Translate Journal Review

Analysis of biomolecular condensates and protein phase separation with microfluidic technology

dr. Flavia Angelina Satopoh 04022782125001

dr. Randy Pangestu 04022782125002
dr. Fenny Pranandita 04022782125005
dr. Erlangga Danu Saputro 04022782125006

Prodi : Ilmu Kesehatan Anak

Pembimbing :
dr. Subandrate, M.Biomed

DEPARTEMEN ILMU KESEHATAN ANAK

FAKULTAS KEDOKTERAN UNIVERSITAS SRIWIJAYA
RSUP DR. MUHAMMAD HOESIN PALEMBANG

2021
Ulasan

Analisa kondensat biomolekuler dan pemisahan fase protein dengan teknologi

mikrofluida
Miriam Linsenmeier, Marie RG Kopp, Stavros Stavrakis, Andrew de Mello, Paolo Arosio ⁎
Departemen Kimia dan Terapan Biosciences, ETH Zurich, Zurich 8093, Swiss

Kata kunci:
Mikrofluida, Kondensat biomolekuler
Pemisahan fase cair-cair, Protein dan RNA
Organel tanpa membran, Kompartemen tetesan
ABSTRAK
Semakin banyak bukti yang menunjukkan bahwa organel tanpa membran merupakan komponen kunci dalam organisasi seluler. Pengamatan ini membuka berbagai
pertanyaan luar biasa tentang aturan fisika-kimia yang mendasari perakitan, pembongkaran, dan fungsinya Beberapa penentu molekuler dari kondensat biomolekuler
menantang untuk diselidiki dan dipahami dalam sistem in vivo yang kompleks. Pendekatan rekonstitusi in vitro yang minimalis dapat mengisi celah ini, meniru fitur
biologis utama, sambil mempertahankan kesederhanaan yang cukup untuk memungkinkan analisis aspek fundamental dari kondensat biomolekuler . Dalam konteks
ini, teknologi mikofluida merupakan alat yang sangat menarik untuk analisis transisi fase biomolekuler. Dalam konteks ini, teknologi mikofluida adalah alat yang sangat
menarik untuk analisis transisi fase biomolekuler. Selain memungkinkan pengukuran throughput tinggi pada volume sampel kecil, alat mikofluida menyediakan kontrol
perakitan mandiri yang sangat baik dalam waktu dan ruang, yang mengarah pada analisis kuantitatif yang akurat dari transisi fase biomolekuler. Di sini, dengan fokus
khusus pada mikrofluida berbasis tetesan, kami menjelaskan keunggulan teknologi mikofluida untuk analisis beberapa aspek pemisahan fase. Ini termasuk diagram
fase, dinamika perakitan dan pembongkaran, sifat reologi dan permukaan, pertukaran bahan dengan lingkungan sekitarnya dan kopling antara kompartementalisasi
dan reaksi biokimia. Kami menggambarkan konsep-konsep ini dengan contoh-contoh yang dipilih, mulai dari solusi sederhana protein individu untuk miyang lebih
kompleksXmembangun strukturdari protein dan RNA, yang merupakan model sintetis organel membraneless biologis. Akhirnya, kami membahas bagaimana teknologi
ini dapat berdampak pada fabrikasi bottom-up sel buatan sintetis dan untuk pengembangan bahan protein sintetis dalam bioteknologi.

1. Pendahuluan
Dalam sepuluh tahun terakhir telah menjadi jelas bahwa sel dapat
membentuk kondensat biomolekuler padat yang dapat bertindak
sebagai kompartemen tanpa membran [1-4]. Badan-badan ini dapat
menunjukkan berbagai sifat reologi dan dapat memediasi beragam
proses dan fungsi biologis, yang baru mulai dijelaskan. Yang paling
penting, pembentukan organel membraneless memungkinkan
organisasi reversibel reaksi kimia bio dalam ruang dan waktu,
sementara menjamin influ terus menerus X dan outfluX reaktan dan
produk. Karakteristik ini berguna dalam banyak proses seluler yang
sangat dinamis, termasuk cluster sinyal[5,6],ekspresi gen dengan
pembentukan super-en-[hancers 7,8],RNA fluX,penyimpanan dan
pengolahan di butiran stres atau tubuh pemrosesan [9-12], dan
pertahanan kekebalan bawaan [13]. Tidak mengherankan, pengamatan
baru-baru ini telah menghidupkan kembali minat ilmiah dalam
pemisahan fase cair-cair dari biopolimer.
Protein dan asam nukleat yang terkait dengan organel tanpa
membran
mengkodekan beberapa interaksi antarmolekul [14-18] yang telah
berevolusi secara alami untuk menyediakan kontrol spatiotemporal
yang luar biasa tidak hanya dari respon stimulus tetapi juga sifat dari
kompartemen yang dihasilkan, termasuk dinamika, komposisi , sifat
reologi dan aktivitas biokimia.
Selain interaksi antarmolekul yang dikodekan dalam urutan
protein, kontrol pemisahan fase yang akurat dimediasi oleh berbagai
faktor modulasi, yang meliputi modifikasi pasca-translasi, serta
interaksi dengan RNA dan DNA [13,18-22] , selain molekul kecil dan
faktor metabolik seperti ATP [22-25]. Ketidakseimbangan mekanisme
ini sering dapat mengakibatkan transisi fase cair-ke-padat patologis
dan pembentukan agregat protein menyimpang yang terkait dengan
penyakit neurodegeneratif [17,26-31].
Kontrol spatiotemporal fungsi biokimia yang ditawarkan oleh
pemisahan fase cair-cair juga telah disarankan untuk memainkan
peran kunci dalam asal usul kehidupan dan pembentukan
kompartemen primitif [32]. Secara khusus, coacervates kompleks
dibentuk oleh malah dibebankan
 M. Linsenmeier,
biopolimer dapat mewakili bentuk sederhana dari katalitik aktif,
kompartemen terbuka [33-36]. Mekanisme kompleks bahwa sel-sel
memiliki veloped de- untuk mengontrol terbuka kompartementalisasi
kenaikan gaji tions-pertanyaan menarik tentang kimia fisik yang
mengatur pemisahan fase dalam mi biologi Xmembangun struktur.
Beberapa dari pertanyaan mendasar ini tidak dapat dijawab dalam
lingkungan sel yang kompleks dan memerlukanminimal in vitro
pendekatan rekonstitusiyang meniru fitur biologis dasar, sambil
mempertahankan kesederhanaan yang memadai. Pengembangan
sistem model tersebut sangat diperlukan tidak hanya untuk memahami
pemisahan fase biologis tetapi juga untuk menghasilkan sistem sintetik
dengan aplikasi dalam bioteknologi, seperti bahan protein adaptif dan
biosensor [37-42].
Dalam konteks ini, teknologi mikofluida mewakili alat yang
berharga baik untuk analisis perakitan mandiri biologis dan untuk
pembuatan kompartemen sintetis bottom-up [43]. Pertama,
karakterisasi komprehensif dari proses transisi fase dan sifat-sifat
kompartemen yang dihasilkan memerlukan sejumlah besar percobaan.
Manfaat yang jelas dari sistem mikofluida adalah kemudahan
eksperimen yang dapat dilakukan dengan throughput tinggi dengan
menggunakan bahan dalam jumlah terbatas. Selain itu, manipulasi
sampel cairan pada skala mikron memungkinkan kinerja operasi yang
pada dasarnya tidak mungkin dilakukan pada skala massal. Dalam
konteks saat ini, teknologi mikofluida menghasilkan manipulasi
lingkungan protein yang unggul dalam ruang dan waktu, yang pada
gilirannya mengarah pada kontrol yang sangat baik dari
termodinamika dan kinetika reaksi biokimia. Ini sangat menarik dalam
analisis transisi fase biologis yang terkait dengan kompartementalisasi
seluler, yang biasanya melibatkan proses non-ekuilibrium.
Dalam ulasan ini, setelah menjelaskan fitur generik dari sistem
mikofluida yang memiliki relevansi khusus dengan transisi fase
protein, kami akan fokus pada contoh terpilih yang menunjukkan
kekuatan teknologi ini dalam menyelidiki pemisahan fase cair-cair
biologis.
2. Keuntungan teknologi mikofluida untuk transisi fase
protein dan kondensat biomolekuler
Kemajuan dalam teknik litografi lunak telah sangat memudahkan
dan menyederhanakan pengembangan platform mikofluida untuk
eksperimen biologis, memastikan adopsinya dalam berbagai aplikasi
kimia dan biologi [[4444], termasuk ilmu protein]45-48].
Singkatnya, fitur mikofluida pertama kali dipola dalam lapisan
photoresist (menggunakan fotolitografi) untuk menghasilkan struktur
induk. Master ini kemudian digunakan untuk mencetak polimer yang
dapat disembuhkan secara termal, biasanya karet silikon seperti
polydimethylsiloXane (PDMS), dengan saluran skala mikro untuk
mengarahkan aliran fluida. Perangkat fungsional hanya diwujudkan
dengan ikatan polimer matriX pada substrat, biasanya slide kaca atau
PDMS lapisan tipis[49,50].Aliran fluida dalam saluran mikrofluida
tersebut kemudian dipaksakan baik oleh pompa eksternal atau dengan
mengontrol tekanan pada saluran masuk atau keluar.
Manipulasi sampel fluida dalam saluran mikofluida menawarkan
semua keuntungan yang melekat pada miniaturisasi, dan
memungkinkan analisis sampel dalam jumlah kecil pada throughput
analitis yang tinggi (Gbr. 1A). Kemampuan untuk memproses sampel
dalam jumlah kecil sangat penting ketika bahan biologis terbatas, yang
sering terjadi ketika menganalisis in vitro model pemisahan fase
biologis, yang bergantung pada protein yang diekspresikan secara
rekombinan dan secara in vitro RNA yang disintesis, atau bahan yang
diekstraksi dari sel, jaringan atau biofluida. Potensi mikofluida,
bagaimanapun, tidak didorong semata-mata oleh keuntungan ini, dan
lebih dibangun di atas fakta bahwa beberapa fenomena fisik bervariasi
sebagai fungsi skala [51]. Misalnya, proses transportasi massal di
lingkungan mikofluida dapat dikontrol secara akurat hanya dengan
BBA-MolecularCellResearch1868(2021)118823
memodifikasi rasio gaya inersia terhadap gaya kental [52]. Meskipun
rezim aliran dalam sistem mikofluida hampir selalu laminar di
alam[53]dan ideal untuk mengukur sifat fisik protein dan majelis
protein[54,55],transportasi massal dapat en- hanced melalui adveksi
khaotic, yang memungkinkan pencampuran cepat antar jenis selama
skala waktu sub-milidetik [56].
Selain operasi aliran kontinu, perangkat mikofluida dapat
digunakan untuk membuat aliran tersegmentasi secara pasif,
menggunakan pemfokusan aliran atau geometri persimpangan-T [57]
(Gbr. 1B). Adopsi dari rezim aliran tersegmentasi (bukan kontinu)
memungkinkan kompartementalisasi analit dalam tetesan berukuran
fL-nL yang berada dalam cairan pembawa yang kontinu dan tidak
bercampur. Pendekatan semacam itu memungkinkan pembangkitan
jutaan mikrokompartemen yang terdefinisi dengan baik dengan
distribusi ukuran yang sangat sempit, yang ukuran dan muatannya
dapat dikontrol secara akurat dengan memvariasikan geometri
saluran atau laju aliran input (Gbr. 1B) [58]. Selain itu, karena cairan
pembawa (fase kontinyu) membasahi permukaan saluran, isolasi lengkap dari
campuran uji dipastikan. Ini kontras dengan format aliran kontinu, di
mana interaksi permukaan-molekul tidak dapat dihindari, meskipun
fakta bahwa berbagai fungsionalisasi permukaan telah dikembangkan
untuk meminimalkan adsorpsi biomolekul pada dinding saluran
mikofluida [59-61]. Akhirnya, pendekatan mikofluida berbasis tetesan
memungkinkan pembentukan susunan besar kompartemen mikro
dalam periode waktu yang singkat, secara signifikan meningkatkan
throughput analitis dan memungkinkan untuk berbagai pengujian
titik akhir.
Dalam konteks kondensat biomolekuler, alat tersebut
memungkinkan enkapsulasi dan mi Xing dari lutions protein homogen
begitu- dengan modulator dari diagram fase (seperti asam nukleat,
garam, penyangga komponen dan pH), yang memungkinkan
pengamatan termodinamika dan kinetika transisi fase dalam
kompartemen dengan volume seperti sel (pL-nL) (Gbr. 1B, C) [62].
Volume kecil seperti itu juga memungkinkan pengamatan peristiwa
stokastik, seperti peristiwa nukleasi langka yang mendasari agregasi
protein dan pemisahan fase [63].
Dalam kompartemen mikro ini, larutan bersentuhan dengan
antarmuka yang terdefinisi dengan baik, biasanya terdiri dari
surfaktan non-ionik, seperti polietilen glikol (PEG), yang
menunjukkan interaksi terbatas dengan biomolekul (Gbr. 1B).
Surfaktan ini menstabilkan kompartemen berbasis air dalam cairan
pembawa hidrofobik [64]. Interaksi terbatas antara biomolekul dan
antarmuka wadah meminimalkan masalah yang berkaitan dengan
permukaan kaca atau plastik yang ada dalam pengujian massal, yang
dapat mengubah transisi fase atau mencegah peristiwa koalesensi
tetesan karena lengketnya kondensat pada permukaan. Sistem
mikofluida berbasis tetesan dapat dieksploitasi lebih lanjut untuk
menghasilkan struktur yang lebih kompleks, menuju tiruan yang
akurat dari antarmuka seluler, termasuk misalnya struktur seperti
vesikel yang dibatasi oleh lapisan ganda lipid [32].
Bahan perangkat mikrofluida, biasanya polimer termo-curable
(karet silikon) polydimethylsiloXane (PDMS), transparan dan
kompatibel dengan sebagian besar metode deteksi optik. Transisi fase
dan reaksi biokimia yang terjadi di dalam kompartemen dapat diikuti
dengan pemantauan, misalnya, sinyal fluoresensi dari fluorofor
terkonjugasi atau fluoresensi intrinsik dari sampel asli [65] (Gbr. 1D).
Untuk memantau peristiwa transisi fase selama rentang waktu
inkubasi yang lama (menit hingga jam atau bahkan berhari-hari),
tetesan dapat disimpan dalam susunan penyimpanan tetesan (Gbr.
1E) dengan memasukkan perangkap [66], ruang penyimpanan [67]
atau saluran tunda yang secara drastis mengurangi laju aliran tetesan
[68,69] (Gbr. 1E).
Tetesan juga dapat dimanipulasi sebelum, selama atau setelah
penyimpanannya. Misalnya, tetesan dapat terperangkap dalam ruang
dan menyusut dari waktu ke waktu dengan menghilangkan air [70-
72]. Pengurangan volume kompartemen ini meningkatkan
konsentrasi protein, memungkinkan eksplorasi daerah supersaturasi
dan pemisahan fase dalam diagram fase [73-75]. Proses ini dapat
 M. Linsenmeier, BBA-MolecularCellResearch1868(2021)118823
meniru kehilangan volume yang kadang-kadang diamati dalam sel
sebagai respons terhadap tekanan eksternal [76,77]. Misalnya,
pengurangan 15% dari volume sel telah diamati padakekurangan
glukosa Saccharomyces cerevisiae yang sel. Karena massa sel total tetap
konstan, pengurangan ini mengarah pada peningkatan kepadatan
massa intraseluler dan kepadatan molekul [78], yang berpotensi
memfasilitasi transisi fase secara sinergis dengan faktor pensinyalan
seluler lainnya. Tetesan yang menyusut juga dapat digunakan untuk
meniru peningkatan konsentrasi biomolekul yang transisi fase protein
benih. Misalnya, tutup
Gambar 1. Ilustrasi skematis dari beberapa fitur utama sistem mikofluida ketika menganalisis kondensat biomolekuler. (A, B) Teknologi mikofluida berbasis tetesan
memungkinkan kompartementalisasi sampel menjadi emulsi air dalam minyak, menghasilkan ribuan kompartemen mikro yang terdefinisi dengan baik dalam waktu
singkat. Sampel dapat disaring dengan throughput tinggi dan dalam tetesan dengan volume seperti sel. (C) Cepat mi Xing dalam memastikan tetesan didefinisikan
dengan baik mulai kondisi untuk tes kinetik. (D) Reaksi biokimia dapat diamati dalam tetesan menggunakan metode optik, seperti spektroskopi fluoresensi. (E) Tetesan
dapat disimpan, diproses, dan diamati dalam rentang waktu yang lama dengan menjebak tetesan dalam perangkap atau dengan memindahkannya ke dalam kapiler. (F)
Komposisi kompartemen dapat dimodifikasi setelah generasi dengan memasukkan molekul tambahan melalui pico-injection.

penurunan translasi pada stres seluler meningkatkan jumlah mRNA

sitoplasma, yang menghasilkan pembentukan badan pemrosesan
dalam ragi dengan pemisahan fase cair-cair [79].
Sistem mikofluida berbasis tetesan juga memfasilitasi perubahan
komposisi miXmendatang, misalnya dengan memperkenalkan Lumes
picoliter vo- molekul tambahan dari bunga ke dalam kompartemen air
dalam minyak individu melalui pico-injection(Gambar.1F). Injeksi pico
dicapai dengan penerapan medan listrik (pada kecepatan kHz), yang
mengacaukan antarmuka air-minyak dari tetesan, memungkinkan
sejumlah kecil aliran fluida yang mengalir masuk [80,81] (Gbr. 1F ).
Pendekatan tersebut dapat memungkinkan penyelidikan peran
modulator tidak hanya pada perakitan kondensat biomolekuler tetapi
juga penting pada pembongkaran reversibel mereka, yang sangat
penting untuk fungsi biologis mereka dan belum dipelajari secara luas
[82]. In vivo, contoh umum yang mengatur pelepasan kondensat
termasuk modifikasi pasca translasi yang dimediasi enzim reversibel,
seperti (de-)fosforilasi [83] atau (de-) metilasi [19], serta (de-) )
protonasi karena perubahan pH [84], interaksi dengan molekul
pendamping [17,85,86] dan pengikatan ATP dan hidrolisis [12]. Proses
reversibel tersebut baru-baru ini telah diamati dan penerapan
teknologi mikofluida akan berkontribusi pada pemahaman mekanisme
molekuler yang mendasari pembentukan dan pembubaran tetesan.
Akhirnya, fitur yang kuat dari semua teknologi mikofluida adalah
kemampuan untuk mengontrol dan memodifikasi suhu secara akurat,
karena rasio luas permukaan terhadap volume yang terkait [87,88].
Suhu adalah parameter fisik utama yang mengatur kinetika dan
termodinamika pemisahan fasa dan kuantifikasi efek suhu adalah
pendekatan standar ketika menilaientalpi dan entropik
kontribusidari proses pemisahan fasa. Pengukuran ini memiliki
implikasi langsung dalam penjelasan mekanisme yang dikembangkan
oleh sel untuk merasakan suhu, khususnya dalam menanggapi
tekanan panas [89-91]. Sebagai contoh, baru-baru ini telah
ditunjukkan bahwa protein pengikat poliA 1 (Pab1) bertindak sebagai
sensor suhu dan mengalami pemisahan fase dengan meningkatnya
suhu, menunjukkan perilaku LCST [92]. Pemisahan fase
kemungkinan didorong oleh residu hidrofobik di LCD protein, yang
mempromosikan interaksi protein-protein yang menarik pada
peningkatan suhu untuk memaksimalkan entropi pelarut [40,92].
Khususnya, tingkat pemisahan fase berubah secara drastis pada
rentang suhu yang sempit, memungkinkan penginderaan proses yang
akurat. Mereplikasi proses biologis seperti itu pada chip adalah
pendekatan yang menjanjikan untuk memahami modulator molekuler
khusus yang mendasari kontrol [93].
Secara keseluruhan, fitur yang memungkinkan sistem mikofluida
memiliki potensi besar dalam beragam bidang penelitian biologi
[45,94-99], termasuk karakterisasi pemisahan fase dan sifat
kompartemen yang dihasilkan (Gbr. 2), seperti yang dibahas secara
rinci dalam paragraf berikut.
3. Mikrofluida berbasis katup dan droplet untuk diagram fase
biopolimer dan kondensat biomolekuler
Diagram fase makromolekul bergantung pada sejumlah besar
modulator molekuler dan kondisi lingkungan, dengan konsentrasi
protein, suhu, pH, kekuatan ionik, dan crowding agent makromolekul
yang paling umum [100]. Untuk kondensat biomolekuler, daftar ini
mencakup banyak molekul spesifik lainnya yang berinteraksi
Katup pneumatik (biasanya disebut Quake katup) telah

Gambar 2. Teknologi mikofluida untuk analisis proses pemisahan fasa dan sifat-
sifat kompartemen yang dihasilkan: (i) Diagram fasa dengan throughput dan
hanya menggunakan volume sampel kecil; (ii) Dinamika perakitan dan
pembongkaran dengan mengakses rentang waktu yang singkat; (iii) Sifat reologi
dan permukaan; (iv) EXperubahan materi dengan vironment en- dan dengan
tetesan yang berdekatan; (v) Penggabungan antara transisi fase dan reaksi
biokimia, termasuk sistem non-kesetimbangan aktif; (vi) Selain itu, mikofluida
adalah alat yang sangat baik untuk enkapsulasi sistem pemisahan fase ke dalam
struktur seperti vesikel, menciptakan kompartementalisasi seperti sel.

langsung dengan komponen pemisah fase, seperti RNA, ATP, dan

beberapa kofaktor lainnya.
Diagram fase biasanya diperoleh melalui penyaringan sistematis
dari modulator yang berbeda ini [19,26,37]. Namun, menggunakan uji
massal konvensional, pendekatan ini membutuhkan sampel dalam
jumlah besar, yang seringkali tidak tersedia saat bekerja dengan
protein yang diekspresikan secara rekombinan atau secara in vitro RNA
yang ditranskripsi. Dua fitur mikrofluida utama telah dieksploitasi
untuk mengurangi jumlah sampel yang diperlukan untuk evaluasi
diagram fase; mikrofluida berbasis katup dan berbasis tetesan.
Keberhasilan pertumbuhan kristal protein memerlukan
penyaringan ruang kimia yang luas untuk mengidentifikasi kondisi
termodinamika dan kinetik terbaik untuk kristalisasi. Beberapa
pendekatan kinetik, termasuk drop gantung, mikro-batch atau metode
difusi antarmuka bebas telah diterapkan untuk mencari ruang kinetik
yang optimal untuk kristalisasi protein [101]. Namun, ini
membutuhkan sejumlah besar protein dan hasil dari pemurnian
protein seringkali rendah, khususnya untuk protein kompleks yang
seringkali juga paling sulit untuk mengkristal. Isu-isu ini menunjukkan
kesesuaian teknologi mikofluida dalam studi kristalisasi protein.
Memang, aplikasi pertama dari mikrofluida untuk pertumbuhan kristal
protein dilaporkan oleh Quake dan rekan kerja pada tahun 2002 [102-
104]. Melalui implementasi platform kristalisasi mikrofluida, penulis
merancang paradigma mikrofluida untuk pertumbuhan kristal
sistematis, memperoleh kristal protein yang tidak dapat diakses melalui
metode tradisional. Kemampuan paralelisasi dan otomatisasi yang
besar menyediakan platform yang ideal untuk upaya penyaringan
throughput tinggi, seperti pengukuran volumetrik untuk mencapai
penyaringan berbasis difusi antarmuka bebas throughput tinggi untuk
hit kristal
[102] dan penyaringan ruang fase otomatis untuk mengidentifikasi
presipitan ideal untuk protein bunga [103].
juga digunakan untuk membangun peristaltik mikro- transisi fase protein. Reaksi cepat (bio)kimia pada skala waktu s-min
pompa[103,105],yang ketika terintegrasi dalam mi Xing struktur dapat diikuti secara real-time [114,115] dengan memantau perubahan
cincin, memungkinkan presisi titrasi tinggi dan multiplexing konten tetesan. Dalam analogi termodinamika, aplikasi pertama dari
sederhana. Misalnya, dengan menggunakan konfigurasi seperti itu,
perilaku faseendo-1,4-β-Xproteinylanase dari Trichoderma reesei
jamurdisaring dengan menguji 4300 kondisi berbeda yang diperoleh
dalam 16 buffer berbeda dan 16 zat presipitasi [103].
Perangkat mikrofluida berbasis tetesan memungkinkan
pembuatan ruang uji nanoliter dan sub-nanoliter. Tidak
mengherankan, ada banyak kemajuan dalam teknologi untuk
kristalisasi protein berbasis tetesan selama beberapa tahun terakhir.
Misalnya, Ismagilov dan rekan kerja telah menghasilkan sejumlah
perangkat berbasis tetesan pasif untuk kristalografi protein. Sistem ini
menggabungkan reagen dalam tetesan yang tertanam dalam minyak
yang tidak dapat bercampur, dan memungkinkan penyaringan yang
cepat dari kondisi kristal [106]. Teknik Memang, penulis telah
menunjukkan untuk mengubah kinetika kristalisasi oleh
miXing[107]dan penyemaian[108],dan juga telah disajikan platform
untuk in situ difraksi sinar-X kristal protein tumbuh on-chip[109].
Transisi fase dapat diinduksi dengan mengubah tidak hanya
komposisi buffer tetapi juga konsentrasi protein. Dalam konteks ini,
platform mikofluida berbasis tetesan telah digunakan untuk
merangkum solusi homogen pada konsentrasi sub-kritis ke dalam
kompartemen air-dalam-minyak, yang kemudian terperangkap dan
menyusut oleh ekstraksi air [73]. Dengan cara ini, konsentrasi molekul
di setiap kompartemen meningkat sampai jenuh tercapai, yang
mengarah ke transisi fase. Penghapusan air dapat dikontrol dengan
pengaturan tekanan osmotik antara tetesan yang terperangkap dan
lapisan cairan kedua yang mengandung larutan garam tinggi [70]
(Gbr. 3A, B), penguapan air melalui PDMS berpori [74], mengalirkan
udara melalui saluran mikofluida setelah perangkap tetesan [110] atau
ekstraksi molekul air ke dalam fase minyak di sekitar tetesan yang
terperangkap [72] (Gbr. 3C). Semua strategi ini dapat digunakan
untuk meningkatkan konsentrasi biomolekul di dalam kompartemen
sampai supersaturasi dan pemisahan fase diamati. [70,72-75] (Gbr.
3D).
Sementara transisi fase cair-padat telah dipelajari secara ekstensif
menggunakan sistem mikofluida [111,112], pemisahan fase cair-cair
telah jauh lebih sedikit dieksplorasi [70,75]. Namun, platform ini
memiliki potensi untuk menganalisis pemisahan fase cair-cair dari
sistem yang relevan secara biologis. Dalam hal ini, kami baru-baru ini
menunjukkan pemantauan transisi fase darirelevan secara biologis in
vitro yang sistem modeldari badan pemrosesan (diwakili olehDEAD-
boX proteinATPase Dhh1 dengan adanya ATP dan poliU) dengan
meningkatkan konsentrasi konstituen dalam konsentrator tetesan
mikrofluida [72] (Gbr. 3E). Konsentrator dirancang untuk
meningkatkan daya apung dan memastikan bahwa tetesan tetap
terperangkap di dalam bilik bahkan pada penyusutan yang parah,
sehingga memungkinkan penilaian konten selama periode waktu yang
lama menggunakan mikroskop konvensional. Di sini, susut berat
menyediakan cess ac- untuk faktor konsentrasi luas appro Ximately
100.000 kali lipat, yang pada gilirannya memungkinkan promosi
transisi fase pada konsentrasi cular biomole- tinggi, sementara hanya
menggunakan nanogram sampel. Selain itu, peristiwa koalesensi
kondensat kaya protein menjadi satu tetesan tunggal menegaskan sifat
cair seperti fase terdispersi [72].
Baru-baru ini, pendekatan elegan berdasarkan katup kapiler telah
ditunjukkan untuk penentuan diagram fase yang akurat dan tepat
[113]. Pendekatan ini menghindari kebutuhan elemen kontrol aliran
mikofluida seperti katup atau pompa yang digerakkan, memfasilitasi
penerapan teknik oleh pengguna non-ahli [113].

4. Mikrofluida tetesan untuk menganalisis dinamika fase protein

transisi dan kondensat biomolekuler

Sebagai hasil dari kemampuan untukcepat mi X reagenpada

chip(Gbr.1C), sistem mikofluida berbasis tetesan telah diterapkan
untuk menyelidiki tidak hanya termodinamika tetapi juga kinetika
Gambar. 3. Diagram fase larutan protein pada chip. (A, B, C) Sistem mikofluida berbasis tetesan digunakan untuk menyaring diagram fase pada throughput tinggi,
sambil mengonsumsi sampel dalam jumlah kecil. Tetesan yang diisi dengan larutan pada konsentrasi sub-kritis terperangkap di dalam chip mikofluida dan dipekatkan
dengan menghilangkan air baik dengan osmosis (A, B) atau dengan ekstraksi air ke dalam fase minyak di sekitarnya (C). (A) Dicetak ulang (diadaptasi) dengan izin dari
[73]. Hak Cipta (2007) American Chemical Society. (B) Hak Cipta (2013) National Academy of Sciences. (D) Diagram fase skema dari larutan protein. Batas dan status
fisik yang diakses bergantung pada protein yang dipertimbangkan dan kondisi larutan. Panah menunjukkan lintasan yang mungkin selama penyusutan tetesan dalam
perangkat mikofluida seperti yang ditunjukkan pada (A, B, C). (E) Pemisahan fase dari sistem model badan pemrosesan.DEAD-bo X ProteinDhh1 bergeser dari larutan
homogen (salib biru) ke fase terpisah dispersi (kotak merah) pada peningkatan konsentrasi protein dan tiga modulator: ATP, asam poliuridilat (poliU, RNA mimik) dan
KCl , diperoleh dalam perangkat mikofluida yang ditunjukkan pada (C). Sifat seperti cairan dari kondensat Dhh1 dikonfirmasi oleh penggabungan semua tetesan kaya
protein menjadi fase kental tunggal, seperti yang ditunjukkan pada gambar fluoresensi di sisi kanan. Bilah skala adalah 50 m. Dicetak ulang (diadaptasi) dengan izin
dari [72] Hak Cipta (2020) American Chemical Society.

mikrofluida dalam analisis kinetika pemisahan fase adalah untuk nukleasi lebih lanjut sehubungan
transisi cair ke padat, seperti pembentukan kristal protein [73] dan
fibril amiloid [69]. Kontrol kinetik sangat penting untuk kristalisasi
protein, karena jumlah dan morfologi kristal yang dihasilkan sangat
dipengaruhi oleh keseimbangan peristiwa nukleasi dan pertumbuhan,
yang pada gilirannya tergantung pada tingkat kejenuhan. Khususnya,
kristal tunggal besar, yang diperlukan untuk penentuan struktur
dengan kristalografi sinar-X, dapat diperoleh dengan mendorong
pertumbuhan inti yang ada di atas nukleasi yang baru. Pendekatan
mikofluida berbasis tetesan memungkinkan tidak hanya penyaringan
beberapa kondisi dengan volume sampel yang rendah, tetapi juga
kontrol yang tepat dari tingkat kejenuhan (Gbr. 4A) [73]. Yang penting,
supersaturasi dapat dikontrol secara dinamis dengan mengubah
volume tetesan dari waktu ke waktu. Misalnya, kristal besar dapat
dihasilkan dalam proses dua langkah yang dilakukan dalam emulsi air
dalam minyak yang terperangkap. Pertama, nukleasi diinduksi dengan
mengecilkan volume tetesan secara osmotik dengan mengalirkan
larutan garam tinggi melalui lapisan fluida kedua untuk meningkatkan
kejenuhan. Setelah nukleasi, volume tetesan meningkat secara osmotik
(dengan mengalirkan larutan dengan konsentrasi garam rendah), oleh
karena itu menurunkan tingkat supersaturasi dan tidak mendukung
dengan pertumbuhan kristal dengan pematangan Ostwald [73] (Gbr.
4A).
Agregasi protein merupakan contoh lain dari transisi cair-ke-
padat. Seperti sebelumnya, keseimbangan nukleasi dan peristiwa
pertumbuhan dalam proses ini mengontrol ukuran dan morfologi
agregat yang dihasilkan [116]. Sebuah kelas yang sangat menarik dari
agregat protein diwakili oleh fibril amiloid, yang berhubungan dengan
berbagai gangguan neurodegeneratif [117]. Memahami nukleasi dan
pertumbuhan amiloid sangat penting untuk pengembangan strategi
terapi terhadap penyakit protein salah lipat [118]. Fibril ini awalnya
dibentuk oleh peristiwa nukleasi yang jarang, sebuah proses yang sulit
untuk dipantau dalam uji massal konvensional. Alat mikofluida
berbasis tetesan dapat mereproduksi peristiwa nukleasi dan
pertumbuhan dalam volume seperti sel, memungkinkan analisis
pembentukan stokastik dari inti pertama serta propagasi agregasi
dalam ruang dan waktu (Gbr. 4B) [69] . Studi-studi ini menunjukkan
bahwa stokastik hanya terjadi dalam volume kecil (pL-nL) dan tidak
dapat bertanggung jawab atas variabilitas profil agregasi yang
biasanya diamati dalam in vitro uji kinetik[119,120].
Kinetika juga penting dalam konteks kondensat biomolekuler,
karena sistem kehidupan secara intrinsik di luar keseimbangan dan
memastikan
Gambar. 4. Dinamika transisi fase dalam mikrofluida tetesan. (A) Pembentukan kristal protein dalam tetesan mikofluida melalui kontrol supersaturasi. Nukleasi kristal
diinduksi dengan mengurangi volume kompartemen yang merangkum larutan protein. Selanjutnya, pertumbuhan kristal didorong dengan meningkatkan volume
tetesan dan dengan mengurangi tingkat supersaturasi, sehingga tidak mendukung nukleasi dan mendorong pertumbuhan dengan pematangan Ostwald. Dicetak ulang
(diadaptasi) dengan izin dari [73] Hak Cipta (2007) American Chemical Society. (B) Nukleasi dan pertumbuhan amiloid diamati dalam tetesan mikofluida, yang
memungkinkan seseorang untuk menyelidiki efek pengurungan volume dan stokastik dari peristiwa nukleasi primer. Hak Cipta (2011) Akademi Ilmu Pengetahuan
Nasional. (C) Dinamika pembentukan kondensat melibatkan beberapa kemungkinan mekanisme mikroskopis seperti dekomposisi spinodal, nukleasi dan pertumbuhan,
pertumbuhan tetesan oleh pematangan Ostwald atau koalesensi tetesan. (D) Dinamika pemisahan fase cair-cair dalam tetesan mikofluida, mewakili in vitro sistem
modeldari badan pemrosesan. Tahap memisahkan protein dikemas menjadi tetesan air-dalam-minyak dan pemisahan fase yang disebabkan oleh mi cepat Xing dengan
pemicu molekul. (E) Pembentukan kondensat dapat dilacak dalam rentang waktu yang singkat, dengan nukleasi dan pertumbuhan dipantau pada chip. Selanjutnya,
pengkasaran tetesan dapat diamati dalam rentang waktu yang lebih lama dengan mengumpulkan kompartemen di kapiler. Dengan mengekstraksi distribusi ukuran
dari waktu ke waktu, mekanisme pengerasan tetesan seperti pematangan Ostwald dan koalesensi dibedakan.

pergantian konstan agen aktif biokimia [121,122]. Kondensat cular

Biomole- adalah reaktor terbuka dan menunjukkan cepat intern
miXing, pertukaran cepat dengan lingkungan sekitarnya dan
dapatcepat sebagai-
dan membongkar melalui flukonstanX molekuldarimolekul yang
[123-126]. Selain itu, dalam rentang waktu yang lebih lama, kondensat
biomolekuler dapat mengalami "penuaan", di mana sifat fisik dari fase
padat protein berubah dan fase cair kaya protein membentuk hidrogel
dan/atau agregat padat [127-129]. Penyelidikan transisi tersebut sangat
penting karena pembentukan fase cair pada konsentrasi protein tinggi
dapat menyebabkan pembentukansolid
strukturterkait dengan berbagai menghancurkan tions menderita
penyakit patologis, termasuk Amyotrophic Lateral Sclerosis,
Alzheimer dan penyakit Par- kinson ini [17,26,27,29-31]. Memahami
me-semblemekanismemendasari proses "penuaan" seperti itu oleh
karena itu penting dalam
pertempuran yangmelawan perilaku menyimpang.
Terlepas dari peran penting dinamika dalam organisme hidup,
mekanisme sebagian besar masih belum dijelajahi. Hal ini sebagian
disebabkan oleh kurangnya alat yang sesuai yang dapat memantau
dinamika secara akurat dan kuantitatif pada rentang waktu yang
pendek dan panjang. Dalam hal ini, mikrofluida berbasis tetesan
berguna dalam memantau kejadian seperti

dekomposisi spinodal, nukleasi dan pertumbuhan kondensat dan menerapkan mikrofluida berbasis tetesan untuk analisis dinamika
mekanisme pengerasan melalui pematangan Ostwald atau koalesensi transisi fase cair-cair dari in vitro sistem modeldari badan pemrosesan
tetesan (Gbr. 4C). [12,79,130]. Di sini, protein pengolahan tubuh-terkait MATI-bo X
Selain konstruksi diagram fase (Gbr. 3D, E), kami baru-baru ini ATPase Dhh1 adalah cepat miXed dengan pemicu molekul (ATP dan
PolyU) dan dikemas ke dalam KASIH compart- air dalam minyak
menggunakan aliran fokus geometri(Gbr.4D). Pada rentang waktu
mulai dari milidetik hingga detik, nukleasi dan pertumbuhan tetesan
yang dipisahkan fase kemudian dipantau, serta peristiwa pengkasaran
yang terjadi pada rentang waktu yang lebih lama (menit hingga jam).
Analisis ini menyoroti peningkatan laju pembentukan kondensat
sebagai fungsi dari volume kompartemen. Selain itu, hasil
menunjukkan koalesensi sebagai mekanisme yang mendominasi untuk
pertumbuhan droplet [62] (Gbr. 4E). Fitur menarik lainnya dari sistem
mikofluida berbasis tetesan adalah kemampuan untuk membentuk
struktur yang lebih relevan secara biologis. Misalnya, matriks hidrogel
dapat dirakit di dalam kompartemen tetesan untuk meniru struktur
seperti sitoskeleton, dengan hidrogel yang terbentuk menahan
koalesensi tetesan [62,131].
Baru-baru ini, platform mikrofluida tetesan kombinatorial telah
dikembangkan untuk akuisisi cepat dan resolusi tinggi dari diagram
fase protein, yang telah ditunjukkan dengan kondensat protein FUS
[132].
5. Alat mikofluida untuk analisis sifat reologi dan komposisi
kondensat biomolekuler
Selain analisis termodinamika dan kinetika pemisahan fase,
teknologi mikofluida baru-baru ini diterapkan untuk menyelidiki sifat
material dari kondensat biomolekuler yang dihasilkan serta perekrutan
klien molekul (Gbr. 5). Dalam situasi ini, keuntungan mikrofluida
terletak pada kontrol akurat dari proses transportasi massal pada skala
mikron.
Metode pelacakan partikel biasanya digunakan untuk menganalisis
sifat reologi dan mengukur koefisien difusi dan viskositas [21]. Namun,
dalam banyak kasus ukuran tetesan yang dipisahkan fase terbatas pada
beberapa mikron dan dengan demikian tidak sesuai dengan teknik ini.
Untuk mengatasi keterbatasan ini, perangkat mikofluida yang
mengintegrasikan pilar berukuran mikron digunakan untuk
menggabungkan tetesan yang telah terbentuk sebelumnya menjadi fase
terdispersi fase tunggal. Selanjutnya, partikel pelacak dapat direkrut ke
dalam fase yang sekarang besar ini dan berhasil dilacak [133] (Gbr.
5A). Selain mikroreologi pasif, penulis yang sama mengembangkan
konfigurasi mikofluida untuk menganalisis viskositas di bawah aliran,
yang sangat relevan untuk sistem di luar kesetimbangan [133]. Di sini,
aliran fluida yang kaya protein dan dipisahkan fase dialirkan bersama
dengan fase tanpa protein, dengan kedua fase disuplai dengan manik-
manik pelacak untuk mengukur profil aliran. Viskositas fase individu
kemudian dapat diekstraksi dengan profil kecepatan yang diukur [133]
(Gbr. 5B). Pendekatan mikofluida semacam itu telah diterapkan pada
analisis viskositas kondensat protein Laf1, Whi3 dan GAR-1ΔN, yang
masing-masing terkait dengan butiran P, nukleolus dan rakitan Whi3
[133]. Sejak kondensat biologis dapat menunjukkan berbagai sifat
reologi, mulai dari cair hingga seperti gel, alat mikofluida ini sangat
penting dalam menghubungkan interaksi biomolekuler dengan sifat
viskoelastik dan fungsi biokimia.
Selain itu, sifat material tersebut dapat berubah seiring waktu.
Misalnya, baru-baru ini telah ditunjukkan bahwa penerapan gaya geser
dapat mendorong transisi cair-ke-padat dalam kondensat berbasis
protein [134]. Keuntungan utama dari platform mikofluida adalah
kemungkinan untuk menerapkan tegangan geser yang sangat
terkontrol dan regangan elongasi [134,135].
Selain fitur massal, mikofluida juga dapat diterapkan untuk
mengukur sifat permukaan, seperti yang baru-baru ini ditunjukkan
oleh pengukuran potensial elektrostatik permukaan kondensat
biomolekuler [136].
Komposisi dan pertukaran material antara kondensat dan
sekitarnya merupakan aspek penting lain dari kondensat
biomolekuler. Proses transportasi massal yang cepat tersebut dapat
dengan mudah dipantau dalam lingkungan mikofluida. Memang,
sebuah penelitian baru-baru ini menganalisis perekrutan protein klien
menjadi tetesan kaya protein dalam perangkat mikofluida yang berisi
geometri pemfokusan aliran. Di sini, pemisahan fase dipicu pada chip
dan tetesan yang dihasilkan bersentuhan dengan larutan homogen
dari protein kargo bertanda fluoresensi yang mengalir paralel di kedua
sisi aliran tetesan. Dengan cara ini, protein kargo mampu berdifusi di
dalam tetesan, dengan kinetika penyerapan diamati pada skala waktu
milidetik dengan memantau peningkatan fluoresensi protein dari
waktu ke waktu [137,138]. Pendekatan ini digunakan untuk
menyelidiki kemampuan kompleks pori nuklir untuk secara selektif
mengangkut biomolekul kargo melintasi membran nuklir [137]. Model
in vitro tetesan kaya proteinterdiri dari nukleoporin kaya fenilala-
sembilan/glisin (FG-Nups), yang sangat melimpah di kompleks
tersebut. Protein klien disuntikkan tanpa adanya dan adanya
importin, yang memediasi perdagangan melalui pori-pori nuklir
dengan membentuk kompleks dengan protein kargo. Hasil
menunjukkan bahwa hanya kompleks yang dibentuk oleh importin
dan protein kargo yang dapat direkrut, sementara tanpa impor, FG-
Nup yang dipisahkan fase tidak dapat ditembus oleh protein klien.
Selain membuktikan peran kunci importin dalam memediasi
transportasi melintasi membran nuklir, metode mikofluida juga
memungkinkan pengukuran kinetika proses ini pada rentang waktu
yang sangat singkat.
Baru-baru ini, perangkat mikrofluida tetesan diterapkan untuk
mengkarakterisasi kuantitatif dengan throughput tinggi koefisien
partisi molekul yang berbeda dalam coacervates individu kimia yang
berbeda [139] (Gbr. 5C, D). Teknik ini menemukan beberapa aplikasi,
misalnya dalam studi reaksi enzimatik dalam kondensat yang
dipisahkan fase.
6. Mikrofluida tetesan untuk menganalisis pemisahan fase
biomolekuler dalam sistem mirip sel buatan
Sampai saat ini, kami telah memfokuskan diskusi kami pada
perangkat mikofluida untuk mempelajari in vitro modeldari kondensat
biologis yang terkait dengan organel tanpa membran yang berbeda
dalam sel. Selain analisis kompartemen biologis, teknologi mikofluida
telah banyak dieksploitasi dalam beberapa tahun terakhir untuk
menghasilkan kompartemen sintetis untuk sintesis bottom-up sel
buatan. Kompartemen yang terikat membran serta coacervate
sederhana dan kompleks telah dirakit pada chip untuk menjawab
pertanyaan mendasar tentang bagaimana kehidupan berasal dari
sistem kimia sederhana. Topik ini telah diringkas secara komprehensif
dalam beberapa ulasan terbaru yang sangat baik [140-142]. Oleh
karena itu, kami fokus sekarang pada beberapa contoh terpilih yang
sangat relevan untuk studi kondensat biomolekuler, perakitan
antarmuka biologis dan penggabungan antara kompartementalisasi
dan reaksi biokimia (Gbr. 2).
Sebuah karakteristik sentral dan properti dari sel adalah
kemampuan untuk mengkotak-kotakkan dan mengatur reaksi
biokimia baik dalam ruang dan waktu [32]. Dalam sistem buatan,
lingkungan mikro semacam itu dapat dibuat dengan mengenkapsulasi
kompartemen yang terikat membran dan tanpa membran menjadi
liposom atau vesikel unilamellar raksasa (GUVs). Vesikel ini terdiri
dari bilayer fosfolipid, yang merupakan tiruan dari membran plasma
sel eukariotik [143]. Pendekatan mikofluida adalah alat yang sangat
baik untuk perakitan konstruksi tersebut, karena mereka
menyediakan kontrol yang tepat dari ukuran dan komposisi vesikel
yang dihasilkan [144-147]. Lapisan ganda lipid dapat dihasilkan
menggunakan perangkat pemfokusan aliran berbasis PDMS
sederhana untuk menghasilkan emulsi ganda air-dalam-minyak-
dalam-air. Di sini, fosfolipid diperkenalkan dalam fase minyak dan
dirakit dengan penghilangan pelarut [148] (Gbr. 6A). Selain perangkat
fokus aliran, emulsi ganda juga dapat dihasilkan oleh mikofluida
kapiler [93] (Gbr. 6B) atau dengan metode transfer tetesan [149,150].
Dalam pendekatan terakhir, tetesan dikelilingi oleh fosfolipid
monolayer ditransfer off-chip dari fase minyak hidrofobik ke fase air
[149,150]. Mikrofluida berbasis tetesan memungkinkan
Gambar. 5. Perangkat mikofluida dapat menyelidiki sifat reologi kondensat yang dipisahkan fase dan perekrutan molekul. (A) Tetesan yang terbentuk sebelumnya
diterbangkan melalui jaringan pilar untuk menghasilkan fase terdispersi yang besar, yang dapat disuplai dengan nanopartikel, sehingga memungkinkan analisis
pelacakan partikel. (B) Pengukuran viskositas fase dispersi dan kontinu dengan mikroreologi aktif berbasis aliran. Partikel pelacak digunakan untuk mengukur profil
aliran di kedua fase, dari mana viskositas diekstraksi. (A,B) Direproduksi dari Ref. [ 133] dengan izin dari Royal Society of Chemistry. (C) Pengukuran koefisien partisi
throughput tinggi untuk mengkarakterisasi perekrutan molekul fluorescein (atas) dan FITC-dsDNA (bawah) ke dalam koaservat pLys/ATP yang terbentuk dalam
tetesan mikofluida. (D) Penilaian kuantitatif koefisien partisi berbagai molekul (fluorescein, NADH, b-Gal, FDH, DNA) ke dalam berbagai jenis koaservat (pLys/ATP,
CMDex/PDDA, CMDex/pLys). (C,D) dicetak ulang dari [139] di bawah persyaratan Lisensi Atribusi-NonKomersial Creative Commons untuk tujuan non-komersial.

pembentukan struktur yang semakin kompleks yang sangat mirip

dengan membran biologis. Sebagai contoh, dimungkinkan untuk
menambahkan pori-pori protein ke dalam lapisan ganda lipid,
memungkinkan transpor aktif atau pasif molekul melintasi membran
[36] (Gbr. 6C).
Sel buatan dapat dihasilkan dengan merakit kompartemen tanpa
membran dalam wadah tertutup oleh antarmuka seperti sel ini. Untuk
aplikasi seperti itu, teknologi mikofluida sangat bermanfaat, karena
kompartemen tanpa membran dapat dienkapsulasi di dalam
kompartemen seperti sel "on-chip" dengan cara yang kuat. Saat ini,
organel terbuka sintetis telah terbentuk di dalam sel buatan terutama
oleh koaservasi kompleks, misalnya dengan menggunakan peptida-
nukleotida kompleks[33],polycations(e.G.Polyarginine, polylysine,
spermine) dan polyanions(e.G.PolyU, ATP , CoA) [93,143] atau peptida
seperti elastin [151]. Transisi fase juga dapat diatur dengan
memodulasi pH di dalam kompartemen mirip sel [152,153], meniru
perubahan nilai pH yang sering diamati pada sel di bawah tekanan
[154-156] (Gbr. 6D). Platform penting ini menetapkan dasar untuk
enkapsulasilebih kompleks in vitro modelkondensat biomolekuler yang,
bergerak menuju representasi sel yang lebih dekat.
Selain enkapsulasi dan pengamatan sistem pemisahan fase
sederhana, teknologi mikofluida juga memungkinkan analisis
penggabungan antara kompartementalisasi dan reaksi biokimia (Gbr.
2), yang menjadi semakin penting mengingat temuan yang muncul di
bidang non -ekuilibrium pemisahan aktif [122,157,158]. Dalam
lingkungan mikofluida, perubahan bentuk yang tepat dari laju reaksi
biokimia diaktifkan oleh kontrol yang akurat dari komposisi
miXmendatang dan mi cepatXing reagen, yang menjamin kondisi awal
didefinisikan dengan baik.
Interaksi antara reaksi biokimia dan kondensat biomolekuler
dapat terjadi dalam berbagai cara [159,160]. Dalam beberapa kasus,
reaksi biokimia memodifikasi blok bangunan dari kondensat
biomolekuler, baik dengan meningkatkan atau menghambat
kecenderungan mereka untuk fase terpisah, yang pada gilirannya
mendorong perakitan atau pembongkaran kompartemen [152,161-
163] (Gbr. .6E, i). Sebagai contoh, dalam satu studi koaservasi
kompleks antara kation dan sekuens asam poliuridilat diinduksi
dengan secara progresif meningkatkan panjang sekuens yang awalnya
pendek dari molekul peniru RNA melalui reaksi enzimatik, hingga
panjang kritis tercapai [36]. Enzim yang diperlukan dan
Gambar. 6. EXamples pendekatan mikofluida yang kompartementalisasi meniru dalam sel buatan. (A, B) Mikrofluida tetesan digunakan untuk membentuk
kompartemen seperti sel yang dikelilingi oleh bilayer fosfolipid yang meniru membran sel. Hal ini dapat dicapai dengan menggunakan perangkat PDMS- (A) atau
berbasis kapiler (B) untuk menghasilkan emulsi ganda, di mana fosfolipid dimasukkan dalam fase minyak. (A) Bahan yang digunakan kembali dari [ 148]. (B) Bahan
yang digunakan kembali dari [93]. (C) Dalam kompartemen seperti itu dimungkinkan untuk mengenkapsulasi organel sintetik dan menambahkan pori-pori ke dalam
lapisan ganda fosfolipid untuk memungkinkan transportasi melintasi membran. (D) Perakitan dan pembongkaran coacervates dapat diatur oleh perubahan nilai pH,
dimodulasi oleh difusi proton melintasi membran lipid. Materi yang digunakan kembali dari [ 152] https://pubs.acs.org/ doi/10.1021/acsnano.9b10167. Izin lebih lanjut
terkait dengan materi yang dikutip harus diarahkan ke ACS. (E) Penggabungan antara kompartementalisasi dan reaksi biokimia: (i) reaksi dapat memodifikasi bahan
penyusun kondensat, baik mempromosikan perakitan atau pembongkaran; (ii) kondensat dapat merekrut reagen, inhibitor dan katalis, menampung reaksi di bagian
dalamnya; (iii) bahan penyusun kondensat dapat bertindak sebagai katalis itu sendiri.

reaktan dienkapsulasi bersama dengan counterion dalam vesikel lipid seringkali peningkatan konsentrasi substrat dan enzim lokal
ke dalam tetesan. Dalam kasus lain, kondensat biomolekuler merekrut meningkatkan kinetika
molekul klien yang bertindak sebagai reagen atau katalis reaksi
biokimia yang ada di dalam kompartemen yang telah dibentuk
sebelumnya (Gbr. 6E, ii) [42,93,164,165]. Misalnya, pembentukan
model sistem sitoskeleton direproduksi dengan mempartisi protein
sitoskeleton bakteri FtsZ ke dalam fase dekstran dari sistem dua fase
berair PEG/dekstran, diikuti oleh polimerisasi dengan adanya GTP
[150]. Dalam penelitian lain, in vitro yang transkripsi dan
translasimengarah ke ekspresi GFP diwujudkan dalam koaservat yang
dienkapsulasi ke dalam kompartemen air-dalam-minyak serta dalam
liposom (Gbr. 6E, ii) [70].
Dalam kondisi yang berbeda, bahan penyusun organel tanpa
membran dapat menunjukkan aktivitas enzimatik itu sendiri dan dapat
bertindak sebagai katalis untuk reaksi biokimia [37,41,42] (Gbr. 6E,
iii). Dalam hal ini, penelitian baru-baru ini menunjukkan bahwa
kompartementalisasi reaksi biokimia mempengaruhi lajunya, dan
sehubungan dengan fase curah, sesuai dengan pengamatan in vivo
[41,70,93]. Namun, viskositas tinggi dan lingkungan yang berbeda
dari kondensat juga dapat memiliki efek penghambatan yang
berlawanan, dan penggabungan antara kompartemen terbuka dan
reaksi biokimia merupakan area dengan aktivitas arus yang banyak
[159]. Dalam konteks ini, mikofluida dapat memainkan peran kunci
dalam memungkinkan analisis kuantitatif proses biokimia dan
mereproduksi lingkungan seperti sel.
7. Kesimpulan dan pandangan
Sistem mikofluida adalah alat yang sangat menarik untuk analisis
dan sintesis struktur supramolekul biomolekul. Keuntungan utama
dari sistem tersebut terkait dengan manfaat yang melekat pada
miniaturisasi dan kontrol yang unggul dari lingkungan reaktif pada
skala mikron, yang pada gilirannya mengarah pada modulasi akurat
perakitan mandiri dalam ruang dan waktu. Didorong oleh keunggulan
ini, alat mikrofluida telah diterapkan secara luas dalam dekade
terakhir untukbawah

sintesis sel buatan darike atas dan bidang tersebut telah mengalami granule assembly and drives pathological fibrillization, Cell 163 (2015) 123–133.
[10] J. Guillén-BoiXet, A. Kopach, AS Holehouse, S. Wittmann, M. Jahnel,
pengembangan beberapa platform yang menarik [81,93,166,167] untuk R. Schlüßler, K. Kim, IREA Trussina, J. Wang, D. Mateju, I. Poser, S. Maharana,
studi pada sistem mirip sel. Studi-studi ini telah memberikan wawasan M. Ruer-Gruß, D. Richter, X. Zhang, YT Chang, J. Guck, A. Honigmann,
penting, seperti kemungkinan percepatan reaksi biokimia di J. Mahamid, AA Hyman, et al., RNA-induced conformational switching and clustering
of G3BP drive stress granule assembly by condensation, Cell 181 (2020) 346–361.
kompartemen terpisah [41,70,93].
Secara bersamaan, sejumlah berkembang pesat penelitian dalam
biologi telah dihasilkan pengetahuan penting tentang peran
membraneless atau- ganelles di kompartementalisasi sel, shedding
cahaya pada molekul kunci dan pemicu molekul yang mengatur proses
ini[2,4,168,169].Oleh karena itu tepat waktu untuk mereproduksi in
vitro sistem modeldari kompartemen biologis ini dalam platform
mikofluida, bergerak menuju replikasi kompartementalisasi seluler di
bangku cadangan. Dalam ulasan ini kami telah mengilustrasikan
kekuatan mikofluida dalam mendapatkan wawasan tentang proses
pemisahan fase dan sifat-sifat kompartemen yang dihasilkan.
Pengetahuan ini sangat penting untuk memahami kopling kompleks
antara kompartementalisasi dan fungsi biokimia (Gbr. 2). Teknologi
ini akan sangat penting ketika menganalisis transisi fase dalam biologi
dan perannya pada metabolisme seluler, serta menemukan strategi
terapi baru terhadap berbagai penyakit yang terkait dengan pemisahan
fase. Selain meningkatkan pemahaman kita tentang kondensat biologis
[62], produksi ulang kompartemen sintetis dalam platform mikofluida
akan memiliki implikasi yang jelas untuk pengembangan sel buatan
dari bawah ke atas dan untuk generasi bahan protein yang diilhami bio
dalam bio - teknologi [37,41,42].

Deklarasi kepentingan bersaing

Penulis tidak memiliki konflik kepentingan.

Ucapan Terima Kasih

Kami berterima kasih atas dukungan keuangan dari Swiss National

Science Foundation (hibah 205321_179055), Yayasan Synapsis untuk
Penyakit Alzheimer dan ETH Research Grant ETH-33 17-2.

Referensi

[1] CP Brangwynne, CR Eckmann, DS Courson, A. Rybarska, C. Hoege,

J. Gharakhani, F. Jülicher, AA Hyman, Germline P butiran adalah tetesan cair yang
terlokalisir dengan pelarutan/pengembunan terkontrol, Science 5 (2009) 1729–1732.
[2] SF Banani, HO Lee, AA Hyman, MK Rosen, Biomolecular condensates: or-
ganizers of cellular biochemistry, Nat. Pdt Mol. Biol Sel. 18 (2017) 285–298.
[3] WM Aumiller, CD Keating JR, EXperimental models for dynamic compartmen-
talization of biomolecules in lquid organelles: reversible formation and parti- tioning
in aqueous biphasic systems, Adv. Interf koloid Sci. 239 (2017) 75–87.
[4] RJ Wheeler, AA Hyman, Controlling compartmentalization by non-membrane-
bound organelles, Philos. Trans. R. Soc. B Biol. Sci. 373 (2018) 1–9.
[5] X. Su, JA Ditlev, E. Hui, W. Xing, S. Banjade, J. Okrut, DS King, J. Taunton,
MK Rosen, RD Vale, Phase separation of signaling molecules promotes T cell receptor
signal transduction, Science 352 (2016) 595–600.
[6] LB Case, X. Zhang, JA Ditlev, MK Rosen, Stoichiometry controls activity of
phase-separated clusters of actin signaling proteins, Science 363 (2019) 1093–1097.
[7] D. Hnisz, K. Shrinivas, RA Young, AK Chakraborty, PA Sharp, A phase se- paration
model for transcriptional control, Cell 169 (2017) 13–23.
[8] BR Sabari, A. Dall'Agnese, A. Boija, IA Klein, EL Coffey, K. Shrinivas,
BJ Abraham, NM Hannett, AV Zamudio, JC Manteiga, CH Li, YE Guo,
DS Day, J. Schuijers, E. Vasile, S. Malik, D. Hnisz, TI Lee, II Cisse, RG Roeder,
et al., Coactivator condensation at super-enhancers links phase separation and gene
control, Science 361 (2018) 1–11.
[9] A. Molliex, J. Temirov, J. Lee, HJ Kim, T. Mittag, JP Taylor, A. Molliex,
J. Temirov, J. Lee, M. Coughlin, AP Kanagaraj, HJ Kim, Phase separation by low
complexity domains promotes stress granule assembly and drives pathological
fibrillization article phase separation by low complexity domains promotes stress
[11] P. Yang, C. Mathieu, RM Kolaitis, P. Zhang, J. Messing, U. Yurtsever, Z. Yang,
J. Wu, Y. Li, Q. Pan, J. Yu, EW Martin, T. Mittag, HJ Kim, JP Taylor, G3BP1 is a
tunable switch that triggers phase separation to assemble stress granules, Cell 181 (2020)
325–345.
[12] M. Hondele, R. Sachdev, S. Heinrich, J. Wang, P. Vallotton, BMA Fontoura,
K. Weis, DEAD-boX ATPases are global regulators of phase-separated organelles, Nature
573 (2019) 144–148.
[13] M. Du, ZJ Chen, DNA-induced liquid phase condensation of cGAS activates innate
immune signaling, Science 339 (2018) 704–709.
[14] AN Semenov, M. Rubinstein, Thermoreversible gelation in solutions of associa- tive
polymers, Macromolecules 31 (1998) 1373–1385.
[15] J.-M. Choi, F. Dar, R. Pappu, LASSI: a lattice model for simulating phase transi-
tions of multivalent proteins, PLoS Comput. Biol. (2019) 1-39.
[16] CW Pak, M. Kosno, AS Holehouse, SB Padrick, A. Mittal, R. Ali, AA Yunus,
DR Liu, RV Pappu, MK Rosen, Sequence determinants of intracellular phase separation
by complex coacervation of a disordered protein, Mol. Cell 63 (2016)
72–85.
[17] S. Qamar, GZ Wang, SJ Randle, FS Ruggeri, JA Varela, JQ Lin, EC Phillips,
A. Miyashita, D. Williams, F. Ströhl, W. Meadows, R. Ferry, VJ Dardov,
GG Tartaglia, LA Farrer, GS Kaminski Schierle, CF Kaminski, CE Holt,
PE Fraser, G. Schmitt-Ulms, et al., FUS phase separation is modulated by a mo-
lecular chaperone and methylation of arginine cation-π interactions, Cell 173 (2018)
720–734.
[18] EM Langdon, Y. Qiu, AG Niaki, GA McLaughlin, CA Weidmann, TM Gerbich,
JA Smith, JM Crutchley, CM Termini, KM Weeks, S. Myong, AS Gladfelter, mRNA
structure determines specificity of a polyQ-driven phase separation,
Science 360 (2018) 922–927.
[19] TJ Nott, E. Petsalaki, P. Farber, D. Jervis, E. Fussner, A. Plochowietz, TD Craggs,
DP Bazett-Jones, T. Pawson, JD Forman-Kay, AJ Baldwin, Phase transition of a
disordered nuage protein generates environmentally responsive membraneless
organelles, Mol. Sel 57 (2015) 936–947.
[20] N. Kedersha, G. Stoecklin, M. Ayodele, P. Yacono, J. Lykke-Andersen, MJ Fitzler,
D. Scheuner, RJ Kaufman, DE Golan, P. Anderson, Stress granules and proces-
sing bodies are dynamically linked sites of mRNP remodeling, J. Cell Biol. 169 (2005)
871–884.
[21] S. Elbaum-Garfinkle, Y. Kim, K. Szczepaniak, CC-H. Chen, CR Eckmann,
S. Myong, CP Brangwynne, The disordered P granule protein LAF-1 drives phase
separation into droplets with tunable viscosity and dynamics, Proc. Natal akad.
Sci. AS 112 (2015) 7189–7194.
[22] CF Mugler, M. Hondele, S. Heinrich, R. Sachdev, P. Vallotton, AY Koek,
LY Chan, K. Weis, ATPase activity of the DEAD-boX protein Dhh1 controls pro- cessing
body formation, Elife 5 (2016) 1–27.
[23] A. Patel, L. Malinovska, S. Saha, J. Wang, S. Alberti, Y. Krishnan, AA Hyman,
Biochemistry: ATP as a biological hydrotrope, Science 356 (2017) 753–756.
[24] S. Sridharan, N. Kurzawa, T. Werner, I. Günthner, D. Helm, W. Huber,
M. Bantscheff, MM Savitski, Proteome-wide solubility and thermal stability profiling
reveals distinct regulatory roles for ATP, Nat. komuni. 10 (2019) 1–13.
[25] RJ Wheeler, HO Lee, I. Poser, A. Pal, T. Doeleman, S. Kishigami, S. Kour,
EN Anderson, L. Marrone, AC Murthy, M. Jahnel, X. Zhang, E. Boczek,
A. Fritsch, NL Fawzi, J. Sterneckert, U. Pandey, DC David, BG Davis,
AJ Baldwin, et al., Small molecules for modulating protein driven liquid-liquid phase
separation in treating neurodegenerative disease, BioR Xiv (2019), https://
doi.org/10.1101/721001.
[26] A. Molliex, J. Temirov, J. Lee, M. Coughlin, AP Kanagaraj, HJ Kim, T. Mittag,
JP Taylor, Phase separation by low complexity domains promotes stress granule
assembly and drives pathological fibrillization, Cell 163 (2015) 123–133.
[27] A. Patel, HO Lee, L. Jawerth, S. Maharana, M. Jahnel, MY Hein, S. Stoynov,
J. Mahamid, S. Saha, TM Franzmann, A. Pozniakovski, I. Poser, N. Maghelli,
LA Royer, M. Weigert, EW Myers, S. Grill, D. Drechsel, AA Hyman, S. Alberti, A liquid-
to-solid phase transition of the ALS protein FUS accelerated by disease mutation, Cell
162 (2015) 1066–1077.
[28] J. Wang, JM Choi, AS Holehouse, HO Lee, X. Zhang, M. Jahnel, S. Maharana,
R. Lemaitre, A. Pozniakovsky, D. Drechsel, I. Poser, RV Pappu, S. Alberti,
AA Hyman, A molecular grammar governing the driving forces for phase se- paration of
prion-like RNA binding proteins, Cell 174 (2018) 688–699.
[29] S. Wegmann, B. Eftekharzadeh, K. Tepper, KM Zoltowska, RE Bennett,
S. Dujardin, PR Laskowski, D. MacKenzie, T. Kamath, C. Commins,
C. Vanderburg, AD Roe, Z. Fan, AM Molliex, A. Hernandez-Vega, D. Muller,
AA Hyman, E. Mandelkow, JP Taylor, BT Hyman, Tau protein liquid–liquid phase
separation can initiate tau aggregation, EMBO J. 37 (2018) 1–21.
[30] S. Ray, N. Singh, R. Kumar, K. Patel, S. Pandey, D. Datta, J. Mahato, R. Panigrahi,
A. Navalkar, S. Mehra, L. Gadhe, D. Chatterjee, AS Sawner, S. Maiti, S. Bhatia,
JA Gerez, A. Chowdhury, A. Kumar, R. Padinhateeri, R. Riek, et al., α-Synuclein
aggregation nucleates through liquid–liquid phase separation, Nat. Kimia 12
(2020) 705–716.
[31] WM Babinchak, R. Haider, BK Dumm, P. Sarkar, K. Surewicz, JK Choi,
WK Surewicz, The role of liquid-liquid phase separation in aggregation of the TDP-
43 low-complexity domain, J. Biol. Kimia 294 (2019) 6306–6317.
[32] P. Schwille, J. Spatz, K. Landfester, E. Bodenschatz, S. Herminghaus, V. Sourjik,
TJ Erb, P. Bastiaens, R. Lipowsky, A. Hyman, P. Dabrock, JC Baret,
T. Vidakovic-Koch, P. Bieling, R. Dimova, H. Mutschler, T. Robinson, TYD Tang,
S. Wegner, K. Sundmacher, MaxSynBio: avenues towards creating cells from the bottom
up, Angew. Kimia Int. Ed. 57 (2018) 13382–13392.
[33] S. Koga, DS Williams, AW Perriman, S. Mann, Peptide-nucleotide microdroplets
as a step towards a membrane-free protocell model, Nat. Kimia 3 (2011) 720–724.
[34] CA Strulson, RC Molden, CD Keating, PC Bevilacqua, RNA catalysis through
 compartmentalization, Nat. Kimia 4 (2012) 941–946.
[35] B. Drobot, JM Iglesias-Artola, K. Le Vay, V. Mayr, M. Kar, M. Kreysing,
H. Mutschler, TYD Tang, Compartmentalised RNA catalysis in membrane-free
coacervate protocells, Nat. komuni. 9 (2018) 1–9.
[36] S. Deshpande, F. Brandenburg, A. Lau, MGF Last, WK Spoelstra, L. Reese,
S. Wunnava, M. Dogterom, C. Dekker, Spatiotemporal control of coacervate for-
mation within liposomes, Nat. komuni. 10 (2019) 1–11.
[37] L. Faltova, AM Küffner, M. Hondele, K. Weis, P. Arosio, Multifunctional protein
materials and microreactors using low complexity domains as molecular ad-
hesives, ACS Nano 12 (2018) 9991–9999.
[38] N. Srinivasan, M. Bhagawati, B. Ananthanarayanan, S. Kumar, Stimuli-sensitive
intrinsically disordered protein brushes, Nat. komuni. 5 (2014) 1–8.
[39] BS Schuster, EH Reed, R. Parthasarathy, CN Jahnke, RM Caldwell,
JG Bermudez, H. Ramage, MC Good, DA Hammer, Controllable protein phase
separation and modular recruitment to form responsive membraneless organelles, Nat.
komuni. 9 (2018) 1–12.
[40] H. Yoo, C. Triandafillou, DA Drummond, Cellular sensing by phase separation: using
the process, not just the products, J. Biol. Kimia 294 (2019) 7151–7159.
[41] AM Küffner, M. Prodan, R. Zuccarini, U. Capasso Palmiero, L. Faltova, P. Arosio,
Acceleration of an enzymatic reaction in liquid phase separated compartments based on
intrinsically disordered protein domains, ChemSystemsChem 2
(2020) 1–7.
[42] U. Capasso Palmiero, AM Küffner, F. Krumeich, L. Faltova, P. Arosio, Adaptive
chemoenzymatic microreactors composed of inorganic nanoparticles and bioin-
spired intrinsically disordered proteins, Angew. Kimia Int. Ed. 59 (2020) 8138–8142.
[43] MT Guo, A. Rotem, JA Heyman, DA Weitz, Droplet microfluidics for high-
throughput biological assays, Lab Chip 12 (2012) 2146–2155.
[44] GM Whitesides, The origins and the future of microfluidics, Nature 442 (2006) 368–
373.
[45] J. Charmet, P. Arosio, TPJ Knowles, Microfluidics for protein biophysics, J. Mol.
Biol. 430 (2018) 565–580.
[46] WE Arter, A. Levin, G. Krainer, TPJ Knowles, Microfluidic approaches for the
analysis of protein–protein interactions in solution, Biophys. Rev. 12 (2020) 575–585.
[47] TW Herling, A. Levin, KL Saar, CM Dobson, TPJ Knowles, Microfluidic ap-
proaches for probing amyloid assembly and behaviour, Lab Chip 18 (2018) 999–1016.
[48] MRG Kopp, P. Arosio, Microfluidic approaches for the characterization of ther- apeutic
proteins, J. Pharm. Sci. 107 (2018) 1228–1236.
[49] Y. Xia, GM Whitesides, Soft lithography, Annu. Rev. Mater. Sci. 28 (1998)
153–184.
[50] J. Friend, L. Yeo, Fabrication of microfluidic devices using polydimethylsilo Xane,
Biomicrofluidics 4 (2010) 1–5.
[51] TM Squires, SR Quake, Microfluidics: fluid physics at the nanoliter scale, Rev.
Mod. fisik. 77 (2005) 987–1026.
[52] JS Kuo, DT Chiu, Controlling mass transport in microfluidic devices, Annu. Putaran.
dubur. Kimia 4 (2011) 275–296.
[53] PJA Kenis, RF Ismagilov, GM Whitesides, Microfabrication inside capillaries using
multiphase laminar flow patterning, Science 285 (1999) 83–85.
[54] P. Arosio, T. Müller, L. Rajah, EV Yates, FA Aprile, Y. Zhang, SIA Cohen,
DA White, TW Herling, EJ De Genst, S. Linse, M. Vendruscolo, CM Dobson,
TPJ Knowles, Microfluidic diffusion analysis of the sizes and interactions of proteins
under native solution conditions, ACS Nano 10 (2016) 333–341.
[55] A. Hatch, AE Kamholz, KR Hawkins, MS Munson, EA Schilling, BH Weigl,
P. Yager, A rapid diffusion immunoassay in a T-sensor, Nat. Bioteknologi. 19 (2001)
461–465.
[56] X. Casadevall i Solvas, A. DeMello, Droplet microfluidics: recent developments and
future applications, Chem. komuni. 47 (2011) 1936–1942.
[57] SY Teh, R. Lin, LH Hung, AP Lee, Droplet microfluidics, Lab Chip 8 (2008)
198–220.
[58] T. Thorsen, RW Roberts, FH Arnold, SR Quake, Dynamic pattern formation in a
vesicle-generating microfluidic device, Phys. Pdt. Lett. 86 (2001) 4163–4166.
[59] J. Zhou, AV Ellis, NH Voelcker, Recent developments in PDMS surface mod-
ification for microfluidic devices, Electrophoresis 31 (2010) 2–16.
[60] BG Abdallah, A. Ros, Surface Coatings for Microfluidic-Based Biomedical
Devices, Woodhead Publishing Limited, 2013.
[61] T. Trantidou, Y. Elani, E. Parsons, O. Ces, Hydrophilic surface modification of PDMS
for droplet microfluidics using a simple, quick, and robust method via pva
deposition, Microsystems Nanoeng. 3 (2017), https://doi.org/10.1038/
micronano.2016.91.
[62] M. Linsenmeier, MRG Kopp, F. Grigolato, L. Emmanoulidis, D. Liu, D. Zürcher,
M. Hondele, K. Weis, U. Capasso Palmiero, P. Arosio, Dynamics of synthetic
membraneless organelles in microfluidic droplets, Angew. Kimia Int. Ed. 58
(2019) 14489–14494.
[63] SV Akella, A. Mowitz, M. Heymann, S. Fraden, Emulsion-based technique to
measure protein crystal nucleation rates of lysozyme, Cryst. Growth Des. 14 (2014)
4487–4509.
[64] JC Baret, Surfactants in droplet-based microfluidics, Lab Chip 12 (2012)
422–433.
[65] Z. Toprakcioglu, P. Challa, C. Xu, TPJ Knowles, Label-free analysis of protein
aggregation and phase behavior, ACS Nano 13 (2019) 13940–13948.
[66] DJ Eastburn, A. Sciambi, AR Abate, Ultrahigh-throughput mammalian single-
cell reverse-transcriptase polymerase chain reaction in microfluidic drops, Anal. Kimia
85 (2013) 8016–8021.
[67] F. Courtois, LF Olguin, G. Whyte, D. Bratton, WTS Huck, C. Abell, F. Hollfelder,
An integrated device for monitoring time-dependent in vitro expression from single
genes in picolitre droplets, ChemBioChem 9 (2008) 439–446.
[68] L. Frenz, K. Blank, E. Brouzes, AD Griffiths, Reliable microfluidic on-chip in-
cubation of droplets in delay-lines, Lab Chip 9 (2009) 1344–1348.
[69] TPJ Knowles, DA White, AR Abate, JJ Agresti, SIA Cohen, RA Sperling,
EJ De Genst, CM Dobson, DA Weitz, Observation of spatial propagation of amyloid
assembly from single nuclei, Proc. Natal akad. Sci. USA 108 (2011) 14746–14751.
[70] E. Sokolova, E. Spruijt, MMK Hansen, E. Dubuc, J. Groen, V. Chokkalingam,
A. Piruska, HA Heus, WTS Huck, Enhanced transcription rates in membrane- free
protocells formed by coacervation of cell lysate, Proc. Natal akad. Sci. USA
110 (2013) 11692–11697.
[71] L. Labanieh, TN Nguyen, W. Zhao, DK Kang, Floating droplet array: an ultra- high-
throughput device for droplet trapping, real-time analysis and recovery,
Micromachines 6 (2015) 1469–1482.
[72] MRG Kopp, M. Linsenmeier, B. Hettich, S. Prantl, S. Stavrakis, JC Lerou X,
P. Arosio, Microfluidic shrinking droplet concentrator for analyte detection and
phase separation of protein solutions, Anal. Kimia 92 (2020) 5803–5812.
[73] JU Shim, G. Cristobal, DR Link, T. Thorsen, Y. Jia, K. Piattelli, S. Fraden, Control
and measurement of the phase behavior of aqueous solutions using microfluidics,
Selai. Kimia Soc. 129 (2007) 8825–8835.
[74] BJ Bleier, SL Anna, LM Walker, Microfluidic droplet-based tool to determine phase
behavior of a fluid system with high composition resolution, J. Phys. Kimia
B 122 (2018) 4067–4076.
[75] J. Man, S. Chien, S. Liang, J. Li, H. Chen, Size-dependent phase separation in
emulsion droplets, ChemPhysChem 19 (2018) 1995–1998.
[76] K. Luby-Phelps, Cytoarchitecture and Physical Properties of Cytoplasm: Volume,
Viscosity, Diffusion, Intracellular Surface Area, Elsevier Masson SAS, 1999.
[77] PC Chao, M. Sivaselvan, F. Sachs, Cytoskeletal Contribution to Cell Stiffness due to
Osmotic Swelling; EXtending the Donnan Equilibrium, Elsevier Ltd, 2018.
[78] RP Joyner, JH Tang, J. Helenius, E. Dultz, C. Brune, LJ Holt, S. Huet,
DJ Müller, K. Weis, A glucose-starvation response regulates the diffusion of
macromolecules, Elife 5 (2016) 1–26.
[79] R. Sachdev, M. Hondele, M. Linsenmeier, P. Vallotton, CF Mugler, P. Arosio,
K. Weis, Pat1 promotes processing body assembly by enhancing the phase se-
paration of the DEAD-boX ATPase Dhh1 and RNA, Elife 8 (2019) 1–27.
[80] AR Abate, T. Hung, P. Marya, JJ Agresti, DA Weitz, High-throughput injection with
microfluidics using picoinjectors using picoinjectors, Proc. Natal akad. Sci. U.
SA 107 (2010) 19163–19166.
[81] T. Beneyton, D. Krafft, C. Bednarz, C. Kleineberg, C. Woelfer, I. Ivanov,
T. Vidaković-Koch, K. Sundmacher, JC Baret, Out-of-equilibrium micro-
compartments for the bottom-up integration of metabolic functions, Nat. komuni. 9
(2018) 1–10.
[82] WT Snead, AS Gladfelter, The control centers of biomolecular phase separation: how
membrane surfaces, PTMs, and active processes regulate condensation, Mol.
Cell 76 (2019) 295–305.
[83] AK Rai, JX Chen, M. Selbach, L. Pelkmans, Kinase-controlled phase transition of
membraneless organelles in mitosis, Nature 559 (2018) 211–216.
[84] TM Franzmann, M. Jahnel, A. Pozniakovsky, J. Mahamid, AS Holehouse,
E. Nüske, D. Richter, W. Baumeister, SW Grill, RV Pappu, AA Hyman,
S. Alberti, Phase separation of a yeast prion protein promotes cellular fitness, Science
359 (2018) 1–8.
[85] V. Cherkasov, S. Hofmann, S. Druffel-Augustin, A. Mogk, J. Tyedmers,
G. Stoecklin, B. Bukau, Coordination of translational control and protein home-
ostasis during severe heat stress, Curr. Biol. 23 (2013) 2452–2462.
[86] S. Kroschwald, S. Maharana, D. Mateju, L. Malinovska, E. Nüske, I. Poser,
D. Richter, S. Alberti, Promiscuous interactions and protein disaggregases de-
termine the material state of stress-inducible RNP granules, Elife 4 (2015) 1–32.
[87] S. Duhr, S. Arduini, D. Braun, Thermophoresis of DNA determined by microfluidic
fluorescence, Eur. fisik. J. E 15 (2004) 277–286.
[88] CG Alexander, R. Wanner, CM Johnson, D. Breitsprecher, G. Winter, S. Duhr,
P. Baaske, N. Ferguson, Novel microscale approaches for easy, rapid determination
of protein stability in academic and commercial settings, Biochim. Biofis. Acta,
Proteins Proteomics 1844 (2014) 2241–2250.
[89] L. Nover, KD Scharf, D. Neumann, Cytoplasmic heat shock granules are formed
from precursor particles and are associated with a specific set of mRNAs, Mol. Cell.
Biol. 9 (1989) 1298–1308.
[90] P. Anderson, N. Kedersha, RNA granules, J. Cell Biol. 172 (2006) 803–808.
[91] JR Buchan, JH Yoon, R. Parker, Stress-specific composition, assembly and ki-
netics of stress granules in Saccharomyces cerevisiae, J. Cell Sci. 124 (2011) 228–
239.
[92] JA Riback, CD Katanski, JL Kear-Scott, EV Pilipenko, AE Rojek,
TR Sosnick, DA Drummond, Stress-triggered phase separation is an adaptive,
evolutionarily tuned response, Cell 168 (2017) 1028–1040.
[93] NN Deng, WTS Huck, Microfluidic formation of monodisperse coacervate or-
ganelles in liposomes, Angew. Kimia Int. Ed. 56 (2017) 9736–9740.
[94] DB Weibel, GM Whitesides, Applications of microfluidics in chemical biology,
Curr. pendapat. Kimia Biol. 10 (2006) 584–591.
[95] BT Kelly, JC Baret, V. Taly, AD Griffiths, Miniaturizing chemistry and biology in
microdroplets, Chem. komuni. (2007) 1773–1788.
[96] A. Huebner, S. Sharma, M. Srisa-Art, F. Hollfelder, JB Edel, AJ DeMello,
Microdroplets: a sea of applications? Lab Chip 8 (2008) 1244–1254.
[97] AB Theberge, F. Courtois, Y. Schaerli, M. Fischlechner, C. Abell, F. Hollfelder,
WTS Huck, Microdroplets in microfluidics: an evolving platform for discoveries in
chemistry and biology, Angew. Kimia Int. Ed. 49 (2010) 5846–5868.
[98] DT Chiu, AJ deMello, D. Di Carlo, PS Doyle, C. Hansen, RM Maceiczyk,
 RCR Wootton, Small but perfectly formed? Successes, challenges, and opportu- nities
for microfluidics in the chemical and biological sciences, Chem 2 (2017)
201–223.
[99] L. Armbrecht, PS Dittrich, Recent advances in the analysis of single cells, Anal. Kimia
89 (2017) 2–21.
[100] KM Ruff, S. Roberts, A. Chilkoti, RV Pappu, Advances in understanding sti-
mulus-responsive phase behavior of intrinsically disordered protein polymers, J. mol.
Biol. 430 (2018) 4619–4635.
[101] I. Rayment, Small-scale batch crystallization of proteins revisited: an underutilized way
to grow large protein crystals, Structure 10 (2002) 147–151.
[102] CL Hansen, E. Skordalakest, JM Berger, SR Quake, A robust and scalable mi-
crofluidic metering method that allows protein crystal growth by free interface diffusion,
Proc. Natal akad. Sci. USA 99 (2002) 16531–16536.
[103] CL Hansen, MOA Sommer, SR Quake, Systematic investigation of protein
phase behavior with a microfluidic formulator, Proc. Natal akad. Sci. USA 101 (2004)
14431–14436.
[104] CL Hansen, S. Classen, JM Berger, SR Quake, A microfluidic device for kinetic
optimization of protein crystallization and in situ structure determination, J. Am.
Kimia Soc. 128 (2006) 3142–3143.
[105] MA Unger, HP Chou, T. Thorsen, A. Scherer, SR Quake, Monolithic micro- fabricated
valves and pumps by multilayer soft lithography, Science 288 (2000)
113–116.
[106] B. Zheng, LS Roach, RF Ismagilov, Screening of protein crystallization condi- tions on a
microfluidic chip using nanoliter-size droplets, J. Am. Kimia Soc. 125 (2003) 11170–
11171.
[107] DL Chen, GJ Gerdts, RF Ismagilov, Using microfluidics to observe the effect of
miXing on nucleation of protein crystals, J. Am. Kimia Soc. 127 (2005) 9672–9673.
[108] CJ Gerdts, V. Tereshko, MK Yadav, I. Dementieva, F. Collart, A. Joachimiak,
RC Stevens, P. Kuhn, A. Kossiakoff, RF Ismagilov, Time-controlled microfluidic seeding
in nL-volume droplets to separate nucleation and growth stages of protein
crystallization, Angew. Kimia Int. Ed. 45 (2006) 8156–8160.
[109] B. Zheng, JD Tice, LS Roach, RF Ismagilov, A droplet-based, composite PDMS/
glass capillary microfluidic system for evaluating protein crystallization conditions by
microbatch and vapor-diffusion methods with on-chip X-ray diffraction,
Angew. Kimia Int. Ed. 43 (2004) 2508–2511.
[110] X. Casadevall i Solvas, V. Turek, T. Prodromakis, JB Edel, Microfluidic eva- porator
for on-chip sample coneentration, Lab Chip 12 (2012) 4049–4054.
[111] B. Zheng, CJ Gerdts, RF Ismagilov, Using nanoliter plugs in microfluidics to facilitate
and understand protein crystallization, Curr. pendapat. Struktur. Biol. 15
(2005) 548–555.
[112] H. Yamaguchi, M. Maeki, K. Yamashita, H. Nakamura, M. Miyazaki, H. Maeda,
Controlling one protein crystal growth by droplet-based microfluidic system, J.
Biochem. 153 (2013) 339–346.
[113] A. Bremer, T. Mittag, M. Heymann, Microfluidic determination of liquid-liquid
phase separation binodals, BioRXiv (2020), https://doi.org/10.1101/2020.06.16.
154518.
[114] H. Song, RF Ismagilov, Millisecond kinetics on a microfluidic chip using nano-
liters of reagents, J. Am. Kimia Soc. 125 (2003) 14613–14619.
[115] KS Burke, D. Parul, MJ Reddish, RB Dyer, A simple three-dimensional-fo-
cusing, continuous-flow miXer for the study of fast protein dynamics, Lab Chip 13 (2013)
2912–2921.
[116] TPJ Knowles, CA Waudby, GL Devlin, SIA Cohen, A. Aguzzi,
M. Vendruscolo, EM Terentjev, ME Welland, CM Dobson, An analytical solu- tion to the
kinetics of breakable filament assembly, Science 326 (2009)
1533–1537.
[117] TPJ Knowles, M. Vendruscolo, CM Dobson, The amyloid state and its associa- tion with
protein misfolding diseases, Nat. Pdt Mol. Biol Sel. 15 (2014) 384–396.
[118] P. Arosio, M. Vendruscolo, CM Dobson, TPJ Knowles, Chemical kinetics for
drug discovery to combat protein aggregation diseases, Trends Pharmacol. Sci. 35 (2014)
127–135.
[119] TCT Michaels, AJ Dear, TPJ Knowles, Stochastic calculus of protein filament formation
under spatial confinement, New J. Phys. 20 (2018) 1–11.
[120] F. Grigolato, P. Arosio, Sensitivity analysis of the variability of amyloid aggrega-
tion profiles, Phys. Kimia Kimia fisik. 21 (2019) 1435–1442.
[121] BA Grzybowski, WTS Huck, The nanotechnology of life-inspired systems, Nat.
Nanotechnol. 11 (2016) 585–592.
[122] CA Weber, D. Zwicker, F. Jülicher, CF Lee, Physics of active emulsions, Rep. Prog.
fisik. 82 (2019) 1–40.
[123] CP Brangwynne, TJ Mitchison, AA Hyman, Active liquid-like behavior of nu- cleoli
determines their size and shape in Xenopus laevis oocytes, Proc. Natal akad.
Sci. USA 108 (2011) 4334–4339.
[124] M. Feric, N. Vaidya, TS Harmon, DM Mitrea, L. Zhu, TM Richardson,
RW Kriwacki, RV Pappu, CP Brangwynne, Coexisting liquid phases underlie nucleolar
subcompartments, Cell 165 (2016) 1686–1697.
[125] A. Hubstenberger, SL Noble, C. Cameron, TC Evans, Translation repressors, an
RNA helicase, and developmental cues control RNP phase transitions during early
development, Dev. Cell 27 (2013) 161–173.
[126] JB Woodruff, B. Ferreira Gomes, PO Widlund, J. Mahamid, A. Honigmann,
AA Hyman, The centrosome is a selective condensate that nucleates microtubules by
concentrating tubulin, Cell 169 (2017) 1066–1077.
[127] P. Li, S. Banjade, HC Cheng, S. Kim, B. Chen, L. Guo, M. Llaguno,
JV Hollingsworth, DS King, SF Banani, PS Russo, QX Jiang, BT Ni Xon,
MK Rosen, Phase transitions in the assembly of multivalent signalling proteins, Nature
483 (2012) 336–340.
[128] T. Murakami, S. Qamar, JQ Lin, GSK Schierle, E. Rees, A. Miyashita, AR Costa,
RB Dodd, FTS Chan, CH Michel, D. Kronenberg-Versteeg, Y. Li, SP Yang,
Y. Wakutani, W. Meadows, RR Ferry, L. Dong, GG Tartaglia, G. Favrin, WL Lin,
et al., ALS/FTD mutation-induced phase transition of FUS liquid droplets and reversible
hydrogels into irreversible hydrogels impairs RNP granule function,
Neuron 88 (2015) 678–690.
[129] A. Patel, HO Lee, D. Drechsel, A. Anthony, S. Alberti, A. Patel, HO Lee,
L. Jawerth, S. Maharana, M. Jahnel, MY Hein, S. Stoynov, J. Mahamid, S. Saha,
TM Franzmann, A. Pozniakovski, I. Poser, AA Hyman, S. Alberti, Article a li- quid-to-
solid phase transition of the ALS protein FUS accelerated by disease mu-
tation article a liquid-to-solid phase transition of the ALS protein FUS accelerated by
disease mutation, Cell 162 (2015) 1066–1077.
[130] U. Sheth, R. Parker, Decapping and decay of messenger RNA occur in cytoplasmic
processing bodies, Science 300 (2003) 805–808.
[131] RW Style, T. Sai, N. Fanelli, M. Ijavi, K. Smith-Mannschott, Q. Xu, LA Wilen,
ER Dufresne, Liquid-liquid phase separation in an elastic network, Phys. Rev. X 8
(2018) 11028.
[132] WE Arter, R. Qi, G. Krainer, TJ Welsh, Y. Xu, Rapid generation of protein
condensate phase diagrams using combinatorial droplet microfluidics, BioR Xiv
(2020), https://doi.org/10.1101/2020.06.04.132308.
[133] N. Taylor, S. Elbaum-Garfinkle, N. Vaidya, H. Zhang, HA Stone,
CP Brangwynne, Biophysical characterization of organelle-based RNA/protein liquid
phases using microfluidics, Soft Matter 12 (2016) 9142–9150.
[134] Y. Shen, FS Ruggeri, D. Vigolo, A. Kamada, S. Qamar, A. Levin, C. Iserman,
S. Alberti, PS George-Hyslop, T. Knowles, Biomolecular condensates undergo a
generic shear-mediated liquid-to-solid transition, Nat. Nanotechnol. (2020),
https://doi.org/10.1038/s41565-020-0731-4.
[135] F. Grigolato, P. Arosio, Synergistic effects of flow and interfaces on antibody ag-
gregation, Biotechnol. Bioeng. 117 (2020) 417–428.
[136] TJ Welsh, G. Krainer, JR Espinosa, JA Joseph, A. Sridhar, M. Jahnel,
WE Arter, KL Saar, S. Alberti, R. Collepardo-Guevara, TPJ Knowles, Single particle zeta-
potential measurements reveal the role of electrostatics in protein
condensate stability, BioRXiv (2020), https://doi.org/10.1101/2020.04.20.
047910.
[137] G. Celetti, G. Paci, J. Caria, V. VanDelinder, G. Bachand, EA Lemke, The liquid state
of FG-nucleoporins mimics permeability barrier properties of nuclear pore
complexes, J. Cell Biol. 219 (2019) 1–11.
[138] D. Dormann, FG-nucleoporins caught in the act of liquid-liquid phase separation, J.
Cell Biol. 219 (2020) 10–11.
[139] T. Beneyton, C. Love, M. Girault, T.-YD Tang, J. Baret, High-throughput synthesis and
screening of functional coacervates using microfluidics, ChemSystemsChem 2
(2020) 1–9.
[140] C. Martino, AJ deMello, Droplet-based microfluidics for artificial cell generation: a
brief review, Interface Focus 6 (2016).
[141] H. Jia, P. Schwille, Bottom-up synthetic biology: reconstitution in space and time,
Curr. pendapat. Bioteknologi. 60 (2019) 179–187.
[142] M. Ugrinic, A. deMello, TYD Tang, Microfluidic tools for bottom-up synthetic
cellularity, Chem 5 (2019) 1727–1742.
[143] CD Crowe, CD Keating, Liquid–liquid phase separation in artificial cells,
Interface Focus 8 (2018) 1–17.
[144] Y. Elani, RV Law, O. Ces, Vesicle-based artificial cells as chemical microreactors with
spatially segregated reaction pathways, Nat. komuni. 5 (2014) 1–5.
[145] N. Nuti, PE Verboket, PS Dittrich, Multivesicular droplets: a cell model system
to study compartmentalised biochemical reactions, Lab Chip 17 (2017) 3112–3119.
[146] JW Hindley, Y. Elani, CM McGilvery, S. Ali, CL Bevan, RV Law, O. Ces, Light-
triggered enzymatic reactions in nested vesicle reactors, Nat. komuni. 9
(2018) 3–8.
[147] P. Supramaniam, O. Ces, A. Salehi-Reyhani, Microfluidics for artificial life: tech-
niques for bottom-up synthetic biology, Micromachines 10 (2019) 1–27.
[148] S. Deshpande, Y. Caspi, AEC Meijering, C. Dekker, Octanol-assisted liposome
assembly on chip, Nat. komuni. 7 (2016) 1–9.
[149] P. Carrara, P. Stano, PL Luisi, Giant vesicles “colonies”: a model for primitive cell
communities, ChemBioChem 13 (2012) 1497–1502.
[150] M. Sobrinos-Sanguino, S. Zorrilla, CD Keating, B. Monterroso, G. Rivas,
Encapsulation of a compartmentalized cytoplasm mimic within a lipid membrane by
microfluidics, Chem. komuni. 53 (2017) 4775–4778.
[151] H. Zhao, V. Ibrahimova, E. Garanger, S. Lecommandou X, Dynamic spatial for-
mation and distribution of intrinsically disordered protein droplets in macro-
molecularly crowded protocells, Angew. Kimia Int. Ed. 59 (2020) 11028–11036.
[152] MGF Last, S. Deshpande, C. Dekker, pH-controlled Coacervate-membrane in-
teractions within liposomes, ACS Nano 14 (2020) 4487–4498.
[153] C. Love, J. Steinkühler, DT Gonzales, N. Yandrapalli, T. Robinson, R. Dimova,
TYD Tang, Reversible pH-responsive coacervate formation in lipid vesicles ac- tivates
dormant enzymatic reactions, Angew. Kimia Int. Ed. 59 (2020)
5950–5957.
[154] G. Weitzel, U. Pilatus, L. Rensing, The cytoplasmic pH, ATP content and total protein
synthesis rate during heat-shock protein inducing treatments in yeast, E Xp. Cell Res.
170 (1987) 64–79.
[155] MC Munder, D. Midtvedt, T. Franzmann, E. Nüske, O. Otto, M. Herbig,
E. Ulbricht, P. Müller, A. Taubenberger, S. Maharana, L. Malinovska, D. Richter,
J. Guck, V. Zaburdaev, S. Alberti, A pH-driven transition of the cytoplasm from a
fluid- to a solid-like state promotes entry into dormancy, Elife 5 (2016) 1–30.
[156] CG Triandafillou, CD Katanski, AR Dinner, DA Drummond, Transient in-
tracellular acidification regulates the core transcriptional heat shock response, Elife 9
(2020) 1–30.
[157] D. Zwicker, R. Seyboldt, CA Weber, AA Hyman, F. Jülicher, Growth and division
 of active droplets provides a model for protocells, Nat. fisik. 13 (2017) 408–413.
[158] A. Sorrenti, J. Leira-Iglesias, A. Sato, TM Hermans, Non-equilibrium steady states in
supramolecular polymerization, Nat. komuni. 8 (2017) 1–8.
[159] N. Martin, Dynamic synthetic cells based on liquid–liquid phase separation,
ChemBioChem 20 (2019) 2553–2568.
[160] KK Nakashima, MA Vibhute, E. Spruijt, Biomolecular chemistry in liquid phase
separated compartments, Front. mol. Biosci. 6 (2019) 1–9.
[161] M. Tena-Solsona, C. Wanzke, B. Riess, AR Bausch, J. Boekhoven, Self-selection of
dissipative assemblies driven by primitive chemical reaction networks, Nat.
komuni. 9 (2018) 1–8.
[162] KK Nakashima, JF Baaij, E. Spruijt, Reversible generation of coacervate droplets in an
enzymatic network, Soft Matter 14 (2018) 361–367.
[163] K. Dai, JR Fores, C. Wanzke, B. Winkeljann, AM Bergmann, O. Lieleg,
J. Boekhoven, Regulating chemically fueled peptide assemblies by molecular de- sign
regulating chemically fueled peptide assemblies by molecular design, J. Am. Kimia Soc.
142 (2020) 14142–14149.
[164] E. Marszal, M. Suchova, P. Konecny, WH Scouten, Study of cell-free protein
synthesis in aqueous two-phase systems, J. Mol. Recognit. 8 (1995) 151–156.
[165] P. Torre, CD Keating, SS Mansy, Multiphase water-in-oil emulsion droplets for cell-
free transcription-translation, Langmuir 30 (2014) 5695–5699.
[166] D. van Swaay, DTY Tang, S. Mann, A. DeMello, Microfluidic formation of membrane-
free aqueous coacervate droplets in water, Angew. Kimia Int. Ed. 54
(2015) 8398–8401.
[167] M. Weiss, JP Frohnmayer, LT Benk, B. Haller, JW Janiesch, T. Heitkamp,
M. Börsch, RB Lira, R. Dimova, R. Lipowsky, E. Bodenschatz, JC Baret,
T. Vidakovic-Koch, K. Sundmacher, I. Platzman, JP Spatz, Sequential bottom-up
assembly of mechanically stabilized synthetic cells by microfluidics, Nat. Mater.
17 (2018) 89–95.
[168] A. Aguzzi, M. Altmeyer, Phase separation: linking cellular compartmentalization to
disease, Trends Cell Biol. 26 (2016) 547–558.
[169] S. Alberti, D. Dormann, Liquid–liquid phase separation in disease, Annu. Putaran.
gen. 53 (2019) 171–194.