Perkembangan Terkini Teknologi Pemisahan pada Industri Bioproses

Kezia Febriana*

Jurusan Teknik Kimia, Fakultas Teknologi Industri, Institut Teknologi Bandung

Jalan Ganesa No. 10, Bandung, Indonesia
*Corresponding Author: kezia.febriana@students.itb.ac.id

Abstrak
Dengan meningkatnya permintaan produk industri bioproses dalam kemurnian yang tinggi,industri bioproses
membutuhkan metode-metode pemisahan yang lebih efisien. Efisiensi yang dimaksud adalah perolehan yang
lebih tinggi dari proses-proses yang biasa digunakan. Karena dibutuhkannya metode yang lebih efisien,
terciptalah metode baru seperti reverse micelle, affinity membrane chromatography, isoelectric focusing, super
critical fluid extraction, dan microfluidic biosepatation. Reverse micelle merupakan teknik pemisahan
berdasarkan kepolaran. Affinity membrane chromatography merupakan gabungan 2 konsep proses pemisahan
yang sudah ada, yaitu kromatografi afinitas dan penggunaan membran. Isoelectric focusing adalah pemisahan
protein dari larutannya dengan memanfaatkan informasi pI. Supercritical fluid extraction adalah pemisahan
senyawa organik ringan yang bersifat non polar menggunakan fluida superkritik.Teknik yang termasuk baru,
yaitu microfluidic bioseparation, memanfaatkan microchip dan biosensor untuk mendeteksi protein dan
memisahkannya. Teknik-teknik yang baru dikembangkan ini sangat berpotensi untuk dijadikan investasi industri
bioproses.

Kata kunci : peroses pemisahan, industri bioproses, reverse micell, affinity membrane chromatography,
isoelectric focusing, supercritical fluid extraction, microfluidic bioseparation.

1. Pendahuluan ini dapat meningkatkan stress kepada mikroba

sehingga dapat menyebabkan lysis pada sel
Semakin lama, kebutuhan akan kemurnian
padahal sel tersebut akan dibutuhkan untuk
produk industri bioproses meningkat.
batch atau proses fermentasi selanjutnya.
Contohnya adalah industri farmasi yang
Berarti industri bioproses membutuhkan
membutuhkan kemurnian zat hasil fermentasi
teknik-teknik pemisahan hasil fermentasi yang
yang tinggi. Padahal dengan teknologi
baru dan lebih efisien. Sekarang dengan
sekarang, hanya beberapa kilogram protein
berkembangnya teknologi telah dikembangkan
atau enzim yang dapat diperoleh
beberapa teknik proses pemisahan produk
pertahunnya.[1] Walaupun begitu, keuntungan
bioproses yang baru. Namun, sebagian
industri terebut sudah sangat besar karena
konsep-konsep ini masih di tahap penelitian,
saingannya yang sedikit tetapi permintaan
belum dibawa ke skala pabrik. Maka dari itu,
konsumen besar. Tantangan lain yang akan
bidang ini sangat berpotensi untuk
dihadapi industri bioproses adalah merancang
dikembangkan dan diinvestasikan.
proses pemisahan tanpa mengetahui sifat fisik
atau kimiawi dari zat yang dibutuhkan 2. Reverse Micelles
maupun limbah.[1] Selain itu, dalam
perancangan proses pemisahan ada beberapa Konsep pemisahan menggunakan reverse
hal yang harus dipertimbangkan selain micelles dikembangkan untuk memisahkan
perolehan yang tinggi seperti keamanan protein dari pelarut beserta pengotornya dan
produk dan sel mikroba atau agen biologis itu menghasilkan larutan protein yang murni.
sendiri.[2] Dengan menggunakan proses Tidak hanya protein, teknik ini dapat
pemisahan seperti elektroforesis atau digunakan untuk memperoleh makromolekul
pemisahan mekanik, sel akan terekspos seperti DNA dan organel sel seperti
dengan lingkungan yang mungkin dianggap mitokondria.[3,4]
ekstrim bagi sel itu sendiri seperti medan
elektrik atau tekanan.[1] Lingkungan yang baru
 Kezia Febriana, Perkembangan Terkini Teknologi Pemisahan pada Industri
Bioproses, 2015, 01-11
Senyawa yang berperan besar dalam
penggunaan teknik reversed micelles, adalah
senyawa yang bersifat amfifilik. Senyawa ini
juga dapat disebut sebagai surfaktan karena
memiliki bagian hidrofilik yang terdiri dari
gugus polar dan hidrofobik yang terdiri dari
gugus non-polar. Pada teknik pemisahan
reverse micelles, bagian polar dari surfaktan
akan berikatan hidrogen dengan senyawa yang
ingin dipisahkan (bersifat polar). Sementara
bagian non-polar pada micelles akan berikatan
dengan pelarut non-polar dengan ikatan van
der Waals.Hasilnya, surfaktan akan
membentuk reversed micelles, dimana bagian
polar menghadap ke dalam dan bagian polar
menghadap ke pelarut.[3,4,5,8] Contoh surfaktan
yang biasa digunakan untuk teknik ini adalah
AOT, anionic di-2-ethylhexyl sodium
sulfosuccinate.[4]
Gambar 1. Struktur Reverse Micell Sumber:
Ganguli (2009)
Teknik reverse micelles terdiri dari 2 tahap
yakni solubilisasi dan desolubilisasi. [3,4,5].
Pada tahap solubilisasi, molekul polar yang
ingin diekstrak akan berpindah dari pelarut
medium ke pelarut organik. Senyawa ini dapat
terlarut di dalam pelarut organik dengan cara
memasuki struktur reversed micelle yang
terbentuk oleh surfaktan. Menurut sistem
Winsor-II, perpindahan massa molekul polar
dari pelarut awal dengan air pada inti reversed
micelle mengikuti mekanisme endositosis
yang terdapat pada sistem biologis.[3] Kinetika
atau kecepatan solubilisasi dipengaruhi oleh
pH air inti pada reverse micelle, konsentrasi
surfaktan yang dinyatakan dalam Wo, dan
sifat pada surfaktan dan biomolekul. Tingkat
keasaman (pH) pada pelarut polar dapat
2
mempengaruhi muatan pada biomolekul.
Semakin besar muatan biomolekul, ikatan
antara biomolekul dan surfaktan semakin kuat,
sehingga waktu yang dibutuhkan untuk
solubilisasi semakin cepat. Wo adalah
konstanta yang menyatakan rasio
perbandingan mol air dalam inti micelle
terhadap mol surfaktan (mol H2O/mol
surfaktan). Jika Wo tidak memenuhi syarat,
maka sistem reversed micelle tidak akan
terbentuk. Nilai syarat Wo tergantung pada
ukuran biomolekul dan konsentrasi surfaktan.
Sifat pada surfaktan dan biomolekul akan
mempengaruhi kekuatan ikatan yang akan
terbentuk. Semakin besar muatan atau
kepolaran biomolekul dengan surfaktan,
semakin cepat solubilisasi. [3,5,8]
Surfaktan yang biasa digunakan untuk teknik
pemisahan reversed micelle adalah surfaktan
ionik seperti AOT dan CTAB (cationic cetyl
trimethyl ammonium bromide). Surfaktan
ionik adalah surfaktan yang memiliki gugus
ionik sebagai bagian hidrofiliknya. Ikatan
yang kuat terbentuk antara biomeluk dengan
surfaktan diakibatkan oleh adanya pertukaran
ion.[6] Walaupun ikatan terbentuk antara
surfaktan dengan biomolekul yang kuat
mempercepat solubilisasi, waktu yang
dibutuhkan untuk tahap desolubilisasi realtif
lama dan sulit untuk dilakukan. Selain itu,
karena ikatannya terlalu kuat, biomolekul
sering mengalami kerusakan, terutama protein.
Akibatnya, aktivitas biologis pada biomolekul
hilang. Untuk mencegah masalah ini,
surfaktan nonionik seperti Tween 85
digunakan. Surfaktan ini cocok untuk
mengekstraksi protein yang aktivitas
biologisnya harus dijaga. Sayangnya,
perolehan menggunakan surfaktan ini tidak
sebanyak menggunakan surfaktan ionik
walaupun waktu yang dibutuhkan untuk
desolubilisasi tidak lama. Untuk mengoptimasi
antara perolehan dan kualitas biomolekul,
konsep mixed reverse micelles terbentuk. Pada
konsep ini, ekstraksi dilakukan dengan
menggunakan campuran surfaktan ionic dan
non-ionik seperti AOT-Tween80 yang
digunakan untuk ekstraksi protein. Konsep
yang paling terkini adalah affinity-based
reverse micelles. Konsep ini memiliki
 Kezia Febriana, Perkembangan Terkini Teknologi Pemisahan pada Industri
Bioproses, 2015, 01-11
selektivitas dan kapasitas yang lebih tinggi
sehingga perolehan biomolekul dengan
menggunakan konsep ini lebih tinggi. Pada
konsep ini bagian polar pada surfaktan
memiliki ligand atau gugus yang akan
mengikat biomolekul secara spesifik.
Ekstraksi antibody dapat memanfaatkan
konsep ini karena menggunakan antigen
sebagai ligand pada surfaktan.[4]
Gambar 2. Tahap Solubilisasi Protein[8]
Tahap setelah solubilisasi adalah
desolubilisasi. Tahap ini merupakan proses
penghancuran sistem reversed micelle untuk
melarutkan biomolekul dalam pelarut air yang
murni, menghasilkan larutan biomolekul
murni. Kecepatan desolubilisasi dipengaruhi
oleh kekuatan ikatan yang terbentuk pada
tahap solubilisasi, semakin kuat ikatan antara
biomolekul dengan surfaktan, semakin lama
waktu yang dibutuhkan untuk desolubilisasi.
Maka dari itu kondisi operasi seperti pH dan
temperatur dapat diatur untuk mempercepat
desolubilisasi. Dengan pengaturan pH, muatan
protein dapat diatur sehingga protein dengan
surfaktan mengalami tolakan diakibatkan oleh
tanda muatan yang sama. Dengan tolakan
tersebut, struktur micelle runtuh dan
biomolekul terlarut oleh pelarut air murni.[3,5]
Temperatur dapat mempengaruhi ikatan antar
pelarut, terutama air. Dengan kenaikan
temperatur nilai Wo membesar sehingga tidak
memenuhi syarat. Akibatnya, micelle hancur
dan biomolekul terekstraksi. Penambahan ion
dalam lingkungan reversed micelle dapat
dilakukan agar konten air dalam reversed
micelle mengalami osmosis sehingga air
3
bersama biomolekul keluar dari micelle.
Selain senyawa garam, alkohol seperti etanol
dapat ditambahkan untuk mempercepat
desolubilisasi. Alkohol memiliki gugus
hidroksi yang polar dan gugus alkil yang non
polar sehingga dapat melarutkan surfaktan
dalam pelarut non-polar. Akibatnya, struktur
micelle hancur dan protein terekstraksi.
Sayangnya, pengaturan pH, temperatur dan
konsentrasi garam dapat merusak biomolekul,
terutama protein yang sensitif terhadap
perubahan kondisi tersebut. Bahkan, alkhohol
yang dibutuhkan untuk desolubilisasi cukup
untuk mengubah pH pelarut biomolekul secara
drastis. Maka dari itu digunakanlah alternatif
lain seperti penambahan counter-ionic
surfactant yang akan berikatan dengan
surfaktan dan membentuk sebuah kompleks.
Pembentukan kompleks ini beringingan
dengan penghancurkan struktur micelle.
Metode lain adalah dehidrasi menggunakan
gel silika yang mengakibatkan hilangnya
konten air sekaligus protein pada micelle.
Biomolekul yang keluar kemudian larut dalam
air murni. Tekanan yang ditambahkan hingga
3-5 atm pada sistem reversed micelle akan
membentuk gas hidrat dari konten air pada inti
micelle. Pembentukan gas ini akan merusak
micelle dan biomolekul dapat membentuk
persipitasi yang mudah dipisahkan. [3]
Aplikasi teknik pemisahan reverse micelles
cukup luas terutama pada ektraksi enzim yang
aktivitas biologisnya perlu dijaga. Contohnya
ekstraksi enzim lysozyme dari telur putih
ayam.[7] Teknik ini juga dapat digunakan
untuk ekstraksi biomolekul lainnya seperti
asam amino[6], DNA atau bahkan organel
sel[3].
Teknik ini sangat berpotensi dalam industri
bioproses karena selektivitas yang tinggi,
dapat dilakukan secara kontinu, mudah
scaling-up, dan biaya operasinya relatif
rendah.[3,5,8] Beberapa surfaktan juga
merupakan bahan antimicrobial seperti
AOT.[9] Maka teknik ini perlu diteliti lebih
lanjut supaya dapat diaplikasikan pada
industri-industri.
 Kezia Febriana, Perkembangan Terkini Teknologi Pemisahan pada Industri
Bioproses, 2015, 01-11
3. Affinity Membrane Chromatography
Teknik pemisahan yang sekarang umum
dipakai oleh industri bioproses untuk
memperoleh kemurnian yang tinggi adalah
bead-packed column-liquid chromatography.
Kekurangan dari menggunakan metode ini
adalah hilang tekan pada aliran fluida sangat
besar sehingga waktu yang dibutuhkan untuk
pemisahan lama. Selain itu proses difusi
biomolekul dalam packing juga membutuhkan
waktu yang lama. Kerugian ini mengakibatkan
perolehan yang rendah.[10,11] Teknik yang telah
dikembangkan, teknik affinity membrane
chromatograpy memecahkan masalah ini.
Karena pori-pori yang berukuran makro pada
membran, aliran fluida mengalami hilang
tekan yang rendah sehingga laju alir fluida
tetap tinggi dan perolehan biomolekul lebih
tinggi dibandingkan teknik sebelumnya.[10]
Teknik affinity membrane chromatography
merupakan aplikasi konsep kromatografi.
Senyawa dengan afinitas terhadap fasa
stasioner akan tertinggal. Hanya saja fasa
stasioner tersebut adalah membrane berpori.
Pori pada membrane membiarkan larutan
mengalir untuk mengurangi hambatan yang
mengakibatkan hilang tekan. Karena hilang
tekan yang dialami fluida kecil, laju alir fluida
tetap tinggi sehingga biomolekul yang
memiliki afinitas terhadap membran cepat
mengalir melalui membran dan
terpisahkan.[11,12] Akibatnya waktu tinggal
biomolekul yang diinginkan dalam membran
cepat.
Supaya teknik ini dapat digunakan, ada
beberapa syarat yang harus dipenuhi oleh
substrat membran atau biomolekul yang akan
dipisahkan[11]. Berikut adalah syarat-
syaratnya:
Struktur molekul tahan terhadap aliran
fluida yang cepat
Substrat memiliki gugus yang reaktif
seperti gugus hidroksida, amida, dan
asam karboksilat
Sifat kimiawi dan fisika tetap stabil
terhadap temperatur tinggi dan bahan
kimia yang digunakan untuk sterilisasi
4
Memiliki sifat hidrofobik untuk
mempermudah pemisahan
Jika kelima syarat ini tidak terpenuhi, metode
pemisahan ini tidak dianjurkan karena dapat
merusak molekul substrat itu sendiri.
Akibatnya, hasil dari pemurnian tidak
maksimal.
Untuk melaksanakan teknik ini jelas
dibutuhkan membran terbuat dari bahan yang
memiliki afinitas dengan protein ataupun zat
yang ingin diperoleh. Jadi proses pembuatan
membran ini merupakan proses yang penting.
Berikut adalah 3 tahap dalam pembuatan
membran berafinitas:
Membuat membran dengan
bahan dasar
Aktivasi membran dasar
Penyesuaian ligand dengan
membran berafinitas
Gambar 3. Tahap-Tahap Pembuatan
Membran Berafinitas untuk Pelaksanaan
Affinity Membrane Chromatography[10]
Bahan dasar membran perlu diperhatikan
karena merupakan struktur dasar dari
membran. Pemilihan bahan dasar yang akan
digunakan tergantung pada sifat zat yang akan
dipisahkan. Bahan polimer yang biasa
digunakan untuk membuat membran
berafinitas ini adalah selulosa karena selulosa
memiliki gugus reaktif hidroksi yang banyak
sehingga gugus ini dapat direaksinya untuk
membentuk ligand. Namun, kekuatan bahan
ini cukup lemah dan tidak tahan terhadap
cairan yang basa karena menyebabkan
hidrolisis selulosa. Selain itu pembentukan
pori pada selulosa juga sulit.[13] Turunan
selulosa, kitin dan kitosan, juga merupakan
bahan yang sering digunakan sebagai bahan
dasar membran karena memiliki struktur yang
kuat, gugus reaktif yang banyak, dan ukuran
porinya mudah diatur. Poliamida dan
turunannya seperti nylon juga sering
digunakan sebagai bahan dasar membran
 Kezia Febriana, Perkembangan Terkini Teknologi Pemisahan pada Industri
Bioproses, 2015, 01-11
karena memiliki struktur yang kuat dan stabil
secara kimiawi. Tetapi, hidrolisis membran
nilon perlu dilakukan untuk menambah gugus
aktif dan menghindari afinitas terhadap
molekul yang tidak diinginkan. Jika
diperlukan bahan yang tahan terhadap suhu
yang tinggi, polisulfon dan turunannya dapat
digunakan. Sayangnya, bahan ini bersifat
hidrofobik. Maka untuk mengatasi masalah ini
bahan ini perlu dimodifikasi. Contoh
modifikasi adalah mencampurkan polimer ini
dengan polimer yang hidrofilik. Polietilen dan
polipropilen merupakan bahan yang
berpotensi untuk dimanfaatkan sebagai
membran karena memiliki stabilitas terhadap
panas dan bahan kimia. Tetapi bahan ini
bersifat hidrofobik. Sama seperti polisulfon,
perlu dilakukan modifikasi. [10]
Setelah pemilihan bahan, pembentukan pori
perlu dilakukan. Metode pembentukan pori
tergantung pada bahan yang digunakan.
Pembentukan pori makro (0,5-1m) pada
selulosa dilakukan dengan mereaksikan
selulosa dengan basa kuat pada konsentrasi
yang tinggi kemudian direaksikan dengan
NaBH4.[13]
Pemodifikasian bahan dasar membran telah
dilakukan untuk meningkatkan afinitas
membrane terhadap biomolekul. Resin yang
biasa digunakan pada packed-column
chromatography memiliki afinitas yang tinggi.
Sifat resin ini dimanfaatkan untuk membentuk
mixed-matrix membrane. Hasil modifikasi ini
memiliki afinitas yang lebih besar dari
membran biasa.[12]
Hasil pembentukan membran dari bahan dasar
adalah membrane yang belum teraktivasi.
Berarti, membrane ini belum dapat menarik
protein dengan baik sehingga diperlukan
aktivasi terlebih dahulu. Aktivasi membrane
dapat dilakukan dengan beberapa cara. Salah
satu cara yang paling biasa digunakan adalah
aktivasi cyanogen bromide. Pada metode ini
bahan dasar direaksikan dengan cyanogen
bromide pada pH 7.2. Hasil reaksi ini akan
membentuk membran teraktivasi dimana
membran akan berikatan dengan gugus
aromatik primer atau alifatik dari monomer
5
asam amino pada sebuah protein saat proses
pemisahan protein. Sayangnya cyanogen
bromide dikatakan karsinogenik sehingga
proses aktivasi menggunakan metode ini harus
dilakukan dengan hati-hati. Metode ini kurang
cocok untuk digunakan pada proses pemisahan
enzim yang akan dikonsumsi manusia. Karena
metode sebelumnya bersifat kurang aman,
telah dikembangkan metode aktivasi yang
menggunakan zat yang lebih aman, yaitu
metode aktivasi epoksida. Metode ini
melibatkan reaksi antara gugus hidroksida
pada bahan dasar membrane dengan
bioxiranes, epichlorohydrin, atau epoxy
bromopropane. Reaksi ini menghasilkan
membran yang teraktivasi karena ada
pembentukan gugus kelompok oksiran pada
bahan dasar membran. Ada berbagai metode
lain selain yang disebutkan sebelumnya seperti
periodate oxidation dan triazine activation.[10]
Tahap terakhir pembuatan membran
berafinitas setelah tahap aktivasi adalah tahap
penyesuaian ligan dengan membran. Tahap ini
diperlukan untuk mencegah membran
berikatan dengan zat yang memiliki afinitas
dengan bahan dasar namun bukanlah zat yang
ingin dipisahkan.
Penyesuaian ligand dengan membran
dilakukan dengan cara penambahan spacer
arm kepada membran terlebih dahulu. Spacer
arm adalah gugus mengikat kepada membran
yang bertugas untuk memberi jarak antara
membran dengan ligand. Spacer arm yang
baik memiliki karakteristik berikut: (1)panjang
spacer arm lebih dari 3 atom, (2) tidak
memiliki gugus aktif selain yang mengikat
substrat untuk menghindari afinitas terhadap
molekul yang tidak diinginkan, dan (3) dapat
mengikat ligand dan memiki afinitas terhadap
substrat sehingga menambah kapasitas affinity
chromatography membrane. Contoh spacer
arm yang biasa digunakan adalah polipeptida,
alkilamin, dan polieter.[10]
Ligand yang terikat pada membran tergantung
pada substrat yang ingin dipisahkan. Terdapat
4 macam ligan yang digunakan pada teknik ini
yaitu: immunoafinity ligands (memanfaatkan
ikatan antigen-antibody), Protein A atau G
 Kezia Febriana, Perkembangan Terkini Teknologi Pemisahan pada Industri
Bioproses, 2015, 01-11
(mengikat imunoglobulun G, IgG), ligan low-
molecular mass, dan ligan lain-lainnya.[12]
Ligan yang baik harus memenuhi syarat
berikut: (1) reaksi pembentukan ikatan antara
subtrat dan ligan harus reversibel, (2) ikatan
yang terbentuk tidak boleh merusak
konformasi atau situs aktif substrat.[10] Jika
syarat ini tidak terpenuhi, substrat yang
dihasilkan akan kehilangan ativitas
biologisnya.
Gambar 4. Struktur Affinity Chromatography
Membrane
Aplikasi teknik ini sangat berpotensi dalam
pemurnian protein. Contohnya adalah
pemurnian inhibitor enzim tripsin
menggunakan membrane selulosa berpori
(ukuran makro) dan enzim tripsin sebagai
ligannya.[13] Concanavalin A berhasil
dipisahkan menggunakan membran selulosa
berpori yang diaktivasi menggunakan gugus
epoksi, ditambahkan spacer arm dengan
maltosa sebagai ligan.[14]
4. Isoelectric Focusing
Diketahui bahwa setiap enzim memiliki nilai
pI yang berbeda-beda. pI adalah nilai pH pada
saat enzim memiliki muatan total sebesar 0.
Informasi ini kemudian dimanfaatkan untuk
pemisahan enzim. Teknik pemisahan protein
dengan memanfaatkan informasi pI disebut
sebagai teknik isoelectric focusing. Teknik ini
juga merupakan hasil modifikasi teknik
elektroforesis, yang memisahkan zat
tergantung pada muatannya.[15]
6
Teknik ini dilaksanakan dengan meletakkan
larutan berenzim di tempat bermedan elektrik.
Medan elektrik ini dibentuk oleh anoda dan
katoda yang dialiri listrik. Dengan adanya
anoda dan katoda yang bermuatan, konsentrasi
ion hidrogen atau senyawa asam akan
terkonsentrasi pada anoda sehingga larutan
sekitar anoda bersifat asam. Sementara
senyawa basa akan terkonsentrasi pada katoda.
Perpindahan senyawa asam dan basa ini akan
membentuk konsentrasi gradien pH dari anoda
(pH rendah) ke katoda (pH tinggi). Ditambah
lagi, reaksi yang terjadi pada anoda adalah
oksidasi air yang menghasilkan ion hidrogen
sehingga menurunkan pH pada anoda.
Sementara pembentukan ion hidroksi dengan
reduksi air terjadi pada katoda.[16]
Molekul protein yang kebetulan terletak pada
pH dibawah nilai pI-nya akan bersifat asam
dan memiliki muatan positif. Muatan yang
terbentuk ini akan mendorong protein untuk
berpindah menuju katoda yang bermuatan
negatif. Selama perpindahan protein akan
mengalami perubahan pH pada lingkungan
sehingga muatan protein juga berubah menuju
0. Perubahan pH ini diakibatkan oleh protein
yang bereaksi dengan ion hidroksi selama
perpindahan. Pada saat pH molekul protein
mencapai pI, molekul bermuatan 0 dan akan
diam di tempat itu karena telah mencapai
kondisi paling stabil. Jika protein kebetulan
terletak pada pH yang lebih tinggi dari nilai pI,
hal yang sebaliknya akan terjadi. Protein
bermuatan negative berpindah menuju anoda
yang disebabkan oleh ketertarikan antara
muatan protein dengan elektroda yang
berbeda. Selama perjalanan protein akan
bereaksi dengan ion hidrogen, menghasilkan
protein yang bermuatan 0. Pada kondisi ini
protein akan diam di tempat yang sama dari
kondisi sebelumnya. Akhirnya sebuah daerah
pada reaktor akan terkonsentrasi dengan
protein. Daerah tersebut memiliki nilai pH
yang sama dengan pI dari protein.[15,16] Teknik
ini berbeda dengan elektroforesis dimana
biomolekul akan terus bergerak selama ada
medan listrik.[17]
 Kezia Febriana, Perkembangan Terkini Teknologi Pemisahan pada Industri
Bioproses, 2015, 01-11
Gambar 5. Konsep Isoelectric Focusing[15]
Dalam mendesain proses pemisahan ini ada
beberapa faktor yang harus dipertimbangkan
yakni:
Rentang gradient pH
Gel yang digunakan
Listrik yang dibutuhkan
Kelarutan protein terhadap larutan
yang akan digunakan
Rentang gradien pH yang akan terbentuk perlu
diperhatikan karena nilai pI protein harus
berada di rentang gradien yang akan terbetuk.
Idealnya nilai pI protein berada di tengah
rentang pH larutan. Supaya protein dapat
dikonsentrasikan ke suatu area yang spesifik.
Berarti, larutan yang akan membentuk gradien
pH perlu dipilih dengan baik. Ada 2 macam
larutan yang dapat digunakan pada sistem ini
yaitu elektrolit amfoterik, larutan dengan
campuran berbagai macam senyawa amin
alifatik dengan senyawa bergugus asam
karboksilat, dan penyangga acrylamido sebuah
senyawa turunan dari akrilamida.[15,16]
Senyawa elektrolit amfoterik, atau pembawa
amfolit, selain penyangga dapat
menghantarkan arus listrik untuk menjaga pH
gradien antara elektroda. Senyawa ini juga
harus memiliki kapasitas penyangga yang
besar untuk menghindari perubahan pH pada
daerah tersebut. Selain itu, penyangga ini
harus dipilih dengan baik sehingga tidak
berikatan dengan protein dan membentuk
sebuah kompleks. Jika terbentuk kompleks,
protein tidak dapat dipisahkan. Masalah dari
menggunakan larutan ini adalah seiring
berjalannya waktu variasi pH antara elektroda
berubah dikarenakan larutan yang terus
7
bereaksi dengan protein. Akibatnya, efisiensi
pemisahan tidak konstan dan berbeda setiap
percobaan. Maka dari itu, digunakanlah
penyangga akrilamido yang tetap pada matriks
poliakrilamid dalam wujud gel. Terdapat 7
macam senyawa turunan akrilamid yang
digunakan untuk membentuk gradien pH.
Tujuh titik pH senyawa tersebut sebesar: 3,6;
4,6; 6,2; 7,0; 8,5; 9,3; dan 10,3. Berbeda
dengan elektrolit amfoterik, gradien pH pada
penyangga akrilamido konstan maka proses
pemisahan dapat dilakukan dalam waktu yang
lebih lama, efisiensi dan perolehan
menggunakan penyangga ini lebih besar.[16]
Biasanya pada metode ini digunakan media
gel dengan pori-pori yang besar sehingga
molekul protein dan senyawa penyangga dapat
berpindah tempat dengan bebas. Terdapat 2
macam gel yang biasa digunakan, agar dan
poliakrilamid. Jika menggunakan
poliakilamid, penyangga yang digunakan pasti
senyawa turunan akrilamido dimana gradien
pH akan selalu konstan dalam waktu yang
lama. Agar merupakan polisakarida yang
natural. Struktur pada agar dan poliakrilamid
tidak berbeda jauh hanya saja pori pada agar
lebih besar. Ini merupakan kelebihan bari agar
karena dapat digunakan untuk pemisahan
protein yang besar (>200 kDa). Pemisahan
protein besar menggunakan poliakrilamid
tidak menghasilkan perolehan yang tinggi
karena protein tidak dapat berpindah jauh
sehingga tidak dapat capai pI.[16]
Listrik yang dibutuhkan juga perlu
diperhitungkan karena listrik yang mengalir
pada anoda dan katoda akan mempengaruhi
pH larutan. Semakin besar gradien pH
semakin baik karena protein akan
terkonsentrasi ke area yang lebih kecil
sehingga lebih mudah untuk diperoleh. Waktu
yang dibutuhkan untuk pemurnian juga
berkurang.[17] Namun, semakin besar tegangan
yang diberi, semakin banyak panas yang
tertinggal dalam gel. Hal ini tidak diinginkan
karena kenaikan suhu gel yang drastis dapat
mengakibatkan kerusakan biomolekul seperti
denaturasi protein. Maka dari itu, tegangan
yang diberi harus diperhitungkan dengan baik.
Salah satu caranya adalah menggunakan gel
 Kezia Febriana, Perkembangan Terkini Teknologi Pemisahan pada Industri
Bioproses, 2015, 01-11
yang lebih tipis karena rasio permukaan
terhadap volumenya lebih besar dibandingkan
gel yang teba sehingga lebih mudah untuk
menghilangkan panas ke lingkungan. [15]
Kelarutan protein juga harus diperhatikan
karena molekul protein cenderung
mengdendap saat keasaman protein mencapai
pI. Untuk menghindari terjadinya
pendendapan, urea atau senyawa detergen
ditambahkan ke larutan. Urea dalam larutan
akan mengganggu pembentukan ikatan
hidrogen antar molekul protein sehingga tidak
terjadi koagulasi. Tetapi jika urea yang
ditambahkan terlalu banyak, pH larutan dapat
berubah drastis sehingga menyebabkan
denaturasi protein. Jadi dibutuhkan senyawa
lain yang menghambat koagulasi protein.[15]
Pemisahan campuran protein menggunakan
isoelectric focusing dilakukan pada jaringan
sel tikus dilakukan dengan gel akrilamid.
Hasilnya, pemisahan dapat memisahkan
ratusan protein yang terdapat pada jaringan sel
tikus. Titik pI yang sangat berdekatan dapat
mengartikan mutasi protein pada jaringan
sel.[18]
5. Ekstraksi Fluida Superkritik
Fluida superkritikal adalah fluida dalam
kondisi temperatur diatas temperatur kritis dan
tekanan diatas tekanan kritis. Fluida
superkritikal pada umumnya memiliki densitas
yang tinggi, viskositas yang rendah, dan
difusivitas diantara cairan dan gas.[19] Jika
tekanan ditingkatkan terus, solubilitas dan
massa jenis fluida akan semakin menyerupai
cairan.[20] Karakteristik ini menyebabkan
fluida superkritikal dapat menyebar melewati
celah-celah padatan seperti gas dan
melarutkan zat seperti cairan.[21] Sifat-sifat ini
menyebabkan fluida superkritik menjadi
pelarut ekstraksi yang baik. Fluida superkritik
yang pada umum digunakan adalah karbon
dioksida, CO2. Karbon dioksida merupakan
fluida yang umum digunakan karena tidak
mudah bereaksi, tidak berbahaya, tidak mudah
terbakar dan harganya relatif terjangkau.[19]
8
Alasan lain yang membuat karbon dioksida
sering digunakan sebagai pelarut ekstraksi
adalah tidak dibutuhkan suhu yang tinggi
untuk mencapai kondisi superkritik sehingga
senyawa yang diekstraksi tidak mengalami
kerusakan yang disebabkan oleh kondisi
operasi.
Pada teknik ekstraksi menggunakan fluida
superkritik terdapat dua tahap utama yaitu
melarutkan senyawa dalam fluida superkritik
dan dilanjutkan dengan persipitasi senyawa
estrak. Pada tahap pertama, fluida pelarut,
biasanya karbon dioksida dipanaskan dan
diberi tekanan sampai mencapai kondisi
superkritik.[20] Selektivitas dan kapasitas
pelarut dipengaruhi oleh massa jenis fluida
superkritik. Sementara, massa jenis fluida
dipengaruhi oleh tekanan dan temperatur
fluida. Maka dari itu untuk mengoptimalkan
selektivitas dan kapasitas, tekanan dan suhu
fluida superkritik diatur.[19] Tahap selanjutnya
adalah persipitasi senyawa terlarut dengan
cara menurunkan tekanan fluida superkritik.
Penurunan tekanan mengakibatkan penurunan
massa jenis yang menghasilkan kelarutan
terhadap senyawa ekstrak yang sangat rendah.
Hasilnya, senyawa biomolekul memisahkan
diri dari fluida sebagai persipitasi sementara
fluida menjadi gas dan menguap.[20]
Karena fluida pelarut yang biasa digunakan
adalah karbon dioksida, senyawa yang terlarut
terbatas pada senyawa non-polar yang ringan
seperti hidokarbon C3 dan C4. Hal ini
diakibatkan oleh sifat karbon dioksida yang
polar dan massa jenis karbon dioksida
superkritik kurang besar untuk mengikat
molekul polar yang lebih besar. Penambahan
ko-pelarut seperti metanol yang bersifat polar
telah dilakukan untuk mengekstraksi senyawa
polar. Sayangnya, hasilnya perolehannya
belum setinggi hasil ekstraksi konvensional.[19]
Beberapa upaya lain telah dilakukan untuk
meningkatkan perolehan. Contohnya adalah
 Kezia Febriana, Perkembangan Terkini Teknologi Pemisahan pada Industri 9
Bioproses, 2015, 01-11

menggunakan ekstraksi beberapa tahap. mendeteksi dan memisahkan senyawa produk

Misalkan ekstraksi perasa alami dari lemak yang diinginkan. Metode ini juga
susu dengan karbon dioksida superkritikal menggunakan konsep elektroforesis dimana
dilakukan dengan 2 tahap. Tahap pertama substrat berpindah tempat sesuai muatan.[28]
adalah ekstraksi dengan kondisi operasi 200
Teknik ini dilaksanakan dengan cara
bar dan 45C dan dilanjutkan dengan ekstraksi
penanaman microchip dengan biosensor
tahap kedua dengan kondisi operasi 170 bar
kepada medium hasil fermentasi. Kemudian
60C. Hasil percobaan menyatakan
dengan adanya magnet, senyawa yang ingin
konsentrasi perasa dipekatkan 500 sampai
diperoleh akan terkonsentrasi ke arah daerah
1000 kali dengan metode ekstraksi 2 tahap.[22]
yang paling dekat dengan sumber medan
Salah satu cara lain untuk mengoptimasi
magnet. Dengan ini protein terpisahkan dan
adalah menggunakan kolom dengan packing.
dapat diperoleh untuk dimurnikan lebih
Namun hal lain yang perlu diperhatikan adalah
lanjut.[28,30]
laju alir fluida dengan ukuran packing karena
kedua hal ini mempengaruhi efisiensi.[23]
Teknik ini telah diaplikasikan untuk
mengekstraksi minyak dari kacang kedelai[24],
biji pohon ek[25], perasa pada susu dari lemak
susu[22], dan -karoten serta likopen dari
tomat[26]. Selain itu teknik ini dapat digunakan
untuk mengekstrasi bernilai tinggi untuk
industri farmasi seperti karotenoid dan asam
linoleik dari mikroalga.[27] Dapat disimpulkan
bahwa teknik ini berhasil digunakan untuk
mengekstraksi zat-zat organik yang bernilai
tinggi, terutama perasa, obat, dan bahan
aromatik untuk parfum dan makanan. Jadi
teknik ini berpotensi untuk dikembangkan
untuk dioptimasi dan dapat mengekstraksi
berbagai senyawa termasuk yang polar yang
masih merupakan tantangan bagi industri Gambar 6. Perbedaan Antara Metode
bioproses. Microfluidic dan Tube Separation[29]
7. Kesimpulan

6. Microfluidic Bioseparation Dengan meningkatnya permintaan produk

Tantangan yang selalu ada dalam industri
bioproses adalah memisahkan produk yang
diinginkan dari medium hasil fermentasi yang
mengandung berbagai macam senyawa.
Teknik ini kemudian dikembangkan dengan
harapan dapat memecahkan masalah ini.
Teknik ini merupakan teknik yang sangat
modern karena menggunakan microchip untuk
industri bioproses dalam kemurnian yang
tinggi, industri bioproses membutuhkan
metode-metode pemisahan yang menghasilkan
perolehan yang lebih tinggi. Metode
pemisahan yang relative baru adalah reverse
micelle, affinity membrane chromatography,
isoelectric focusing, super critical fluid
extraction dan microfluidic biosepatation.
Reverse micelle sangat berpotensi untuk
 Kezia Febriana, Perkembangan Terkini Teknologi Pemisahan pada Industri
Bioproses, 2015, 01-11
pemisahan molekul polar. Affinity membrane
chromatography berpotensi digunakan dalam
pemurnian berbagai macam molekul, yang
penting adalah substrat memiliki afinitas
terhadap ligan pada membrane, senyawa
tersebut termasuk antibody dan protein.
Isoelectric focusing adalah teknik yang
dikembangkan khusus untuk pemisahan
protein. Supercritical fluid extraction sangat
berpotensi dalam bidang kosmetik dan
makanan yang membutuhkan senyawa yang
memiliki wangi khas dan perasa natural yang
khas dimana senyawa-senyawa ini biasanya
adalah senyawa organik ringan yang bersifat
non polar. Teknik yang termasuk baru, yaitu
microfluidic bioseparation, berpotensi untuk
berbagai macam pemisahan biomolekul, hanya
saja teknik ini perlu penelitian yang lebih
lanjut.
Daftar Pustaka
[1] Keller, K., Friedmann, T., (2011). The
Boseparation Needs for Tomorrow. The NDS in
Biotechnology. 19(11). Hal 438-441.
[2] Singh, P.C., Singh, R.K., (1996). Choosing an
Appropriate Bioseparation Technique. Trends in
Food Science & Technology Engineering. 16(6).
Hal 949-955.
[3] Lazarova, Z., Tonova, K., (2008). Reversed
Micelle Solvents as Tools of Enzyme Purification
and Enzyme-Catalyzed Conversion,
Biotechnology Advances, 26, Hal 516-532.
[4] Liu, Y., Dong, X., Sun., Y. (2008). New
Development of Reverse Micelles and Application
in Protein Separation and Refolding. Chinese
Journal of Chemical Engineering.16(6). Hal 949-
955.
[5] Kadam, K. L. (1986). Reverse Micelles as a
Bioseparation Tool, Enzyme Microbiology
Technology, 8. Hal 266-273.
[6] Cardoso, M. M., et al. (1998). Mechanisms of
Amino Acid Partitioning in Cationic Reversed
Micelles, Bioseparation, 7. Hal 65-78
[7] Jarudilokkul, S., Paulsen, E., Stuckey, D. C.
(2000). The Effect of Demulsifiers on Lysozyme
10
Extraction from Hen Egg White Using Reverse
Micelles, Bioseparation,9. Hal 81-91.
[8] Krei, G. A., Hustedt, H. (1992). Extraction of
Enzymes by Reverse Micelles, Chemical
Engineering Science, 47(1). Hal 99-111
[9] Chen, F., et al. (2008). Antimicrobial Activity
of AOT-isooctane Reverse Micelle as a
Bioseparation and Biocatalyst Tool. Chemical
Speciation and Bioavailability, 20(3), Hal 191-197.
[10] Zou, H., Luo, Q., Zhou, D,. (2001). Affinity
Membrane Chromatography for the Analysis and
Purification of Proteins. Elsevier. 49. 199-240.
[11] Ghosh, R., (2002). Protein Separation Using
Membrane Chromatography: Opportunities and
Challenges. Elsevier. 952. Hal 13-27.
[12] Orr, V., et al. (2013). Recent Advances in
Bioprocessing Application of Membrane
Chromatography, Biotechnology Advances, 31, hal
450-465.
[13] Ruckenstein, E., Guo, W. (2001). Crosslinked
Mercerized Cellulose Membranes and Their
Application to Membrane Affinity
Chromatography, Journal of Membrane Science
187, hal 277-286.
[14] Guo, W., Ruckenstein, E. (2001). A New
Mtrix for Membrane Affinity Chromatography and
its Application to the Purification of Concanavalin
A, Journal of Membrane and Science, 182, hal 227-
234.
[15] Davey, J., Lord, M. (2003). Isoelectric
Focusing. Oxford University Press, Oxford UK.
Hal 1-8.
[16] Garfin, D. E. (2000). Separation Science and
Technology, Volume 2, Academic Press. Hal 263-
298.
[17] Vesterberg, O. (1972). Isoelectric Focusing of
Proteins in Polyacrylamide Gels, Biochimica Et
Biophysica Acta, 257, hal 11-19.
[18] Klose, J. (1975). Protein Mapping by
Combined Isoelectric Focusing and Electrophoresis
of Mouse Tissue, Humangenetik 26, hal 231-243.
[19] Palmer, M. V., Ting, S. T. T. (1995).
Applications for Supercritical Fluid Technology in
Food Processing, Food Chemistry, 52, hal 345-352.
[20] Morgan, E. D. (2000). Supercritical Fluid
Extraction, III/Natural Products, Academic Press,
hal 3451-3459
 Kezia Febriana, Perkembangan Terkini Teknologi Pemisahan pada Industri 11
Bioproses, 2015, 01-11

[21] Sapkale, G. N., et al. (2010). A Review:

Supercritical Fluid Extraction. Int. J. Chem. Sci,
8(2), hal 729-743.
[22] de Haan, A. B., et al. (1990). Extraction of
Flavours from Milk Fat with Supercritical Carbon
Dioxide, The Journal of Supercritical Fluids, 3, hal
15-19.
[23] Salamatin, A. A., Egorov, A. G. (2015).
Optimization of Supercritical Fluid Extraction:
Polydisperse Packed Beds and Variable Flow
Rates. The Journal of Supercrtical Fluids, 105, hal
35-43
[24] Friedrich, J. P., List, G. R., Heakin, A. J.
(1982). Petroleum-Free Extracton of Oil from
Soybeans with Supercritical CO2, JAOCS, 59(7),
hal 288-292
[25] Bernando-Gil, M. G., et al. (2007).
Supercritical Carbon Dioxide Extraction of Acorn
Oil, The Journal of Supercritical Fluids, 40, hal
444-348.
[26] Baysal, T., Ersus, S., Starmans, D. A. J.
(2000). Supercritical CO2 Extraction of -Carotene
and Lycopene fro Tomato Waste Paste. Journal of
Agriculture and Food Chemistry. 48, hal 5507-
5511.
[27] Mendes, R. L., et al. (2003). Supercritical
Carbon Dioxide Extraction of Compounds with
Pharmaceutical Importance from Microalgae.
Inorganica Chimica Acta, 356, hal 328-334.
[28] Khashan, S. A., Alazzam, A., Furlani E. P.
(2014). Computational Analysis of Enhanced
Magnetic Bioseparation in Microfluidic Systemns
with Flow-Invasive Magnetic Elements. Scientific
Reports. 4(5299). Hal 1-9.
[29] http://www.robaid.com/tech/novel-
microfluidic-method-for-bioseparation.htm,
diakses 7 November 2015.
[30] Shields IV, C. W., Reyes, C.D., Lopez, G.P.,
(2014). Microfluidic Cell Sorting: Arevier of the
Advances on the Seperation of Cells from
Debulking to Rare Cell Isolation. NIH Public
Access. 15(5). 1230-1249

All in-text references underlined in blue are linked to publications on ResearchGate, letting you access and read them immediately.