Diterjemahkan dari bahasa Inggris ke bahasa Indonesia - www.onlinedoctranslator.

com

Penelitian Sel (2014) 24:9-23.

© 2014 IBCB, SIBS, CAS Hak cipta dilindungi undang-undang 1001-0602/14 $ 32,00
npg
www.nature.com/cr
TINJAUAN

Landmark sejarah penelitian autophagy

Yoshinori Ohsumi1

1Pusat Penelitian Perbatasan, Institut Teknologi Tokyo, Yokohama 226-8503, Jepang

Tahun 2013 menandai peringatan 50 tahun C de Duve menciptakan istilah "autophagy" untuk proses degradasi
konstituen sitoplasma di lisosom/vakuola. Tahun ini kami dengan menyesal kehilangan ilmuwan hebat ini, yang
memberikan banyak penghargaan selama tahun-tahun awal penelitian di bidang autophagy. Segera setelah penemuan
lisosom oleh de Duve, mikroskop elektron mengungkapkan autophagy sebagai sarana untuk mengirimkan komponen
intraseluler ke lisosom. Untuk waktu yang lama setelah penemuan autophagy, penelitian gagal menghasilkan kemajuan
signifikan pada tingkat molekuler dalam pemahaman kita tentang jalur degradasi mendasar ini. Terobosan pertama dibuat
di awal 1990-an, ketika autophagy ditemukan pada ragi yang mengalami kelaparan dengan pengamatan mikroskopis.
Selanjutnya, upaya genetik untuk mengatasi masalah autophagy yang kurang dipahami menyebabkan penemuan banyak
mutan yang cacat autophagy. Identifikasi selanjutnya dari gen terkait autophagy dalam ragi mengungkapkan set molekul
unik yang terlibat dalam dinamika membran selama autophagy. Homolog ATG kemudian ditemukan di berbagai organisme,
menunjukkan bahwa mekanisme dasar autophagy dilestarikan dengan baik di antara eukariota. Temuan ini membawa
perubahan revolusioner untuk penelitian di bidang ini. Misalnya, 10 tahun terakhir telah melihat kemajuan luar biasa dalam
pemahaman kita autophagy, tidak hanya dalam hal mekanisme molekuler autophagy, tetapi juga berkaitan dengan peran
fisiologisnya yang luas dan relevansinya dengan kesehatan dan penyakit. Sekarang pengetahuan kita tentang autophagy
berkembang secara dramatis dari hari ke hari. Di sini, tonggak sejarah yang mendukung ledakan penelitian autophagy
dijelaskan dengan fokus khusus pada kontribusi ragi sebagai organisme model.
Kata kunci:autofagi; ragi; ATG
Penelitian Sel(2014)24:9-23. doi:10.1038/cr.2013.169; diterbitkan online 24 Desember 2013

pengantar menggunakan pelabelan isotop protein tidak konvensional pada

Sifat dinamis yang luas dari kehidupan menjadi semakin
jelas dengan setiap kemajuan dalam pemahaman ilmiah.
Selain metabolit, mesin seluler, protein, dan organel itu
sendiri dipertahankan dalam keseimbangan antara sintesis
dan degradasi yang berkelanjutan, yang merupakan salah
satu perbedaan penting antara kehidupan dan mesin
buatan manusia. Sebuah pasokan konstan bahan kimia dan
energi dari lingkungan eksternal diperlukan untuk
pemeliharaan keadaan keseimbangan ini. Yang paling
sumber produktif bahan kimia seperti yang ditemui pada
hewan adalah pencernaan protein yang diambil sebagai
makanan di saluran pencernaan, yang secara topologi
diadakan di luar tubuh. Dalam hal protein intraseluler, karya
perintis oleh R. Schoenheimer menyajikan konsep penting,
yaitu "pergantian protein" dalam tubuh [1]. Studi terbarunya
saat itu, tetapi merangsang banyak perdebatan dan pekerjaan
selanjutnya di bidang metabolisme protein intraseluler [2]. Namun,
orang masih percaya selama bertahun-tahun bahwa protein itu
stabilin vivodan degradasi itu tidak memainkan peran penting dalam
homeostasis protein. Pada tahun 1970-an, percobaan untuk
memperkirakan masa hidup protein individu dengan tingkat
degradasi dalam sel melalui injeksi protein murni ke dalam sel atau
dengan eksperimen pengejaran pulsa menunjukkan bahwa setiap
proteinin vivomemiliki waktu paruh yang berbeda secara luas mulai
dari beberapa menit hingga lebih dari 100 hari [3, 4]. Kita sekarang
tahu bahwa protein yang membentuk tubuh kita diganti hampir
sepenuhnya setiap 1-2 bulan tanpa perubahan nyata dalam
penampilan fisik. Kami masih belum sepenuhnya memahami apa
yang sebenarnya menentukan masa hidup protein yang unik,
bagaimana dan mengapa fenomena ini terjadi, atau memang
fisiologis signifikansi di balik pola yang rumit dan berbeda dari
degradasi protein. Namun, jelas bahwa untuk beradaptasi dengan
perubahan kondisi lingkungan yang terus menerus atau mendadak,

Korespondensi: Yoshinori Ohsumi pergantian protein harus memainkan peran penting.

Email: yohsumi@iri.titech.ac.jp
npgLandmark sejarah penelitian autophagy
10
Di alam, kelaparan, yang hanya merupakan kekurangan
pasokan nutrisi, adalah ancaman yang paling sering dan serius
bagi pemeliharaan dan pelestarian kehidupan. Untuk
menanggung kesulitan ini, daur ulang protein adalah garis
pertahanan utama di mana sel dapat menyimpan asam amino
untuk sintesis komplemen minimal protein yang penting untuk
kelangsungan hidup. Pada tahap awal evolusi, sel pasti telah
memperoleh mekanisme intraseluler tertentu degradasi protein
yang disempurnakan selama evolusi; contoh mencolok dari ini
adalah bahwa semua organisme di Bumi memiliki protease
tanpa kecuali. Sekarang diketahui bahwa bahkan dalam kondisi
normal sebagian besar asam amino untuk sintesis protein
dalam tubuh kita berasal dari degradasi protein sel itu sendiri,
yang menunjukkan bahwa daur ulang adalah ciri intrinsik
kehidupan.
Pada saat yang sama, degradasi protein intraseluler bisa
menjadi proses yang berbahaya. Degradasi sembarangan
bersama sintesis protein dalam kompartemen yang sama
dapat menyebabkan siklus sia-sia yang mengakibatkan
pemborosan energi. Namun, setidaknya ada empat kunci
strategi yang telah berkembang untuk menghindari
masalah ini: pertama, aktivitas protease diatur dengan ketat,
dan aktivasi enzim hidrolitik hanya terjadi bila diperlukan.
Kedua, protease membentuk kompleks terkurung besar
yang menyerupai bar- rel, membatasi aktivitas
degradatifnya. Ketiga, target dimodifikasi secara selektif
sebelum degradasi, memungkinkan de- gree kontrol atas
apa yang dipecah. Akhirnya, enzim hidrolitik diasingkan ke
dalam kompartemen membran, secara fisik memisahkan
aktivitas ini di dalam sel. Sistem ubiquitin/proteasome
bertanggung jawab untuk kasus 2 dan 3. Kasus 4
tergantung pada sistem degradasi lisosom. Pemisahan
hidrolase oleh membran pasti menimbulkan masalah lain,
yaitu bagaimana mengakses substrat ditakdirkan untuk
degradasi oleh enzim hidrolitik. Oleh karena itu, degradasi
melalui sistem lisosom, yang sebagian besar bergantung
pada autofagi, harus melibatkan proses yang diperantarai
membran tertentu.
Penemuan lisosom dan autofagi
Pengungkapan mekanisme degradasi protein
intraseluler dibawa oleh penemuan lisosom oleh C de
Duve [5]. Selama fraksinasi sel homogenat hati tikus
dengan sentrifugasi berturut-turut, ia menemukan
latensi aktivitas asam fosfatase. Analisis lebih lanjut
mengungkapkan organel baru yang membungkus asam
fosfatase dan juga berbagai jenis enzim hidrolitik dengan
aktivitas optimal pada pH asam. Dia menamakan organel
unik ini, yang diidentifikasi murni oleh studi biokimia,
"lisosom", mengacu pada perannya sebagai organel
untuk fungsi litik [6].
Segera setelah itu, studi mikroskopis elektron digunakan,
mengidentifikasi lisosomdi tempatdi dalam sel dan tisu.
Novikoff dan rekannya pertama kali mengamati iso- fraksi
yang diperkaya lisosom, dan kemudian ditemukan struktur
serupa di bagian tipis jaringan hati, yang membuktikan
lisosom sebagai entitas morfologis [7]. Pengamatan awal
lisosom di berbagai sel dan jaringan mengungkapkan
bahwa lisosom secara morfologis cukup heterogen di antara
berbagai jenis sel.
Pada saat itu proses endositosis telah dipelajari
dengan mikroskop elektron (EM), yang mengungkapkan
bahwa sel-sel yang menghasilkan endositosis, seperti
makrofag dan leukosit, banyak mengandung lisosom.
Dalam proses endositosis, bahan asing dari luar sel
pertama-tama diambil ke dalam fagosom, yang
kemudian sekering dengan lisosom, menghasilkan tubuh
yang dikenal sebagai fagolisosom di mana degradasi
target hasil [8]. Pengamatan ini memberikan
pemahaman tentang rute dari luar ke lisosom.
Namun, proses degradasi komponen intraseluler lebih
sulit untuk dianalisis. Pertama temuan penting dibuat oleh S
Clark, yang mengamati sel tubulus ginjal dari tikus yang
baru lahir, dan ditemukan, selain lisosom, vakuola
berbentuk tidak teratur yang mengandung bahan amorf
dan kadang-kadang mitokondria [9]. Seorang Novikoffdkk.,
juga mengamati struktur membran asam fosfatase-positif
serupa yang mengandung mitokondria, ER, dan ribosom [7].
Struktur membran ini dapat disebabkan oleh perlakuan
kimia tertentu atau kondisi stres. TP Ashfold dan KR Porter
selanjutnya menunjukkan bahwa pengobatan dengan
hormon, glukagon, menghasilkan peningkatan frekuensi
lisosom yang mengandung komponen sitoplasma [10].
Perawatan semacam itu sangat membantu ketika
menggambarkan evolusi morfologis dari struktur membran
yang mengandung komponen sitoplasma ini dari waktu ke
waktu. Segera setelah itu, AU Arstila dan BF Trump dengan
terampil menunjukkan bahwa struktur terikat membran
ganda yang mengandung sebagian sitoplasma dan organel
tanpa enzim hidrolitik yang dikenal sebagai autophagosome
terbentuk pada awalnya [11]. Struktur ini adalah selanjutnya
diamati sebagai struktur membran tunggal, disebut sebagai
autophagolysosome, menunjukkan berbagai tahap
degradasi organel oleh enzim lisosom.
[11]. Berdasarkan pengamatan ini, C de Duve
mendefinisikan mode pengiriman bahan sitoplasma ke
lisosom untuk degradasi sebagai "autophagy" (dari bahasa
Yunani untuk makan sendiri) pada tahun 1963 [12], yang
pada saat itu kontras dengan "heterophagy", rute dari luar
ke lisosom , sekarang umumnya disebut endositosis.
Sejak temuan penting ini, autophagy telah kembali porting di
berbagai jaringan dan organ hewan bahkan tumbuhan [13].
Peristiwa paling kritis dalam autophagy adalah
Penelitian Sel | Vol 24 No 1 | Januari 2014

penyerapan sebagian sitoplasma dengan
membentuk kompartemen baru, autophagosome.
Pembentukan autofagosom bergantung pada
serangkaian peristiwa membran dinamis: di
sitoplasma, kantung membran kecil (fagofor atau
membran isolasi) pertama kali muncul, yang
meluas untuk membentuk struktur berbentuk
cangkir yang kemudian menyegel, menghasilkan
struktur terikat membran ganda, autophagosome,
melampirkan sebagian dari sitoplasma.
Autofagosom ini kemudian menyatu dengan
lisosom, dan membran bagian dalam beserta isinya
didegradasi oleh hidrolase lisosom. Akhirnya,
autofagolisosom menjadi tubuh residu dan produk
degradasi seperti asam amino diangkut kembali ke
sitoplasma dan digunakan kembali sebagai bahan
penyusun atau sumber energi.
Sebelum gen terkait autophagy
Konsepsi awal tentang peran fisiologis autophagy
Seperti disebutkan di atas, de Duve dan lain-lain menemukan
bahwa glukagon menginduksi autophagy di hati [14]. Temuan
ini merangsang minat pada peran fisiologis autophagy. Salah
satu studi berikutnya, oleh U Pfeifer dkk., memeriksa degradasi
protein berumur panjang oleh autophagy, mengungkapkan
hubungan antara autophagy dan ritme sirkadian [15, 16]. Dalam
karya ini, penulis menemukan bahwa autophagy dihambat
dengan memberi makan dan diinduksi oleh puasa di antara
waktu makan, memperkuat bahwa autophagy diatur secara
ketat oleh kondisi nutrisi. U Pfeiferdkk., juga menunjukkan
bahwa dengan 48 jam kelaparan 30-40% protein hati
terdegradasi [16].
Sekitar waktu yang sama, kelompok G Mortimore sedang
bekerja secara intensif pada regulasi autophagy oleh nutrisi,
memeriksa pelepasan asam amino dari protein di hati tikus
yang diperfusi. Pertama, mereka menemukan bahwa tingkat
degradasi protein meningkat secara signifikan ketika asam
amino dalam larutan perfusi menurun. Sebaliknya, peningkatan
kadar asam amino dalam larutan menekan degradasi hingga
sepertiga dari laju basal normal. Eksperimen ini dengan jelas
menunjukkan bahwa degradasi protein melalui autophagy
dikontrol secara ketat oleh tingkat asam amino [17]. Lebih
lanjut, Mortimore menanyakan asam amino mana yang secara
individu atau kombinasi memiliki efek penghambatan pada
autophagy, dan menunjukkan bahwa delapan asam amino, Leu,
Tyr, Phe, Gln, Pro, His, Trp, dan Met, menekan autophagy [18].
Segera, PO Seglen melakukan percobaan serupa dengan
menggunakan kultur hepatosit dan ketika sampai pada
kesimpulan yang sama, juga menunjukkan bahwa Leu paling
kuat menghambat autophagy [19]. Baru-baru ini, efek asam
amino pada autophagy telah diperiksa ulang
www.cell-research.com | Penelitian Sel
Yoshinori Ohsuminpg
11
dalam kaitannya dengan aktivasi mTORC1, dan beberapa model
aksi yang menarik telah diusulkan [20, 21]. Namun, percobaan
lebih lanjut diperlukan untuk mendapatkan pemahaman yang
bernuansa tentang regulasi autophagy pada tingkat molekuler
(lihat ulasan oleh Guan dalam masalah ini).
Berbeda dengan efek stimulasi glukagon, beberapa
kelompok melaporkan bahwa insulin menekan autophagy [14],
yang sesuai dengan fungsi kontrol yang diketahui dari hormon-
hormon ini dalam katabolisme dan anabolisme, masing-masing.
Regulasi autophagy oleh hormon-hormon ini adalah subjek
yang penting secara fisiologis, dan dengan demikian
mekanisme kerjanya telah lama menjadi perhatian besar.
Dengan perkembangan alat canggih baru-baru ini seperti
spektrometri massa, sekarang kita dapat menganalisis perilaku
dinamis berbagai metabolit, termasuk asam amino. Analisis
sistematis lebih lanjut akan memberikan wawasan terperinci
tentang regulasi dan hubungan erat antara autophagy dan
metabolisme seluler.
Karena pH asam lisosom sangat penting untuk fungsinya,
beberapa reagen yang meningkatkan pH lisosom juga
menghambat degradasi protein autofagik, seperti am- ion
monium, klorokuin dan bafilomisin, yang digunakan untuk
memperkirakan degradasi lisosom. Namun, senyawa ini
secara luas dapat mempengaruhi berbagai fungsi seluler,
membatasi kegunaan studi tersebut.
Di layar untuk senyawa organik tertentu yang menghambat
autophagy, PO Seglen melaporkan aktivitas penghambatan 3-
methyladenine [22], dan senyawa ini telah digunakan sejak
sebagai penghambat autophagy. Kemudian terbukti, seperti
wortmannin, penghambat tipe III phosphatidylinositol 3-kinase
(PI-3K), yang penting untuk pembentukan autophagosome [23].
Namun, 3-methyladenine tidak hanya menghambat Kelas III
PI-3K tetapi juga Kelas I kinase, dan konsentrasi yang diperlukan
untuk penghambatan efektif sangat tinggi. Pengobatan dengan
inhibitor seperti leupeptin, inhibitor cathepsin, menginduksi
pembentukan banyak vakuola yang mengandung berbagai
enzim sitoplasma dengan menghalangi degradasi dalam
lisosom, dan analisis biokimia mengungkapkan bahwa ini
mewakili enwrapping non-selektif enzim sitosolik [24].
Keterlibatan fosforilasi protein dalam autophagy juga
diusulkan oleh PO Seglen dengan menggunakan berbagai
inhibitor protein kinase [25, 26], tetapi target dan kinase yang
terlibat pada berbagai tahap autophagy tetap tidak diketahui
untuk waktu yang lama, yang menghambat kemajuan dalam
penjelasan peran fosforilasi. Sekarang banyak e- benteng dalam
mencari penghambat spesifik autophagy adalah sedang
berlangsung berdasarkan kemajuan terbaru dalam studi
biokimia dan struktural dari mesin autophagic.
Berbagai mode autophagy
Proses yang disebutkan di atas, yang melibatkan autofa-
npgLandmark sejarah penelitian autophagy
12
sekuestrasi gosomal dari target yang akan didegradasi,
disebut macroautophagy, yang merupakan rute
intraseluler utama ke lisosom. Makroautofagi pada
awalnya dipahami untuk menargetkan komponen dan
organel sitosol secara nonselektif. Namun, ribosom,
mitokondria, dan organel lainnya diamati dalam
autophagolysosome dari hari-hari awal penelitian
autophagy, yang menunjukkan bahwa autophagy adalah
cara yang baik untuk menurunkan struktur supramolekul
besar dan organel secara efisien dalam satu gerakan.
Seharusnya, pertanyaan tetap ada, apakah komponen
tersebut diasingkan secara kebetulan atau dikirim secara
selektif ke autophagosome. Penyerapan selektif organel
yang berkembang biak dengan autophagy setelah
perubahan nutrisi atau perawatan kimia ditunjukkan
dalam studi awal yang menangani masalah ini. Temuan
ini menunjukkan bahwa autophagy berperan dalam
pengendalian jumlah organel. Saat ini satu salah satu hal
yang paling menarik di lapangan menyangkut degradasi
selektif organel. Kemajuan terbaru dalam mekanisme
molekuler autophagy selektif dibahas secara lebih rinci di
tempat lain (lihat ulasan oleh Okamoto dalam edisi
khusus yang sama).
Pemindahan sesekali komponen sitosol ke
kompartemen lisosom melalui invaginasi langsung
membran lisosom tanpa sekuestrasi sebelumnya ke
dalam autofagosom juga telah diamati. Fenomena ini
dikenal sebagai microautophagy karena sebagian kecil
dari sitoplasma terdegradasi jika dibandingkan dengan
macroautophagy [29]. Studi terperinci tentang
mikroautofagi pada mamalia masih langka, tetapi baru-
baru ini mekanisme dan signifikan telah menarik banyak
perhatian. Mikroautof- agy oleh membran vakuolar pada
beberapa spesies ragi, sepertiPichia pastorisdan
Polimorfa Hansenula, telah dipelajari secara intensif
sebagai sistem model autophagy selektif [30].
Pada tahun 1978 JF Dice melaporkan degradasi selektif
protein sitosol oleh lisosom [31]. Substrat khas untuk sistem
ini, RNase A, kemudian diinvestasikan disimak lebih lanjut.
Untuk penyerapan yang efisien, 20-ami- tidak ada residu
asam dari domain terminal-N yang diperlukan, dan analisis
sistematis lebih lanjut menunjukkan bahwa sinyal degradasi
berada dalam urutan asam amino dari motif KFERQ yang
bertindak untuk memfasilitasi transportasi langsung
substrat melintasi membran lisosom. Baru-baru ini jalur ini
diberi nama chaperon-mediated autophagy (CMA), detail
molekuler dan peran fisiologisnya telah dipelajari secara
intensif oleh AM Cuervo dan disajikan di tempat lain (lihat
ulasan oleh Cuervo dalam edisi ini).
Seperti dijelaskan di atas, autophagy sekarang digunakan sebagai gen-
istilah umum degradasi dalam lisosom/vakuola, tetapi
selanjutnya dalam ulasan ini makroautofagi disebut
hanya sebagai autofagi.
Kesulitan dalam mempelajari autophagy
Untuk waktu yang lama autophagy terutama dianalisis
secara morfologis oleh EM melalui pemeriksaan
autophagosomes dan autophagolysosomes di bagian ultrathin.
Struktur membran terkait lisosom cukup heterogen dalam
bentuk dan isi, dan oleh karena itu interpretasi gambar yang
tepat membutuhkan pengalaman jangka panjang. Sementara
fenomena autophagy dapat diamati dalam sel, selama
bertahun-tahun tidak ada metode yang baik untuk
memperkirakan secara kuantitatif tingkat autophagy. Pelepasan
asam amino, seperti Val atau Leu, dari protein seluler pra-label
sering dipantau sebagai indikator autophagy [32], tetapi sulit
untuk memperkirakan mate seberapa banyak rilis ini benar-
benar mencerminkan autophagic degradasi. Selain itu,
autophagosome adalah organel sementara yang ada selama
kurang dari 10 menit sebelum menyatu dengan lisosom,
menghasilkan munculnya autophagolysosom pada berbagai
tahap degradasi. Oleh karena itu, studi biokimia autophagy juga
menghadirkan tantangan yang signifikan bagi para peneliti.
Meskipun enzim lisosom (terutama protease) telah dipelajari
secara intensif, identifikasi protein membran lisosom telah
berkembang lambat. ATPase tipe-V, pompa proton bertanggung
jawab untuk pengasaman lisosom, adalah contoh khas, yang
diidentifikasi dan dicirikan hanya dalam tahun 1980-an [33].
Tidak perlu disebutkan bahwa di awal tahap penelitian
autophagy bukan protein secara khusus melokalisasi ke
autophagosome atau protein yang diperlukan untuk autophagy
telah diidentifikasi. Dengan demikian, masalah yang paling
penting adalah kurangnya penanda spesifik dari autofa-
gosome atau autophagolysosome untuk studi morfologi dan
biokimia. Oleh karena itu, sistem model yang sederhana dan
baik akan sangat penting untuk menjelaskan mekanisme
molekuler autophagy.
SetelahATGgen
Penemuan autophagy dalam ragi
Dalam ragiS. cerevisiae, vakuola adalah satu-satunya
organel yang terlihat dengan mikroskop fase kontras, dan
berfungsi sebagai kompartemen penyimpanan untuk asam
amino dan ion. Vakuola diasumsikan setara dengan lisosom
pada mamalia, karena merupakan kompartemen asam yang
mengandung berbagai jenis enzim hidrolitik [34]. Ketika sel
ragi ditantang oleh kondisi kekurangan nitrogen, sporulasi
dan pembelahan sel meiosis diinduksi. Jelas bahwa proses
diferensiasi dan remodeling sel yang luar biasa ini tanpa
adanya pasokan nitrogen harus
Penelitian Sel | Vol 24 No 1 | Januari 2014

membutuhkan degradasi protein massal dari protein sel itu
sendiri. Vakuola adalah kompartemen yang cukup besar
(diameter ca 3 m) indeks bias rendah karena sangat rendah
kandungan protein. Jika mutan yang kekurangan proteinase
vakuolar mengalami kekurangan nitrogen, bahan yang dikirim
ke vakuola dapat diamati karena pemblokiran degradasi normal.
Memang Y Ohsumi menemukan perubahan morfologis yang
dramatis dalam vakuola saat kelaparan. Setelah 30 menit
kelaparan, benda-benda bulat yang bergerak dengan penuh
semangat muncul di vakuola, yang secara bertahap meningkat
jumlahnya dan akhirnya mengisi vakuola [35]. EM
mengungkapkan bahwa badan-badan ini, yang disebut badan
autophagic, adalah vesikel terikat membran tunggal dengan
diameter rata-rata 500 nm dan menutupi sebagian sitoplasma,
mengandung ribosom dan kadang-kadang berbagai struktur
sitoplasma seperti mitokondria [36].
Perkembangan autophagy karenanya dapat
dipantau oleh akumulasi badan autophagic di
vakuola di bawah mikroskop cahaya. Dalam sel tipe
liar, tubuh ini segera dihancurkan oleh hidrolase
vakuolar.
Selanjutnya, studi EM oleh M Babadkk. mengungkapkan
struktur membran ganda dengan ukuran yang sama dengan
badan autophagic di sitoplasma, autophagosome ragi, dan
juga fusi antara membran luar autophagosome dan
membran vakuolar [37]. Fusi ini menghasilkan tubuh
autophagic terikat membran tunggal, di lumen vakuolar.
Rangkaian dinamika membran ini secara topologi persis
sama dengan proses autophagy pada mamalia kecuali
bahwa vakuola jauh lebih besar daripada lisosom. Segera
setelah proses yang sama terbukti diinduksi dalam kondisi
karbon-, sulfat-, fosfat- dan kelaparan asam amino
auxotrophic tunggal [35]. Analisis EM dari autophagosomes
dan badan autophagic mengungkapkan beberapa fitur unik
untuk membran ini. Pada gambar bagian tipis, membran
autofagosom berlapis ganda lebih tipis daripada membran
organel lainnya dan terkait erat tanpa ruang antar
membran. Juga, gambar fraktur beku telah menunjukkan
keberadaan partikel intramembran yang terbatas di
membran luar, sedangkan hampir tidak ada satupun yang
diamati di membran dalam, menunjukkan bahwa kedua
membran dibedakan dan bahwa membran autofagosom
terspesialisasi untuk penyerapan sebagian. sitoplasma [37].
Selama studi morfologi, T Noda di laboratorium Ohsumi
mengembangkan uji elegan aktivitas autophagic dalam ragi
[38]. Sementara penurunan protein sitoplasma oleh
autophagy sulit untuk diukur, kekuatan sistem ini adalah
dalam pengukuran peningkatan aktivitas enzim yang
bergantung pada autophagy. Dengan membangun sel yang
menyimpan bentuk pro rekayasa fosfatase vakuolar
www.cell-research.com | Penelitian Sel
Yoshinori Ohsuminpg
13
di sitosol (Pho8∆60), pematangan enzim ini dapat
dipantau karena diambil ke dalam autofagosom,
diangkut ke dalam vakuola oleh autofagi dan selanjutnya
diproses menjadi enzim aktif. Peningkatan aktivitas ini
membentuk reporter aktivitas autophagic, yang misalnya
meningkat secara dramatis selama kondisi yang memicu
autophagy seperti kelaparan. Perkembangan penting ini
memungkinkan estimasi aktivitas autophagy yang
sederhana namun andal secara kuantitatif.
Analisis genetik autophagy
Y Ohsumi selanjutnya mengadopsi pendekatan genetik
untuk membedah proses autophagic. Pada saat itu tidak ada
yang diketahui tentang peran fisiologis autophagy, atau
memang fenotipe mutan autophagy-defective dalam ragi.
Pendekatan sederhana Tsukada, menggunakan seleksi
mikroskopis cahaya untuk mendapatkan mutan yang gagal
mengakumulasi tubuh autophagic dalam kondisi
kekurangan nitrogen, menghasilkan mutan cacat autophagy
pertama,apg1 [39]. Mutan itu memang cacat dalam
degradasi protein yang diinduksi kelaparan, dan diploid
homozigotnya cacat sporulasi. Namun, itu tumbuh secara
normal dalam media yang kaya dan tidak menunjukkan
cacat yang jelas dalam berbagai fungsi termasuk sekresi dan
endositosis. Satu fenotipe yang jelas, bagaimanapun, adalah
bahwaapg1 sel mutan mati ketika mengalami kelaparan
nitrogen dalam waktu lama [39]. Untuk mendapatkan lebih
lanjutapgmutan hilangnya fenotipe viabilitas ini digunakan
sebagai layar utama, dengan kandidat awal selanjutnya
diperiksa dengan metode mikroskopis yang dijelaskan di
atas sebagai layar sekunder, menghasilkan identifikasi
sekitar seratus mutan autophagydefective. Analisis genetik
iniapgmutan mengungkapkan 15 kelompok pelengkap [39].
Mutan ini menunjukkan fenotipe yang sangat mirip dengan
apg1dan sebaliknya tidak dapat dibedakan satu sama lain.
Analisis EM menunjukkan bahwa mutan ini ditandai dengan
cacat dalam pembentukan autophagosome. Strategi
penyaringan didasarkan pada asumsi bahwa autophagy
tidak penting untuk pertumbuhan sel, dan karenanya semua
mutasi ini tidak memengaruhi pertumbuhan vegetatif dalam
media yang kaya. Hilangnya fenotipe viabilitas disebabkan
oleh hilangnya autophagy yang diinduksi kelaparan, yang
menunjukkan bahwa iniapgmutan mewakili mutasi nol.
Harus ditekankan bahwa layar pertama sangat efektif,
menghasilkan isolasi sebagian besar gen penting untuk
autophagy, sangat memfasilitasi studi molekuler autophagy
berikutnya [40].
Sekitar waktu yang sama M Thumm mengisolasi enam
autophagy-cacatotomutan dengan menyaring koloni
yang rusak dalam degradasi enzim sitoplasma
menggunakan pewarnaan antibodi [41]. D Klionsky, yang
awalnya tertarik pada pengangkutan enzim vakuolar
npgLandmark sejarah penelitian autophagy
14
-aminopeptidase I ke vakuola, yang dikenal sebagai Cvt
jalur, mengisolasi banyak mutan yang rusak dalam
pengangkutan enzim ini [42]. Studi mikroskopis elektron
dari jalur ini mengungkapkan bahwa ia terdiri dari
dinamika membran yang hampir sama persis dengan
makroautofagi [43], dan oleh karena itu jalur Cvt telah
dipelajari sebagai model yang sangat baik dari autofagi
selektif, meskipun merupakan jalur konstitutif dan
biosintetik dari enzim vakuolar. daripada jalur degradatif.
Kelompok Dr Klionsky berhasil mengisolasi sejumlahcvt
mutan rusak di jalur ini, yang ternyata sebagian besar
alel untukapgmutan (lihat di bawah, dan juga ditinjau
oleh Klionsky dalam edisi ini).
Beberapa kelompok juga menilai autophagy pada spesies
ragi yang berbeda, memperoleh mutan yang mereka beri
nama mereka sendiri, misalnya penamaan gen setelah
autophagy selektif yang dimediasi glukosa [44, 45], dan
degradasi peroksisom (PAG[30],PAZ[46],dan PDD[47]).
Situasi membingungkan ini diselesaikan dengan
menggunakan baru, uni- sistem tata nama gen, denganATG
gen yang digunakan untuk menamai gen autophagy (lihat
ulasan oleh Klionsky dalam edisi ini). Sekarang jumlahATG
gen telah meningkat menjadi lebih dari 37, terdiri dari
serangkaian gen yang bertanggung jawab untuk mesin inti
autophagosome pembentukan serta gen-gen yang
dibutuhkan secara khusus untuk mode autophagy selektif.
Isolasi dan karakterisasi gen autophagy
Kloning dariATGgen dilakukan dengan menyaring
perpustakaan genom untuk fragmen DNA yang melengkapi
fenotipeatgmutan. Kelompok pertama Ohsumi iso-
terlambatATG1, kemudianATG5,ATG6,ATG13dan seterusnya
[48]. Pemeriksaan urutan asam amino Atg1 menunjukkan
bahwa protein ini adalah protein kinase Ser/Thr [49]. ATG6
ditemukan alel untukVPS30[50], yaitu diidentifikasi pada
waktu yang hampir bersamaan, sebagai faktor penting
untuk jalur penyortiran protein vakuolar (Vps). Tapi semua
lainnyaATGgen ternyata gen yang tidak diketahui pada saat
itu, menunjukkan bahwa sebagian besar gen yang secara
khusus terlibat dalam autophagy belum pernah diselidiki
bahkan dalam ragi. Sebelum penyatuan nomenklatur,
Thumm juga mengkloningAUTOgen [41], sedangkan
kelompok Klionsky memperoleh beberapaCVTgen [42].
Karena ketersediaan urutan genom lengkap yang
dimungkinkan oleh ragi proyek genom, proses identifikasi
ATG gen sangat dipercepat, dan sebagian besarATGgen
dikloning dalam waktu yang sangat singkat. Namun, urutan
primer yang diprediksi menawarkan sedikit petunjuk
tentang fungsi protein yang disandikan.
Ketika kloningATGgen mendekati kesimpulan,
hubungan antara protein Atg dijelaskan dalam waktu
singkat, mengungkapkan bahwa fungsi protein
dalam beberapa unit fungsional seperti yang diuraikan di bawah ini.
Sistem konjugasi Atg12
Temuan mencolok pertama adalah penemuan ubiq-
sistem konjugasi protein mirip uitin oleh N Mizushima [51].
Investigasi Atg12 dengan analisis western blot menunjukkan
pita dengan berat molekul tinggi selain pita yang sesuai
dengan ukuran molekul yang diprediksi dari Atg12. Pita
massa molekul tinggi ini tidak diamati padaatg5,atg7, atau
atg10 mutan. Studi lebih lanjut mengungkapkan basis
molekuler dari fenomena ini. Atg12 adalah molekul mirip
ubiquitin yang unik, 2,5 kali lebih besar dari ubiquitin, dan
disintesis sebagai bentuk aktif tanpa pemrosesan C-
terminusnya. Terminal C gli- cine dari Atg12 pertama kali
diaktifkan oleh enzim E1 Atg7, dan kemudian ditransfer ke
enzim E2, Atg10, sebelum akhirnya membentuk konjugat
dengan Atg5 melalui isopeptida ikatan dengan residu lisin di
tengah Atg5 [51]. Konjugat Atg12-Atg5 ini sangat penting
untuk autophagy. Atg16 segera ditemukan untuk bertindak
sebagai protein yang diperlukan untuk dimerisasi dua
konjugat Atg12-Atg5 melalui kemampuannya untuk
berinteraksi dengan konjugat Atg12-Atg5 dan membentuk
homodimer Atg16 [52, 53]. Peran yang tepat dari konjugat
Atg12-Atg5 masih belum jelas, tetapi diketahui bahwa ia
memainkan peran penting dalam sistem Atg8, seperti yang
dijelaskan di bawah ini.
Sistem lipidasi Atg8
Segera setelah identifikasi sistem konjugasi Atg12, sistem
konjugasi lain ditemukan di antara protein Atg. Atg8 adalah
protein hidrofilik kecil dan ekspresinya diregulasi saat
kelaparan [54]. Lokalisasi intraseluler Atg8 berubah saat
kelaparan dan setidaknya sebagian terlokalisasi ke
autophagosome dan membran tubuh autophagic [54]. Oleh
karena itu, Atg8 menawarkan janji besar sebagai penanda
yang baik dari membran autofagosom dan molekul kunci
selama pembentukan autofagosom. Studi biokimia
mengungkapkan bentuk Atg8 yang terkait erat dengan
membran [54], dan pekerjaan tambahan menggambarkan
peran unik sistem modifikasi seperti di mana-mana [55].
Atg8 adalah sin- berukuran sebagai prekursor, dan
kemudian diproses oleh protease sistein baru, Atg4, menjadi
bentuk terekspos glisin C-terminal. Setelah ini, Atg8 yang
diproses diaktifkan oleh enzim E1 Atg7, sebelum bagian
Atg8 ditransfer ke enzim E2 Atg3. Atg8 tidak menunjukkan
bentuk yang dimodifikasi ketika dianalisis dengan SDS-PAGE
konvensional, tetapi spektrometri massa membran ketat
bentuk modifikasi terikat dari Atg8 membuktikan bahwa
Atg8 membentuk a konjugasi dengan kelompok kepala
fosfolipid membran, phosphatidylethanolamine (PE). Oleh
karena itu, target sistem konjugasi ini bukanlah protein,
tetapi
Penelitian Sel | Vol 24 No 1 | Januari 2014

benar-benar fosfolipid. Enzim pemrosesan Atg4 juga
memotong Atg8-PE, sehingga bertindak sebagai enzim
dekonjugasi [56], yang memang terbukti penting untuk
pembentukan autofagosom [55]. Jumlah Atg8-PE
menentukan ukuran autophagosome, menunjukkan
bahwa Atg8-PE terlibat dalam langkah perpanjangan
pembentukan membran isolasi [57].
Atg7 adalah enzim E1 unik yang mengaktifkan dua
molekul mirip ubiquitin, Atg12 dan Atg8, dan
mentransfernya ke enzim E2 yang berbeda. Baru-baru ini
Nodadkk.melaporkan dasar struktural untuk aksi enzim
ini [58]. Seperti yang disarankan oleh enzim E1 yang
umum, kedua sistem konjugasi ini berfungsi dalam
hubungan yang erat [58], dan terbukti bahwa sistem
Atg12 diperlukan untuk pembentukan Atg8-PE [55].
Faktanya, Atg12-Atg5 berfungsi sebagai enzim mirip E3
untuk meningkatkan reaksi lipidasi Atg8 [59, 60]. Dasar
struktural aktivasi Atg3 oleh konjugat Atg12-Atg5 juga
baru-baru ini telah dijelaskan [60].
Temuan ini menunjukkan bahwa di antaraAtgproduk
gen delapan protein Atg terlibat dalam reaksi konjugasi
ini. Peran yang tepat dari bentuk lipid dari Atg8 dalam
pembentukan autophagosome belum dijelaskan, tetapi
telah diamati bahwa Atg8-PE terlibat dalam penambatan
dan hemi-fusi vesikel membran.in vitro, dan analisis
mutasi menunjukkan bahwa aktivitas ini diperlukan
untuk pembentukan autophagosomein vivo[61].
Kompleks atg1 kinase
ATG1, yang pertamaATGgen diidentifikasi, mengkodekan
Ser/Thr kinase penting untuk autophagy [49]. Atg13, yang
mengikat Atg1, sangat terfosforilasi oleh TORC1 kinase dalam
kondisi pertumbuhan, dan pada kelaparan atau rapamy-
pengobatan cin dengan cepat mengalami defosforilasi [62]. afin-
itas Atg13 untuk Atg1 meningkat ketika defosforilasi ini terjadi,
dan ikatan yang dihasilkan meningkatkan kinase aktivitas Atg1.
Atg17 selanjutnya diidentifikasi sebagai pengikat mitra Atg1-
Atg13 [63], dan Atg29 dan Atg31 ditemukan berinteraksi dengan
Atg17 [64]. Atg17, Atg29, dan Atg31 membentuk kompleks 1:1:1
yang stabil terlepas dari kondisi nutrisi [65, 66]. Setelah
kelaparan, Atg13-Atg1 membentuk kompleks pentamerik
dengan Atg17-Atg31-Atg29, yang berfungsi sebagai perancah
untuk perekrutan lebih lanjut dari protein Atg lainnya. Atg17,
Atg29, dan Atg31 secara khusus diperlukan untuk autophagy
yang diinduksi kelaparan, tetapi tidak untuk jalur Cvt. Atg1
memainkan peran sentral dalam kompleks perancah, tetapi
aktivitas kinasenya tidak diperlukan untuk perakitan ini.
Kompleks PI-3K dan Atg18-Atg2
Tak lama setelah identifikasi dua konjugasi sistem,
kelompok Ohsumi menemukan esensi kompleks PI-3K
www.cell-research.com | Penelitian Sel
Yoshinori Ohsuminpg
15
penting untuk autophagy [50]. Ragi memiliki PI-3K tunggal,
Vps34, yang membentuk dua kompleks. Kompleks I
diperlukan untuk autophagy, sedangkan kompleks II
diperlukan untuk jalur Vps. Kompleks I terdiri dari Vps34,
Vps15, Vps30/ Atg6 dan Atg14, sedangkan kompleks II berisi
Vps38 bukan Atg14. Tiga subunit yang umum antara dua
kompleks, dan spesifisitas fungsional disediakan oleh
kehadiran Atg14 atau Vps38 untuk masing-masing jalur.
Atg14 dan Vps38 menentukan lokalisasi kompleks kinase
[67]. Baru-baru ini subunit baru Kompleks I, Atg38,
dilaporkan [68]. PI3P, produk dari PI-3K, ditemukan penting
untuk pembentukan autophagosome dan berada pada
membran autophagosomal, lebih disukai pada membran
bagian dalam autophagosome [69]. PI3P diperkirakan
merekrut protein efektor yang diperlukan untuk
pembentukan autophagosome.
Atg18 mengikat PI3P dan PI3,5P2 dan memiliki dua fungsi
berbeda, berperan dalam morfologi autophagy dan vacuolar.
Ketika terikat pada PI3,5P2, Atg18 penting untuk pengaturan
ukuran vakuolar, sementara sebagian dari Atg18 membentuk
kompleks dengan Atg2 dan berfungsi dalam pembentukan
autophagosome dengan cara yang bergantung pada PI3P [70,
71]. Penentuan lokasi produksi PI3P yang tepat oleh Kompleks I,
dan peran kompleks Atg2-Atg18 merupakan masalah penting
yang harus dijawab dalam penelitian yang sedang berlangsung.
Atg9
Di antara protein Atg, Atg9 adalah satu-satunya protein
membran multispanning yang penting untuk pembentukan
autophagosome [72], dan oleh karena itu telah dipostulasikan
bahwa protein ini memainkan peran kunci dalam pengiriman
lipid membran yang diperlukan untuk pembentukan
autophagosome dengan mendaur ulang antara reservoir yang
belum teridentifikasi. dan membran isolasi. Namun, karya
terbaru oleh H Yamamotodkk. melaporkan bahwa mayoritas
Atg9 ada pada vesikel membran sitoplasma kecil yang bergerak
yang berasal dari aparatus Golgi dalam proses yang bergantung
pada Atg23 dan Atg27 [73]. Sejumlah kecil vesikel ini
berpartisipasi pada tahap awal pembentukan autofagosom,
menghasilkan situs nukleasi untuk biogenesis membran, seperti
yang dibahas di bawah ini.
Mode autophagy lainnya dalam ragi
Jalur Cvt sebagai model autophagy selektif
D Klionsky telah bekerja selama bertahun-tahun di
jalur transportasi sitoplasma-ke-vakuola, yang dikenal
sebagai jalur Cvt, yang bertanggung jawab untuk
pengiriman protein penduduk vacuolar, -aminopeptidase
I dan -mannosidase 1 [74]. Meskipun jalur Cvt adalah
jalur konstitutif dan biosintetik, gen esensial
npgLandmark sejarah penelitian autophagy
16
untuk jalur ini (CVTgen) ditemukan sama denganAPGgen.
Analisis mikroskopis elektron membuktikan bahwa
dinamika membran dari jalur Cvt sangat mirip dengan
makroautofagi, yang konsisten dengan kebutuhannya
untuk sebagian besar mesin Atg [43, 75]. Perbedaan
yang paling jelas adalah ukuran struktur membran
ganda dari dua jalur ini: vesikel Cvt, yang secara
fungsional sesuai dengan au- tophagosomes dan secara
khusus membungkus kompleks Cvt (kompleks
-aminopeptidase 1 dan virus mirip virus Ty1 par- ticles)
[76] dengan pengecualian protein sitoplasma, jauh lebih
kecil (berdiameter sekitar 150 nm) daripada au-
tofagosom (sekitar 500 nm). Sifat spesifik dari Cvt jalur
berarti berfungsi sebagai sistem model yang baik untuk
mempelajari autophagy selektif. Selain kebutuhan- untuk
mesin autophagy inti, beberapa spesifik faktor untuk
jalur Cvt diidentifikasi. Di antaranya, Atg19 dan Atg34
adalah protein reseptor dari se- kargo pilihan
-aminopeptidase 1 dan -mannosidase 1, masing-masing
[77]. Identifikasi Atg11, yang berfungsi sebagai protein
perancah yang menyatukan protein inti Atg dan target
degradasi selektif, merupakan perkembangan penting
dalam bidang autofagi selektif [78, 79].
Dalam kondisi kelaparan, kompleks Cvt secara istimewa
tertutup oleh autofagosom, menunjukkan bahwa bahkan
autofagi non-selektif memiliki beberapa preferensi target
untuk diasingkan ke dalam autofagosom.
Mitophagy dan Pexophagy
Degradasi selektif peroksisom dalam ragi metilotrofik,
seperti:P. pastorisdanH. polimorfa, juga telah dipelajari
dengan baik [80]. Peroksisom ragi ini sangat berkembang
biak ketika mikroorganisme dikultur dalam medium yang
mengandung metanol sebagai satu-satunya sumber karbon.
Ketika sel-sel ini diubah menjadi etanol atau glukosa,
peroksisom yang berproliferasi didegradasi oleh autophagy.
W Dunn menunjukkan bahwaP. pastoris menggunakan
mode yang berbeda dari autophagy, macroautophagy dan
microautophagy, tergantung pada sumber karbon [81].
Autophagy selektif dari peroksisom yang berproliferasi
membutuhkan beberapa faktor spesifik untuk pexophagy
[80]. Baru-baru ini, studi tentang degradasi selektif
mitokondria (mitofag) dalam ragi mengidentifikasi
mitochon- protein membran drial, Atg32, yang memainkan
peran penting dalam pergantian organel ini [82, 83].
Mesin inti pembentukan autophagosome dalam ragi
Seperti dibahas di atas, 18 protein Atg penting untuk
autophagy non-selektif yang diinduksi kelaparan diidentifikasi
Fied dalam waktu singkat dan dibagi menjadi enam fungsional
unit: Atg1 kinase dan regulatornya, kompleks PI-3k, the
Sistem konjugasi Atg12, sistem lipidasi Atg8, Atg9 dan
kompleks Atg18-Atg2. Protein Atg ini berfungsi dengan cara
yang sangat erat dalam proses pembentukan
autophagosome. Masalah berikutnya yang memerlukan
penyelidikan adalah bagaimana dan di mana protein ini
berfungsiin vivo. K Suzuki di laboratorium Ohsumi
menyelidiki lokalisasi protein Atg dengan menghasilkan fusi
protein Atg dengan GFP dan secara visual menyelidiki
perilaku intraselulernya menggunakan mikroflora
fluoresensi. salinan [84]. Atg8-GFP adalah protein Atg
pertama yang divisualisasikan dialisasi sedemikian rupa,
muncul sebagai struktur titik perivacuolar, di mana sebagian
besar protein Atg kemudian ditunjukkan setidaknya
sebagian berkolokasi. Struktur titik ini dapat dideteksi
bahkan dalam keadaan tertentuatgmutan, menunjukkan
bahwa itu bukan membran isolasi atau autophagsome, dan
karena itu dinamai struktur pre-autophagosomal (PAS),
mengacu pada perannya sebagai perakitan protein Atg yang
memediasi pembentukan autophagosome [84]. Sebagian
besar hanya satu PAS per sel yang diamati bahkan dalam
kondisi kelaparan. Tidak diketahui bagaimana dan mengapa
PAS dalam ragi dikaitkan dengan membran vakuolar.
Organisasi PAS dianalisis secara sistematis dengan
mengukur perekrutan PAS dari setiap protein Atg tanpa
adanya setiap protein Atg.ATGgen [85, 86]. Analisis ini
menunjukkan adanya hubungan hierarkis antar unit
fungsional. Penemuan PAS merupakan tonggak penting
dalam deskripsi hubungan epistatik antara unit fungsional
protein Atg dan pembuktian mesin molekuler.in vivo[86, 87].
Studi terbaru telah mengungkapkan bahwa hierarki ini
kembali mencerminkan urutan protein Atg direkrut ke PAS [86,
87]. Saat kelaparan, penghambatan TORC1 kinase menghasilkan
defosforilasi Atg13, yang berikatan dengan Atg1, dan
membentuk kompleks perancah, Atg1-Atg13/ Atg17-Atg31-
Atg29. Kompleks ini berkumpul di sebuah situs di membran
vakuolar, setelah itu sejumlah kecil vesikel Atg9 bergabung
dengan PAS melalui interaksi antara Atg17 dan Atg9. Setelah ini
tidak ada vesikel Atg9 lebih lanjut yang bergabung dengan PAS,
menunjukkan bahwa vesikel Atg9 bukanlah sumber lipid utama
untuk membran autophagosomal. Selanjutnya, kompleks PI-3K I
direkrut ke PAS, dan kompleks Atg2-Atg18 bergabung dengan
PAS melalui pengikatan Atg18 ke PI3P. Kompleks Atg12-Atg5-
Atg16 juga melokalisasi ke PAS dengan cara yang bergantung
pada PI3P, meskipun ini tidak tergantung pada pengikatan
Atg2-Atg18. Akhirnya, kompleks Atg12-Atg5-Atg16 memfasilitasi
pembentukan Atg8-PE di PAS, yang diperlukan untuk perluasan
membran isolasi. Oleh karena itu, semua protein Atg diatur ke
PAS secara terpadu dan diatur secara temporal untuk
menghasilkan membran prekursor yang diperlukan untuk
pembentukan membran isolasi.
Awalnya PAS didefinisikan oleh fluoresensi mi-
Penelitian Sel | Vol 24 No 1 | Januari 2014

kroskopi sebagai struktur titik yang mewakili perakitan protein Atg [84].
Karena dalam ragi jalur Cvt secara konstitutif aktif, PAS dibentuk dengan
cara yang bergantung pada Atg11 di bawah kondisi pertumbuhan,
dengan Atg11 menjadi penting untuk jalur Cvt tetapi tidak untuk
makroautofagi. Dengan tidak adanya Atg11, dinamika perakitan PAS
yang diinduksi kelaparan menjadi mudah dideteksi. Diatg11∆ PAS tidak
terlihat dalam kondisi pertumbuhan, tetapi cepat diinduksi oleh
kelaparan atau pengobatan rapamycin [79]. Namun, PAS juga diamati
untuk segera dibongkar setelah penambahan nutrisi yang sel-sel awalnya
kelaparan. Sekarang diperkirakan bahwa PAS sebenarnya bukan hanya
perakitan stoikiometrik protein Atg, melainkan struktur dinamis yang
berubah dalam komposisi dari waktu ke waktu dan pada berbagai tahap
sebelum pembentukan membran isolasi. Jumlah molekul protein Atg
yang berasosiasi dengan PAS telah terbukti bervariasi dari selusin hingga
beberapa ratus [88], sedangkan jumlah Atg8 diketahui berosilasi setiap
10 menit [57]. Menariknya, sebuah penelitian baru-baru ini menyarankan
bahwa pada tahap awal pembentukan autophagosome, vesikel Atg9
direkrut ke PAS, yang berarti bahwa PAS ada pada semacam membran
prekursor sebelum pembentukan membran isolasi. Banyak protein Atg di
PAS dapat mengubah pasangan yang berinteraksi selama proses ini
sebelum munculnya membran isolasi, dan memainkan peran lebih lanjut
saat membran isolasi mengembang. Dinamika spatiotemporal protein
Atg seperti itu dapat diatur oleh fosforilasi atau defosforilasi. Sejauh ini
PAS dalam ragi belum diamati oleh EM, dan terlalu kecil untuk dibedakan
dari membran isolasi atau autofagosom dengan mikroskop fluoresensi.
Dinamika spatiotemporal protein Atg seperti itu dapat diatur oleh
fosforilasi atau defosforilasi. Sejauh ini PAS dalam ragi belum diamati
oleh EM, dan terlalu kecil untuk dibedakan dari membran isolasi atau
autofagosom dengan mikroskop fluoresensi. Dinamika spatiotemporal
protein Atg seperti itu dapat diatur oleh fosforilasi atau defosforilasi.
Sejauh ini PAS dalam ragi belum diamati oleh EM, dan terlalu kecil untuk
dibedakan dari membran isolasi atau autofagosom dengan mikroskop
fluoresensi.
Perkembangan pesat studi autophagy
Gen ATG pada organisme lain
Selama berada di lab Ohsumi, N Mizushima mulai mencari
homolog dariATG12pada manusia. Setelah mengidentifikasi
calon homolog dengan pencarian basis data, ia berhasil
menunjukkan bahwa hAtg12 membentuk konjugat dengan
hATG5 [89], mirip dengan konjugasi Atg12 ke Atg5 dalam ragi,
yang menunjukkan sistem terkonservasi dengan baik di seluruh
eukariota. Rekanan dari Atg16, hATG16L, juga ditemukan dan
ditandai dengan adanya perpanjangan terminal-C yang panjang
dari pengulangan WD. Atg16L manusia memfasilitasi
pengikatan dua konjugat Atg12-Atg5 dengan membentuk
dimer, seperti yang diamati pada ragi [90].
T Yoshimori, juga di laboratorium Ohsumi pada waktu itu,
sedang menyelidiki LC3, homolog mamalia dari Atg8, dan
menemukan dua bentuk: LC3-I, suatu bentuk olahan dari
LC3 yang baru lahir oleh homolog ragi Atg4, hATG4, dan
www.cell-research.com | Penelitian Sel
Yoshinori Ohsuminpg
17
LC3-II, bentuk lipidated seperti Atg8-PE dalam ragi [91].
Yoshimori mengamati bahwa LC3-II melokalisasi ke au-
membran tophagosomal, yang memberikan kebaikan
pertama penanda membran autophagosomal pada
mamalia. Selain itu, jumlah LC3-II berkorelasi dengan
jumlah autofagosom, yang telah digunakan sebagai
indikator autofagi. Seperti ragi Atg8, LC3 melokalisasi ke
struktur perantara serta autofagosom lengkap, dan
dengan demikian sebagian LC3 dikirim ke lisosom.
Sementara itu, kompleks Atg12-Atg5-Atg16L hanya
berada pada permukaan cembung dari membran isolasi
dan berdisosiasi dari membran setelah autophagosome
selesai [92, 93]. Oleh karena itu, GFP-Atg5 berhasil
digunakan sebagai penanda yang baik untuk struktur
tahap awal pembentukan autofagosom.
Selain protein Atg dari dua konjugasi sistem,
protein Atg lainnya telah diidentifikasi dalam mam-
mal. Proses ini memakan waktu karena kesamaan
urutan asam amino yang agak rendah antara ragi dan
homolog mamalia. Tetapi pada akhirnya hampir
semua protein ragi Atg ditemukan pada mamalia. Ini
termasuk kompleks ULK1 [94], kompleks PI-3k [95-97],
Atg9 [98], kompleks WIPI-Atg2 [99], dan dua sistem
konjugasi. Pelestarian unit fungsional ini dengan kuat
menunjukkan bahwa mekanisme dasar autophagy
diperoleh pada tahap awal evolusi eukariotik dan
sejak itu telah dilestarikan, fakta yang secara
signifikan telah memfasilitasi studi lebih lanjut
tentang autofagi pada mamalia.
Berbeda dengan ragi, di mana satu gen mengkode setiap
protein Atg, banyak protein Atg pada eukariota yang lebih
tinggi, seperti Atg1, Atg14, Atg2, Atg18, Atg16 dan Atg8 dicirikan
oleh paralogi, kemungkinan besar timbul oleh gen acara
duplikasi. Diversifikasi ini dapat menjadi cerminan tion sifat
autophagy yang semakin kompleks dalam sel mamalia,
mungkin karena regulasi lebih lanjut atau peran khusus untuk
setiap paralog dalam beragam mode autophagy ditemukan di
antara berbagai jenis jaringan dan sel. Sementara Atg17, Atg29,
dan Atg31 dalam ragi tidak memiliki homolog pada mamalia,
protein mamalia FIP200 dan Atg101 tampaknya melakukan
fungsi yang serupa. Meskipun protein tambahan yang
diperlukan untuk autophagy pada mamalia kembali utama
untuk diidentifikasi, jelas bahwa hierarki dasar urutan acara
telah dilestarikan [100] (lihat detail dalam ulasan oleh Klionsky
dalam edisi ini).
Manipulasi genetik autophagy pada mamalia
Segera setelah penemuan sistem konjugasi Atg12 pada
tikus, N Mizushima berhasil menghasilkan tikus transgenik
yang secara sistemik mengekspresikan GFP-LC3,
pengamatan mikroskop fluoresensi yang memungkinkan
visualisasi autophagosome yang mudah. GFP-pos-
npgLandmark sejarah penelitian autophagy
18
struktur itive sesuai dengan autophagosomes dan
autophagolysosomes, sehingga di mana dan berapa banyak
autophagy terjadi di seluruh tubuh dapat dinilai.
Menggunakan model tikus ini, Mizushima menunjukkan
bahwa selama puasa setiap organ ditandai oleh perbedaan
dalam kinetika dan tingkat induksi autophagy [93, 101].
Mizushima juga berhasil membuat mouse pertama tersingkir
karenaAtggen, yaitu Atg5 [102]. Tikus ini mampu menghasilkan
keturunan pada tingkat normal, tetapi bayi tikus mati dalam
waktu 24 jam setelah lahir, menunjukkan bahwa autophagy
sangat penting untuk bertahan hidup selama tahap
perkembangan neonatal pada mamalia. Tikus knockout GFP-LC3
transgenik dan Atg5 ini terbukti sangat kuat dalam mendeteksi
dan menyelidiki fisiologi signifikansi kal autophagy pada
mamalia bahwa mereka didistribusikan ke seluruh dunia,
berkontribusi banyak pada pemahaman kita tentang autophagy
pada mamalia melalui penggunaannya dalam penelitian.
Hingga saat ini gangguan sembilanAtggen telah
dilaporkan pada tikus yang dimodifikasi secara genetik.
Di antara tikus knockout ini, fenotipe tikus knockout
Atg3, Atg7, Atg9 dan Atg16L1 mirip dengan Atg5,
sedangkan tikus knockout Beclin 1, Ambra1, dan FIP200
tidak dapat menghasilkan keturunan homozigot karena
kematian embrio awal, menunjukkan bahwa gen ini
memiliki fungsi lain selain autophagy [103]. Sementara
tikus KO ULK1 mengalami gejala anemia ringan.
IdentifikasiATGgen kemudian dilakukan dalam berbagai
organisme, umumnya dengan pencarian basis data sederhana
atau dengan mencari molekul yang berinteraksi dengan protein
Atg yang diketahui. GangguanATGgen juga dimulai pada
organisme model sepertiDrosophila. Kelompok Ohsumi dan D
Vierstra paling banyak diidentifikasiATG homolog gen dalam
organisme model tumbuhan tingkat tinggi,Arabidopsis thaliana,
dan menunjukkan gen-gen ini juga berpartisipasi dalam
autophagy pada tanaman [104, 105], memperkuat peran
autophagy yang sangat dilestarikan dan mendasar dalam
kehidupan eukariotik.
Baru-baru ini, pendekatan genetika maju untuk
identifikasi gen autophagy diCaenorhabditis elegans
mengungkapkan bahwa selain diketahuiATGhomolog gen,
beberapa gen baru penting untuk autophagy hadir dalam
organisme ini [106]. Beberapa gen baru ini dilestarikan pada
eukariota yang lebih tinggi, menunjukkan bahwa evolusi
telah melihat munculnya gen autophagy tambahan di antara
eukariota yang lebih tinggi (lihat ulasan oleh Zhang dalam
edisi ini).
Peran penting autophagy pada eukariota yang lebih tinggi
Seperti dijelaskan di atas, autophagy adalah mekanisme
penting untuk bertahan hidup melalui perannya dalam daur
ulang protein dan makromolekul. Namun, lipid (badan lipid)
serta lipid membran), asam nukleat, dan karbohidrat
juga dikirim ke lisosom/vakuola selain protein melalui
autophagy. Ini menggarisbawahi bukti yang
menunjukkan bahwa autophagy harus berkontribusi
langsung pada metabolisme sel dengan memasok blok
bangunan seluler serta sumber energi.
Di sisi lain, kemajuan terbaru dalam penelitian autophagy
di berbagai organisme telah mengungkapkan peran penting
autophagy lainnya. Untuk memahami peran autophagy
dalam organ atau jaringan tertentu, banyak tikus knockout
spesifik jaringan telah dihasilkan. Generasi Mizushima- ed
tikus knockout sel khusus sel saraf di mana tingkat basal
autophagy di otak sangat berkurang. Hal ini menyebabkan
akumulasi protein di mana-mana dan p62, keduanya dikenal
sebagai muatan spesifik autophagy pada mamalia, dan
akhirnya mengakibatkan neurodegenerasi [107]. Komatsu
dalam kelompok Kominami menunjukkan bahwa tidak
adanya autophagy di jaringan hati menyebabkan hipertrofi
hati dan pembentukan tumor [108]. Mizushima juga berhasil
menunjukkan bahwa autophagy diinduksi pada saat
pembuahan dan diperlukan untuk perkembangan embrio
awal pada tikus dengan menggunakan oosit yang
sepenuhnya kehabisan Atg5 [109]. Karena karya-karya
penting ini, banyak penelitian tentang tikus knockout terus
memberikan wawasan penting tentang banyak fungsi
fisiologis autophagy, menunjukkan peran penting
autophagy di luar pasokan nutrisi. Degradasi itu sendiri atau
penghapusan bahan berbahaya atau berlebihan dari
sitoplasma dimediasi oleh autophagy dan sangat penting
untuk kehidupan. Pada organisme multiseluler proses
pembelahan sel memakan waktu lebih lama jika
dibandingkan dengan eukariota uniseluler seperti ragi;
peningkatan rentang hidup seluler ini menciptakan
kebutuhan yang lebih besar untuk kontrol kualitas
intraseluler yang ketat, yang dikenal sebagai pembersihan.
Sel saraf adalah contoh ekstrim, karena sel-sel ini tidak
membelah dan sebaliknya dipertahankan sepanjang hidup
organisme, sangat menekankan perlunya pemeliharaan
intraseluler. Salah satu aspek dari kontrol kualitas tersebut
adalah peran penting autophagy dalam menghilangkan
protein yang salah lipatan atau rusak, serta protein yang
rentan terhadap agregat. Setiap protein dalam sel terlibat
dalam interaksi dengan protein lain, membentuk kompleks
sementara dalam siklus asosiasi dan disosiasi yang berulang
sebagai respons terhadap perubahan metabolisme.
B Levine mengidentifikasi Beclin 1, homolog mamalia ragi
Atg6 [110]. Dia mengusulkan, untuk pertama kalinya, bahwa
autophagy bisa menjadi penting untuk penekanan tumor, yang
kemudian dikonfirmasi oleh studinya sendiri dan studi orang
lain, yang memicu perluasan signifikan dari re- mencari peran
autophagy dalam pertumbuhan dan kelangsungan hidup
tumor.
Penelitian Sel | Vol 24 No 1 | Januari 2014

Dari hari-hari awal penelitian autophagy, sudah jelas
bahwa organel yang berlebihan atau rusak adalah target
autophagy. Baru-baru ini degradasi selektif organel telah
dibedah pada tingkat molekuler. Dua kelompok, dipimpin
oleh Okamoto dan Kanki, secara independen melaporkan
bahwa protein membran luar mitokondria Atg32 berfungsi
sebagai reseptor untuk degradasi mitokondria oleh
autophagy (mitofag) [82, 111]. Atg32 berinteraksi dengan
Atg8 dan Atg11. Seperti Atg32, Atg19, sebuah reseptor
protein untuk jalur Cvt, memiliki motif tertentu (bernama
AIM atau LIR pada mamalia) yang mengikat kantong
hidrofobik di Atg8 dan homolognya, yang mewakili mode
interaksi penting untuk autophagy selektif.
Sementara itu, mitofag dalam sel mamalia telah menarik minat
yang kuat dari para peneliti, dan kelompok R Youle telah secara
intensif mempelajari mitofag pada mamalia dan menunjukkan
bahwa PINK1 dan Parkin memainkan peran penting dalam
penghapusan mitokondria yang rusak, dan bahwa mitofag pada
mamalia bergantung pada ubiquitination [112 ] (lihat ulasan oleh
Okamoto dalam edisi khusus yang sama). Temuan penting dan tak
terduga lainnya adalah bahwa autophagy juga bertindak
sebagai mekanisme pertahanan melawan
Gambar 1Pertumbuhan penelitian autophagy dan landmark sejarah.
www.cell-research.com | Penelitian Sel
Yoshinori Ohsuminpg
19
infeksi bakteri dan virus. Diketahui bahwa Streptokokus
Grup A memasuki sel melalui endositosis, kemudian keluar
ke sitoplasma dengan sekresi streptolisin O. Pada tahun
2004 I Nakagawa menunjukkan bahwa bakteri di sitoplasma
ini segera ditangkap dalam autofagosom, yang bergabung
dengan autofagosom lain untuk membentuk struktur
membran di mana bakteri akhirnya dicerna setelah fusi
dengan lisosom [113]. Autophagy selanjutnya terlibat dalam
kekebalan bawaan.Salmonellajuga merupakan target
autophagosome, tetapi juga telah ditemukan bahwaListeria
dan Shigellamampu melarikan diri dari degradasi oleh
autophagy. Autophagy terhadap patogen intraseluler
(disebut Xenophagy) telah mengakibatkan geod sebagai
bidang penelitian yang menarik menjanjikan berbagai cara
baru memerangi penyakit menular [114].
Seperti disebutkan secara singkat di atas, autophagy selektif,
sebagai sarana kontrol kualitas di dalam sel, adalah subjek utama
dalam penelitian autophagy saat ini. Begitu banyak pertanyaan baru
yang harus dijawab, tidak hanya mengenai signifikansi fisiologis
mereka, tetapi juga yang mendasarinya mekanisme molekuler yang
memungkinkan target untuk dibungkus secara selektif ke dalam
autofagosom.
npgLandmark sejarah penelitian autophagy
20
Komunitas riset autophagy
Di tingkat konferensi, autophagy pertama kali dibahas ketika
konferensi Penelitian Gordon pertama tentang lisosom
diadakan pada tahun 1967, dengan beberapa pembicaraan
tentang autophagy. Setelah ini, PO Seglen menyelenggarakan
sesi tentang autophagy di konferensi Komite Internasional
Proteolisis, yang mencakup pergantian protein non-lisosom dan
lisosom; dan pertemuan ke-11 di Turku dihadiri oleh E
Kominami, P Codogno, A Meijer, W Dunn, G Mortimore, dan JF
Dice. Pada tahun 1997 Y Ohsumi menyelenggarakan 1st
International Symposium on Autophagy (ISA) di Okazaki, Jepang.
ISA, yang secara eksklusif menangani autophagy semakin besar
dan besar, dan ISA ke-6 diadakan di Okinawa, 2012, dengan
lebih dari 300 peserta dari seluruh dunia. Konferensi Penelitian
Gordon tentang autophagy diselenggarakan oleh D Klionsky
pada tahun 2003, dan di tahun berikutnya Simposium Keystone
pertama pada Autophagy diselenggarakan oleh B Levine. Baru-
baru ini, konferensi EMBO tentang autophagy diselenggarakan
oleh S Tooze. Selain ledakan dalam karya autophagy yang
diterbitkan dalam jurnal (Gambar 1), meningkatnya jumlah
pertemuan internasional yang membahas penelitian autophagy
adalah cerminan dari popularitas bidang yang menarik ini.
Poin lain yang layak disebutkan secara khusus adalah
keberhasilanAutofagijurnal di bawah upaya luar biasa D
Kilonsky, yang kini telah memantapkan dirinya sebagai jurnal
berdampak tinggi.
Kesimpulan dan perspektif
Seperti dijelaskan di atas, 50 tahun telah berlalu sejak
studi tentang autophagy dimulai. Karena autophagy dalam
sel mamalia dicirikan oleh serangkaian fenomena membran
yang begitu canggih, para ilmuwan tetap skeptis selama
bertahun-tahun bahwa autophagy adalah jalur degradasi
utama protein dan organel. IdentifikasiATG gen dalam ragi
adalah titik balik sejati dalam biologi modern autophagy.
Autophagy kini telah menjadi bidang yang sangat panas
dalam biologi. Selama dua de- cades kita telah belajar
banyak tentang mekanisme molekuler autophagy dan
signifikansi fisiologisnya. Namun, kami masih pada tahap
awal autophagy penelitian, dan bidang ini terus
berkembang di kedua volume dan dampak. Sekarang sangat
jelas bahwa degradasi adalah fungsi seluler yang mendasar,
sama pentingnya dengan fungsi kehidupan seperti halnya
sintesis. Waktu dan pekerjaan lebih lanjut akan
mengungkapkan relevansi autophagy dengan semakin
banyak peristiwa fisiologis. Ada begitu banyak pertanyaan
yang masih harus dijawab tentang dinamika membran unik
yang membentuk autophagy, dan masih banyak misteri
yang harus diungkap sebelum kita benar-benar memahami
mekanisme molekuler autophagy. Es-
Hal penting dalam usaha ini adalah pengembangan berbagai
sistem yang kuat untuk bekerja dengan serta peningkatan lebih
lanjut dari perangkat yang memungkinkan kita untuk
memvisualisasikan mesin dinamis autophagy dalam resolusi
spatiotemporal yang lebih tinggi. Informasi lebih lanjut tentang
komposisi dan lokalisasi halus molekul lipid dalam isolasi
membran dan autophagosome juga akan sangat membantu
upaya penelitian, seperti juga analisis biokimia, struktural dan
biologis dari Atg dan protein terkait. Pada akhirnya, dengan
pemahaman lengkap tentang mekanisme autophagy,
pemulihan proses harus menjadi ob- tujuan bagi para ilmuwan
yang bekerja di lapangan.
Referensi
1 Schoenheimer R. Keadaan Dinamis Konstituen Tubuh.
Kuliah Edward K. Dunham untuk Promosi Ilmu
Kedokteran. Harvard University Press, 1942.
2 Schoenheimer R, Ratner S, Rittenberg D. Proses
deaminasi terus menerus dan reaminasi asam amino
dalam protein hewan normal.Sains1939;89:272-273.
3 Ganschow RE, Schimke RT. Kontrol genetik independen
dari aktivitas katalitik dan laju degradasi katalase pada
tikus.J Biol Chem1969;244:4649-4658.
4 Kalish F, Chovick N, Dadu JF. Cepatin vivodegradasi
glikoprotein yang diisolasi dari sitosol.J Biol Chem1979;
254:4475-4481.
5 de Duve C, Pressman BC, Gianetto R, Wattiaux R,
Appelmans F. Studi fraksinasi jaringan. 6. Pola distribusi
enzim intraseluler dalam jaringan hati tikus.Biokimia J1955;
60:604-617.
6 de Duve C. Lisosom ternyata lima puluh.Biola Sel Nat2005; 7
:847-849.
7 Novikoff AB, Beaufay H, de Duve C. Mikroskop elektron
dari fraksi kaya lisosom dari hati tikus.J Biophys Biochem
Cytol1956;2:179-184.
8 de Duve C, Wattiaux R. Fungsi lisosom.Annu Rev Physiol
1966;28:435-492.
9 Clark SLJ. Diferensiasi seluler pada ginjal tikus yang baru
lahir dipelajari dengan mikroskop elektron.J Biophys
Biochem Cytol1957;3:349-362.
10 Ashford TP, Porter KR. Komponen sitoplasma dalam
lisosom sel hati.Biola Sel J1962;12:198-202.
11 Arstila AU, Trump BF. Studi tentang autofagositosis
seluler. Pembentukan vakuola autophagic di hati
setelah pemberian glukagon.Am J Pathol1968;53
12 :687-733. de Duve C, Yayasan C. Simposium Yayasan
Ciba: Lisosom. De Reuck A, Cameron MP, eds. Kecil,
Brown, 1963.
13 Matile P. Biokimia dan fungsi vakuola.Annu Rev Plant
Physiol1978;29:193-213.
14 Deter RL, Baudhuin P, de Duve C. Partisipasi lisosom dalam
autophagy seluler yang diinduksi di hati tikus oleh glukagon.
Biola Sel J1967;35:C11-C16.
15 Pfeifer U, Strauss P. Vakuola autophagic di otot jantung dan
hati. Sebuah studi morfometrik komparatif termasuk variasi
sirkadian pada tikus yang diberi makan.Kardiol Sel J Mol1981;
Penelitian Sel | Vol 24 No 1 | Januari 2014

13:37-49.
16 Pfeifer U, Warmuth-Metz M. Penghambatan oleh insulin
autophagy seluler dalam sel tubulus proksimal ginjal tikus.Am J
Physiol1983;244:E109-E114.
17 Mortimore GE, Ward WF. Perilaku sistem lisosom selama
perfusi organ. Penyelidikan mekanisme proteolisis hati.
Biola Depan1976;45:157-184. Mortimore GE, Hutson NJ,
18 Surmacz CA. Korelasi kuantitatif antara proteolisis dan
makro dan mikroautofagi pada hepatosit tikus selama
kelaparan dan pemberian makan kembali.Proc Natl Acad
Sci USA1983;80:2179-2183.
19 Seglen PO, Gordon PB, Poli A. Asam amino penghambatan
jalur autophagic/lisosomal degradasi protein pada
hepatosit tikus terisolasi.Biochim Biophys Acta1980;630
:103- 118.
20 Nicklin P, Bergman P, Zhang B,dkk.Transportasi dua arah
asam amino mengatur mTOR dan autophagySel2009; 136
:521-534.
21 Sheen JH, Zoncu R, Kim D, Sabatini DM. Regulasi autophagy yang
rusak pada kekurangan leusin mengungkapkan kewajiban yang
dapat ditargetkan dari sel melanoma manusiain vitrodanin vivo. Sel
Kanker2011;19:613-628.
22 Seglen PO, Gordon PB. 3-Methyladenine: inhibitor spesifik
degradasi protein autophagic / lisosom pada hepatosit tikus
terisolasi.Proc Natl Acad Sci USA1982;79:1889-1892.
23 Blommaart EF, Krause U, Schellens JP, Vreeling-Sindelarova H,
Meijer AJ. Inhibitor phosphatidylinositol 3-kinase wortmannin
dan LY294002 menghambat autophagy pada hepatosit tikus
yang terisolasi.Biokimia Eur J1997;243:240-246. Furuya N,
24 Kanazawa T, Fujimura S, Ueno T, Kominami E, Kadowaki M.
Leupeptin-induced penampilan fragmen parsial betaine
homocysteine methyltransferase selama autophagic
pematangan di hepatosit tikus.J Biokimia2001; 129:313-320.
25 Holen I, Gordon PB, Seglen PO. Efek protein kinase dari
asam okadaic pada autophagy hepatocytic dan integritas
sitoskeletal.Biokimia J1992;284:633-636.
26 Holen I, Gordon PB, Seglen PO. Penghambatan autophagy
hepatocytic oleh asam okadaic dan inhibitor protein fosfatase
lainnya.Biokimia Eur J1993;215:113-122.
27 Masaki R, Yamamoto A, Tashiro Y. Sitokrom P-450 dan
NADPH-sitokrom P-450 reduktase terdegradasi dalam
autolisosom di hati tikus.Biola Sel J1987;104:1207-1215.
28 van der Klei IJ, Harder W, Veenhuis M. Biosintesis dan
perakitan alkohol oksidase, protein matriks peroksisomal
dalam ragi methylotrophic: review.Ragi1991;7:195-209.
29 Marzella L, Ahlberg J, Glaumann H. Autophagy,
heterophagy, microautophagy dan crinophagy sebagai
sarana untuk degradasi intraseluler.Virchows Archiv B Sel
Patologi Zellpathologie1981;36:219-234.
30 Sakai Y, Koller A, Rangell LK, Keller GA, Subramani S. Degradasi
peroksisom oleh microautophagy di Pichia paste- ris:
identifikasi langkah-langkah spesifik dan interaksi morfologis
menengahi.Biola Sel J1998;141:625-636.
31 Dadu JF, Walker CD, Byrne B, Cardiel A. Karakteristik umum
degradasi protein pada diabetes dan kelaparan.Proc Natl
Acad Sci USA1978;75:2093-2097.
32 Mortimore GE, Woodside KH, Henry JE. Kompartemen valin bebas
dan hubungannya dengan pergantian protein dalam perfusi
www.cell-research.com | Penelitian Sel
Yoshinori Ohsuminpg
21
hati tikus.J Biol Chem1972;247:2776-2784.
33 Kakinuma Y, Ohsumi Y, Anraku Y. Sifat-sifat H+
-translokasi adenosin trifosfatase di membran vakuolar
Saccharomyces cerevisiae.J Biol Chem1981;256:10859-
10863.
34 Jones EW. Protease vakuolar dan artefak proteolitik dalam
Saccharomyces cerevisiae.Metode Enzim2002;351:127-
150.
35 Takeshige K, Baba M, Tsuboi S, Noda T, Ohsumi Y. Autoph- agy
dalam ragi ditunjukkan dengan mutan yang kekurangan
proteinase dan kondisi untuk induksinya.Biola Sel J1992;119:301-
311.
36 Baba M, Takeshige K, Baba N, Ohsumi Y. Analisis
ultrastruktur dari proses autophagic dalam ragi:
deteksi autophagosomes dan karakterisasinya.Biola Sel
J1994; 124:903-913.
37 Baba M, Osumi M, Ohsumi Y. Analisis struktur membran yang
terlibat dalam autophagy dalam ragi dengan metode replika
beku.Fungsi Struktur Sel1995;20:465-471.
38 Noda T, Klionsky DJ. Uji kuantitatif Pho8Delta60 dari
autofagi nonspesifik.Metode Enzim2008;451:33-42.
39 Tsukada M, Ohsumi Y. Isolasi dan karakterisasi mutan
autophagy-cacat dariSaccharomyces cerevisiae. FEBS
Lett1993;333: 169-174.
40 Nakatogawa H, Suzuki K, Kamada Y, Ohsumi Y. Dinamika
dan keragaman mekanisme autophagy: pelajaran dari ragi.
Nat Rev Mol Sel Biol2009;10:458-467.
41 Thumm M, Egner R, Koch B,dkk.Isolasi mutan
autofagositosis dariSaccharomyces cerevisiae.FEBS Lett
1994;349:275-280.
42 Harding TM, Morano KA, Scott SV, Klionsky DJ. Isolasi
dan karakterisasi mutan ragi dalam sitoplasma ke jalur
penargetan protein vakuola.Biola Sel J1995; 131
:591-602.
43 Baba M, Osumi M, Scott SV, Klionsky DJ, Ohsumi Y. Dua
jalur berbeda untuk menargetkan protein dari sitoplasma
ke vakuola/lisosom.Biola Sel J1997;139:1687-1695. Yuan W,
44 Tuttle DL, Shi YJ, Ralph GS, Dunn WAJ. Mikroautofagi yang
diinduksi glukosa di Pichia pastoris membutuhkan subunit
alfa fosfofruktokinase.Ilmu Sel J1997; 110:1935-1945.
45 Yuan W, Stromhaug PE, Dunn WAJ. Autofagi peroksisom
yang diinduksi glukosa di Pichia pastoris membutuhkan
protein mirip E1 yang unik.Sel Mol Biol1999;10:1353-1366.
46 Mukaiyama H, Oku M, Baba M,dkk.Paz2 dan 13 produk gen
PAZ lainnya mengatur vacuolar engulfment peroksisom
selama micropexophagy.Sel Gen2002;7:75-90. 47 Titorenko
VI, Keizer I, Harder W, Veenhuis M. Isolasi dan
karakterisasi mutan terganggu dalam degradasi
selektif peroksisom dalam ragi Hansenula polymorpha.J
Bakteri1995;177:357-363.
48 Ohsumi Y. Perputaran protein.Hidup IUBMB2006;58:363-369.
49 Matsuura A, Tsukada M, Wada Y, Ohsumi Y. Apg1p, protein
kinase baru yang diperlukan untuk proses autophagic di
Saccharomyces cerevisiae.gen1997;192:245-250.
50 Kihara A, Noda T, Ishihara N, Ohsumi Y. Dua kompleks Vps34
phosphatidylinositol 3-kinase yang berbeda berfungsi dalam
penyortiran autophagy dan carboxypeptidase Y di
Saccharomyces cerevisiae.Biola Sel J2001;152:519-530.
npgLandmark sejarah penelitian autophagy
22
51 Mizushima N, Noda T, Yoshimori T,dkk.Sistem konjugasi
protein penting untuk autophagy.Alam1998;395:395- 398.
52 Mizushima N, Noda T, Ohsumi Y. Apg16p diperlukan
untuk fungsi konjugat Apg12p-Apg5p di jalur
autophagy ragi.EMBO J1999;18:3888-3896.
53 Kuma A, Mizushima N, Ishihara N, Ohsumi Y. Pembentukan
kompleks multimerik Apg12-Apg5.Apg16 sekitar 350-kDa,
dimediasi oleh oligomerisasi Apg16, sangat penting untuk
autophagy dalam ragi.J Biol Chem2002;277:18619-18625.
54 Kirisako T, Baba M, Ishihara N,dkk.Proses pembentukan
autophagosome dilacak dengan Apg8/Aut7p dalam ragi.Biola
Sel J1999;147:435-446.
55 Ichimura Y, Kirisako T, Takao T,dkk.Sistem mirip ubiquitin
memediasi lipidasi protein.Alam2000;408:488-492. Kirisako
56 T, Ichimura Y, Okada H,dkk.Modus reversibel fication
mengatur keadaan pengikatan membran Apg8/Aut7
penting untuk autophagy dan sitoplasma ke jalur
penargetan vakuola.Biola Sel J2000;151:263-276.
57 Xie Z, Nair U, Klionsky DJ. Atg8 mengontrol ekspansi
fagofor selama pembentukan autofagosomSel Mol Biol
2008;19:3290-3298.
58 Yamaguchi M, Matoba K, Sawada R,dkk.Pengenalan nonkanonik
dan pemuatan UBL dari E2 yang berbeda oleh autophagyessential
Atg7.Struktur Nat Mol Biol2012;19:1250-1256. Hanada T, Noda NN,
59 Satomi Y,dkk.Konjugat Atg12-Atg5 memiliki aktivitas seperti E3
baru untuk lipidasi protein dalam autophagy.J Biol Chem2007;282
:37298-37302. Sakoh-Nakatogawa M, Matoba K, Asai E,dkk.
60 Konjugat Atg12-Atg5 meningkatkan aktivitas E2 Atg3 dengan
mengatur ulang situs katalitiknya.Struktur Nat Mol Biol2013;20
:433-439. Nakatogawa H, Ichimura Y, Ohsumi Y. Atg8, protein
61 serupa yang ada di mana-mana yang diperlukan untuk
pembentukan autofagosom, menengahi penambatan membran
dan hemifusi.Sel2007;130:165- 178.
62 Kamada Y, Funakoshi T, Shintani T, Nagano K, Ohsumi M,
Ohsumi Y. Tor-dimediasi induksi autophagy melalui protein
kinase kompleks Apg1.Biola Sel J2000;150:1507-1513.
63 Kabeya Y, Kamada Y, Baba M, Takikawa H, Sasaki M,
Ohsumi Y. Atg17 bekerja sama dengan Atg1 dan Atg13
dalam autophagy ragi.Sel Mol Biol2005;16:2544- 2553.
64 Kawamata T, Kamada Y, Kabeya Y, Sekito T, Ohsumi Y.
Organisasi struktur pra-autofagosom yang bertanggung jawab
untuk pembentukan autofagosom.Sel Mol Biol2008;19
:2039-2050.
65 Kabeya Y, Noda NN, Fujioka Y, Suzuki K, Inagaki F, Ohsumi Y.
Karakterisasi com- Atg17-Atg29-Atg31 plex yang secara khusus
diperlukan untuk autophagy yang diinduksi kelaparan di
Saccharomyces cerevisiae.Biochem Biophys Res Commun
2009;389:612-615.
66 Ragusa MJ, Stanley RE, Hurley JH. Arsitektur kompleks
Atg17 sebagai perancah untuk biogenesis
autophagosome. Sel2012;151:1501-1512.
67 Obara K, Sekito T, Ohsumi Y. Bermacam-macam kompleks
phosphatidylinositol 3-kinase--Atg14p mengarahkan
asosiasi kompleks I ke struktur pra-autophagosomal di
Saccharomyces cerevisiae.Sel Mol Biol2006;17:1527-1539.
68 Araki K, Ku WC, Akioka M,dkk.Atg38 diperlukan untuk
integritas kompleks phosphatidylinositol 3-kinase autophagy-
spesifik.Biola Sel J2013;203:299-313.
69 Obara K, Noda T, Niimi K, Ohsumi Y. Transportasi
phosphatidylinositol 3-fosfat ke dalam vakuola melalui
membran autophagic diSaccharomyces cerevisiae.Sel Gen
2008; 13:537-547.
70 Stromhaug PE, Reggiori F, Guan J, Wang CW, Klionsky DJ. Atg21
adalah protein pengikat fosfoinositida yang diperlukan untuk
lipidasi yang efisien dan lokalisasi Atg8 selama pengambilan
aminopeptidase I oleh autophagy selektif.Sel Mol Biol 2004;15
:3553-3566.
71 Krick R, Henke S, Tolstrup J, Thumm M. Membedah
lokalisasi dan fungsi Atg18, Atg21 dan Ygr223c.Autofagi
2008;4:896-910.
72 Noda T, Kim J, Huang WP,dkk.Apg9p/Cvt7p adalah protein
membran integral yang diperlukan untuk pembentukan vesikel
transportasi di jalur Cvt dan autophagy.Biola Sel J2000;148:465-
480.
73 Yamamoto H, Kakuta S, Watanabe TM,dkk.Vesikel Atg9
adalah sumber membran penting selama langkah awal
pembentukan autophagosome.Biola Sel J2012;198
74 :219-233. Hutchins MU, Klionsky DJ. Lokalisasi vakuolar dari
oligomer alfa-mannosidase membutuhkan sitoplasma ke
penargetan vakuola dan komponen jalur autophagy di
Saccharomyces cerevisiae.J Biol Chem2001;276
75 :20491-20498. Scott SV, Baba M, Ohsumi Y, Klionsky DJ.
Aminopeptidase I ditargetkan ke vakuola oleh mekanisme
vesikular nonklasik.Biola Sel J1997;138:37-44.
76 Suzuki K, Morimoto M, Kondo C, Ohsumi Y. Autophagy selektif
mengatur mutagenesis penyisipan oleh retrotransposon Ty1 di
Saccharomyces cerevisiae.Sel Pengembang2011; 21:358-365.
77 Suzuki K, Kondo C, Morimoto M, Ohsumi Y.
Transportasi selektif alpha-mannosidase oleh jalur
autophagic: identifikasi reseptor baru, Atg34p.J Biol
Chem2010; 285:30019-30025.
78 Yorimitsu T, Klionsky DJ. Atg11 menghubungkan kargo ke
mesin pembentuk vesikel di sitoplasma ke jalur penargetan
vakuola.Sel Mol Biol2005;16:1593-1605.
79 Shintani T, Klionsky DJ. Protein kargo memfasilitasi
pembentukan vesikel transportasi di sitoplasma ke jalur
penargetan vakuola.J Biol Chem2004;279:29889-29894.
80 Dunn WAJ, Cregg JM, Kiel JA,dkk.Pexophagy: autophagy
selektif peroksisom.Autofagi2005;1:75-83. Tuttle DL, Dunn
81 WAJ. Mode autophagy yang berbeda dalam ragi
methylotrophic Pichia pastoris.Ilmu Sel J1995; 108:25-35.
82 Kanki T, Wang K, Cao Y, Baba M, Klionsky DJ. Atg32 adalah protein
mitokondria yang memberikan selektivitas selama mitofag.Sel
Pengembang2009;17:98-109.
83 Kanki T, Klionsky DJ. Atg32 adalah tag untuk degradasi
mitokondria dalam ragi.Autofagi2009;5:1201-1202.
84 Suzuki K, Kirisako T, Kamada Y, Mizushima N, Noda T,
Ohsumi Y. Struktur pra-autofagosom yang diatur oleh
fungsi terpadu gen APG sangat penting untuk
pembentukan autofagosom.EMBO J2001;20:5971-5981.
85 Suzuki K, Ohsumi Y. [Struktur pre-autophagosomal (PAS),
diperlukan untuk pembentukan membran
autophagosome].Seikagaku2003;75:492-499.
Penelitian Sel | Vol 24 No 1 | Januari 2014

86 Suzuki K, Kubota Y, Sekito T, Ohsumi Y. Hirarki protein
Atg dalam organisasi struktur pra-autofagosom.Sel Gen
2007;12: 209-218.
87 Suzuki K, Noda T, Ohsumi Y. Keterkaitan antara protein
Atg selama autophagy diSaccharomyces cerevisiae.
Ragi2004;21:1057-1065.
88 Geng J, Baba M, Nair U, Klionsky DJ. Analisis kuantitatif
stoikiometri protein terkait autophagy oleh fluoresensi
mikroskopi.Biola Sel J2008;182:129-140. Mizushima N,
89 Sugita H, Yoshimori T, Ohsumi Y. Sistem konjugasi protein
baru pada manusia. Rekan dari sistem konjugasi ragi
Apg12p penting untuk autophagy.J Biol Chem1998;273
:33889-33892.
90 Mizushima N, Kuma A, Kobayashi Y,dkk.Mouse Apg16L,
protein pengulangan WD baru, menargetkan membran
isolasi autophagic dengan konjugat Apg12-Apg5.Ilmu Sel J
2003;116:1679-1688.
91 Kabeya Y, Mizushima N, Ueno T,dkk.LC3, homolog mamalia
dari ragi Apg8p, dilokalisasi dalam membran autophagosome
setelah diproses.EMBO J2000;19:5720-5728. Mizushima N,
92 Yamamoto A, Hatano M,dkk.Pembedahan pembentukan
autophagosome menggunakan tikus yang kekurangan Apg5
sel induk bryonic.Biola Sel J2001;152:657-668. Mizushima N,
93 Yamamoto A, Matsui M, Yoshimori T, Ohsumi Y.in vivoanalisis
autophagy dalam menanggapi nutrisi ent kelaparan
menggunakan tikus transgenik mengekspresikan fluorescent
penanda autofagosom.Sel Mol Biol2004;15:1101-1111. Jung
94 CH, Jun CB, Ro SH,dkk.Kompleks ULK-Atg13-FIP200 memediasi
pensinyalan mTOR ke mesin autophagy. Sel Mol Biol2009;20:
1992-2003.
95 Matsunaga K, Saitoh T, Tabata K,dkk.Dua protein pengikat
Beclin 1, Atg14L dan Rubicon, secara timbal balik mengatur
autophagy pada tahap yang berbeda.Biola Sel Nat2009;11
96 :385-396. Itakura E, Kishi C, Inoue K, Mizushima N. Beclin 1
membentuk dua kompleks phosphatidylinositol 3-kinase yang
berbeda dengan Atg14 mamalia dan UVRAG.Sel Mol Biol2008;
19:5360-5372.
97 Zhong Y, Wang QJ, Li X,dkk.Regulasi berbeda dari aktivitas
autophagic oleh Atg14L dan Rubicon yang terkait dengan
kompleks Beclin 1-phosphatidylinositol-3-kinase.Biola Sel Nat
2009;11:468-476.
98 AR Muda, Chan EY, Hu XW,dkk.Kelaparan dan siklus
bergantung ULK1 dari mamalia Atg9 antara TGN dan
endosom.Ilmu Sel J2006;119:3888-3900. Velikkakath AK,
99 Nishimura T, Oita E, Ishihara N, Mizushima N. Protein Atg2
mamalia penting untuk autophago-
www.cell-research.com | Penelitian Sel
Yoshinori Ohsuminpg
23
beberapa pembentukan dan penting untuk pengaturan
ukuran dan distribusi tetesan lipid.Sel Mol Biol2012;23
100 :896-909. Koyama-Honda I, Itakura E, Fujiwara TK,
Mizushima N. Analisis temporal perekrutan protein ATG
mamalia ke situs pembentukan autophagosome.Autofagi
2013; 9:1491-1499.
101 Kuma A, Mizushima N. Pemetaan kromosom transgen GFP-
LC3 pada tikus GFP-LC3.Autofagi2008;4:61-62. Kuma A,
102 Mizushima N. Peran fisiologis autophagy sebagai sistem
daur ulang intraseluler: dengan penekanan pada
metabolisme nutrisi.Semin Cell Dev Biola2010;21:683-690.
103 Levine B, Kroemer G. Autophagy dalam patogenesis
penyakit.Sel2008;132:27-42.
104 Doelling JH, Walker JM, Friedman EM, Thompson AR,
Vierstra RD. Enzim APG8/12-mengaktifkan APG7
diperlukan untuk daur ulang nutrisi yang tepat dan
penuaan diArabidopsis thaliana.J Biol Chem2002;277
105 :33105-33114. Hanaoka H, Noda T, Shirano Y,dkk.Penuaan
daun dan klorosis yang diinduksi kelaparan dipercepat
oleh gangguanArabidopsisgen autofagi.Fisiol Tumbuhan
2002; 129:1181-1193.
106 Melendez A, Levine B. Autophagy diC. elegan.buku cacing
2009; 1-26.
107 Hara T, Nakamura K, Matsui M,dkk.Penekanan autophagy
basal dalam sel saraf menyebabkan penyakit neurodegeneratif
pada tikus.Alam2006;441:885-889.
108 Komatsu M, Waguri S, Koike M,dkk.Tingkat homeostatik p62
mengontrol pembentukan tubuh inklusi sitoplasma dalam
autoph- tikus yang kekurangan agy.Sel2007;131:1149-1163.
109 Tsukamoto S, Kuma A, Murakami M, Kishi C, Yamamoto A,
Mizushima N. Autophagy sangat penting untuk perkembangan
praimplantasi embrio tikus.Sains2008;321:117-120. Liang XH,
110 Jackson S, Seaman M,dkk.Induksi autophagy dan
penghambatan tumorigenesis oleh beclin 1.Alam 1999;402
:672-676.
111 Okamoto K, Kondo-Okamoto N, Ohsumi Y. Mitokondria
berlabuh reseptor Atg32 menengahi degradasi mitokondria
melalui autophagy selektif.Sel Pengembang2009;17:87-97.
112 Youle RJ, Narendra DP. Mekanisme mitofag.Nat Rev Mol Sel
Biol2011;12:9-14.
113 Nakagawa I, Amano A, Mizushima N,dkk.Autophagy
mempertahankan sel terhadap invasi grup A Streptococcus.
Sains 2004;306:1037-1040.
114 Randow F, Munz C. Autophagy dalam regulasi replikasi
patogen dan imunitas adaptif.Tren Imun2012; 33
:475-487.