PEMERIKSAAN SPERMA PADA KASUS PERSETUBUHAN

PENDAHULUAN

Deteksi dan identifikasi cairan tubuh di TKP adalah aspek yang sangat penting dari ilmu
forensik. Cairan tubuh yang paling umum ditemukan di TKP adalah darah, air mani, dan air
liur, tetapi lainnya seperti cairan vagina, urin, dan keringat juga dapat memainkan peran
penting termasuk kontribusi evidence DNA berharga.

Masalah utama dengan tes-tes ini adalah penghancuran sampel. Kadang-kadang kasus dapat
rusak dengan jumlah bukti biologis yang sedikit, sehingga sangat penting bahwa jumlah
sampel kecil diperiksa seefisien mungkin dengan metode non destruktif di TKP. Alasan yang
paling penting tes non-destruktif ini adalah pelestarian evidence DNS.

Penentuan jenis dan asal cairan tubuh yang ditemukan di TKP dapat memberikan wawasan
penting dalam rekonstruksi TKP dengan mendukung hubungan antara donor sampel dan
tindak pidana yang sebenarnya. Selama lebih dari satu abad, berbagai jenis metode
identifikasi sperma telah dikembangkan, seperti tes kimia, tes imunologi, tes aktivitas
katalitik protein, metode spektroskopi dan mikroskop. Namun, metode identifikasi sperma
konvensional sebagian besar merupakan test dugaan, dan dilakukan hanya pada suatu waktu.
Oleh karena itu, penggunaan pendekatan molekuler genetika berbasis RNA atau deteksi
metilasi DNA baru-baru ini diusulkan untuk menggantikan metode identifikasi cairan sperma
konvensional. Beberapa penanda RNA dan tDMRs yang khusus untuk cairan semen yang
relevan telah diidentifikasi, dan spesifitas dan sensitivitas telah diuji menggunakan berbagai
sampel.

PEMERIKSAAN SPERMA PADA KASUS PERSETUBUHAN

Semen merupakan salah satu cairan tubuh yang paling sering ditemui di TKP. Terdapat
beberapa tes dugaan serta test konfirmasi untuk mengidentifikasi semen. Berikut ini
menjelaskan teknik pemeriksaan yang sudah diakui di bidang forensik atau telah diringkas
pada literatur umumnya.
Tanda marker mani telah lama digunakan dalam kasus-kasus kekerasan seksual, namun,
dalam sekitar dua pertiga kasus, tidak mungkin untuk mengidentifikasi donor sperma, karena
cairan biologis campuran menghasilkan jenis serologis campuran.

Bahkan ketika sperma tidak ada, beberapa jenis sel non-sperma yang ditinggalkan oleh
pelaku (epitel, leukosit, sel germinal belum matang) dan merupakan sumber yang layak untuk
analisis DNA. Sel-sel ini biasanya ditemukan di sekitar 15% dari bahan sperma yang
disediakan oleh kelenjar prostat dan vesikula seminalis. Azoospermia dilaporkan oleh Willott
sekitar 1,9% dari bercak air mani yang ditemukan pada swab kasus serangan seksual.

1. Alternating least squares (ALS)

Mirip dengan darah, air mani juga dapat dideteksi menggunakan alternating least squares
(ALS) seperti sinar ultraviolet. Ini merupakan prosedur rutin untuk mencari air mani dan
cairan lainnya di TKP menggunakan metode yang sederhana dan non-destruktif. Woods
Lamp (WL) adalah perangkat khusus yang memancarkan panjang gelombang 320-400 nm,
dengan ukurannya yang kecil, murah, aman, dan mudah digunakan.

Namun ketika WL diuji terhadap cairan lainnya, alat tersebut menjadi tidak spesifik dan
bahkan kadang-kadang tidak mendeteksi noda air mani, dan memberikan hasil positif palsu
terhadap salep dan krim. Alat ALS komersial lainnya, BluemaxxTM BM500, diuji dengan
cara yang sama dan hasilnya 100% sensitif terhadap noda air mani. Dan juga para dokter
yang menggunakan ALS mampu membedakan semen dengan cairan lainnya dengan waktu
83% setelah menerima pelatihan tentang bagaimana menggunakan perangkat tersebut.
Perangkat ALS lainnya yang digunakan untuk pemeriksaan cairan termasuk air mani adalah
Polilight1 yang memiliki rentang panjang gelombang 415-650 nm cahaya putih ultraviolet.

2. Seminal acid phosphatase (SAP)

Test pemeriksaan yang paling populer dan diterima keberadaan air mani adalah tes seminal
acid phosphatase (SAP). Enzim ini memiliki kemampuan untuk mengkatalisis hidrolisis
fosfat organik membentuk produk yang akan bereaksi dengan chromogen garam diazonium
yang menyebabkan perubahan warna. Ini merupakan prinsip dasar dari tes SAP. Salah satu
kombinasi pengembang substrat / warna populer adalah alpha-naphthyl phosphate dan
Brentamine Fast Blue. Kombinasi lain adalah beta-naphthol dengan Fast Garnet B, dan
alphanaphthol dengan Fast Red AL. 3

AP (asam fosfatase) adalah enzim yang diproduksi oleh kelenjar prostat. Ini mengkatalisis
hidrolisis asam lysophosphatidic, produk pemecahan membran fosfolipid, dan mungkin
terlibat dalam kapasitasi spermatozoa (dimana membran sel yang hilang) yang mengekspos
protein di kepala akrosom, yang memungkinkan penetrasi ovum. AP ditemukan dalam
konsentrasi tinggi dalam air mani (sekitar 1 mg / mL atau 300 U / mL), sehingga berguna
sebagai penanda untuk penentuan forensik cairan mani. AP stabil dalam keadaan kering, dan
dapat dideteksi dalam bercak air mani lama. Tes AP pertama kali dijelaskan oleh Babson
pada tahun 1959. Meskipun tidak sensitif seperti tes PSA, namun memberikan hasil yang
dramatis dalam waktu 15 detik dengan bercak yang kuat dan sangat mudah digunakan di
lapangan.

Gambar 1. Pemeriksaan seminal acid phosphatase (SAP).

Positive bila berwarna ungu dalam 15 detik.

Gambar 2. Alat untuk memeriksa SAP

Reagen tambahan natrium thymolphthalein monofosfat telah digunakan karena selektivitas

dan stabilitas yang tinggi dan risiko bahaya rendah, dan merupakan kombinasi pnitroaniline,
NaNO3, a-naftil asam fosfat, dan magnesium klorida encer. Tes ini juga menghasilkan hasil
positif palsu pada vaginal acid phosphatase (VAP), sehingga teknik ini tidak dapat
dianggap sebagai test konfirmasi. Salah satu cara untuk menghindari potensi hasil positif
palsu pada VAP adalah mengamati perubahan warna yang terjadi antara 5 hingga 30 detik
karena VAP tidak pernah memberikan hasil positif yang begitu cepatnya. Metode lain yang
telah dikembangkan untuk membedakan antara SAP dan VAP ialah melibatkan pemisahan
dua fosfatase asam menggunakan fokus isoelektrik, dan dengan menggunakan elektroforesis
gel akrilamida. Kerugian lebih lanjut dari tes SAP adalah enzim dapat menurun ketika
terkena panas, jamur, membusuk, atau bahan kimia.

Tabel 1. Komposisi masing masing cairan tubuh

3. Leucine aminopeptidase (LAP)

Ada tes dugaan serupa untuk pemeriksaan semen berdasarkan adanya enzim lain, tetapi tes
ini tidaklah populer. Dalam sebuah studi, perbandingan dengan tes SAP, uji leucine
aminopeptidase (LAP) memiliki hasil positif palsu yang lebih sedikit dibandingkan dengan
cairan tubuh manusia lainnya dan hanya menunjukkan hasil negatif dengan spesies lain.
Namun tes tersebut kurang sensitif terhadap pengenceran tinggi.

4. Glycylproline dipeptidyl aminopeptidase (GDA)

Enzim lain yang telah diuji adalah glycylproline dipeptidyl aminopeptidase (GDA). Hasil
menunjukkan bahwa noda semen berumur 24 tahun dapat memberikan reaksi positif; positif
palsu pada cairan vagina, feses, stroberi, kacang, dan bawang. Sensitivitas diuji dengan
pengenceran serendah 1:4 di mana semua hasil positif.

5. Cystine aminopeptidase (CAP)

Tes berbasis enzim lainnya mendeteksi cystine aminopeptidase (CAP). Enzim ini 100 kali
lebih nampak pada air mani dari cairan lainnya. Ketika diuji cairan tubuh lainnya termasuk
cairan vagina dan feses, tidak ditemukan adanya hasil positif palsu seperti dengan beberapa
tes enzim yang disebutkan sebelumnya.

6. Gglutamyltransferase (g-GTP)

Sebuah tes dengan enzim gglutamyltransferase (g-GTP) menggunakan garam Fast Garnet
GBC dan anaphthylamine sebagai indikator menunjukkan hasil positif pada noda semen tapi
dapat memberikan positif palsu pada ASI, cairan vagina, kacang hijau, kacang-kacangan,
bawang, stroberi, apel, dan plum.

7. Pemeriksaan Zinc

Pemeriksaan zinc pada mani telah diteliti dan lebih baik dan kurang degradable dibandingkan
SAP. Sebuah metode pemeriksaan paperstrip zinc dibandingkan dengan paperstrip SAP, dan
pada akhirnya kedua tes memiliki sensitivitas dan spesifisitas yang sama. Pemeriksaan ini
menggunakan reagen Hoofts 1-(2-Pyridylazo)-2-naphthol. Pemeriksaan dianggap positif bila
perubahan warna dari kuning ke pink.

Gambar 3. Pemeriksaan Zinc

8. Tes kolin

Tes dugaan pemeriksaan semen lainnya yang telah digunakan sejak lama namun tidak lagi
digunakan secara teratur adalah tes kolin. Pemeriksaan kolin menggunakan tes Florence yang
menempatkan ekstrak zat yang dicurigai pada slide mikroskop, diberikan larutan yodium dan
kalium iodida, dan diamati kristal jarum cokelat yang terbentuk. Kemungkinan negatif palsu
sangat besar karena sensitivitasnya rendah, dan tes ini negatif untuk cairan tubuh lainnya
seperti cairan vagina serta semen dari spesies lain. Metode pemeriksaan kolin didasarkan
pada reaksi dengan kolin oksidase ialah tes chemiluminescent yang melibatkan cairan kolin
oksidase / luminol. Sebuah metode yang lebih rumit untuk mendeteksi kolin ialah metode
isotachophoresis dimana tidak memiliki positif palsu dengan cairan tubuh lain, buah-buahan,
atau sayuran. Bercak berumur 10 tahun masih menunjukkan beberapa hasil positif, dan tes
menunjukkan semen positif pada vaginal swab yang diambil dari perempuan yang telah
meninggal.

9. Seminal polyamine atau spermine (SPM)

Satu tes dugaan yang telah dipelajari di masa lalu tapi jarang digunakan adalah deteksi
seminal polyamine atau spermine (SPM) yang konsentrasinya tertinggi pada air mani.
Kromatografi cair berkinerja tinggi (HPLC) dikombinasikan dengan metode ekstraksi
sederhana telah ditemukan untuk menjadi cara yang sederhana dan sensitif untuk mendeteksi
SPM dibandingkan dengan kromatografi kertas, TLC, tabung kapiler isotachophoresis, dan
metode enzim. Positif palsu yang paling umum berasal dari kecap, dan tidak ada spermine
diukur dalam cairan tubuh seperti urine, darah, keringat, air susu ibu, dan air liur.

10. Tes Barberio

Test lainnya untuk pemeriksaan spermine yaitu tes Barberio, melibatkan konfirmasi kristal
kuning yang terbentuk oleh mikroskop ketika air mani terkena larutan asam pikrat. Tes ini
dianggap lebih dapat diandalkan dibandingkan tes Florence untuk kolin, dan masih
memberikan hasil positif pada bercak setua 3 tahun dan dipanaskan sampai 150 oC. Sebuah
metode yang sama yaitu tes Puanen adalah tes kristal lain yang menggunakan Naphthol
Yellow S sebagai reagen dan membentuk kristal oranye dengan adanya air mani.

11. Identifikasi mikroskop

Teknik pemeriksaan konfirmasi yang paling dapat diandalkan dan diterima secara luas untuk
mendeteksi air mani adalah identifikasi mikroskopis sel sperma. Semen adalah satu-satunya
cairan tubuh yang memiliki sel sperma, dan sejumlah besar DNA di kepala sperma dapat
diidentifikasi dengan zat warna untuk membuat sperma terlihat. Zat warna paling populer
digunakan adalah zat warna Christmas tree, dikenal warna khas pada kepala sperma adalah
merah dan hijau pada ekor.

Teknik tambahan menggunakan larutan proteinase K yang akan mengubah sifat sel-sel epitel
dan membuat kepala sperma yang tidak berpengaruh lebih terlihat. Zat warna lain yang
kurang efektif daripada zat warna Christmas tree yang telah diuji adalah pewarnaan Gram
modifikasi Christmas tree, hematoxylin dan eosin, Baecchi, Papanicolaou, dan Wright. Tentu
saja kelemahan terbesar dari teknik mikroskop ini jika donor sperma adalah azoospermia
karena penyebab alami atau dengan vasektomi; untuk alasan ini, tes kimia lainnya telah
dikembangkan.

Gambar 4. Deteksi spermatozoa berdasarkan pewarnaan Dibandingkan dengan

alkaline fuchsin, pewarnaan Christmas tree dan hematoxylin-eosin merupakan metode
sitologi baku emas deteksi spermatozoa.

Gambar 5. Analisis mikroskop pada sampel pewarnaan dengan Baechi

12. Prostate-specific antigen (PSA)

Tes konfirmasi yang paling populer untuk sel sperma di luar dari semen adalah tes prostate-
specific antigen (PSA).

Antigen spesifik prostat (PSA, juga dikenal sebagai p30), suatu glikoprotein yang diproduksi
oleh kelenjar prostat dan disekresikan ke dalam plasma mani, adalah penanda yang
digunakan untuk menunjukkan adanya cairan mani.

Air mani dari pria azoospermia masih akan berisi antigen ini yang hadir dalam plasma mani;
cairan tubuh lainnya mengandung tingkat PSA yang sangat rendah. Kadar PSA yang rendah
mengakibatkan tes PSA tidak terlalu sensitif sehingga tidak dapat mengakibatkan hasil positif
palsu. Konsentrasi PSA pada urin laki laki adalah 800 ng/ml. PSA tidak terdeteksi pada urine
dilusi laki laki di atas 1/200.7 Sebuah aspek penting untuk pendeteksian PSA melibatkan
kemampuan yang baik untuk mendeteksi sampel yang terkontaminasi atau sulit seperti kain
yang telah dicuci dan mayat yang membusuk.

Menurut beberapa penelitian, PSA dapat ditemukan dalam cairan tubuh wanita. Breul
menyatakan bahwa konsentrasi PSA di urin perempuan rata rata adalah 3,72 ng/ml.
Pembentukan protein PSA dipengaruhi oleh steroid; Oleh karena itu, dapat dikembangkan
dalam berbagai jaringan tubuh termasuk jaringan perempuan. Walaupun begitu, konsentrasi
PSA di urin perempuan sangatlah rendah, sehingga tidak terdeteksi oleh rapid test PSA
karena di bawah cut-off point dari perangkat. Dengan demikian, hasil positif palsu yang
disebabkan oleh urin perempuan bisa dihilangkan.

Metode yang melibatkan immunoelectrophoresis atau ELISA, dan beberapa teknik khusus
immunoassay dot blot dengan metode radiolabeled Protein A serta dot-immunobinding
disebut juga membrane aspiration test (MAT). Tes lainnya mengunakan thin-layer
immunoassay (TIA) dan tidak menunjukkan hasil positif palsu dengan darah, air liur, urine,
keringat, dan air mata. Sekarang telah terdapat beberapa alat tes yang bergantung pada reaksi
antigen-antibodi dan jauh lebih cepat dan lebih mudah digunakan.

Pemeriksaan PSA dalam cairan mani kuantitatif relatif sulit dan cukup mahal, sehingga tidak
pernah dilakukan di Indonesia. Untungnya, ada rapid test untuk memeriksa PSA, yang sangat
praktis, cepat, mudah digunakan, murah, dan cukup sensitif dan spesifik. Namun, rapid test
ini dirancang untuk memeriksa konsentrasi PSA dalam darah, plasma, dan serum.

Salah satu alat yang tersedia secara komersial adalah tes Biosign1 PSA, dan alat tersebut lebih
murah untuk digunakan daripada metode tradisional ELISA. The OneStep ABAcard1 adalah
alat test komersial lainnya. Alat ini juga bergantung pada teknik antibodi mobile monoclonal
anti-human PSA yang mengikat PSA manusia dan bermigrasi sepanjang alat strip ke antibodi
polyclonal anti-human PSA imobile dan membentuk garis. PSA dalam air mani yang
diencerkan 106 kali mampu dideteksi dengan tes ini, dan hanya sampel urin pria memberikan
hasil positif palsu.

Gambar 6. Pemeriksaan ABAcard (hasil positif dan negative)

Tes komersial lainnya yang telah dikembangkan meliputi Chembio, Medpro, Onkoscreen,
PSAcheck-1, Seratec1 PSA Semiquant dan Phosphatesmo KM PaperR _ test.5,10 Alat test
Seratec1 ditemukan menunjukkan positif palsu dengan sampel cairan vagina bebas semen.
Sebuah studi perbandingan antara PSA Rapid Test Kit, Rapid PSA, dan SMITEST
menetapkan bahwa tiga alat tersebut memiliki spesifisitas yang sama, tetapi SMITEST
memiliki sensitivitas terbesar. Alat tes otomatis yang memungkinkan analisis simultan adalah
Hybritech Tandem-E PSA Immunoenzymetric Assay karena menggunakan lebih sedikit
tenaga kerja dan dana daripada metode tradisional.

Gambar 7. Pemeriksaan PSA hasil positif dengan Seratec

MHS-5, yang juga dikenal sebagai immunoglobulin G1 dan seminal vessel specific antigen
(SVSA), merupakan antigen yang hanya akan bereaksi dengan epitel di vesikula seminalis
manusia. Protein utama pembentuk gel dalam air mani manusia, semenogelin I dan
semenogelin II, keduanya mengandung SVSA dan dapat dideteksi oleh antibody MHS-5
monoklonal. Sema1 adalah alat tes ELISA yang dirancang untuk mendeteksi keberadaan
semen berdasarkan reaksi antara antibody MHS-5 dan SVSA. Metode ini sensitif untuk
sampel semen yang diencerkan sebanyak 106 kali, tapi tidak sama spesifik dengan tes PSA
dan tidak lagi digunakan. Metode imunologi lain yang telah dikembangkan untuk
mendeteksi air mani melibatka semenogelin, semenogelin II, 19-OH F1A / F2a prostaglandin,
dan antibodi monoklonal yang disebut 1E5. Akhirnya, teknik ELISA untuk mendeteksi
antibodi monoklonal untuk SAP telah dikembangkan yang tidak menunjukkan hasil positif
palsu dengan cairan tubuh lainnya dan sensitif dengan pengenceran air mani hingga 1:
100.000.

13. Isozim LDH dan Isozim lainya

Seperti disebutkan sebelumnya dalam diskusi tentang mengkonfirmasikan adanya darah,

suatu isozim LDH juga dapat berperan dalam mengkonfirmasikan kehadiran air mani. LDH
isozym memiliki properti di antara LDH-3 dan LDH-4 dan dinamakan LDH-X. Hal ini unik
terhadap sperma manusia, bagaimanapun, teknik pewarnaan Christmas tree, metode LDH
hanya akan bekerja jika air mani donor mengandung sperma. Isozim terdeteksi dengan
elektroforesis, dan teknik ini akan memberikan hasil positif pada pewarnaan setidaknya
setelah 30 minggu dan pada swab vagina pasca-coital. Sperma bahkan dapat dideteksi dalam
campuran dengan darah dan cairan vagina menggunakan metode ini. Metode ini tidak umum
digunakan di laboratorium forensik modern.
Isozim lain yang dapat digunakan untuk mendeteksi air mani adalah g-glutamil
transpeptidase (GGT). Isozym ini jauh lebih aktif dalam plasma mani dari cairan tubuh lain..
Beberapa isozim lainnya telah dipelajari seperti sperm diaphorase, creatine
phosphokinase (CPK), dan berbagai esterase, tetapi metode ini belum terbukti sama
efektifnya dengan tes PSA yang lebih populer.

Tabel 2. Ringkasan Pemeriksaan Sperma Model Lama

Tabel 3. Ringkasan Pemeriksaan Sperma Model Baru

14. SPERM HY-LITER

SPERMA HY-LITER TM dikembangkan dan divalidasi untuk analisis mikroskopik

spermatozoa manusia dari bukti serangan seksual. Kekhasan metode ini dilakukan dengan
fluorescent antibodi monoklonal Alexa 488 (flourescein isotiosianat hijau FITC), yang
secara khusus menargetkan antigen pada membran inti sel sperma. Dalam hubungannya
dengan Alexa 488, perwarnaan inti biru, 40,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), juga
dimasukkan sebagai bagian dari pewarnaan tersebut. Akibatnya, semua sel yang mengandung
inti kaya DNA dapat divisualisasikan melalui penggunaan selektif DAPI kompatibel
penyaring fluoresent.

Hal ini memungkinkan untuk memvisualisasikan berbagai sel tanpa perlu degradasi selektif
epitel / sel vagina oleh proteinase K sebelum analisis mikroskopis. Karena fluoresensi intens,
sedikitnya satu sel sperma dapat diidentifikasi antara sampel padat sel epitel vagina yang
sering ditemukan pada swab serangan seksual.

Gambar 8. Sampel analisis mikroskopik SPERM HY-LITER.

Percobaan dilakukan menunjukkan bahwa uji Sperma Hy-LiterTM adalah (1) sangat spesifik
dan valid (tidak ada gangguan dari semen diperoleh dari berbagai hewan dan tidak adanya
sinyal fluoresensi positif di semua slide control dari swab darah, ragi, urin, epitel vagina sel
atau feces), (2) sensitif dan dapat diandalkan (spermatozoa terdeteksi pada swab vagina
dilarutkan dalam pengenceran semen 1: 1000 dan 1: 10.000; spermatozoa terdeteksi lebih
efektif dalam sampel mengandung beberapa spermatozoa dibandingkan menggunakan
mikroskop), (3 ) cepat (1 menit dibandingkan rata-rata 10 menit atau lebih menggunakan
mikroskop untuk spermatozoa < 10), (4) kuat (spermatozoa dideteksi pada noda semen
berusia 24 tahun, bebas dari spermisida, pelumas, kondom fluorescent dan non-fluorescent
dan krim anti-jamur) dan (5) sederhana untuk digunakan.

15. Skoring Sperma

Metode yang paling banyak digunakan untuk mengklasifikasikan kehadiran spermatozoa

dengan visualisasi dikembangkan pada tahun 1974 oleh Davies dan Wilson. Metode
menggunakan serangkaian plus (+) untuk merekam jumlah spermatozoa yang diamati.
Sebutan digunakan adalah:

++++, banyak spermatozoa di setiap lapang pandang;

+++, banyak atau beberapa spermatozoa di seluruh lapang pandang;

++, beberapa spermatozoa di beberapa lapang pandang, mudah untuk digunakan;

+, sulit untuk ditemukan, dan;

0, tidak nampak spermatozoa.

Metode skoring sperma saat ini sangat subjektif dengan % RSD slide sangat tinggi dengan
jumlah sperma rendah secara keseluruhan. Selain itu, rekaman ekor tidak menambah nilai
teknik skoring sperma. Penelitian lebih lanjut mungkin meningkatkan objektivitas penilaian
sperma dan keandalan pencatatan ekor sperma.

16. Sperm-elution

Secara historis, metode yang paling umum untuk menghilangkan sel-sel dari sampel
dikirimkan untuk dilakukan pemeriksaan elusi air. Ketika sel merupakan campuran, biasanya
epitel dan spermatozoa, slide elusi dan sentrifugasi disiapkan dan jika spermatozoa
ditemukan, ekstraksi preferensial ini dapat dilakukan sebelum profiling DNA.

Ekstraksi preferensial memisahkan fraksi spermatozoa dan sel epitel, paling sering
memproduksi dua profil DNA; satu terutama dari bahan epitel dan lainnya dari laki-laki
(spermatozoa).
Proses ini bukan tanpa keterbatasan. Menurut AFSP Body Fluid Forum (BFF) menunjukkan
bahwa pemulihan awal spermatozoa dalam sel pelet yang dihasilkan oleh metode ekstraksi air
adalah 20%. Penilaian jumlah pulih spermatozoa pada slide mikroskop dapat terhambat oleh
kehadiran sel-sel epitel berinti (NECs) yang dapat menyembunyikan spermatozoa sehingga
sulit untuk ditemukan. Jika pemulihan spermatozoa rendah dan pemisahan fraksi mani dan
epitel sulit, kemungkinan menghasilkan profil DNA mani yang dilaporkan sangatlah kecil.

Orchid Cellmark (Cellmark) telah mengembangkan protokol elusi dua tahap; Sperma Elusi.
Metode ini memungkinkan pelepasan NECs utuh dan beberapa spermatozoa terutama pada
fase pertama dan fase kedua. Pelet mani terdiri dari NECs utuh jumlah terbatas dan sel debris
kecil, menghasilkan slide yang lebih mudah mencari rendahnya spermatozoa juga
menghasilkan fraksi mani mengandung DNA epitel.

1. Slide dari sampel elusi air Cellmark ( pembesaran 400 ).

2. Slide dari elusi sperma ( pembesaran 400).

Gambar 9. Persentase rata rata recovery dari swab polyester Scenesafe ketika
spermatozoa dalam jumlah tinggi (sekitar 4700) dan jumlah rendah (sekitar 470) (n
= 10 swab per metode elusi).

17. Metode RT-PCR

Bagian berikut akan menjelaskan teknik-teknik baru dalam unit forensik yang mendeteksi
semen. Seperti dengan darah, kebanyakan tehnik ini melibatkan penanda imunologis dan
sekaligus dapat mengidentifikasi spesies dari sampel air mani yang tidak diketahui.

Banyak metode baru yang dikembangkan untuk mengidentifikasi semen dengan melibatkan
penanda mRNA dan metode yang sama telah disebutkan untuk mendeteksi noda darah.
Ulasan Bauer mengenai penggunaan RNA dalam ilmu forensik juga mencakup metode
pendeteksi air mani. Metode ko-isolasi RNA dan DNA yang dijelaskan oleh Alvarez et al.
juga dapat diterapkan untuk sampel air mani. Protamine 1 (PRM1) adalah penanda semen
khusus yang masih diselidiki dalam penelitian ini.

Metode RT-PCR yang diusulkan oleh Juusola dan Ballantyne pada tahun 2005 juga dapat
digunakan untuk memeriksa semen. Proses ini melibatkan deteksi gen spesifik air mani-
PRM1 dan protamin 2 (PRM2). Metode paten mulai dikembangkan untuk teknik yang sama.
Sensitivitas untuk sampel air mani adalah yang tertinggi di antara cairan tubuh lainnya yang
terdeteksi dengan kurang dari 200 pg RNA yang diperlukan untuk hasil yang positif untuk
kedua gen. Spesivitas terbukti saat gen ini hanya terdeteksi dalam sampel air mani.

Metode RT-PCR octaplex tidak menghasilkan positif palsu, tidak ada negatif palsu, dan tidak
ada gen tunggal drop out. Versi terbaru percobaan ini disajikan pada tahun 2007 melibatkan
sistem tripleks, dan gen yang terlibat yaitu gen semen PRM1 dan PRM2 bersama dengan gen
GAPDH. Sebuah studi serupa dilakukan pada tahun 2008 dengan menggunakan gen semen
yang sama PRM1 dan PRM2 dimana dilakukan oleh Juusola dan Ballantyne, dan ditemukan
bahwa hasil positif pada semen yang berusia hingga 15 bulan.

Pendekatan RT-PCR yang dikembangkan oleh Nussbaumer et al. pada tahun 2006 berfokus
pada kallikrein 3 (KLK) penanda untuk semen (juga dikenal sebagai PSA). Tidak ada
reaktivitas silang dengan sampel dari cairan lain seperti darah, cairan vagina, dan air liur, dan
tidak ada dari sampel ini menunjukkan hasil positif untuk uji KLK. Juga, penanda semen
mRNA khusus ini menunjukkan stabilitas yang besar dan sama-sama terdeteksi setelah 10
hari penyimpanan pada suhu kamar tanpa adanya buffer stabil. Teknik ini terbukti lebih
sensitif dibandingkan tes berbasis protein PSA.

18. Rapid stain identification (RSID) Semen Test

Pada tahun 2007 Pang dan Cheung membandingkan rapid stain identification (RSID) -
Semen Test dengan tes ABAcard1 PSA untuk deteksi bercak air mani.

RSID-Semen Test didasarkan pada deteksi semenogelin (Sg) menggunakan antibodi

monoklonal anti-human Sg. Kedua tes melibatkan teknologi immunochromatographic
membrane assay. RSID-Semen Test ditemukan lebih sensitif mendeteksi Sg pada
pengenceran semen 1: 100.000. Test air mani pada beberapa spesies yang berbeda yang
dinyatakan positif spermatozoa semua menunjukkan hasil Sg negatif. Tes ini tidak
menunjukkan positif palsu dengan cairan tubuh lainnya, dan analisis hanya memakan waktu
10 menit. Alat test komersial lain yang mendeteksi Sg disebut Nanotrap Sg. Alat ini memiliki
sensitivitas yang sama dengan RSID-Semen Test, tetapi lebih dari tiga pengulangan
pembekuan dan pencairan sampel semen menyebabkan hasil sensitivitas menurun. Tes ini
dapat mendeteksi semen pada 67% sampel yang tidak mengandung spermatozoa.
Kemampuan metode ini untuk menemukan DNA pada sampel yang tidak menunjukkan
spermatozoa membuatnya berharga untuk dilakukan analisis DNA selanjutnya.

Gambar 10. Pakaian putih dan hitam mengandung semen diiluminasi dengan Lumatec
Superlight 400 at 550 nm. Alat ini mengunakan gelombang 320 700 nm.

Mirip darah, Trombka et al. telah memperkenalkan metode identifikasi semen non destruktif.
Metode melibatkan teknologi NASA yang unik, melibatkan XRF portabel yang dapat
mendeteksi zat Seng dalam bercak air mani, dan juga memiliki potensi untuk menjadi
bantuan berharga dalam identifikasi semen di TKP karena perangkatnya yang portabel.
Proses ini hanya membutuhkan waktu sekitar satu menit, dan memiliki presisi baik lebih dari
10% dalam mengukur 1 ml air mani dalam area 40 cm2. Metode non-destruktif akan sangat
membantu dalam kasus-kasus kekerasan seksual yang mengandalkan bukti DNA yang tidak
hancur akibat tes skrining awal.

19. Lumatec Superlight 400

Akhirnya, tes terbaru dikembangkan untuk pemeriksaan bercak air mani adalah sumber
cahaya UV-vis disebut Lumatec Superlight 400. Alat tesebut memancarkan cahaya 320-700
nm dan dilakukan uji pada sampel air mani manusia dan babi pada jenis dan warna kain yang
berbeda. Gambar. 10 menunjukkan hasil bercak bercahaya pada kain terang dan gelap dengan
filter yang berbeda. Superlight mampu mendeteksi bercak baik di kegelapan dan di siang
hari; waktu penyimpanan 3 dan 5 minggu tidak menunjukkan perbedaan dalam hasil. Semen
paling baik dideteksi menggunakan cahaya kisaran 415-490 nm dengan kacamata oranye atau
merah. Hasil buruk diperoleh pada kain gelap dan pada kain yang telah dicuci, tetapi berbagai
jenis kain menunjukkan hasil yang sama.

Gambar 11. Lumatec Superlight 40

20. Metode non destruktif

Tabel 2 menunjukkan bahwa banyak metode identifikasi cairan tubuh menggunakan tes
kimia yang bersifat destruktif untuk mengidentifikasi komponen-komponen tertentu di setiap
cairan. Melihat Tabel 3, jelas bahwa banyak teknik yang muncul menggunakan metode
mRNA yang sangat spesifik. Kecuali profil DNA secara bersamaan dianalisis seperti yang
diusulkan oleh Alvarez et al., bahan sampel tambahan akan diperlukan untuk melakukan tes
DNA kedua. Seperti disebutkan sebelumnya, kemampuan untuk mengidentifikasi cairan
tubuh di TKP dengan cara non-destruktif sangat penting untuk melestarikan sampel dan bukti
DNA. Selain menjadi tak rusak, tes yang bisa dilakukan di TKP akibat dari pemeriksaan
terbatas di laboratorium sangat penting dilakukan karena memberikan jawaban instan.

Hal ini memberikan informasi berharga pada para peneliti tentang bercak yang sulit diketahui
seketika sehingga mereka dapat mengubah penyelidikan mereka. Ada beberapa metode non
destruktif yang telah disebutkan, namun terdapat dua metode yang memiliki kemampuan
terbaik untuk mengkonfirmasi setiap cairan. Kedua metode baru tersebut melibatkan
spektroskopi fluoresensi dan spektroskopi Raman, dimana masih dalam tahap percobaan
pengembangan dan saat ini tidak sedang digunakan untuk pengujian forensik.

Harapannya adalah bahwa teknik ini pada akhirnya akan diterima oleh komunitas forensik
dan akan dapat memberikan konfirmasi, identifikasi non-destruktif dari cairan tubuh di TKP
tanpa perlu pengujian laboratorium yang panjang. Mungkin ada kebutuhan untuk duplikat
pengujian di laboratorium dalam tahap awal penerapan metode ini untuk menunjukkan hasil
yang handal dan cocok untuk kesaksian pengadilan, tetapi akhirnya metode baru harus
mampu menghasilkan hasil yang dapat diterima, cara kerja otomatis dan sederhana untuk
digunakan oleh penyidik dan polisi di TKP.

20.1. Fluorescence spectroscopy

Spektroskopi fluoresensi adalah teknik sensitif yang menggunakan fluorophore, merupakan

kelompok kimia suatu analit yang menyerap radiasi (biasanya di daerah ultraviolet) dan
memancarkan cahaya dengan panjang gelombang spesifik. Teknik ini tidak menggunakan
reagen perusak dan tidak menyebabkan kontak dengan sampel, tetapi sifat non-destruktif
dipertanyakan karena kemungkinan adanya fotodegradasi setelah terpapar sinar ultraviolet.

Sebuah metode mendeteksi air liur menggunakan spektroskopi fluoresensi telah dibahas
sebelumnya. Selain itu, Powers dan Lloyd menunjukkan bahwa spektroskopi fluoresensi
ultraviolet dapat diterapkan untuk mengidentifikasi beberapa cairan tubuh. Kemampuan
setiap tes yang akan diterapkan ke beberapa cairan merupakan karakteristik berharga karena
menghilangkan dugaan mengenai tes apa yang akan digunakan berdasarkan cairan apa yang
mungkin tidak diketahui. Banyak komponen yang ditemukan dalam cairan tubuh dapat
menunjukkan fluoresensi seperti asam nukleat, protein dan lipid, produk metabolit dalam
urin, heme dalam darah, air mani kering.

Komposisi cairan masing masing individu (lihat Tabel 1) adalah unik, dan sidik jari kimia
akan sesuai dengan karakteristik spektrum emisi. Gambar.12 menunjukkan spektrum emisi
dari semen, darah, air liur, dan urin diukur dengan panjang gelombang eksitasi 260 nm.
Eksitasi panjang gelombang terendah yang digunakan adalah 260 nm, dan tidak jelas apakah
panjang gelombang ini akan merusak bukti DNA mirip dengan kerusakan yang diamati
dalam penelitian lain menggunakan eksitasi 255 nm. Teknik ini sangat ideal karena dapat
dengan cepat memindai area bahan bernoda yang luas dan sangat sensitif. Penggunaan
beberapa panjang gelombang eksitasi dan deteksi fluoresensi atas berbagai panjang
gelombang memungkinkan untuk identifikasi cairan tubuh tertentu tanpa tumpang tindih
karakteristik masing masing.

Gambar 12. Spektrum fluoresensi emisi semen (), skin oil (-..-..), blood (- -), saliva (-
.-.), and urine ()260 nm.

Studi independen lain memperkenalkan alat fluoresensi genggam yang berpotensi dapat
digunakan di TKP untuk memberikan umpan balik instan tentang identitas cairan tubuh. Alat
ini dirancang pada tahun 2003 untuk mendeteksi mikroba contamina tion, tetapi sensitivitas
tinggi akan membuatnya ideal untuk aplikasi deteksi cairan tubuh ketika digabungkan dengan
perangkat lunak yang tepat.

20.2. Raman spectroscopy

Spektroskopi Raman merupakan teknik bioanalitis non-destruktif lainnya yang memiliki

potensi besar identifikasi konfirmasi cairan tubuh di TKP. Spektroskopi Raman, bila
dibandingkan dengan spektroskopi fluoresensi, menunjukkan selektivitas dan spesifitas kimia
dan biokimia yang lebih tinggi walaupun memiliki sensitivitas yang lebih rendah, dan
berpotensi digunakan dalam menyelesaikan sampel campuran beberapa cairan tubuh. Teori di
balik spektroskopi Raman didasarkan pada hamburan inelastis sinar laser intensitas rendah,
non-destruktif oleh sampel padat, cair atau gas.

Sangat sedikit atau tidak ada persiapan sampel yang dibutuhkan, dan jumlah bahan uji yang
diperlukan oleh mikroskop Raman sebanyak picograms atau femtoliter. Spektrum Raman
terdiri dari beberapa band yang sempit dan memberikan getaran unik. Tidak seperti
spektroskopi absorpsi IR, jenis lain dari spektroskopi vibrasi, spektroskopi Raman
menunjukkan sedikit gangguan air, yang membuatnya menjadi teknik analisis cairan tubuh
yang hebat. Biasanya, spektroskopi Raman non resonansi tidak merusak sampel.

Bercak atau swab dapat diuji di lapangan dan masih dapat digunakan lebih lanjut di
laboratorium untuk analisis DNA, dan yang sangat penting untuk aplikasi forensik. Desain
spektrometer Raman portabel adalah realitas kemampuan untuk membuat identifikasi di
lapangan. Gambar.13 menunjukkan foto instrumen Raman portabel yang dirancang untuk
mengidentifikasi narkotika, bahan peledak, bubuk putih, senjata kimia, dan industri kimia
yang ditemukan di TKP. Sekali lagi, dengan software yang tepat dan implementasi database,
perangkat portabel ini berpotensi dapat digunakan untuk mendeteksi cairan tubuh di
lapangan.

Gambar 13. Spektometer Raman portabel

Microspectroscopy Raman memanfaatkan cahaya inframerah pendek non-actinic (non-

destruktif) untuk eksitasi, baru-baru ini diterapkan untuk analisis cairan tubuh yang
mengering termasuk darah, air mani, air liur, cairan vagina, dan keringat. Hasil yang
dilaporkan sangat menjanjikan dan menunjukkan spektrum Raman mengidentifikasikan
setiap cairan tubuh yang berbeda. Komposisi yang berbeda dari masing-masing cairan yang
tercantum dalam Tabel 1 membuat setiap cairan itu unik, dan variasi ini menghasilkan
karakteristik spektrum Raman.

Sifat spektrum Raman memiliki puncak tajam yang berbeda dengan luas puncak spektrum
emisi fluoresensi membuat metode spektroskopi Raman jauh lebih selektif dan spesifik, dan
teknik ini berpotensi lebih berguna untuk tujuan forensik. Pekerjaan masa depan berupa
mengevaluasi potensi spektroskopi Raman sangat diperlukan untuk menganalisa campuran
cairan tubuh serta bercak pada berbagai substrat. Potensialnya campuran dari beberapa cairan
tubuh dapat dikarakteristikan dengan spektroskopi Raman menggunakan analisis statistik
canggih seperti significant factor analisis (SFA) dan alternating least squares (ALS)
menggunakan perangkat lunak seperti MATLAB 7.0.

Spektrum Raman cairan tubuh setiap individu memiliki puncak sesuai dengan komponen
biologis tertentu, dan campuran cairan akan menghasilkan spektrum yang merupakan
kombinasi dari semua puncak ini yang dapat diselesaikan secara matematis menjadi spektrum
secara individual. Selain itu, spektroskopi Raman mampu membedakan antara semen
manusia dan anjing. Kemampuan untuk membedakan jenis cairan tubuh di TKP juga sangat
penting, dan beberapa teknik yang disebutkan sebelumnya dapat melakukan tugas ini hanya
dengan cara destruktif. Studi lain tidak dapat membedakan kucing, anjing, dan sampel darah
manusia menggunakan spektroskopi Raman. Penelitian lebih banyak diperlukan untuk
menentukan kemampuan metode ini untuk mengidentifikasi spesies yang berbeda.

Gambar 14.Spektrum Raman pada mani, cairan vagina, air liur, keringat, dan darah
dengan eksitasi 785-nm

20.3 Kombinasi fluorescence in situ hybridisation dan laser microdissection

Murray et al. menjelaskan menggabungkan fluoresensi in situ hibridisasi (FISH) dan laser
microdissection (LMD) untuk mengidentifikasi dan mengisolasi sel laki-laki dari campuran
sel laki-laki dan perempuan. Sampel intim harus diperoleh beberapa jam setelah hubungan
seksual. Penerapan teknik ini terbatas pada sejumlah kecil kasus dengan persyaratan sampel
yang akan diambil dalam waktu 24 jam dari kejadian. Teknik ini juga bergantung pada
sampel kualitas yang baik dan sel utuh; Oleh karena itu, penting bahwa sel tidak mengalami
lisis.

FISH / LMD memerlukan penggunaan 34 siklus PCR; Namun, kajian independen

menegaskan bahwa teknik LCN DNA yang digunakan oleh FSS adalah bentuk bukti
divalidasi dan cocok untuk tujuan.

Gambar 15. Sel wanita dan pria dengan pewarnaan fluorescence in situ hybridisation.
Chromosom X (orange) dan chromosom Y (hijau) diwarnai dengan alat Vysis CEP1X
Spectrum OrangeTM/Y Spectrum GreenTM DNA.

21. Pemeriksaan DNA

Sampel dari kasus serangan-seksual sering ditandai dengan campuran seimbang dari sel epitel
dan sperma, dengan campuran cairan tubuh korban, yang mengakibatkan rasio yang tidak
menguntungkan DNA laki laki : perempuan. Menurut beberapa penelitian, komponen DNA
autosomal laki-laki dari campuran terlalu rendah untuk dideteksi di atas rasio laki-laki : DNA
perempuan 1 : 10 1 : 20. Pada dasarnya adalah karena kompetisi primer selama amplifikasi
PCR, yang mengarah ke amplifikasi preferensial komponen utama dari campuran. Dalam
kasus tersebut, penggunaan penanda genetik Ychromosome, seperti short tandem repeats
(STR), memungkinkan amplifikasi jumlah rendah dari DNA laki-laki yang bebas dari DNA
korban. Namun, profil Y-STR tidak informatif sebagai profil STR autosom. Pertama,
hubungan paternal pada laki-laki tidak dapat dibedakan. Kedua, frekuensi profil Y-STR di
populatio bisa relatif tinggi, menghambat diskriminasi beberapa laki-laki yang tidak terkait.
Ketiga, profil Y-STR tidak masuk dalam database DNA nasional. Oleh karena itu, profil Y-
STR yang diperoleh secara umum hanya dapat dibandingkan dengan profil Y-STR dari
suspek yang dikenal.

Oleh karena itu, laboratorium forensik-genetika mencoba untuk memisahkan cairan laki-laki
dari cairan wanita untuk meningkatkan peluang mendapatkan profil autosomal pelaku.
Beberapa teknik pemisahan sel yaitu: lisis diferensial, yang bergantung pada ketahanan
diferensial spermatozoa dan sel epitel terhadap bahan kimia; laser microdissection, yang
memungkinkan eksisi dan koleksi spermatozoa, tidak bergantung dari bahan selular
sekitarnya; membran filtrasi dan pelatan mikro yang mengeksploitasi perbedaan antara
ukuran dan bentuk sel-sel; dan aliran cytometry, yang mengambil keuntungan dari protein
membran tertentu untuk menandai dan memisahkan sel. Kebanyakan laboratorium forensik
menggunakan ekstraksi DNA diferensial, yang tidak memerlukan peralatan yang mahal dan
cepat dicapai. Secara singkat, teknik ini termasuk langkah lisis sel ringan yang
memungkinkan pemulihan fraksi sel-epitel diperkaya dengan DNA sel-sel epitel wanita dan
leukosit. Lisis sel yang kuat kemudian digunakan untuk memecahkan membran spermatozoa
dan memulihkan fraksi DNA sperma.