BAB I

PENDAHULUAN

A. Latar Belakang

Dewasa ini kepekatan warna sangat berguna dalam pengujian sampel tertentu.
Spektrofotometer mampu membaca atau mengukur kepekatan warna dari sampel
tertentu dengan penjang gelombang tertentu pula. Alat ini digunakan untuk
mengukur konsentrasi beberapa molekul seperti DNA/RNA (UV light, 260 nm),
protein (UV, 280 nm), kultur sel bakteri, ragi/yeast (VIS light, 600 nm), dan lain-
lain.

Spektrofotometri merupakan suatu metoda analisa yang didasarkan pada

pengukuran serapan sinar monokromatis oleh suatu lajur larutan bewarna pada
panajng gelombang spesifik dengan menggunakan monokromator, prisma atau
kisi difraksi dengan detektro fototube. Sedangkan peralatan yang digunakan
dalam spektrofotometri disebut Spektrofotometer. Cahaya yang dimaksud dapat
berupa cahaya Visible, UV, dan Infamerah, sedangkan materi dapat berupa atom
dan molekul namun yang lebih berperan adalah electron yang ada pada ataom
ataupun molekul yang bersangkutan. Spektrofotometri merupakan salah satu alat
yang harus dikalibrasi agar dalam pemeriksaan menggunakan alat
spektrofotometri ini dapat menghasilkan hasil yang sebenarnya.

Pengertian Kalibrasi menurut ISO/IEC Guide 17025:2005 dan Vocabulary of International

Metrology (VIM) adalah serangkaian kegiatan yang membentuk hubungan antara nilai yang
ditujukan oleh instrument ukur atau system pengukuran, atau nilai yang diwakili oleh bahan
ukur, dengan nilai-nilai yang sudah diketahui yang berkaitan dari besaran yang diukur dalam
kondisi tertentu. Dengan kata lain, kalibrasi adalah kegiatan untuk menentukan kebenaran
konvensional nilai penunjukan alat ukur dan bahan ukur dengan cara membandingkan terhadap

1
standar ukur yang mampu telusuri (traccable) ke standar nasional untuk satuan ukur dan/atau
internasional.

B. Rumusan Masalah
1. Pengertian Kalibrasi
2. Pengertian Spektrofotometer
3. Jenis-Jenis Spektrofotometer
4. Komponen-komponen spektrofotometer
5. Mekanisme Kerja Spektrofotometer
6. Cara Perawatan Spektrofotometer
7. Kalibrasi Spektofotometer

C. Tujuan
1. Untuk mengetahui Pengertian Kalibrasi
2. Untuk mengetahui Pengertian Spektrofotometer
3. Untuk menegtahui Jenis-Jenis Spektrofotometer
4. Untuk mengetahui Komponen-komponen pada Spektrofotometer
5. Untuk mengetahui Mekanisme Kerja Spektrofotometer
6. Untuk mengetahui cara perawatan spektrofotometer
7. Untuk mengetahui cara Kalibrasi Spektofotometer

2
 BAB II

PEMBAHASAN

1. Pengertian Kalibrasi

Kalibrasi merupakan proses verifikasi bahwa suatu akurasi alat ukur sesuai
dengan rancangannya. Kalibrasi biasa dilakukan dengan membandingkan suatu
standar yang terhubung dengan standar nasional maupun internasional dan bahan-
bahan acuan tersertifikasi.
Sistem manajemen kualitas memerlukan sistem pengukuran yang efektif,
termasuk di dalamnya kalibrasi formal, periodik dan terdokumentasi, untuk
semua perangkat pengukuran. ISO 9000 dan ISO 17025 memerlukan sistem
kalibrasi yang efektif.
Sekilas tentang Kalibrasi merupakan proses verifikasi bahwa suatu akurasi alat
ukur sesuai dengan rancangannya. Kalibrasi biasa dilakukan dengan
membandingkan suatu standar yang terhubung dengan standar nasional maupun
internasional dan bahan-bahan acuan tersertifikasi. Sistem manajemen kualitas
memerlukan sistem pengukuran yang efektif, termasuk di dalamnya
kalibrasi formal, periodik dan terdokumentasi, untuk semua perangkat
pengukuran. ISO 9000 dan ISO 17025 memerlukan sistem kalibrasi yang efektif.
Kalibrasi diperlukan untuk:

1. Perangkat baru
2. Suatu perangkat setiap waktu tertentu
3. Suatu perangkat setiap waktu penggunaan tertentu (jam operasi)
4. Ketika suatu perangkat mengalami tumbukan atau getaran yang
berpotensi mengubah kalibrasi
5. Ketika hasil observasi dipertanyakan

3
 Kalibrasi, pada umumnya, merupakan proses untuk menyesuaikan
keluaran atau indikasi dari suatu perangkat pengukuran agar sesuai dengan
besaran dari standar yang digunakan dalam akurasi tertentu. Contohnya,
termometer dapat dikalibrasi sehingga kesalahan indikasi atau koreksi dapat
ditentukan dan disesuaikan (melalui konstanta kalibrasi), sehingga
thermometer tersebut menunjukan temperatur yang sebenarnya dalam celcius
pada titik-titik tertentu di skala. Di beberapa negara, termasuk Indonesia,
terdapat direktorat metrologi yang memiliki standar pengukuran (dalam SI
dan satuan-satuan turunannya) yang akan digunakan sebagai acuan bagi
perangkat yang dikalibrasi. Direktorat metrologi juga mendukung infrastuktur
metrologi di suatu negara (dan, seringkali, negara lain) dengan membangun
rantai pengukuran dari standar tingkat tinggi/internasional dengan perangkat
yang digunakan. Hasil kalibrasi harus disertai pernyataan traceable
uncertainity untuk menentukan tingkat kepercayaan yang di evaluasi dengan
seksama dengan analisa ketidakpastian.

2. Spektrofotometer

Spektrofotometer sesuai dengan namanya adalah alat yang terdiri dari

spectrometer dan fotometer. Spektrofotometer menghasilkan sinar dari spectrum
dengan panjang gelombang tertentu dan fotometer adalah alat pengukur intensitas
cahaya yang di transmisikan atau yang di absorpsi. Jadi Spektrofotometer
digunakan untuk mengukur energy secara relative jika energi tersebut
ditransmisikan, direfleksikan atau diemisikan sebagai fungsi dari panjang
gelombang.

Kelebihan spektrofotometer dibandingkan fotometer adalah panjang

gelombang dari sinar putih lebih dapat terseleksi dan ini diperoleh dengan alat
pengurai seperti prisma, grating ataupun celah optis. Pada fotometer filter tidak
mungkin diperoleh panjang gelombang yang benar benar monokromatis,

4
melainkan suatu trayek panjang gelombang 30-40 nm. Sedangkan pada
spektrofotometer panjang gelombang yang benar-benar terseleksi dapat diperoleh
dengan bantuan alat pengurai cahaya seperti prisma. Suatu spektrofotometer
tersusun dari sumber spectrum tampak yang kontinyu, monokromator, sel
pengabsorpsi untuk larutan sampel atau blanko dan suatu alat untuk mengukur
perbedaan absorpsi anatra sampel dan blanko ataupun pembanding (Khopkar
SM.1990).

3. Jenis-jenis spektrofotometri
Berdasarkan sumber cahaya yang digunakan :
A. Spektrofotometri UV (ultraviolet)

Berbeda dengan spektrofotometri visible, pada spektrofotometri UV

berdasarkan intersaksi sampel dengan sinar UV. Sinar UV memiliki panjang
gelombang 190-380 nm. Sebagai sumber sinar dapat digunakan lampu
deuterium. Karena sinar UV tidak dapat dideteksi dengan mata kita, maka
senyawa yang tidak memiliki warna atau bening dan transparan.

B. Spektrofotometri Visible (Spektro Vis)

Pada spektrofotometri ini yang digunakan sebagai sumber sinar atau energy
adalah cahaya tampak atau visible. Cahaya visible termasuk spectrum
elektromagnetik yang dapat di tangkap oleh mata manusia. Panjang
gelombang sinar tampak adalah 380-750 nm. Sampel yang dapat dianalisis
dengan metode ini hanya sampel yang memiliki warna. Hal ini menjadi
kelemahan tersendiri dari metode Spektrofotometri Viseble.

C. Spektrofotometer UV-Vis

Spektrofotometer UV-Vis adalah anggota teknik analisis

spektroskopik yang memakai sumber REM (radiasi elektromagnetik)

5
Ultraviolet dekat (160-380 nm) dan sinar tampak (380-780 nm) dengan
memakai instrument spektrofotometer. Spektrofotometrik UV-Vis melibatkan
energy elektronok yang cukup besar pada molekul yang dianalisis, sehingga
spektrofotometri UV-Vis lebih banyak dipakai untuk analisis kuantitatif
dibandingkan kualitatif.

Spektroskopi UV/Vis merupakan metode penting yang mapan, handal,

dan akurat. Dengan menggunakan spektroskopiu UV/Vis, substansi tak
dikenal dapat di identifikasi dan konsentrasi substansi yang dikenal dapat
ditentuikan. Pelarut untuk Spektroskopi UV harus memiliki sifat pelarut yang
baik dan memancarkan UV dalam rentang UV yang luas.

Spektrofotometer UV-Vis adalah alat yang digunakan untuk mengukur

transmitansi, Reflektansi dan absorpsi dari cuplikan sebagai fungsi dari
panjang gelombang.

D. Spektrofotometri IR (Infra Red)

Dari namanya sudah bisa dimengerti bahwa spektrofotometri ini

berdasar pada penyerapan panjang gelombang infra merah. Cahaya infra
merah terbagi menjadi infra merah dekat, pertengahan, dan jauh. Infra merah
pada spektrofotometri adalah infra merah jauh dan pertengahan yang
mempunyai panjang gelombang 2.5-1000 m.

Pada spektro IR meskipun bisa digunakan untuk analisa kuantitatif,

namun biasanya lebih kepada analisa kualitatif. Umumnya spektro IR
digunakan untuk mengidentifikasi gugus fungsi pada suatu senyawa, terutama
senyawa organik. Setiap serapan pada panjang gelombang tertentu
menggambarkan adanya suatu gugus fungsi spesifik.

6
4. Komponen-komponen pada Spektrofotometer

Spektrofpotometer ada beberapa komponen di antara nya yang

pertama adalah sumber cahaya. Sebagai sumber cahjaya pada
spektrofotometer haruslah memiliki pancaran radiasi yang stabil dan
intensitasnya tinggi. Sumber energy cahaya yang bisa untuk daerah tampa.
Ultraviolet dekat dan inframerah dekat adalah sebuah lampu pijar dengan
kawat rambut terbuat dari wolfram (tungsten). Lampu ini mirip dengan bola
lampu pijar biasa, daerah panjang gelombang adalah 350-2200 nm.

Tabel Spektrum Cahaya Tampak (visible)

Warna Interval Interval v

Red 625-740 nm 480-405 THz
Orange 590-625 nm 510-480 THz
Yellow 565-590 nm 530-510 THz
Green 520-565 nm 580-530 THz
Cyan 500-520 nm 600-580 THz
Blue 430-500 nm 700-600 THz
Violet 380-430 nm 790-700THz

Tabel Spektrum Cahaya Tampak (Visible)

Panjang gelombang Warna Warna Komplementer

(nm)
400-435 Lembayung (Violet) Kuning-Hijau
435-480 Biru Kubung
480-490 Hijau-Biru Jingga
490-500 Biru-Hijau Merah

7
 500-560 Hijau Ungu (purple)
560-580 Kuning-Hijau Lembayung ( Violet)
580-595 Kuning Biru
595-610 Jingga Hijau-Biru
610-750 Merah Biru-Hijau

5. Mekanisme Kerja Spektrofotometer

Cara Kerja Spektrofotometer secara singkat adalah sebagai berikut.

Tempatkan Larutan pembanding, misalnya blanko dalam sel pertama sedangkan
larutan yang alkan dianalisis pada sel kedua. Kemudian pilih foto sel yang cocok
200 nm 650 nm (650 nm-110 nm) agar daerah yang diperlukan dapat terukur.
Dengan ruang foto sel dalam keadaan tertutup 0 galvanometer didapat dengan
menggunakan tombol dark/current. Pilih h yang diinginkan. Buka fotosel dan
lewatkan berkas cahaya pada blanko dan 0 galvanometer didapat dengan
memutar tombol sensitifitas. Dengan menggunakan tombol transmitansi.
Kemudian atur besarnya pada 100%. Lewatkan Berkas cahaya pada larutan
sampel yang akan dianalisis. Skala absorbansi menunjukan absorbansi larut
sampel.

Berikut cara kerja spektrofotometer secara singkat adalah sebagai berikut :

8
6. Cara Perawatan
Cara Perawatan dan Penyimpanan Alat :
1. Sebelum digunakan, biarkan mesin warming-up selama 15-20 menit.
2. Spektrofotometer sebisa mungkin tidak terpapar sinar matahari langsung,
karena cahaya dari matahari akan dapat mengganggu pengukuran.
3. Simpan spektrofotometer di dalam ruangan yang suhunya stabil dan diatas
meja yang permanen.
4. Pastikan kompartemen sampel bersih dari bekas sampel.
5. Saat memasukkan kuvet, pastikan kuvet kering.
6. Lakukan kalibrasi panjang gelombang dan absorban secara teratur.
7. Hal-hal yang harus diperhatikan :
8. Larutan yang dianalisis merupakan larutan berwarna
Apabila larutan yang akan dianalisis merupakan larutan yang tidak
berwarna, maka larutan tersebut harus diubah terlebih dahulu menjadi
larutan yang berwarna. Kecuali apabila diukur dengan menggunakan
lampu UV.

9. Panjang gelombang maksimum

Panjang gelombang yang digunakan adalah panjang gelombang yang
mempunyai absorbansi maksimal. Hal ini dikarenakan pada panajgn
gelombang maksimal, kepekaannya juga maksimal karena pada panjang
gelombang tersebut, perubahan absorbansi untuk tiap satuan konsentrasi
adalah yang paling besar. Selain itu disekitar panjang gelombang maksimal,
akan terbentuk kurva absorbansi yang datar sehingga hukum Lambert-Beer
dapat terpenuhi. Dan apabila dilakukan pengukuran ulang, tingkat
kesalahannya akan kecil sekali.

10. Kalibrasi Panjang gelombang dan Absorban

Spektrofotometer digunakan untuk mengukur intensitas cahaya yang
dipancarkan dan cahaya yang diabsorbsi. Hal ini bergantung pada spektrum

9
 elektromagnetik yang diabsorb oleh benda. Tiap media akan menyerap cahaya
pada panjang gelombang tertentu tergantung pada senyawa yang terbentuk.
Oleh karena itu perlu dilakukan kalibrasi panjang gelombang dan absorban
pada spektrofotometer agar pengukuran yang di dapatkan lebih teliti.

7. Kalibrasi pada Spektrofotometer

Cara Kalibrasi spektrofotometer :
1. Pengukuran Panjang gelombang (presisi akurasi)
2. Absorban (presisi akurasi)
3. Sinar sesatan

Verifikasi (unjuk kerja) alat : pengecekan secara rutin

1. Panjang gelombang (presisi akurasi)

Ada tiga metode kalibrasi

1. a. Lampu lucutan bertekanan rendah (Hg; Cd atau Zn)

Tabel 1. Garis emisi lampu Hg, Cd dan Zn

Unsur (nm) Unsur (nm)

Hg 185,0 Hg 435,8
Zn 213,9 Cd 467,8
Cd 228,8 Cd 480,0
Hg 253,7 Hg 546,1
Hg 365,0 Hg 579,1
Hg 404,7 Cd 643,8

10
1. b. Gelas filter Holmium atau Didimium

Tabel 2. Data maks terseleksi dari Holmium dan Didimium

Filter Holmium Filter Didimium

maks (nm) maks (nm)

241,5 0,2 573 3,0
279,4 0,3 586 3,0
287,5 0,4 685 4,5
333,7 0,6
360,9 0,8
418,4 1,1
453,2 1,4
536,2 2,3
637,5 3,8

1. c. Larutan Halmium oksida dalam HClO4

Tabel 3. Panjang Gelombang Maks Larutan Holmium Oksida

Panjang Gelombang Maks Larutan Holmium Oksida (nm)

241,1 0,1
278,2 0,5
287,2 0,2
361,2 0,2

11
 Pengecekan panjang gelombang

1) Keterulangan panjang gelombang / wavelength repeatability

Adalah ukuran kemampuan suatu spektrofotometer untuk kembali

pada posisi spektral yang sama yang ditentukan berdasarkan pita absorpsi dari
suatu pita (band) dari panjang gelombang yang telah diketahui bila alat di
reset atau dibaca pada panjang gelombang yang telah ditentukan.

2) Akurasi panjang gelombang / wavelength accuracy

Adalah besarnya penyimpangan (bias) dari rata-rata pembacaan

panjang gelombang pada suatu pita (band) absorpsi dari panjang gelombang
yang telah ditentukan.

2. Absorban (presisi akurasi)

Kalibrasi absorbansi

Konsentrasi analit yang mengabsorpsi berbanding lurus dengan absorbansi

yang terukur
Linearitas skala fotometrik harus diperiksa
Stabilitas pembacaan fotometrik harus cukup baik sehingga variansi selama
pengukuran tidak berpengaruh pada ketelitian

Bahan yang dapat digunakan untuk kalibrasi absorban sbb

Larutan dikromat

Larutan K2Cr2O7 dalam 0,005 M H2SO4 (direkomendasikan untuk daerah UV)

12
Tabel 4. Harga absorban K2Cr2O7 dalam 0,005 M H2SO4

(nm) Larutan A Larutan B

235 (Min) 0,626 0,009 1,251 0,018
257 (Maks) 0,727 0,007 1,454 0,014
313 (Min) 0,244 0,004 0,488 0,008
350 (Maks) 0,536 0,005 1,071 0,010

Kalibrasi absorban dilakukan pada suhu : 20 30 oC

1. Asam kromat
2. Tembaga sulfat

Larutan CuSO4 dalam H2SO4 1 % (direkomendasikan untuk daerah Vis)

Tabel 5. Nilai absorbansi larutan CuSO4 dalam H2SO4 1%

Panjang Gelombang (nm) Absorbansi

600 0,068
650 0,224
700 0,527
750 0,817

Catatan :

Pengukuran dilakukan dengan kuvet 10 mm

Lebar pita (bandwidths) lebih kecil dari 10 nm
Penyimpangan absorban maksimum 2 %

13
3. Sinar sesatan

Untuk mengetahui unjuk kerja sinar sesatan dianjurkan menggunakan metoda

ASTM dengan cara :

Pada 220 nm: ukur transmitansi dari 10 g/L NaI dengan kuvet 1 cm %T < 10-10

Pada 340 nm: ukur transmitansi dari 50 g/L NaNO3 dengan kuvet 1 cm %T = ?

Tabel 5.

Ring spectral (nm) Filter cairan Panjang sel (mm)

165 173,5 Air 0,10
170 183,5 Air 10,0
175 200 KCl encer (12 g/L) 10,0
195 223 NaBr encer (10 g/L) 10,0
210 259 NaCl encer (10 g/L) 10,0
250 320 Aseton 10,0
300 385 NaNO3 encer (50 g/L) 10,0

14
 BAB III

PENUTUP

A. KESIMPULAN

Kalibrasi spektrofotometri penting dilakukan untuk :

1. mendukung sistem manajemen mutu ISO yang diterapkan di berbagai

industri, layanan kesehatan, dan pendidikan pada peralatan laboratorium dan
produksi yang dihasilkannya.
2. Menjamin hasil-hasil pengukuran sesuai dengan standar nasional ataupun
internasional dan dengan melakukan kalibrasi.
3. Agar alat spektrofotometer dapat digunakan dengan baik (menghasilkan data
yang handal dan valid) dan awet
4. Dapat diketahui seberapa jauh perbedaan (penyimpangan) antara nilai
kebenaran standar dengan nilai yang ditunjukkan oleh alat ukur
spektrofotometri.
5. Untuk mengetahui letak kesalahan atau kerusakan Spektrofotometri secara
dini sehingga dapat diperbaiki sebelum alat mengalami kerusakan berat

B. SARAN
Sebaiknya dilakukan kalibrasi secara rutin pada Spektrofotometri agar
hasil pengukuran menghasilkan data yang valid dan agar alat menjadi tahan
lama.

15
 DAFTAR PUSTAKA

https://environmentalchemistry.wordpress.com/2013/07/01/kalibrasi-
spektrofotometer-uvvis/

http://wahyuriyadi.blogspot.co.id/2009/07/macam-spektrofotometri-dan-
perbedaannya.html

https://wanibesak.wordpress.com/tag/bagian-bagian-spektrofotometer/

http://lku.uad.ac.id/manfaat-kalibrasi

https://id.wikipedia.org/wiki/Kalibrasi

16