METODE PENGEMBANGAN DAN VALIDASI DARI METODE RP-HPLC

UNTUK ESTIMASI SIMULTAN DARI PARACETAMOL, IBUPROFEN DAN

CHLORZOXAZONE DALAM JUMLAH BESAR DAN KOMBINASI TABLET
DALAM BENTUK DOSIS

ABSTRAK

Metode ini menjelaskan prosedur untuk mengukur uji Paracetamol, Ibuprofen dan tablet
Chlorzoxazone dengan menggunakan fasa gerak yang mengandung campuran asetonitril:
buffer potassium dihydrogen phosphate 0,02M (60:40) yang disesuaikan dengan pH 3
dengan asam Orthophosphoric, pada laju alir 1ml/menit di mode isokratis. Detektor
dipasang di 221nm. Parasetamol, Chlorzoxazone dan Ibuprofen kemudian dianalisis
dengan kolom HPLC terbalik Prontosil C18 (250 x 4.6 mm, 5μm). Waktu retensi puncak
Paracetamol, Chlorzoxazone dan Ibuprofen masing-masing sekitar 2.263, 3.773 dan
8.897 menit. Metode yang diusulkan telah divalidasi dengan linearitas, akurasi, presisi,
spesifisitas dan ketahanan. Linieritas untuk Parasetamol, Chlorzoxazone dan Ibuprofen
masing-masing berkisar antara 39-104 μg/mL, 30-80 μg/ml dan 40-140 μg/ml. Metode
ini berhasil diaplikasikan pada perkiraan Parasetamol, Ibuprofen dan Chlorzoxazone
dalam bentuk sediaan kombinasi.

PENDAHULUAN

Kombinasi obat ini ternyata lebih efektif untuk menghilangkan rasa sakit ringan sampai
sedang dari masalah otot tertentu. Kombinasi ini juga bisa digunakan untuk kondisi lain
seperti yang didiagnosis oleh dokter Anda. Paracetamol, Chlorzoxazone dan Ibuprofen
adalah kombinasi analgesik dan antipiretik otot. Kombinasi ini bekerja dengan
mengurangi rasa sakit dan pembengkakan, yang membantu otot untuk rileks. Metode
HPLC ini menentukan pengujian kadar logam dari formulasi tablet Paracetamol,
Chlorzoxazone dan Ibuprofen.

1|Kimia Analisis
Ibuprofen (IPB), α-methyl-4-(2-methylpropyl)-benzene acetic acid, adalah salah satu
obat anti-inflamasi non steroid yang paling umum (NSAID). Ini banyak digunakan
sebagai analgesik pada nyeri ringan sampai sedang dan dalam pengobatan rheumatoid
arthritis dan osteoartritis. Dosis harian konvensional NSAID ini adalah 600-1200 mg per
hari.

Ibuprofen tampaknya mengerahkan tindakan farmakologisnya dengan menghambat

siklo-oksigenase dan dengan demikian menghambat tahap pertama dalam sintesis
prostaglandin. Selanjutnya, konsentrasi ibuprofen yang tinggi menghambat migrasi,
kepatuhan, pembengkakan, dan agregasi neutrofil dan pelepasan enzim lisosom.

Parasetamol adalah turunan asam asetat 4-hidroksi acetanilide yang memiliki efek
analgesik, antipiretik dan antiinflamsi lemah.

Chlorzoxazone (5-kloro-2(3H)-benzoxazolone) adalah senyawa dengan sifat relaksan

otot rangka. Hal ini digunakan untuk mengurangi tonus otot dan ketegangan dan serta
untuk meringankan kejang dan nyeri yang berhubungan dengan gangguan
muskuloskeletal.

2|Kimia Analisis
PERCOBAAN

Alat dan Bahan

Parasetamol, Chlorzoxazone diperoleh dari Yarrowchem Pvt Ltd dan Ibuprofen diperoleh
sebagai sampel hadiah dari Strides Shasun Limited, Navi Mumbai. Persiapan komersial
(FLEXON MR TABLET) yang digunakan untuk analisis diperoleh dari pasar farmasi.
Setiap tablet mengandung 325mg PARA, 250mg CHLRZ dan 400mg IBU, asetil asetil
HPLC (Thomas Baker) dan air, Kalium dihidrogen fosfat (LOBA CHEM), Asam
Orthophosphoric, Triethyl Amine (Thomas Baker).

Instrumen

RP-HPLC dilakukan dengan menggunakan sistem HPLC Shimadzu yang terdiri dari
pompa injeksi LC-20AD, rheodyne injeksi dengan 20 microlitre loop, SPD-20A UV-
Detector, perangkat lunak Spinchrom, kolom yang digunakan adalah Prontosil C18 (250
x 4.6mm, 5μm) beratnya dilakukan pada keseimbangan Contech CA-123 dan pH
disesuaikan dengan menggunakan analisis PCI Digital pH meter 111.

Kondisi Kromatografi

Kolom fase balik [Prontosil C18 (ukuran partikel 250 x 4.6mm, 5μm)], diseimbangkan
dengan fase gerak yang terdiri dari asetonitril: buffer potassium dihydrogen phosphate
0,02M (60:40) yang disesuaikan dengan pH 3 dengan menggunakan asam
Orthophosphoric. Kecepatan aliran fase gerak dijaga pada 1mL/menit dan efluen dipantau
pada 221nm. Sampel disuntikkan dengan menggunakan injektor rheodyne 20 mikrolit
fixed loop dan waktu tempuh adalah 13 menit.

Persiapan 0,02 M Potasium dihidrogen ortofosfat (pH 3.0)

Sekitar 2.7218 g kalium dihidrogen ortofosfat secara akurat ditimbang dan dipindahkan
ke labu volumetrik 1000ml dan dilarutkan dalam 900 ml air. PH dengan asam o-fosfat
sampai 3,0 ± 0,05, volume dibuat sampai 1000ml menggunakan fasa gerak. Larutan
kemudian disaring menggunakan filter membran 0,45 μ.

3|Kimia Analisis
Persiapan Fase Gerak

Kalium dihidrogen ortofosfat (0,02M) pH disesuaikan sampai 3,0 dengan asam

Orthophosphoric dan dicampur dengan Asetonitril dengan perbandingan 40:60 dan
disonikasi.

Persiapan Larutan Standar

100 mg Ibuprofen, 100mg Parasetamol dan 100 mg Chlorzoxazone murni ditimbang

secara akurat dan dipindahkan ke dalam labu volumetrik 100 ml. Sekitar 70 ml fase gerak
ditambahkan, disonikasi agar larut dan diencerkan menjadi 100 ml menggunakan fasa
gerak. Konsentrasi akhir Parasetamol, Chlorzoxazone dan Ibuprofen dibuat sampai 65
μg/ml dan 50 μg/ml dan 80 μg/ml, masing-masing dengan pengenceran yang sesuai.

Persiapan Larutan Sampel

10 tablet ditimbang dan dihaluskan. Kuantitas serbuk setara dengan 400 mg Ibuprofen,
325mg Parasetamol dan Chlorzoxazone 250 mg dipindahkan ke dalam labu volumetrik
1000 ml. Volume dibuat menggunakan fase gerak, dicampur dan disaring melalui filter
PVDF 0,45μ. Konsentrasi akhir Parasetamol, Kloroksiazon dan Ibuprofen dibuat sampai
65μg/ml dan 50 μg/ml dan 80 μg/ml, masing-masing dengan pengenceran yang sesuai.

Validasi Metode HPLC

Metode RP-HPLC yang diusulkan telah divalidasi sesuai dengan pedoman ICH.

Penetapan Kadar (Assay)

Jumlah tablet PARA, CHLRZ dan IBU ditentukan dengan menggunakan rumus % assay
rumus. Hasil dilaporkan pada Tabel 1.

Selektivitas dan Spesifisitas

Untuk menilai selektivitas dari solusi metode yang dikembangkan dari ketiga obat
tersebut yang disuntikkan ke dalam sistem kemudian mengamati tiga puncak tajam
PARA, CHLRZ dan IBU diperoleh pada waktu retensi 2.263 menit, 3.3733 dan 8.897

4|Kimia Analisis
menit masing-masing mengacu pada larutan standar. Spesifisitas ditentukan dengan
membandingkan kromatogram larutan campuran dan larutan sampel. Karena waktu
retensi obat standar dan waktu retensi obat dalam larutan sampel sama, maka metodenya
spesifik. Parameter seperti resolusi (Rs) dan faktor asimetris dihitung. Korelasi yang baik
ditemukan antara hasil standar campuran dan larutan sampel. Hasil ditunjukkan pada
Tabel 2.

Linearitas

Linearitas PARA, CHLRZ dan IBU dilakukan dengan menggunakan larutan standar
masing-masing berkisar antara 39-104 μg/ml, 30-80 μg/ml dan 40-140 μg/ml. Hasil
adalah tabel tidak ditunjukkan dalam 3.

Presisi

Studi presisi dilakukan untuk mengetahui variasi intra hari dan antar hari. Studi presisi
intra hari dan antar hari PARA, CHLRZ dan IBU dilakukan dengan memperkirakan
respons korespondensi 3 kali pada hari yang sama dan pada 3 hari berbeda untuk 3
konsentrasi PARA, CHLRZ dan IBU yang berbeda dan hasilnya dilaporkan dalam istilah
dari% deviasi standar relatif (% RSD) bagaimanapun, semua hasil termasuk dalam batas
penerimaan (RSD <2), seperti yang ditunjukkan pada Tabel 4.

Akurasi

Keakuratan metode yang diusulkan dinilai oleh studi pemulihan pada tiga tingkat yang
berbeda yaitu 75%, 100% dan 125%. Studi pemulihan dilakukan dengan menambahkan
jumlah PARA, IBU dan CHLRZ yang diketahui ditambahkan ke sampel yang telah
dianalisis sebelumnya dan kemudian dikenai metode HPLC yang diusulkan. Hasil
pemulihan PARA, IBU dan CHLR dalam sediaan farmasi ditunjukkan pada Tabel 4.

5|Kimia Analisis
Ketahanan

Studi ketahanan dilakukan dengan membuat perubahan kecil pada parameter metode
yang dioptimalkan seperti perubahan rasio fasa gerak ± 1%, suhu kolom dan perubahan
pH ± 1%. Tidak ada dampak signifikan pada waktu retensi dan faktor akhir.

Tabel 1 Analisis Formulasi Tablet

Merek Dagang % Kadar yang Ditemukan (% Assay)

FLEXON MR (Para PARA 98,975%

325mg + CHLRZ CHLRZ 99,076%
250mg+ IBU 400 mg) IBU 98,946%

Tabel 2: Parameter Kesesuaian Sistem

Parameter Kesesuaian
PARA CHLRZ IBU
Sistem
Waktu Retensi (menit) 2,260 3,3773 8,890
Resolusi 2,4 2,7 16,2
Theoretical plates 5775 6862 6546
Faktor Asimetris 1,00 0,93 0,963

Tabel 3: Uji Linearitas

Parameter PARA CHLRZ IBU

Jarak linearitas 39-104 µg/mL 30-80 µg/mL 40-140 µg/mL
Slope 12,265 18,093 18,473
Intercept 1,1525 0,884 5,022
Koefisien korelasi 0,9996 0,9993 0,9999

6|Kimia Analisis
Tabel 4: Hasil Presisi dan LOD & LOQ

Parameter PARA CHLRZ IBU

Presisi (%RSD)
Intra-day (n=3) 0,76 0,53 0,47
Inter-day (n=3) 0,62 0,77 0,841
Batas deteksi 1,85 1,88 1,31
Batas kuantitasi 5,62 5,71 3,99

Tabel 5: Hasil Uji Pemulihan

Kelebihan Jumlah
Sampel yang telah Konsentrasi
obat yang %
dianalisis sampel
ditambahkan ditemukan Pemulihan
sebelumnya [μg/ml] [μg/ml]
[μg/ml] [μg/ml]
32,5 16,25 48,90 99,30%
PARA 32,5 32,5 64,99 98,98%
32,5 48,75 80,95 98,63%
25 12,5 37,69 99,50%
CHLRZ 25 25 49,86 98,72%
25 37,5 62,83 99,52%
40 20 60,25 99,41%
IBU 40 40 80,48 99,59%
40 60 99,83 98,83%

7|Kimia Analisis
 Fig 4 Kromatogram Larutan Standar

Fig 5 Kromatogram Larutan Sampel

8|Kimia Analisis
 Fig 6 Kurva Kalibrasi Paracetamol

Fig 7 Kurva Kalibrasi Chlorzoxazone

Fig 8 Kurva Kalibrasi Ibuprofen

9|Kimia Analisis
KESIMPULAN

Pemisahan yangcepat PCM, CHLRZ dan IBU berhasil dicapai dengan waktu retensi yang
relatif singkat, memberikan resolusi yang luar biasa, bentuk puncak yang baik,
memberikan hasil yang dapat diandalkan dan sangat dapat direproduksi pada kolom
HPLC C18. Pemisahan campuran PCM, CHLRZ dan IBU dicapai dengan total run time
13 menit. Nilai yang sangat baik untuk presisi, pemulihan dan linieritas dicapai
bersamaan dengan rendahnya LOD dan LOQ. Kemudahan dalam persiapan fase gerak
dan ekonomi komponen fase gerak menunjukkan secara eksplisit penerapan metode ini
pilihan terbaik dalam analisis rutin PCM, CHLRZ dan IBU di departemen pengendalian
mutu farmasi dalam waktu singkat dan bahkan pada tingkat konsentrasi rendah.

SARAN

Penelitian sebaiknnya tidak hanya menggunakan sampel hanya dari satu merek dagang
saja, tetapi juga dari beberapa produsen obat sejenisnya, agar hasil dari penelitian dari
produk satu dan produk lainnya dapat dibandingkan.

10 | K i m i a A n a l i s i s