BUKU PANDUAN PRAKTIKUM

MATA KULIAH BIOTEKNOLOGI KELAUTAN

“ANALISIS DATA DNA”

Oleh:
Ade Yamindago, S. Kel., M. Sc., MP.
Cynthia Asthari Kris Hardani
Ma’rufah

FAKULTAS PERIKANAN DAN ILMU KELAUTAN

UNIVERSITAS BRAWIJAYA
MALANG
2014
 PENDAHULUAN

Deoxyribonucleic acid (DNA) merupakan materi genetik yang dicopy dari

induknya. DNA disusun oleh empat tipe nukleotida (basa nukleotida) dan gula
pentosa (deoxyribosa) yang berikatan membentuk rantai polinukleotida ganda
(double helix) melalui ikatan fosfat. Basa nukleotida terdiri dari grup Purin
(Adenine-Guanine) dan Pirimidin (Thymine-Cytocine). Ikatan antar basa
nukleotida yaitu ikatan hidrogen yang mengikat A-T dengan dua ikatan dan G-C
dengan tiga ikatan.
Analisis DNA menggunakan sekuens DNA yang dihasilkan dari proses
ekstraksi jarigan organisme, PCR (Polymerase Chain Reaction), dan
elektroforesis serta sekuensing. Ekstraksi DNA jaringan merupakan tahap
pertama dari berbagai teknologi analisis DNA. Ekstraksi DNA juga diperlukan
cukup banyak prosedur kerja laboratorium untuk memecahkan dinding sel dan
membran inti, yang dilanjutkan dengan pemisahan DNA dari berbagai komponen
sel yang lain (Syafaruddin et al, 2011).
PCR terdiri dari tiga tahap utama yaitu denaturasi, annealing, dan
ekstensi atau yang terkadang disebut polimerasi. Menurut Toha (2001), tahap
denaturasi bertujuan untuk memutuskan ikatan hidrogen dari DNA rantai ganda
yang akan diamplikasi. Hasil yang diperoleh merupakan DNA rantai tunggal
untuk penempelan primer saat tahap annealing. Pada tahap annealing terbentuk
ikatan baru antara untai tunggal DNA cetakan dengan primer. Tahap ekstensi
atau polimerasi merupakan tahap pemanjangan rantai tunggal primer dengan
enzim DNA polimerase. Ketiga tahap ini membutuhkan temperatur dengan
variasi tertentu tergantung dari sampel yang digunakan sehingga tidak ada
standar yang sama untuk temperatur pada tahap-tahap tersebut. Maka
temperatur yang digunakan dapat berbeda untuk organisme, sel, dan gen yang
berbeda pula.
Prinsip kerja elektroforesis yaitu adanya aliran protein dari kutub negatif
(-) menuju ke kutub positif (+) sesuai dengan Fatchiyah et al (2011), bahwa
kecepatan molekul yang bergerak pada suatu medan listrik tergantung pada
muatan, bentuk, dan ukuran. Molekul yang bergerak ini memerlukan medium
sebagai matriks penyangga, yang biasa digunakan adalah gel agarose. Gel
diletakkan diantara dua buffer chamber sebagai sarana untuk menghubungkan
kutub negatif dan positif. Besarnya molekul yang bermuatan listrik tergantung
pada pH dan komposisi medium dimana molekul tersebut terlarut. Pada pH
rendah, protein bersifat kation (bermuatan positif) yang bergerak ke katoda
(bermuatan negatif). Pada pH tinggi, protein bersifat anion (bermuatan negatif)
yang bergerak ke anoda (bermuatan positif). Oleh karena itu, pH buffer
elektroforesis yang berkisar antara 8-9 akan menyebabkan protein bermuatan
negatif yang akan bergerak ke anoda.
Jika telah didapatkan sampel yang positif mengandung band DNA,
sampel hasil PCR dikemas untuk dilakukan proses sekuensing. Hasil sekuensing
berupa format ab1 file yang biasa disebut sebagai elektrophoregram atau
kromatogram dari sekuens DNA hasil primer forward dan primer reverse.
Selanjutnya, data tersebut akan mengalami proses edit dan alignment DNA
menggunakan software MEGA (The Molecular Evalutionary Genetic Analysis).
Proses edit dan alignment adalah untuk mendapatkan sekuens gabungan terbaik
dari kedua primer, untuk mempermudah identifikasi menggunakan BLAST (Basic
Local Alignment Search Tool) dan digunakan pada analisis filogeni dan DNA
Barcoding.
Aplikasi data DNA dapat digunakan pada analisis filogeni dan DNA
Barcoding. Analisis filogeni merupakan analisis kekerabatan antar organisme
yang menggunakan fragmen sekuens DNA yang berasal dari gen mitokondria
dan nukleus. Selain itu, analisis filogeni dapat pula menggunakan complete
genome dengan mengikutsertakan sekuens dari seluruh gen yang ada.
DNA barcoding merupakan metode yang digunakan untuk
mengidentifikasi spesies menggunakan urutan sekuens DNA pada studi
keanekaragaman hayati, identifikasi dan taksonomi organisme, serta analisis
forensik. Dengan teknik ini proses identifikasi dapat lebih cepat dan akurat
sehingga mampu mengidentifikasi suatu spesies baru (Lucas et al., 2012).
DNA barcoding berguna untuk mempercepat identifikasi DNA dari
organisme jenis baru yang akan dikoleksi pada herbarium dan museum. DNA
barcoding menggunakan data fragmen sekuens DNA hingga tingkat spesies
untuk menghasilkan informasi yang lebih detail. Tingkat akurasi sekuens DNA
dapat diketahui melalui kemampuan sekuens tersebut untuk mengidentifikasi
suatu organisme. Pada saat sekuensing dilakukan dan jika ditemukan organisme
baru, maka hal ini akan memperkaya obyek studi tentang keanekaragaman
hayati (Hollingsworth, 2007).
1. Pengenalan Database
Database sekuens DNA tersimpan pada GenBank pada laman
website open access sehingga dapat diakses dimanapun selama tersedia
koneksi internet. Ada beberapa database yang dapat diakses yaitu DataBank
of Japan (DDBJ), the European Molecular Biology Laboratory (EMBL),
Barcode of Life Database (BOLD) dan GenBank yang akan kita pelajari yaitu
NCBI (National Center for Biotechnology Information). NCBI merupakan
server yang memuat database tentang informasi kesehatan dan bioteknologi.
Database terus menerus diperbarui sesuai dengan penemuan-penemuan
terkini yang menyangkut DNA, protein, senyawa aktif, dan taksonomi.
Disamping database, NCBI juga menyediakan berbagai macam fasilitas
untuk analisis DNA, protein 3D, pencarian primer, dan lain sebagainya. NCBI
merupakan salah satu bank data gen, protein dan literatur khususnya
dibidang kesehatan yang terlengkap dan dijadikan acuan oleh para peneliti
didunia.
Laman website NCBI dapat dibuka dengan mengetikkan
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ pada address bar kemudian tekan enter. Muncul
tampilan awal laman website NCBI seperti pada Gambar 1.

Gambar 1. Tampilan Awal Website NCBI

Langkah yang dapat dilakukan untuk mencari sekuens DNA yaitu

dengan meng-klik tombok segitiga di pojok kiri atas menjadi nucleotide.
Ketikkan nama spesies yang akan dicari beserta nama gennya untuk
mempercepat pencarian, kemudian klik tombol Search.
 Selain itu, terdapat pula sistem BLAST yang dapat diakses pada
laman http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST. BLAST (Basic Local Alignment
Search Tool) dapat digunakan untuk menentukan homologi suatu urutan
DNA atau asam amino dengan data yang ada di NCBI (National Center for
Biotechnology Information). Berdasarkan Widodo dan Miftakhunnafisah
(2010), BLAST memiliki menu analisis pensejajaran (alignment analysis).
Analisis pensejajaran dapat digunakan untuk membandingkan dua sekuen
atau lebih. Program ini dapat diakses melalui website National Center for
Biotechnology Information at The National Library of Medicine in Washington,
DC). Laman website ini dapat digunakan untuk melihat urutan sekuens data
penelitian dengan sekuens yang terdapat pada GenBank. Proses BLAST
dapat pula dilakukan melalui software MEGA versi 5.2 dengan
menghubungkan software tersebut dengan NCBI seperti Gambar 2.

Gambar 2. Tampilan Menu BLAST pada NCBI

2. MEGA 5.2
MEGA 5.2 (The Molecular Evalutionary Genetic Analysis) merupakan
perangkat lunak yang dikembangkan dengan tujuan untuk menyediakan
pusat informasi biologi, analisis statistik dari DNA, dan data-data sekuens
DNA serta protein dari sudut pandang evolusi. MEGA 5.2 terus berkembang
hingga dapat juga digunakan untuk visualisasi dan rekonstruksi pohon
filogenetik serta menguji berbagai hipotesis evolusi Tamura et al (2011).
2.1 Proses Analisis Hasil Sekuensing

Skema kerja proses analisis hasil sekuensing dapat dilihat pada Gambar
3 berikut ini :

Sekuens DNA

Memasukkan kedua sekuens DNA hasil dari primer forward

dan reverse pada MEGA 5.2
Menghapus huruf “N” di bagian awal sekuens dan bagian akhir
sekuens
Menggabungkan sekuens DNA hasil dari primer forward dan
reverse yang masing-masing telah diedit
Memulai proses BLAST pada laman website
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/
Melakukan analisis hubungan filogenetik antar spesies sampel
penelitian menggunakan MEGA 5.2

Hasil
Gambar 3. Skema Kerja Proses Analis Sekuensing

Prosedur Kerja
Langkah pertama yang dilakukan adalah dengan membuka MEGA 5.2 dengan
cara klik Start lalu pilih MEGA 5.2 atau klik dua kali pada ikon MEGA 5.2 yang
terdapat pada desktop, seperti pada Gambar 4.

Gambar 4. Membuka Software MEGA 5.2

Selanjutnya, akan terbuka tampilan awal MEGA 5.2 seperti pada Gambar 5.

Gambar 5. Tampilan Awal Software MEGA 5.2

Setelah terbuka tampilan awal MEGA 5.2, klik menu Align lalu pilih Edit/Build
Alignment untuk melakukan alignment sekuens DNA seperti pada Gambar 6.

Gambar 6. Menu Edit/Build Alignment

Pilih Create a New Alignment pada kotak dialog yang muncul untuk menampilkan
lembar dokumen baru dari proses alignment sekuens DNA seperti pada Gambar
7.

Gambar 7. Menu Create a New Alignment

Pilih DNA pada kotak dialog Are you building a DNA or Protein sequence
alignment? Hal ini disebabkan karena akan dilakukan proses edit sekuens DNA
bukan Protein seperti pada Gambar 8.

Gambar 8. Kotak Dialog konfirmasi data

Muncul tampilan seperti pada Gambar 9 berikut ini yaitu menu DNA alignment.

Gambar 9. Tampilan Menu DNA Alignment

Pilih ikon menu View/Edit trace data from DNA sequencers seperti pada Gambar
10 untuk memulai menggabungkan dua data berbentuk elektrophoregram atau
kromatogram yang didapatkan sebagai hasil dari proses sekuensing dengan
primer forward dan primer reverse.
 Gambar 10. Tampilan Menu View/Edit trace data from DNA sequencers

Hasil sekuensing yang diperoleh berupa elektrophoregram atau kromatogram

dimana terdapat berbagai garis warna-warni yang membentuk puncak (peak)
sebagai simbol dari nukleotida yang teridentifikasi saat proses sekuensing.
Nukleotida A (Adenin) berwarna hijau, nukleotida G (Guanin) berwarna hitam,
nukleotida C (Citosin) berwarna biru, dan nukleotida T (Timin) berwarna merah.
Pola warna pada elektrophoregram ini sama dengan pola warna yang
dikemukakan oleh Ratnayani et al (2007) dalam Ferita et al (2012). Setiap satu
sampel yang diidentifikasi berdasarkan primer, terdapat dua hasil sekuensing
dari dua primer yang digunakan yaitu primer forward dan primer reverse.

Pilih dua data format elektrophoregram berdasarkan primer masing-masing yang

tersimpan pada PC dengan cara tekan dan tahan tombol Shift serta klik masing-
masing elektrophoregram lalu pilih Open seperti pada Gambar 11 berikut ini.
 Gambar 11. Membuka Data Format ab1 File

Maka akan terbuka data sekuens DNA dari primer forward dan reverse seperti
pada Gambar 12 dan Gambar 13.

Gambar 12. Sekuens DNA Hasil dari Primer Forward

Gambar 13. Sekuens DNA Hasil dari Primer Reverse

Pilih menu Add unmasked sequence to Alignment Explorer untuk primer forward.
Pada primer forward, data sekuens dapat langsung dimasukkan pada software
MEGA 5.2 tanpa harus dilakukan Reverse complement sequence terlebih dahulu
seperti pada Gambar 14.

Gambar 14. Menu Add unmasked sequence to Alignment Explorer

Data sekuens primer forward akan masuk ke dalam menu Alignment DNA pada
MEGA 5.2 seperti pada Gambar 15.

Gambar 15. Sekuens DNA Hasil dari Primer Forward pada Menu Alignment DNA

Buka data elektrophoregram untuk primer reverse lalu pilih menu Reverse
complement sequence untuk menyamakan urutan sekuens DNA dengan primer
forward seperti pada Gambar 16.
 Gambar 16. Menu Reverse complement sequence untuk Primer Reverse

Pilih menu Add unmasked sequence to Alignment Explorer untuk memasukkan

data sekuens pada MEGA 5.2 seperti pada Gambar 17.

Gambar 17. Menu Add unmasked sequence to Alignment Explorer

untuk Primer Reverse

Tampilan Alignment DNA sekuens primer forward dan reverse yang telah
dimasukkan pada MEGA 5.2 seperti pada Gambar 18.
 Gambar 18. Tampilan Urutan Sekuens DNA pada MEGA 5.2

Proses edit sekuens sangat dibutuhkan sebelum memasuki tahap alignment

sekuens karena kualitas elektrophoregram dari hasil sekuensing yang didapatkan
dapat kurang maksimal. Sinyal gelombang bagian depan maupun bagian
belakang elektrophoregram dapat kurang jelas karena banyak terdapat sinyal
ganda yang tidak beraturan (noise). Saat edit sekuens noise tersebut akan
dihapus. Jika tidak dihapus maka akan teridentifikasi sebagai “N” pada software
MEGA 5.2.

Selanjutnya adalah proses trim atau pemotongan noise sekuens DNA yang tidak
dibutuhkan untuk proses Alignment DNA. Langkah awal pada proses trim adalah
dengan menyorot noise DNA dan dilambangkan dengan huruf N yang terlalu
banyak pada awal dan akhir urutan sekuens DNA. Untuk menyorot sekuens yang
berada di awal, dapat dilakukan dengan tekan Shift + Home seperti pada
Gambar 19.

Gambar 19. Proses Trim Urutan Sekuens Awal

Hapus huruf-huruf N tersebut, dapat dilakukan dengan menekan tombol Delete,

sehingga hasil yang akan muncul seperti pada Gambar 20.
 Gambar 20. Proses Menghapus Urutan Sekuens Awal

Setelah huruf-huruf N tersebut dihapus adalah dengan melakukan Align DNA,

yaitu dengan menyamakan urutan sekuens DNA hasil dari primer forward
maupun reverse.
Caranya adalah dengan sorot keseluruhan sekuens DNA hasil dari primer
forward dan reverse lalu memilih ikon Align selected with MUSCLE. Prinsip kerja
dari MUSCLE yaitu dengan perhitungan algoritma UPGMA, UPGMB, dan
Neighbor Joining. Pemilihan ikon Align Selected with MUSCLE seperti pada
Gambar 21.

Gambar 21. Menu Align selected with MUSCLE

Pada ikon Align selected with MUSCLE, klik pilihan menu Align DNA, seperti
pada Gambar 22.

Gambar 22. Pilih Align DNA

Maka akan muncul tampilan seperti pada Gambar 23 dan untuk mulai Align DNA,
klik Compute lalu tunggu beberapa saat hingga Progress mencapai 100%.
 Gambar 23. Tampilan Menu MUSCLE

Jika alignment telah selesai dilakukan untuk keseluruhan sekuens maka akan
muncul tampilan sekuens DNA yang memiliki urutan yang sudah sesuai.
Selanjutnya menghapus huruf-huruf N yang berada di bagian belakang dari
urutan sekuens DNA hasil dari primer forward tersebut. Caranya adalah dengan
menekan Shift + End lalu tekan Delete, seperti pada Gambar 24.

Gambar 24. Tampilan Sekuens DNA Setelah Klik Menu Align selected with
MUSCLE

Berikutnya, setelah ditekan Delete maka huruf-huruf N tersebut akan terhapus

seperti pada Gambar 25.

Gambar 25. Tampilan sekuens DNA setelah ditekan Delete

Seperti yang telah dilakukan sebelumnya, langkah selanjutnya setelah huruf-

huruf N tersebut dihapus adalah dengan melakukan Align DNA. Caranya adalah
dengan sorot keseluruhan sekuens DNA hasil dari primer forward dan reverse
lalu memilih ikon Align selected with MUSCLE seperti pada Gambar 26.

Gambar 26. Menu Align selected with MUSCLE

Pada ikon Align selected with MUSCLE, klik pilihan menu Align DNA, seperti
pada Gambar 27.

Gambar 27. Pilih Align DNA

Maka akan muncul tampilan seperti pada Gambar 28 dan untuk mulai Align DNA,
klik Compute lalu tunggu beberapa saat hingga Progress mencapai 100%
sehingga akan muncul tampilan sekuens DNA yang memiliki urutan yang sudah
sesuai.

Gambar 28. Tampilan Menu MUSCLE

Proses Alignment DNA dari primer forward sudah selesai dilakukan. Langkah
selanjutnya adalah dengan melakukan tahapan yang sama untuk proses
Alignment DNA dari primer reverse. Untuk menyorot sekuens yang berada di
awal, dapat dilakukan dengan tekan Shift + Home seperti pada Gambar 29.

Gambar 29. Proses Trim Urutan Sekuens Awal

Hapus huruf-huruf N tersebut dengan menekan tombol Delete, sehingga hasil

yang akan muncul seperti pada Gambar 30.

Gambar 30. Proses Menghapus Urutan Sekuens Awal

Setelah huruf-huruf N tersebut dihapus adalah dengan melakukan Align DNA,

yaitu dengan menyamakan urutan sekuens DNA hasil dari primer forward
maupun reverse. Caranya adalah dengan sorot keseluruhan sekuens DNA hasil
dari primer forward dan reverse lalu memilih ikon Align selected with MUSCLE
seperti pada Gambar 31.

Gambar 31. Menu Align selected with MUSCLE

Pada ikon Align selected with MUSCLE, klik pilihan menu Align DNA, seperti
pada Gambar 32.

Gambar 32. Pilih Align DNA

Maka akan muncul tampilan seperti pada Gambar 33 dan untuk mulai Align DNA,
klik Compute lalu tunggu beberapa saat hingga Progress mencapai 100%
sehingga akan muncul tampilan sekuens DNA yang memiliki urutan yang sudah
sesuai.

Gambar 33. Tampilan Menu MUSCLE

Jika alignment telah selesai dilakukan untuk keseluruhan sekuens maka akan
muncul tampilan sekuens DNA yang memiliki urutan yang sudah sesuai.
Selanjutnya adalah dengan menghapus huruf-huruf N yang berada di bagian
belakang dari urutan sekuens DNA hasil dari primer reverse tersebut. Caranya
adalah dengan menekan Shift + End lalu tekan Delete. Setelah ditekan Delete
maka huruf-huruf N tersebut akan terhapus, langkah selanjutnya setelah huruf-
huruf N tersebut dihapus adalah dengan melakukan Align DNA. Caranya adalah
dengan sorot keseluruhan sekuens DNA hasil dari primer forward dan reverse
lalu memilih ikon Align selected with MUSCLE seperti pada Gambar 34.

Gambar 34. Menu Align selected with MUSCLE

Pada ikon Align selected with MUSCLE, klik pilihan menu Align DNA seperti pada
Gambar 35.
 Gambar 35. Pilih Align DNA

Maka akan muncul tampilan seperti pada Gambar 36 dan untuk mulai Align DNA,
klik Compute lalu tunggu beberapa saat hingga Progress mencapai 100%
sehingga akan muncul tampilan sekuens DNA yang memiliki urutan yang sudah
sesuai.

Gambar 36. Tampilan Menu MUSCLE

Sekuens DNA yang sudah mengalami proses Alignment DNA akan berurutan
dan sejajar pada urutan sekuens DNA hasil dari primer forward dan reverse-nya
seperti pada Gambar 37 dan Gambar 38.

Gambar 37. Tampilan Sekuens DNA Hasil dari Primer Forward dan
Reverse Bagian Depan
 Gambar 38. Tampilan Sekuens DNA Hasil dari Primer Forward dan Reverse
Bagian Belakang

Tahap selanjutnya adalah menghapus noise yang terdeteksi sebagai huruf-huruf

N yang berada pada sekuens. Caranya adalah dengan mencocokkan letak huruf
N tersebut dengan data elektrophoregram setiap primer. Langkah awal pencarian
sekuens pada elektrophoregram adalah dengan menyorot beberapa basa yang
berada di depan atau di belakang huruf N tersebut lalu tekan Ctrl + C seperti
pada Gambar 39.

Gambar 39. Proses Penyorotan Beberapa Basa Nitrogen

Klik kanan pada nama primer forward maka akan muncul beberapa pilihan menu
kemudian pilih Open Sequencer File seperti pada Gambar 40.

Gambar 40. Klik Open Sequencer File

Maka akan muncul elektrophoregram yang sesuai dengan data sekuens yang
dipilih, kemudian klik ikon Find the first position of the specified sequence, lalu
tekan Ctrl + V pada kotak isian yang muncul. Letak basa nitrogen yang dicari
tersebut secara otomatis akan disorot seperti pada Gambar 41.
 Gambar 41. Proses Pencarian Letak Suatu Basa Nitrogen

Bagian sekuens yang disorot merupakan daerah yang dicari dan teridentifikasi
sebagai huruf N. Pada Gambar 42 di bawah ini, huruf N yang dimaksud adalah
basa nitrogen C karena dilambangkan dengan puncak berwarna biru.

Gambar 42. Letak Suatu Basa Nitrogen telah Ditemukan pada Elektrophoregram

Sekuens yang terdeteksi sebagai huruf N tersebut dihapus dengan mengarahkan

kursor pada huruf N tersebut lalu tekan Delete. Setelah itu ketik huruf C sebagai
pengganti huruf N seperti pada Gambar 43.

Gambar 43. Letak Suatu Basa Nitrogen telah Ditemukan

Langkah berikutnya, dilakukan hal yang sama untuk sekuens lain yang terdeteksi
sebagai huruf N. Hal ini penting dilakukan supaya diperoleh sekuens yang
lengkap dan memudahkan dalam proses BLAST (Basic Local Alignment Search
Tool). Setelah semuanya selesai diedit, dilakukan proses Alignment DNA kembali
untuk mensejajarkan sekuens selanjutnya dilakukan proses penggabungan
kedua sekuens. Caranya adalah dengan memilih untaian sekuens yang
terpanjang, dapat dipilih pada primer forward ataupun reverse. Jika telah
ditemukan untaian sekuens yang lebih panjang, misalnya pada bagian depan
primer reverse maka tekan Shift + Home pada basa terakhir dari primer reverse
bagian depan yang sejajar dengan basa pertama pada primer forward lalu tekan
Ctrl + C seperti pada Gambar 44.

Gambar 44. Tekan Ctrl + C pada Hasil Sekuens DNA bagian Awal dari Primer
Reverse

Letakkan kursor pada hasil sekuens DNA pertama pada primer forward lalu tekan
Shift + Home lalu tekan Ctrl + V sehingga sekuens yang telah dicopy dari primer
reverse akan menggantikan bagian sekuens yang telah disorot pada primer
forward selanjutnya alignment DNA kembali untuk mensejajarkan sekuens DNA.
Jika hal ini selesai dilakukan maka pada sekuens dari primer forward telah
memiliki bagian sekuens dari primer reverse. Selanjutnya primer reverse dapat
dihapus dengan cara klik kanan pada nama primer reverse lalu piih Delete
seperti pada Gambar 45.

Gambar 45. Proses Penghapusan Sekuens DNA Hasil dari Primer Reverse

Hanya terdapat satu sekuens sebagai bentuk gabungan dua sekuens

sebelumnya yaitu dari sekuens DNA hasil dari primer forward dan reverse.
Berikutnya lakukan BLAST sekuens dengan cara memilih ikon BLAST selected
sequence, seperti pada Gambar 46.

Gambar 46. Klik Menu BLAST selected sequence

Proses BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) yang dapat digunakan untuk
menentukan homologi suatu urutan DNA atau asam amino dengan data yang
ada di NCBI (National Center for Biotechnology Information). Analisis
pensejajaran dapat digunakan untuk membandingkan dua sekuen atau lebih.
Program ini dapat diakses melalui website National Center for Biotechnology
Information at The National Library of Medicine in Washington, DC
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST). Laman website ini dapat digunakan untuk
melihat urutan sekuens data penelitian dengan sekuens yang terdapat pada
GenBank.

BLAST selected sekuens akan menghubungkan koneksi internet antara MEGA

5.2 dengan http://www.ncbi.nlm.nih.gov/, sehingga akan muncul tampilan awal
seperti pada Gambar 47.

Gambar 47. Tampilan Laman http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ untuk BLAST

Pilih database Others karena sekuens yang akan diBLAST bukan sekuens
Human genomic atau Mouse genomic. Langkah selanjutnya dengan scroll layar
ke bawah hingga Program Selection lalu pilih Optimize for dan klik Highly similar
sequences (megablast) kemudian klik BLAST seperti pada Gambar 48.

Gambar 48. Tampilan Menu Program Selection

Tunggu hingga muncul urutan Sequences producing significant alignments. Hasil

identifikasi BLAST ditampilkan pada tabel Sequences producing significant
alignments dengan ini dapat diketahui nilai dari identity, query cover, dan E value
dari masing-masing sampel setelah disesuaikan dengan data GenBank. Tabel
Sequences producing significant alignments dapat dilihat pada Gambar 49.
 Gambar 49. Tampilan Sequences producing significant alignments

Jenis spesies dari sampel yang di-BLAST dapat terlihat dari urutan pertama dari
nilai Ident. Jika yang ditampilkan pada hasil BLAST dari sampel seperti pada
Gambar 49 maka sampel tersebut merupakan spesies Thalassia hemprichii
dengan Ident 99% atau kemiripan 99% dengan spesies “Thalassia hemprichii
chloroplast matK DNA for maturase , partial cds”. Sedangkan untuk mengetahui
rincian sekuens dari Thalassia hemprichii tersebut dapat digunakan dengan cara
klik “Thalassia hemprichii chloroplast matK DNA for maturase , partial cds” yang
merupakan sebuah link, hingga muncul tampilan seperti pada Gambar 50 berikut
ini.
 Gambar 50. Rincian Sekuens DNA dari Thalassia hemprichii chloroplast matK
DNA for maturase , partial cds

Dapat dilihat pada Gambar 50 bahwa basa nitrogen nomor 1 dari sekuens
sampel yang ditunjukkan dengan Query 1, disamakan dengan basa nitrogen
nomor 194 yang ditunjukkan dengan Sbjct 194 atau Subject 194 dari sekuens
yang ada pada GenBank. Hal ini disebabkan karena panjang sekuens pada
GenBank adalah 1308 bp (base pair) sedangkan panjang sekuens sampel hanya
904 bp.

Setelah diketahui spesies sampel yang diujikan maka akan dilakukan

pengubahan nama dari sampel sekuens pada MEGA 5.2. Simpan berkala
dokumen dengan cara klik Data lalu klik Save Session, seperti pada Gambar 51.
 Gambar 51. Menu Save Session

Beri nama dokumen tersebut lalu simpan dalam bentuk Aln. Session (*mas) lalu
klik Save seperti pada Gambar 52.

Gambar 52. Simpan Dokumen MAS File

Jika dokumen telah disimpan dengan format MAS file (.mas), dokumen juga
harus disimpan dengan format MEG file (.meg). Kedua format ini mempunyai
fungsi yang berbeda-beda, MAS file berguna untuk Alignment sekuens DNA
sedangkan MEG file berguna untuk analisis sekuens DNA yang telah di-
alignment. Cara untuk mengubah formatnya adaah dengan klik Data, klik Export
Alignment, lalu klik MEGA format seperti pada Gambar 53.
 Gambar 53. Menu Export Alignment MEGA Format

Sama seperti menyimpan MAS file, beri nama dokumen yang akan disimpan
tersebut, simpan dalam bentuk MEG file, lalu klik Save seperti pada Gambar 54.

Gambar 54. Simpan Dokumen MEG File

Saat melakukan proses alignment, alangkah lebih baik jika proses penyimpanan
dilakukan secara berkala agar data yang disimpan selalu update. Jika terjadi
sesuatu pada PC, data yang disimpan juga tidak akan hilang
Contoh :
Terdapat beberapa sekuens DNA lamun yang semuanya telah selesai
dilakukan alignment sekuens dan juga dilakukan proses BLAST satu per satu
untuk keseluruhan sampel. Jika hasil identifikasi BLAST ditampilkan pada tabel
Sequences producing significant alignments seperti pada Gambar 55 berikut ini
maka dapat diketahui nilai dari identity, query cover, dan E value dari masing-
masing sampel setelah disesuaikan dengan data GenBank.

Gambar 55. Tabel Hasil Pencarian BLAST berdasarkan Komponen Sekuens

Data hasil BLAST sekuens sampel lamun tersebut juga dibandingkan

dengan dua data sekuens yang lain yaitu sekuens dari Enhalus acoroides
dan Halophila ovalis seperti pada Tabel 1 berikut ini.
Tabel 1. Hasil Identifikasi Spesies Lamun pada Gen matK menggunakan BLAST
GenBank Query E
Lokasi ID Sampel Spesies Identity
Accession Cover Value
Sendang Biru IBRC.07.14.10 T.hemprichii AB 002577.1 99% 100% 0.0
Sendang Biru IBRC 07.14.11 T.hemprichii AB 002577.1 99% 100% 0.0
Sendang Biru IBRC 07.14.12 T.hemprichii AB 002577.1 99% 100% 0.0
Sendang Biru IBRC 07.14.14 T.hemprichii AB 002577.1 99% 100% 0.0
E.acoroides AB 002569.1 96% 100% 0.0
GenBank
H.ovalis AB 002570.1 95% 99% 0.0
 Keempat sampel lamun tersebut setelah disesuaikan dengan GenBank
teridentifikasi sebagai spesies Thalassia hemprichii pada data GenBank AB
002577.1. Semua sampel memiliki nilai identity 99%, nilai query cover 100%, dan
nilai E value (expect value) 0.0. Data ini menjelaskan bahwa hasil identifikasi
DNA dari keempat sampel lamun memiliki tingkat kesamaan yang tinggi dengan
data DNA yang terdapat pada GenBank. Selanjutnya dapat dilihat pula pada
Gambar 22, sekuens sampel diidentifikasi sebagai spesies Thalassia hemprichii
pada urutan pertama dan kedua sedangkan pada urutan ketiga sekuens sampel
diidentifikasi sebagai Enhalus acoroides dan pada urutan keempat sekuens
sampel diidentifikasi sebagai Halophila ovalis. Sekuens sampel teridentifikasi
sebagai Enhalus acoroides pada urutan ketiga dengan nilai identity 96%, nilai
query cover 100%, dan nilai E value 0.0 sedangkan untuk Halophila ovalis pada
urutan keempat dengan nilai identity 95%, nilai query cover 99%, dan nilai E
value 0.0 dapat ditemukan pada keempat sampel.
Berdasarkan nilai identity, query cover, dan E value dari hasil pencarian
BLAST maka diambil nilai yang tertinggi agar tidak terjadi kesalahan dalam
identifikasi. Persentase nilai yang diambil berkisar antara 96% sampai 100%,
semakin tinggi persentase nilai maka semakin mirip pula sekuens sampel
dengan sekuens yang ada pada GenBank dilihat dari sisi kesamaan urutannya
maupun panjang sekuensnya.
Identity, query cover, dan E value (expect value) adalah standar
identifikasi dari proses BLAST yang digunakan oleh NCBI. Identifikasi dengan
BLAST perlu memperhatikan urutan pembacaan dari strandar identifikasi, yaitu
nilai identity, nilai query cover, dan nilai E value. Jika urutan pembacaan
identifikasi tersebut tidak sesuai maka akan menghasilkan interpretasi yang tidak
tepat. Identity digunakan untuk mengukur kesamaan urutan sekuens yang dimiliki
oleh sampel dengan sekuens yang terdapat pada GenBank. Semakin tinggi nilai
identity maka semakin mirip pula urutan sekuens sampel dengan data sekuens
yang terdapat pada GenBank. Query cover digunakan untuk mengukur berapa
panjang sekuens dari sampel dengan sekuens yang ada pada GenBank.
Semakin tinggi nilai query cover maka semakin tinggi pula tingkat kesamaan
panjang sekuens sampel dengan sekuens yang ada pada GenBank sehingga
semakin memadai sekuens DNA tersebut untuk dianalisis. E value digunakan
untuk menggambarkan jumlah perbedaan pada alignment. Semakin rendah nilai
E value maka sekuens DNA dari sampel semakin mirip dengan sekuens DNA
yang terdapat pada GenBank NCBI.

2.2 Mengunduh dan Memasukkan Sekuens dari GenBank ke MEGA 5.2

Sekuens dapat dimasukkan (diinput) ke MEGA 5.2 dengan cara
membuka sekuens yang tersimpan pada PC atau dengan mengunduh
(download) sekuens yang tersedia pada GenBank. Tahapan-tahapan download
sekuens adalah sebagai berikut, dimulai dengan membuka software MEGA 5.2
pada desktop seperti pada Gambar 56 berikut ini.

Gambar 56. Membuka Software MEGA 5.2

Jika tampilan awal MEGA 5.2 telah terbuka, pilih menu Align lalu pilih Edit/Build
Alignment untuk membuka dokumen baru seperti pada Gambar 57 .

Gambar 57. Pilihan Menu Edit/Build Alignment

Muncul pilihan Alignment Editor lalu pilih Create a new alignment seperti pada
Gambar 58.

Gambar 58. Menu Alignment Editor

Jika lembar kerja telah terbuka, klik menu Web lalu pilih Query GenBank untuk
memulai mencari sekuens DNA pada GenBank seperti pada Gambar 59.

Gambar 55. Menu Query GenBank

Ubah pilihan menu All Databases dengan Nucleotide lalu ketikkan nama spesies
beserta gen yang digunakan pada kotak yang tersedia lalu pilih Search seperti
pada Gambar 60.
 Gambar 56. Tampilan Awal Menu Nucleotide

Pada kotak disebelah kiri nama spesies tambahkan tanda ceklis kemudian klik
nama spesiesnya untuk menampilkan data sekuens dari spesies tersebut seperti
pada Gambar 61.

Gambar 57. Menu Search Nucleotide

Tunggu beberapa saat hingga muncul tampilan sekuens seperti pada Gambar
62, klik Add to Alignment untuk input sekuens pada MEGA 5.2.
 Gambar 58. Data Sekuens dalam Bentuk FASTA

Jika sudah klik Add to Alignment maka diperoleh sekuens yang telah masuk ke
MEGA 5.2 dan siap untuk dilakukan analisis seperti pada Gambar 63.

Gambar 63. Sekuens dari GenBank pada MEGA 5.2

3. Pembuatan Pohon Kekerabatan (Pohon Filogeni)

Pohon filogeni dibutuhkan untuk menggambarkan kekerabatan antar taxa
atau antar spesies yang berada dalam satu pohon filogeni tersebut. Pembuatan
pohon filogeni dengan software MEGA 5.2. Pohon filogeni dapat dibuat dengan
beberapa metode tergantung dari kebutuhan dan data yang dimiliki. Pendekatan
atau metode pembuatan pohon filogeni ada 4 jenis yaitu Neighbor Joining (NJ),
Maximum Parsimony (MP), Maximun Likelihood (ML), dan Bayesian Inference
(BI). Pada Praktikum Bioteknologi Kelautan Materi Analisis DNA kali ini akan
mempelajari tentang pembuatan pohon filogeni dengan metode Neighbor Joining
(NJ).
Langkah yang pertama adalah membuka MEGA 5.2 dan klik menu Data
lalu pilih menu Open A File/Session. Cari dataset sekuens dengan tipe MAS file
yang akan diubah formatnya menjadi MEG file, lalu klik Open seperti pada
Gambar 64.

Gambar 59. Memasukkan Dataset Sekuens

Jika dataset sekuens telah masuk pada MEGA 5.2, klik menu MUSCLE seperti
pada Gambar 65.

Gambar 60. Dataset Sekuens yang telah Masuk pada MEGA 5.2
Dataset sekuens yang telah selesai alignment akan sejajar menurut site masing-
masing seperti pada Gambar 66 berikut ini. Simpan data tersebut dalam MAS file
dan MEG file.

Gambar 61. Dataset Sekuens Selesai Alignment

Minimize dataset sekuens tersebut, lalu pada halaman utama MEGA 5.2 pilih
Menu Data lalu klik Open File Session. Buka data dengan format MEG file untuk
dilakukan analisis lalu klik Open seperti pada Gambar 67.

Gambar 62. Buka Data Format MEG File

Pilih model terbaik yang akan digunakan untuk membangun pohon filogeni
dengan klik menu Models lalu klik Find Best DNA/Protein Models seperti pada
Gambar 68.

Gambar 63. Menu Find Best DNA/Protein Models

Muncul kotak dialog Analysis Preferences yang berguna untuk memulai proses
running model terbaik yang akan digunakan untuk proses pembuatan pohon
filogeni, langsung pilih tampilan default lalu klik Compute seperti pada Gambar
69.

Gambar 64. Menu Analysis Preferences

Tunggu beberapa saat hingga muncul tabel daftar model seleksi yang terbaik
berdasarkan urutan nilai BIC mulai dari terkecil hingga terbesar. GTR untuk
General Time Reversible, HKY untuk Hasegawa Kishino Yano, TN93 untuk
Tamura Nei, T92 untuk Tamura 3 Parameter, K2 untuk Kimura 2 parameter, dan
JC untuk Jukes Cantor. Model seleksi digunakan untuk menduga seberapa
banyak laju substitusi yaitu transisi dan transversi pada satu site. Transisi adalah
perubahan dari basa purin menjadi purin atau pirimidin menjadi pirimidin
sedangkan transversi adalah perubahan dari basa purin menjadi pirimidin atau
pirimidin menjadi purin.

Amati nilai BIC (Bayesian Information Criterion) yang terkecil dan berada pada
urutan teratas seperti pada Gambar 70.

Gambar 65. Daftar Model Seleksi dalam Pembuatan Pohon Filogeni

Nilai terbaik yan ditunjukkan pada daftar adalah GTR+G (General Time
Reversible), namun pada pembuatan pohon filogeni dengan metode Neighbor
Joining (NJ) tidak terdapat pilihan GTR. Oleh karena itu, dipilih model pada
pilihan kedua terbaik yaitu T92 (Tamura 3 Parameter). Model seleksi GTR
mempertimbangkan frekuensi nukleotida (nucleotide frequency) dan laju
perubahan transisi dan transversi (substitution rate) yang tidak sama. Untuk
mulai membuat pohon filogeni, klik menu Phylogeny lalu pilih Construct/Test
Neighbor Joining Tree seperti pada Gambar 71.
 Gambar 66. Pilihan Menu Phylogeny

Akan muncul kotak dialog Analysis Preferences untuk mulai running pohon
filogeni dengan metode NJ, pilih Tamura 3 Parameter pada pilihan Model/Method
lalu pilih Compute seperti pada Gambar 72.

Gambar 67. Menu Analysis Preferences untuk Pembuatan Pohon Filogeni

Akan muncul pohon filogeni dengan metode Neighbor Joining (NJ) dengan model
perhitungan menurut Tamura 3 Parameter seperti pada Gambar 73.
 Gambar 68. Pohon Filogeni dengan Metode NJ

Pohon filogeni ini dapat disimpan dalam bentuk PNG file atau PDF file, jika akan
menyimpan dalam bentuk PNG file, caranya adalah dengan klik menu Image lalu
klik Save as PNG File seperti pada Gambar 74.

Gambar 69. Save a PNG File

REFERENSI

Fatchiyah, Estri Laras A., Sri Widyarti, Sri Rahayu. 2011. Biologi Molekuler
Prinsip Dasar Analisis. Jakarta : Erlangga.

Ferita, I., Jamsari, I. Suliansyah, Gustian. 2012. Studi Hubungan Karakter

Morfologi, Anatomi, dan Molekuler Terkait Potensi Kadar Katekin pada
Tanaman Gambir (Uncaria gambir (Hunter) Roxb). Fakultas Pertanian
Universitas Andalas, Padang.

Hollingsworth, Peter M. 2007. DNA Barcoding : Potential Users. Genomics,

Society and Policy. Volume 3 No. 2, pages 44-47.

Lucas, Christina, Thirunavakkarasu Thangaradjou, and Jutta Papenbrock. 2012.

Development of a DNA Barcoding System for Seagrasses: Successful but
not Simple. Journal of PLOS One 7 (1) e29987.

Syafaruddin , E., Randriani, dan T. J Santoso. 2011. Efektivitas dan Efisiensi

Teknik Isolasi dan Purifikasi DNA pada Jambu Mete. Balai Penelitian
Tanaman Rempah dan Aneka Tanaman Industri, Sukabumi. Balai Besar
Penelitian dan Pengembangan Bioteknologi dan Sumberdaya Genetik
Pertanian, Bogor.

Tamura, K., D. Peterson, N. Peterson, G. Stecher, M. Nei and S. Kumar. 2011.

MEGA 5 : Molecular Evolutionary Genetics Analysis Using Maximum
Likelihood, Evolutionary Distance, and Maximum Parsimony Methods.
Journal of Molecular Biology Evolutionary 28 (10) : 2731-2739.

Toha, Abdul Hamid. 2001. Deoxyribo Nucleic Acid. Bandung : Alfabeta.

Widodo dan Miftakhunnafisah. 2010. Pengenalan NCBI untuk Analisa DNA,

Protein, dan Senyawa Kimia. Laboratorium Biosistem Fakultas MIPA
Universitas Brawijaya. Malang.