasikan kepada WHO berdasarkan bukti ilmiah; WHOs Strategic

and Technical Advisory Group untuk TB melakukan penelaahan bukti lebih lanjut dan

membuat rekomendasi kebijakan politik.

Desember 2010: WHO merekomendasikan Xpert MTB/RIF.

Desember 2012: Sejak awal WHO merekomendasikan Xpert MTB/RIF, 77 negara

telah tersedia 966 alat GeneXpert dan 1.891.970 catridge Xpert MTB/RIF pada sektor

publik dengan harga yang lebih murah.

Teknologi yang didukung oleh WHO ini, pada 30 Juni 2013 total 3,2 juta catridge dan

1402 mesin GeneXpert (yang terdiri dari 7533 modul mesin) telah digunakan pada 88 negara

dari 145 negara yang memenuhi syarat untuk memperoleh mesin dan catridge dengan harga

yang lebih murah World Health Organization merekomendasikan pemakaian GeneXpert

(Cepheid) untuk mengevaluasi pasien tersangka TB MDR dan pasien dengan BTA negatif

Tuberkulosis paru BTA negatif dihubungkan dengan rendahnya hasil pengobatan, termasuk

kematian yang disebabkan lamanya diagnosa atau tidak terdiagnosa Teknologi baru seperti

GeneXpert memberikan keuntungan untuk diagnosa awal TB dan penggunaan sistem

diagnostik ini dapat meningkatkan diagnosa pasti secara cepat untuk semua pasien dengan

TB paru

Sistem GeneXpert terdiri dari alat GeneXpert, komputer dan disposible catridge Alat

ini membersihkan, mengkonsentrasi dan mengamplifikasi (dengan cepat, real time PCR) dan

mengidentifikasi target asam nukleat dalam gen M. tuberculosis dan memberikan hasil dari

sampel sputum yang tidak perlu diproses hanya dalam waktu kurang lebih 2 jam, dengan
minimal penggunaan tangan. GeneXpert MTB/RIF menggunakan catridge yang berisi semua

elemen yang dibutuhkan untuk reaksi, termasuk reagen lyophilized, liquid buffer serta wash

dan bekerja dengan cara menangkap bakteri setelah proses pencucian kemudian DNA bebas

dan masuk ke chamber pembuangan). GeneXpert MTB/RIF dirancang dengan sistem tertutup

untuk mengurangi atau mengeliminasi resiko kontaminasi amplikon. Sekali tertutup, catridge

jangan pernah dibuka kembali oleh karena itu sebaiknya tidak membuka catridge jika belum

siap untuk memulai pemeriksaan GeneXpert MTB/RIF.

Masing-masing instrumen GeneXpert berisi 4 modul yang dapat diakses secara

individu. Ukuran instrumen yang lain berisi antara 1-72 modul. Masing-masing modul terdiri

dari jarum suntik untuk mengambil atau mengeluarkan cairan, sebuah ultrasonik untuk

melisiskan sel, sebuah thermocycler, dan optical sign untuk mendeteksi komponen. Single

use catridge berisi a) chamber untuk menyimpan sampel dan reagen, b) valve body berisi

sebuah plunger dan syringe barrel, c) sebuah sistem rotary valve untuk mengendalikan

pergerakan diantara chamber, d) sebuah ruang untuk menangkap, menyatukan, mencuci, dan

melisis sel, e) reagen lyophilized real-time PCR dan buffer pencuci dan f) tabung reaksi PCR

yang terintegrasi yang secara automatis diisi instrument Uji GeneXpert MTB/RIF berdasarkan

prinsip multipleks, semi-nested quantitative real-time PCR dengan amplifikasi gen target rpoB

dan untuk meningkatkan sensitivitas, GeneXpert MTB/RIF menggunakan molecular beacon

dengan target gen rpoB. GeneXpert mendeteksi 81 bp core region dari gen rpoB yang dikode oleh

lokasi aktif enzim. Core region rpoB terletak di samping M. tuberculosis-urutan DNA spesifik.

Oleh karena itu, sangat memungkinkan untuk mendeteksi M. tuberculosis dan resistensi

rifampisin secara bersamaan dengan menggunakan teknologi PCR. Molecular beacon merupakan

urutan oligonukleotida yang berisi urutan probe yang terdapat diantara dua tangkai urutan DNA.

Molecular beacon digunakan untuk mendeteksi keberadaan M. tuberculosis dan mendiagnosa

resistensi rifampisin sebagai tanda pengganti untuk TB MDR secara bersamaan. Molecular

beacon menggunakan fluorophor dan quencher untuk mendeteksi hibridisasi pada masing-masing
dari lima region target amplifikasi gen Salah satu dari molecular beacon probes dibuat untuk

mendeteksi DNA pada sampel kontrol Bacillus globigi, suatu organisme tanah yang berspora,

bertindak sebagai penguji kualitas untuk perangkap bakteri, lisis bakteri, ekstraksi DNA,

amplifikasi dan deteksi probe Lima molecular beacon lainnya dibuat untuk hibridisasi pada

region core rpoB-amplikon. Lima warna berbeda yang digunakan pada hibridisasi probe, masing-

masing menutup sequence asam nukleat secara terpisah diantara amplifikasi gen rpoB (Steingart

et al, 2013).

Menurut Piatek dalam Nwokoye et al (2014) probe screen rifampisin adalah untuk mutasi

di core region rpoB. Molecular beacon dibuat hanya untuk hibridisasi gen rpoB sequences yang

cocok dengan M. tuberculosis wild type. Jika tidak ada mutasi, probe mengikat target DNA dan

menghasilkan fluoresen terang. Tetapi jika ada mutasi pada core region rpoB, menghasilkan

fluoresen lambat (partial inhibition) atau tidak menghasilkan fluoresen. Mycobacterium

tuberculosis teridentifikasi jika paling sedikit 2 dari 5 probe memberikan sinyal positif dengan

ambang batas siklus (Cr) 38 siklus atau tidak berbeda jauh dari nilai siklus yang telah

ditetapkan. Dasar deteksi resistensi rifampisin adalah adanya perbedaan antara Cr yang pertama

dan yang terakhir dari probe M. tuberculosis (Cr). Pada Xpert G3, semua deviasi dari wildtype

sequencing menghasilkan pembatasan penampakan sinyal melebihi nilai Cr yaitu 5 dan disebut

resisten rifampisin. Uji berakhir sesudah 38 siklus oleh karena itu dapat dipertimbangkan bahwa

resisten rifampisin indeterminate adalah jika probe pertama Cr adalah >34,5 siklus dan probe

yang terakhir dengan Cr >38 siklus.

Cara pemakaian geneexpert

Pemakaian GeneXpert secara manual sangat mudah: buffer ditambahkan pada sampel

sputum dengan perbandingan volume yang telah ditentukan (2:1), masukkan sampel ke dalam

catridge chamber kemudian catridge dimasukkan ke dalam GeneXpert. Setelah itu, semua proses

yang terjadi adalah secara automatis: GeneXpert pada awalnya menangkap organisme M.
tuberculosis dari sampel sputum pada filter membran. Inhibitor mencuci sel organisme yang

ditangkap dengan buffer kemudian dilisiskan dengan sumber energi ultrasonik dan DNA yang

terlepas dielusi (dialirkan) melalui saringan membran. Solusi DNA akhirnya dicampur dengan

reagen PCR kering kemudian dipindahkan ke dalam tabung PCR untuk real-time PCR dan

dideteksi. Hasilnya dapat dapat diketahui dalam waktu kurang lebih 2 jam. Adanya semua lima

sinyal fluoresensi menunjukkan rifampisin sensitif terhadap DNA M. tuberculosis. Jika 2-<5

sinyal fluoresensi diindikasikan bahwa M. tuberculosis resisten rifampisin. Jika sinyal fluoresensi

tidak ada atau hanya 1 mengindikasikan tidak adanya DNA M. tuberculosis

Sensitivitas GeneXpert MTB/RIF lebih baik daripada pemeriksaan mikroskopis dan

sensitivitasnya sama dengan kultur media padat Hal ini dibuktikan pada saat sesudah dilakukan

penyempurnaan pada Xpert kemudian dilakukan validasi klinis pada pasien di daerah Afrika

Selatan, India, Peru, Jerman dan Azerbaijan. Ada sekitar 4.500 spesimen sputum dari 1.500

suspek TB. Hasilnya Xpert mempunyai spesifisitas dan sensitivitas tinggi untuk mendeteksi DNA

M.tuberculosis pada hampir semua apusan sputum positif dan kultur positif. Sedangkan resisten

rifampisin dideteksi dengan akurasi yang tinggi.

 Uji GeneXpert MTB/RIF merupakan uji diagnostik TB yang memiliki banyak kelebihan

diantaranya: mudah dipakai, mengurangi pemakaian biosafety cabinet, hasil diperoleh lebih cepat

yaitu kurang lebih 2 jam, dan tidak memerlukan tenaga ahli khusus untuk melakukannya. Tetapi

GeneXpert MTB/RIF juga memiliki keterbatasan, diantaranya yaitu: adanya batasan masa pakai

catridge, suhu pengoperasian/ kelembaban dibawah 30 0C sehingga di negara tropis

membutuhkan penyejuk udara yang tetap menyala, biaya mahal, ketersediaan aliran listrik, dan

memerlukan perawatan tahunan serta kalibrasi tiap mesin.

Setelah seseorang didiagnosis sebagai TB MDR maka harus segera dilakukan pelacakan

kontak erat pasien. Definisi kontak erat adalah orang yang tinggal dalam satu ruangan selama

beberapa jam sehari dengan pasien TB MDR, misalnya anggota keluarga, teman kerja dalam

ruangan yang sama, dan lain-lain. Berdasarkan pengalaman, kontak erat pasien TB MDR yang

kemudian sakit TB sebagian besar juga sebagai pasien TB MDR. Resistensi terhadap obat ini

biasanya tidak terdeteksi karena kultur dan uji kepekaan obat tidak rutin dilakukan pada klinik

TB. Pemakaian OAT lini pertama untuk pengobatan pada pasien meningkatkan resiko resistensi

didapat, kambuh dan pengobatan gagal.