Isolasi,Identifikasi dan Pemurnian Kofein dari Daun The

(Theae Folium)
TUJUAN
Ekstraksi padat-cair senyawa organik dari simplisia tanaman
Ekstraksi cair-cair secara bertahap
Kromotografi lapis tipis dan kromatografi lapis tipis preparatif dari senyawa organik
Pemurnian hasil isolasi dengan cara sublimasi
DASAR TEORI
Ekstraksi adalah suatu proses pemisahan dari bahan padat maupun cair dengan bantuan
pelarut.Ekstraksi dapat dibedakan menjadi dua: ekstraksi padat-cair dan ekstraksi cair-cair.
Ekstraksi padat-cair
Ekstraksi padat-cair adalah transfer difusi komponen terlarut dari padatan inert kedalam
pelarutnya.Macam-macam cara ekstraksi padat-cair:
Maserasi :Metode pengekstaksian serbuk simplisia dengan cara merendam dalam cairan
penyari dengan beberapa kali pengocokan atau pengadukan pada suhu kamar.Metode maserasi
sering dimodifikasi dengan cara remaserasi.
Perkolasi :Metode pengekstraksian dengan pelarut yang selalu baru sampai sempurna
(exhaustive extraction) yang umumnya dilakukan pada temperature ruangan.
Digesti :Maserasi kinetik dengan pengadukan yang kontinyu pada temperature yang lebih tinggi
dari temperature ruangan (kamar),yaitu secara umum dilakukan pada temperature 40-50 C.
Refluks :Ekstraksi dengan pelarut pada temperature titik didihnya selama waktu tertentu dan
jumlah pelarut terbatas yang relative konstan dengan adanya pendingin balik.
Soxhlet :Ekstraksi menggunakan pelarut yang selalu baru yang umumnya dilakukan dengan alat
khusus (alat soxlet) sehingga terjadi ekstraksi berkesinambungan / kontinyu dengan jumlah
pelarut relative konstan dengan adanya pendingin balik.
Destilasi :
o Destilasi sederhana digunakan untuk memisahkan zat cair yang titik didihnya rendah atau
memisahkan zat cair dengan zat padat atau minyak.
o Destilasi Uap Air adalah metode yang popular untuk ekstraksi minyak-minyak menguap (esensial)
dari simplisia tanaman.Metode ini diperuntukan untuk menyari simplisia yang mengandung
minyak menguap atau mengandung komponen kimia yang mempunyai titik didih tinggi pada
tekanan udara normal.
Ekstrasi Cair Cair
Ekstraksi cair-cair yaitu suatu proses transfer massa zat terlarut (solut) diantara 2 pelarut
yang tidak saling bercampur.Zat yang diekstraksi terdapat didalam cairan berbentuk cair.Tujuan
ekstraksi pelarut adalah purifikasi dan pemisahan dua senyawa atau lebih berdasarkan koefisien
distribusinya.
Kesempurnaan ekstraksi dipengaruhi oleh PH,macam pelarut,jumlah volume pelarut,dan
jumlah ekstraksi yang dilakukan.

Kromatografi

Kromatografi Lapis Tipis adalah cara pemisahan zat yang cepat dengan menggunakan zat
penjerap serbuk halus yang dilapiskan seba rata pada lempeng kaca atau bahan lain yang sesuai
Kromatografi Kertas
Kromatografi Kolom adalah kromatografi yang menggunakan kolom sebagai alat untuk
memisahkan komponen-komponen dalam campurannya.

DAUN TEH DAUN TEH KERING

SISTEMATIKA TANAMAN TEH ( THEAE SINENSIS ) :

 Divisi : Spermatophyta ( Tumbuhan biji )
Subdivisi : Angiospermae ( Tumbuhan Biji Terbuka )
Kelas : Dicotyledoneae ( Tumbuhan biji belah )
Subkelas : Dialypetalae
Ordo : Guttiferales ( Clusiales )
Familia : Camilliaceae ( Theaceae )
Genus : Camellia
Spesies : Camellia sinensis ; Theae sinensis
Varietas : Assamica

KANDUNGAN THEAE FOLIUM ( DAUN TEH )

Alkaloid golongan purin antara lain kofein, theofilin dan theobromin. Selain itu juga
mengandung polifenol, tannin, asam fenolat, katekin (epikatekin/EC, Epigalat/EG,
Epigalokatekin /EGC, Epigalo katekin Galat/EGCG, Quersetin (Soya, Noni.2007) ). Teh berguna
untuk antioksidan (katekin), antikanker, mencegah peningkatan kolesterol dalam darah, anti
diare (tanin).
Dalam daun teh kofein berada dalam prosentase 25 %. Kofein (1, 3, 7 Trimethilxantin)
berupa kristal jarum mengkilat warna putih, tidak berbau dan berasa pahit. Kelarutan kofein
dalam air (1 : 45,5 suhu 25 C; 1: 5,5 suhu 80 C; 1 : 1,5 suhu 100 C ), dalam alkohol (1 : 22);
diklormetan (1:7); CHCL3 (1:6). Berat molekul 194,19 dan titik lebur 235.
 STRUKTUR DAUN TEH

AKTIVITAS EMPIRIS

Kofein bersifat termostabil sehingga ekstraksi dapat dilakukan dengan cara refluks atau
digesti. Penambahan MgO dapat memisahkan kofein dari senyawa senyawa yang tidak
diinginkan misalnya tanin. Jika konsentrasi basa terlalu tinggi dapat merusak kofein menjadi
koefeedin. Penambahan asam sulfat untuk mengendapkan MgO yang tidak tersaring dengan
menbentuk garam.
Kofein dalam fase cair diekstraksi dengan kloroform karena dalam suasana asam
kelarutan kofein dalam kloroform lebih besar dari kelarutan dalam air. Kofein yang terekstraksi
dalam kloroform dicuci dengan NaOH untuk menghilangkan warna alaminya juga untuk
menetralkan kelebihan H2SO4. Kofein pada manusia mempunyai efek stimulasi SSP, relaksasi
otot bronkus dan diuretik.
Ada beberapa faktor yang dapat mempengaruhi ekstraksi, diantaranya (Kirk-Othmer,
1998) :
a. Suhu
Kelarutan bahan yang diekstraksi dan difusivitas biasanya akan meningkat dengan
meningkatnya suhu, sehingga diperoleh laju ekstraksi yang tinggi. Pada beberapa kasus, batas
atas untuk suhu operasi ditentukan oleh beberapa faktor, salah satunya adalah perlunya
menghindari reaksi samping yang tidak diinginkan.

b. Ukuran partikel
Semakin kecil ukuran partikel, semakin besar luas bidang kontak antara padatan dan
solven, serta semakin pendek jalur difusinya, yang menjadikan laju transfer massa semakin
tinggi.
c. Faktor solven
Kafein biasanya diisolasi dengan ekstraksi menggunakan solven organik, dan kondisi
ekstraksi (solven, suhu, waktu, pH, dan rasio komposisi solven dengan bahan) dapat
mempengaruhi efisiensi ekstraksi kafein (Perva U et al., 2006).
PRINSIP KERJA

1. Ekstraksi
Ekstrak adalah sediaan pekat atau kering yang diperoleh dengan mengekstraksi zat-zat
aktif dari simplisia nabati atau simplisia hewani menggunakan pelarut yang sesuai, kemudian
semua atau hampir semua pelarut diuapkan dan massa atau serbuk yang tersisa diperlakukan
sedemikian rupa sehingga memenuhi baku yang telah ditetapkan.Ekstraksi adalah kegiatan
penarikan zat yang dapat larut dari bahan yang tidak dapat larut dengan menggunakan pelarut
cair. Ekstraksi merupakan proses penyarian simplisia nabati atau simplisia hewani dengan cara
dan pelarut yang sesuai, bebas dari pengaruh cahaya langsung.
Ekstraksi dapat dilakukan berbagai cara :
a. Ekstraksi padat cair ( Leaching ) adalah :
Transfer difusi komponen terlarut dari padatan inert ke dalam pelarutnya. Proses ini
merupakan proses yang bersifat fisik karena komponen trlarut kemudian dikembalikan lagi ke
keadaan semula tanpa mengalami perubahan kimiawi. Ekstraksi dilakukan jika bahan yang
dimaksud larutnya dalam solvent pengekstrak.

b. Ekstraksi cair cair adalah :

Suatu proses transfer massa zat terlarut ( solut ) diantara 2 pelarut yang tidak saling
campur. Zat yang diekstraksi terdapat di dalam campuran berbentuk cair. Tujuan utama ekstraksi
pelarut adalah purifikasi. Purifikasi dapat terjadi jika solut memiliki koefisien partisi besar
sedangkan pengotor memiliki koefisien partisi yang lebih rendah. Kegunaan lainnya untuk
pemisahan dua senyawa atau lebih berdasarkan koefisien distribusinya, hal ini terjadi jika dua
senyawa memiliki sifat kimia sangat berbeda.
2. Kromatografi
 Dasar pemisahan: Perbedaan kecepatan migrasi komponennya / senyawa senyawa yang
dibawa oleh fase gerak dan ditahan secara selektif oleh fase diam, yang bertujuan untuk
memisahkan senyawa senyawa dengan waktu yang tidak terlalu lama.
Metode kromatografi yang dipakai pada pratikum ini antara lain :
a. Kromatografi lapis tipis (KLT) :
Merupakan cara pemisahan zat yang cepat dengan menggunakan bahan berbutir butir
(fase diam) yang ditempatkan pada penyangga berupa pelat gelas/ kaca, logam, atau lapisan lain
yang sesuai. Mekanisme pemisahan : adsorpsi dan partisi.
Penilaian kromatogram : angka Rf pada lempeng KLT.
Jarak pengembangan senyawa pada kromatogram biasanya dinyatakan dengan angka Rf atau hRf
atau x 100. Jika angka hRf > hRf yang dinyatakan , dapat dikatakan kepolaran pelarut harus
dikurangi, jika angka Rf < hRf yang dinyatakan, maka komponen polar pelarut harus dinaikkan (
Egon Stahl, 1985 ).
b. Kromatografi lapis tipis preparatif (KLTP) :
KLTP masih merupakan metode yang banyak digunakan karena merupakan metode yang
sederhana, relatif murah, cepat dan mampu memisahkan sampel antara 1mg 1 g. KLTP
digunakan pada pemurnian tahap akhir dalam prosedur isolasi (tergantung kompleksitas ekstrak),
diutamakan untuk pemisahan campuran yang telah dipisahkan sebagian.
3. Sublimasi :
Sublimasi yaitu pemisahan komponen-komponen dalam campuran yang mudah
menyublim dengan cara penyubliman melalui pemanasan. Sublimasi dapat dilakukan untuk
memisahkan komponen campuran yang mudah menyublim. Dalam hal ini zat yang dapat
menyublim adalah kofein.
ALAT DAN BAHAN

1. Isolasi
Alat : Beaker glass, corong pisah, corong gelas, beaker glass, pemanas, cawan penguap, klem
dan satif.
Bahan : teh kering, MgO/CaO, NaOH, aquadest, CHCL
2. KLT dan KLT Preparatif
 Alat : Bak kromatografi, lempeng KLT Silika gel GF, beaker glass, pipa kapiler, kertas saring,
papan kromatografi, beaker glass.
Bahan : kofein, metanol, eter, kloroform, Silika gel GF,
3. Sublimasi
Alat : Cawan penguap, corong gelas, kertas saring, kapas, asbes, kaki tiga

CARA KERJA

1. Isolasi Kofein
a. Ekstraksi padat-cair
Masukkan 50 gram serbuk teh kering dalam beaker glass 500 ml, tambahkan 25 gram MgO dan
250 ml air panas. Panaskan dengan lampu spiritus selama 1 jam. Saring panas-panas dengan kain
saring. Filtrat ditampung dan tambahkan 25 ml HSO 10 % uapkan sampai volume semula (
bila terjadi larutan koloidal, saring ).
b. Ekstraksi cair-cair
Masukkan larutan dalam corong pisah, ekstraksi dengan 3 x 25 ml CHCL. Kumpulkan fase
CHCL, cuci dengan NaOH 10 % ( beberapa tetes ) dan pisahkan dengan corong pisah. Residu
berada di atas, ambil ekstrak di lapisan bawah tampung dalam cawan penguap/petri. Cuci residu
dengan CHCL 15 ml, campur hasil cucian dengan ekstrak bersih.
Uapkan ekstrak yang didapat sampai kering.

2. Kromatografi lapis tipis

Larutkan sedikit ekstrak kering dalam 1 ml CHCL, totolkan sampel dan standar dengan
menggunakan pipa kapiler pada jarak 1 cm dari sisi bawah lempeng KLT. Lapisi bak
kromatografi dengan kertas saring. Jenuhkan bak kromatografi dengan fase gerak CHCL-
metanol ( 1 : 1 ), ditandai dengan kertas saring terbasahi semuanya.
Masukkan lempeng KLT dalam bak kromatografi, elusi hingga pelarut mencapai 1 cm dari sisi
lempeng KLT. Angkat lempeng KLT, angin-anginkan hingga kering. Amati noda dan
bandingkan dengan standar di lampu UV, hitung harga Rf-nya.
3. Kromatografi lapis tipis preparatif
Larutkan 2 gram ekstrak kering daun teh dalam kloroform 5 ml. Totolkan 5 ml larutan pada
papan kromatografi perlahan-lahan, setiap tahap diikuti dengan pengeringan dengan
penyemprotan adara panas. Penotolan dilakukan pada daerah 3 cm dari sisi bawah papan
kromatografi dalam bentuk garis melintang.
Ke dalam bak kromatografi yang telah dilapisi kertas saring dimasukkan pelarut kloroform :
metanol ( 1 : 1 ), sehinnga tinggi pelarut di dalam bak setinggi 2,5 cm. Diamkan beberapa saat
hingga kertas saring dibasahi pelarut.
Masukkan papan kromatografi yang telah ditotoli ke dalam bak kromatogarfi.
Lakukan elusi dengan pelarut CHCL-metanol ( 1 : 1 ) dan hentikan elusi bila pelarut telah
mencapai daerah sekitar 1 cm dari sisi atas papan kromatografi. Papan kromatografi diangkat dan
dikeringkan dengan semprotan udara panas. Ulangi elusi sampai diperoleh pemisahan yang baik
( dua sampai tiga kali elusi ).
Jika pemisahan telah baik, angkat papan dan semprot dengan udara panas.
Amati noda di bawah lampu UV, beri tanda daerah fluorosensi biru. Kerok lapisan pada daerah
yang bertanda, hasil kerokan dikumpulkan dan dimasukkan ke dalam labu elenmeyer 100 ml,
tambahkan 50 ml CHCL, aduk sampai homogen, kemudian disaring, tampung filtrat dalam
cawan porselen. Sisa penyaringan dimasukkan dalam labu erlenmeyer kembali dan ditambah 50
ml, saring dan tampung filtrat, kumpulkan dengan filtrat pertama. Uapkan filtrat sampai
diperoleh sisa kering Kristal kofein kasar.
Lakukan pemurnian dengan cara sublimasi.

4. Sublimasi
Masukkan kristal kasar yang diperoleh dalam cawan porselen. Tutup krus dengan corong yang di
dalamnya telah diberi kertas saring berlubang-lubang. Tutup ujung corong dan tempatkan kapas
basah di sekeliling corong. Panaskan krus dengan lampu spiritus selama kurang lebih lima menit.
Krus didinginkan selama 5 menit, kemudian corong dibuka dan kristal kofein hasil sublimasi
dikumpulkan, dan ditimbang. Hitung rendemen yang didapat dan tentukan titik lebur kristal yang
telah didapat.
 PERHITUNGAN

Berat sampel daun teh kering :

Berat daun teh kering + plastik = 36,804 gram
Berat plastik = 0,990 gram
Berat sampel daun teh kering = 35,814 gram

Metode isolasi / ekstraksi :

Berat zat yang di dapat metode isolasi/ ekstraksi:
Berat beker glass + zat = 62,589 gram
Berat beker glass = 62,363 gram
Berat zat = 0,226 gram

Metode kromatografi lapis tipis :

Fase gerak : methanol : CHCL (1:1/ 5ml : 5ml)
Fase diam : Silica gel
Pereaksi pendeteksi : Perendaman flouresensi (bercak gelap ), UV 254 nm
Dari hasil elusi KLT didapat :
Berat beaker + ekstrak kering = 62,589 gram
Berat beaker + sisa ekstrak yang ditotolkan = 62,363 gram
Berat sisa ekstrak yang ditotolkan = 0,226 gram

Berat ekstrak kering = 0,226 gram

Berat sisa ekstrak yang ditotolkan = 0,133 gram
Berat ekstrak yang ditotolkan = 0,093 gram
x (jarak yang ditempuh solut) 5,0 cm
y (jarak yang ditempuh eluen sampai tanda batas) 5,4 cm
Perhitungan Rf:
Rf = jarak yang ditempuh solute sampai tanda batas x 100%
jarak yang ditempuh eluen sampai tanda batas
= 4,7 cm = 0,992
5,1 cm
 HRf = x 100%

= 0,922 x 100%
= 92,2 %

Kode Warna noda

Sampel bercak Rf Visual UV 254 UV 366 Pereaksi
nm nm
Kafein dari 4,7 cm 0,922 Putih Ungu - -
ekstrak daun teh
Standart 4,7 cm 0,922 Putih Ungu - -

Pembacaan pada sinar UV = 254 nm menunjukkan adanya senyawa kofein dengan adanya
fluoresensi biru keunguan.
Gambar :

Kromatografi lapis tipis preparatif

Fase gerak : CHCL3 : methanol (1:1/ 20ml:20ml)
Fase diam : Silika GF 254
Pereaksi pendeteksi : Perendaman flouresensi sinar UV 254 nm
Dari hasil percobaan metode KLTP didapatkan :
Berat erlenmeyer + kerokan = 65,28 gram
Berat erlenmeyer kosong = 63,72gram -
Berat kerokan = 1,56 gram
Hasil sublimasi
a. Organoleptis : Kristal putih mengkilat seperti jarum.
b. Data
Berat daun Berat Berat hasil Berat hasil
teh ekstrak kerokan sublimasi Titik lebur
kering
35,814 gram 0,226 gram 1,56 gram 0,015 gram

Pemurnian zat :
 Berat plastik + kristal = 0,492 gram
Berat plastik kosong = 0,477 gram -
Berat kristal = 0,015 gram

Perhitungan Rendemen:
Rendemen ekstrak kofein = ekstrak kristal kasar x 100%
serbuk teh awal
= 0,226 x 100%
35,814
= 0,63 %
Rendemen kafein kristal = kristal preparative x 100%
ekstrak kafein preparative
= 0,015 x 100%
1,56
= 0,96 %

PEMBAHASAN
a. Ekstraksi
Ekstraksi merupakan proses penarikan, pemisahan dari bahan padat maupun cair dengan
bantuan pelarut. Praktikum ini, untuk tahap ekstraksi terjadi 2 macam yaitu: ekstraksi padat
cair dan ekstraksi cair cair.
Ekstraksi padat cair :
Dilakukan karena bahan yang dikehendaki dapat larut dalam solven pengekstraksi. Ekstraksi
serbuk teh dengan aquadest ini termasuk proses digesti (maserasi dengan proses pengadukan
kontinyu pada temperatur kamar ) 40 - 50 C). Adapun penambahan MgO (bersifat basa) untuk
mengikat senyawa selain kofein dan H2SO4 10% pada saat pencampuran filtrat 1 dan 2
bermaksud untuk menurunkan pH (mengasamkan).

Ekstraksi cair cair :

Pada ekstraksi cair cair ini, percobaan dilakukan di corong pisah. Filtrat yang di dapat dari
ekstraksi padat cair ditambah CHCL3 25 ml NaOH secukupnya , lalu gojog sampai 15 kali
 hingga jernih, diamkan sebentar tampung bagian bawahnya . Percobaan diulangi sebanyak 3 x
agar hasilnya lebih optimal. Pada penambahan NaOH (secukupnya ) bermaksud untuk menarik
sisa asam dan untuk pigmentasi.
b. Kromatografi Lapis Tipis (KLT) dan Preparatif (KLTP)
Kromatografi Lapis Tipis
Menggunakan pelat alumina (alumina basa pH 10, karena bersifat basa) sebagai fase diam.
Fase geraknya methanol : CHCL3 (1:1/ 5ml : 5ml) dijenuhkan dengan kertas saring di dalam
chamber. Penotolan larutan ekstrak dan larutan blangko (kloroform) dengan pipa kapiler arah
tegak lurus, setelah ditotolkan dikering anginkan. Selanjutnya dideteksi pada sinar UV 254 nm,
penandaan dilakukan jika terjadi peredaman (kafein + pelarut merupakan larutan yang tak
berwarna, tidak bisa dilihat secara kasat mata, dengan deteksi sinar UV dapat terlihat dengan
terdapat noda yang menunjukkan pemisahan antara fase diam dan fase geraknya/ terjadi interaksi
sinar dengan indikator).
Dengan ini, KLT mempunyai keuntungan yaitu:
a. Waktu pemisahan yang cepat dan serbaguna (dapat digunakan berbagai senyawa tanaman).
b. Untuk mengetahui kemurnian suatu senyawa (suatu senyawa dielusi dengan eluen beberapa beda
polaritas menghasilkan 1 bercak).
c. Untuk mendeteksi senyawa yang terkandung.
d. Untuk standarisasi sampel (dengan parameter Rf-nya)
e. Untuk perhitungan Rf (tanpa satuan) untuk mengetahui :
Seberapa jauh bercak terelusi (Rf idealnya tidak lebih dari 1 ( 0,2 0,8)
Bagaimana sifat kelarutannya

Kromatografi Lapis Tipis Preparatif

Pada KLTP penggunaan cuplikan sampel lebih banyak dari KLT, hasilnya dapat digunakan
analisa lanjutan, lempeng kaca yang digunakan adalah ukuran 20cm20cm. Silika gel GF 254
sebagai fase diam, fase gerak yang digunakan CHCL3 : methanol (1:1) yang dijenuhkan.
Penotolan larutan ekstrak secara tegak lurus bentuk pita sampai habis dan cukup
dikeringaginkan. Pengamatan/ identifikasi kofein pada UV 254 nm, penandaan dilakukan jika
terjadi peredaman warna biru violet/ keunguan karena secara teori pada struktur molekul kofein
terdapat gugus kromofor/ ikatan terkonjugasi yang menyerap energi sehingga mengalami
eksitasi, dimana setelah molekul mengalami eksitasi ke tingkat energi lebih tinggi maka akan
kembali ke keadaan semula (ground state) dan memancarkan energi yang terdeteksi oleh
instrumen. Lalu dikerok dan masukkan ke Erlenmeyer dan untuk selanjutnya dilakukan tahap
sublimasi.
c. Sublimasi
Pada tahap akhir proses ini adalah pemurnian kofein dari daun teh dilakukan dengan cara
sublimasi. Tetapi tidak semua senyawa dapat dimurnikan dengan metode sublimasi. Senyawa
lain dalam daun teh seperti tannin, katekin, dan golongan polifenol tidak bisa disublimasi, hanya
kofein yang dapat dimurnikan dengan cara sublimasi. Pada dasarnya kofein (bersifat non-polar)
yang akan disublimasi dilarutkan dalam kloroform (semipolar) sesuai prinsip like-dissolve-like
(yang dilarutkan = yang terlarut). Hasil pemurnian yang diperoleh berupa hablur kristal jarum
yang mengkilap berwarna putih tidak berbau, berasa pahit dan agak sukar larut dalam air.

KESIMPULAN
Dari percobaan yang telah dilakukan didapat kesimpulan bahwa:
Daun teh (Theae Folium) kering seberat 35,814 gram dilakukan isolasi kofein dengan metode:
1. Ekstraksi, diperoleh hasil = 0,226 gram
2. Kromatografi lapis tipis, diperoleh hasil Rf = 0,992 ( HRf = 92,2 % )
Pembacaan pada sinar UV = 254 nm menunjukkan adanya senyawa kofein dengan adanya
fluoresensi biru keunguan.
Kromatografi lapis tipis preparatif, diperoleh hasil = 1,56 gram
Sublimasi didapat hasil:
Kristal kofein 0,015 gram berbentuk hablur kristal jarum, berwarna putih.
Dengan perolehan Rendemen:
1. R terhadap ekstrak kofein = 0,63 %
2. R kafein kristal = 0,96 %

REFERENSI
1. Departemen Kesehatan Republik Indonesia, 1980. Materia Medika Indonesia. Jilid IV.
2. Kirk-Othmer. 1998. Encyclopedia of Chemical Technology 4th Ed. 10:88.
3. Ponco Rahayu, Mamik.dkk. 2011. Petunjuk Praktikum Fitokimia S1 Farmasi. Universitas
Setia Budi. Surakarta.
 Teh kering yang dimasukan dalam beker glas kemudian ditambah dengan MgO dan
tambah 250 ml air. Penambahan magnesium oksida dilakukan dengan tujuan untuk menjerap
kofein dalam ekstrak dan untuk menghilangkan senyawa tanin. Hal tersebut karena tanin
cenderung membentuk kompleks dengan kofein sehingga akan mempersulit tahap isolasi kofein.
Dengan penambahan Magnesium oksida, tannin akan berikatan dengan Mg dan berubah menjadi
bentuk garam, sehingga kafein terlepas dalam keadaan basa bebas.
Tahapan selanjutnya adalah mendidihkan hingga 1 jam dan menyaring panas-panas,
kumpulkan filtrate hasil penyaringan. Didihkan lagi dengan penambahan 250 ml air dan disaring
panas-panas. Tujuan mendidihkan dengan menggunakan air adalah untuk mendesorpsi kofein
yang muda (Bentuk nukleosida) karena bentuk nukleosida mempunyai kelarutan yang baik dalam
air (Raphael ikan) . Selain itu kelarutan kafein dalam air mendidih cukup besar yaitu dengan
perbandingan 1:1 (Clarke,1986).
A. Filtrat yang telah terkumpul selanjutnya ditambahkan 25 ml asam sulfat 10 %, lalu diuapkan hingga
1/3 volume awalnya . Tujuan dari penambahan asam sulfat ini adalah untuk mengendapkan sisa
magnesium oksida dan untuk mendenaturasi asam nukleat sehingga dapat mencegah
pembentukan ikatan kembali antara kofein dengan asam nukleat. (Robinson, 1991). Larutan
tersebut kemudian disaring untuk menghilangkan endapan yang terbentuk akibat penambahan
asam sulfat.
B. Langkah berikutnya adalah mengekstraksi dengan menggunakan 20 ml (3 kali), 15 ml (2 kali), dan
10 ml (satu kali) kloroform dalam corong pisah . Digunakannya kloroform karena kofein mudah
larut dalam kloroform (Farmakope Indonesia Edisi III , 1995). Kelarutan kafein dalam klorofom
yaitu dengan perbandingan 1:7 (Clarke,1986). Kloroform bersifat non polar, jadi kafein cenderung
terlarut dalam kloroform, sedangkan senyawa xantin lain seperti teofilin dan teobromin terlarut
dalam fase air, karena senyawa-senyawa tersebut cenderung bersifat lebih polar daripada kafein.
Jadi perlakuan ini bertujuan untuk memisahkan kafein dari derivat xanthin lain.
C. Kemudian cuci hasil ekstrasi dengan NaOH 2N secukupnya yang diikuti penggojongan secara
perlahan. Penambahan NaOH berfungsi untuk menghilangkan warna kuning pucat dari ekstrak
tersebut dan memberikan suasana basa sehingga kofein mudah larut dalam kloroform. Warna
kuning tersebut disebabkan karena pigmen theaflavin dan thearubigin pada teh hitam.
Penggojogan dilakukan secara perlahan karena penggojogan yang terlalu kuat akan menyebabkan
terjadinya emulsi pada ekstrak. Adanya emulsi akan menyebabkan proses pemisahan yang kurang
 sempurna. Emulsi juga disebabkan oleh adanya sisa senyawa polifenol yang belum hilang, dengan
penambahan NAOH, senyawa fenol menjadi fenolik anion dan membentuk garam, sehingga terjadi
surfaktan anionik. Surfaktan tersebut yang menyebabkan emulsi. Hasil dari pemisahan tersebut
akan terbentuk dua fase yaitu fase air (lapisan atas) dan fase kloroform (lapisan bawah). Kofein
terdapat dalam fase kloroform. Pisahkan fase tersebut dengan menggunakan corong pisah.
Kemudian residu yang terjadi (lapisan atas) cuci dengan 20 ml kloroform dan campurkan
denganhasil ekstrak bersih.
D. Kemudian kloroform diuapkan sehingga akan terbentuk serbuk putih berbentuk jarum mengkilat
dan menggumpal. Purifikasi senyawa kafein cukup dengan kristalisasi. Kafein dapat menyublim
pada suhu 180C ( Clarke,1986) Untuk mendapatkan kristal kofein yang mentah cukup dengan
mengkristalkan kembali serbuk tersebut dengan sedikit air panas . Kristal yang terbentuk dalam
percobaan kali ini adalah kristal putih mengkilap.
E. Koffein yang diperoleh pada percobaan kali ini adalah 0,374 gram dengan rendemen 0,784 %. Hal
ini sesuai dengan peraturan Surat Keputusan Kepala Badan POM No. HK.00.05.23.3644 bahwa
batas kandungan kafein dalam minuman adalah 50 mg per sajian atau tidak boleh lebih dari 0,5
gram.
F. Untuk dengan mendeteksi kebenaran bahwa yang dihasilkan pada percobaan kali ini adalah kofein
dapat dilakukan dengan tes identifikasi dan tes muxired. Tes identifikasi dapat dilihat dari segi
organoleptisnya, yaitu Kristal putih yang mengkilat. Tes muxired yaitu dengan mengambil sedikit
kofeein dalam cawan penguap, tambah beberapa tetes HCl dan serbuk KCIO 3 kemudian uapkan
samapi kering, residu yang didapat berwarna kuning, tambah dengan NH 4OH akan berubah ungu
violet.