Rekombinasi DNA

Penyusunan kembali informasi genetic dalam dan antara molekul DNA yang
meliputi berbagai macam
proses yang terletak secara kolektif dibawah rekombinasi genetic. Pengertian
tentang bagaimana
penyususnan kembali DNA terjadi menemukan penggunaan praktis seperti
metode baru yang diteliti para
ilmuan untuk mengubah genom berbagai macam organisme.
Peristiwa rekombinasi genetik terbagi menjadi tiga kelas umum. Rekombinasi
genetic homologous
melibatkan pertukaran genetic antara dua molekul DNA (atau segmen
molekul yang sama) yang mendiami
wilayah yang luas dengan susunan homologous. Susunan basa yang
sebenarnya pada DNA tidak sesuai
sepanjang susunan dua DNA yang sama. Daerah rekombinasi khusus
berbeda dalam hal pertukaran yang
hanya terjadi pada susunan DNA yang terdefinisi. Perubahan DNA adalah
berebda dalam hal perubahan
ini melibatkan segment pendek DNA dengan kapasitas yang luar biasa untuk
berpindah dari satu lokasi
kromosom ke lokasi yang lain. “gen hopping” ini merupakan gen yang
pertama kali diamati pada maizena
oleh Barbara McClintock pada tahun 1950. Tambahan lagi tentang kelas
terkarakterisasi ini, ada jarang yang
lebar penyusunan kembali yang tidak biasa dimana tidak ada mekanisme
dan tujuan yang diajukan. Kita
hanya akan fokus pada satu dari tiga kelas yang disebut di atas.
Pebahasan lain dari mekanisme rekombinasi harus selalu menyertakan
stuktur DNA yang luar biasa. Pada
rekombinasi genetic homologous, dua molekul DNA berinteraksi dan
meluruskan susunannya yang sama
pada beberapa tahapa reaksi. Proses pelurusan ini bisa melibatkan formasi
DNA menengah barudima tiga
atau bahkan empat strand dilepaskan. (lihat kembali struktut tiga strand H-
DNA, lihat Gb. 12-22) Cabang
struktur DNA juga ditemukan sebagai rekombinan menengah. Pertukaran
informasi antara dua
makromolekul helix besar sering melibatkan jalinan strand komleks.
Fungsi dari sistem rekombinasi genetic bervariasi tergantung mekanisme.
Pemeliharaan perbedaan genetic,
sistem perbaikan DNA khusus, regulasi ekspresi gen tertentu, dan
penyusunan kembali genetic yang
deprogram selama perkembangan menunjukkan beberapa peranan yang
disadari untuk peristiwa
rekombinasi genetic. Untuk menjelaskan fungsinya, kita pertama harus
menjelaskan reaksi rekombinasi.
Rekombinasi genetic Homologous memiliki Fungsi Ganda
Rekombinasi genetic homologous (juga disebut rekombinasi umum)
dihubungkan secara kuat dengan divisi
sel pada eikaryotik. Proses yang terjadi dlam frekuensi tinggi selama meiosis,
proses yang mana sel
germline dengan dua pasangan kromosom yang cocok (sel diploid) membagi
untuk memproduksi satu set
gamete—sel sperma atau ova pada eukaryotic yang lebih tinggi masing-
masing gamete memiliki satu
anggota untuk masing-masing pasangan kromosom (sel haploid). Proses
meiosis digambarkan pada GB.
24-25. Pada bagan, meiosis dimulai dengan replikasi DNA pada sel germ
sehingga masing-masing molekul
DNA ada pada empat salinan. Sel kemudian berkembang sepanjang proses
dua divisi sel meiotic yang
mengurangi kandungan DNA pada level haploid pada masing-masing empat
sel anang.
Setelah DNA direplikasi selama profase I (profase divisi meiotic pertama),
hasil salinan DNA terasosiasi
dengann sentromernya dan disebut sebagai kromatid saudar. Masing-masing
set molekul DNA homologous
disusun sebagai dua pasang kromatid. Informasi genetic ditukar antara
kromatid genetic homologour
terdekat pada tahap meiosis dengan alat rekombinasi genetic homologous.
Proses ini melibatkan kerusakan
dan penggabungan kembali DNA. Pertukaran juga disebut pindah silang dan
dapat diamati secara sitologi
(Gb. 24-26). Pindah silang menghubungkan dua pasang kromatid saudara
bersama-sama pada titik yang
disebut chiasmata (tunggal, chiasma). Hal ini secara efektif menghubungkan
keempat kromatid homologous
bersama-sama, dan hubungan ini sangat esensial untuk segregasi kromosm
yang tepat pada divisi sel meiotic
berikutnya. Pendekatan awal, rekombinasi atau pindah silang dapat terjadi
dengan kemungkinan yang sama
pada hampir semua titik sepanjang kromosom homologous. Frekuensi
rekombinasi pada daerah yang
memisahkan dua titik pada kromosom sebanding dengan jarak antar titik.
Fakta ini digunakan selama
nenerapa decade untuk memetakan posisi relative dan jarak antara gen;
rekombinasi homologousmerupakan
proses molekuler yang underpin banyak penerapan ilmiah genetic.
Pada bakteri yang tidak menjalani meiosis, rekombinasi genetic terjadi pada
proses seperti konjugasi,
perkawinan dimana kromosom DNA ditransfer antara antara dua sel bakteri
yang berhubungan secara dekat,
hal ini dapat terjadi dalam sel tunggal antara dua kromosom homologous,
ada selama atau sesegera setelah
replikasi.
Tipe rekomendasi ini menyediankan setidak-tidaknya tiga fungsi yang bisa
diidentifikasi :(1) tipe
rekombinasi ini berkontribusi terhadap perbedaan genetic pada populasi; (2)
pada eukariot menyediakan
penghubung sementara antara kromatid yang secara nyata mengoreksi
urutan segregasi pada kromosmke sel
anang pada divisi sel meiotic pertama; dan (3) berkontribusi untuk
memperbaiki beberapa tipe kerusakan
DNA.
Fungsi pertama dan kedua sering menjadi bahan yang menarik bagi ilmuan
untuk studi tentang sel, dan
rekombinasi homologous sering dijelaskan sebagai sumber perbedaan
genetic. Namun, fungsi perbaikan
DNA merupakan peranan yang paling penting pada sel. Perbaikan DNA
seperti yang dijelaskan disebut pada
fakta bahwa luka DNA pada satu strand dapat diperbaiki secara akurat
karena informasi genetic dijaga di
dalam strand saling melengkapi yang tidak rusak. Pada tipe luka tertentu,
seperti luka pada strand ganda,
strand ganda tautan silang, luka yang ditinggalkan strand tunggal setelah
replikasi (Gb. 24-27), strand
komplementer rusak atau tidak ada. , ketika hal ini terjadi, informasi yang
dibutuhkan untuk perbaikan DNA
yang akurat harus berasal dari kromosom homologous yang terpisah dan
perbaikan yang melibatkan
kromosom homologous. Jenis luka ini umumnya berasal radiasi ionisasi dan
reaksi oksidatif, dan
perbaikannya mengoreksi produksi gameteukariot yang bisa hidup dan
keberadaan bkateri setiap harinya.
Perbaikan yang dimediasi oleh rekombinasi genetic homolog disebut
perbaikan rekombinasi
(recombinational repair), akan dijelskan detail kemudian pada bab ini.
Kontribusi penting untuk memahami rekombinasi homolog adalah model
yang diajukan Robin Holliday
pada tahun 1964, versi yang ditunjukan pada Gb. 24-28. Ada empat cirri
kunci dari model ini: (1) DNA
homolog dibentangkan dengan mekanisme umum; (2) salah satu strand dari
masing-masing DNA dirusak
dan digabung dengan denga yang lain untuk membentuk struktur
penyeberang (crossover)yang disebut
Holliday intermediate; (3) daerah dimana strand molekul DNA yang berbeda
diperbaiki disebut hetero
duplex DNA, diperluas oleh cabang migrasi (Gb. 24-29); dan (4)dua strand
Holliday intermediate dibelah
dan yang rusak diperbaiki untuk membentuk produk rekombinan.
Rekombinasi holog dapat bervariasi dalam
berbagai detail dari satu species ke species yang lain, namun sebagian besar
dari tahapannya umumnya
terdiri dari beberapa bentuk. Holliday intermediate telah mengamati in vivo
pada DNA bakteri dan bakteri
fage (Gb. 24-28b). perlu diperhatikan bahwa ada dua cara mebelah atau
“memecah” Holliday
intermediatesehingga prosesnya conservative , yakni dua produk
mengandung gen sama yang terhubung
pada urutan linear yang sama seperti dalam substrat. Jika pembelahan
dilakukan denga satu cara, DNA yang
mengapit daerah heteroduplex direkombinasi: jika pembelahan dilakukan
dengan cara yang lain, DNA yang
mengapit tidak direkombinasikan (Gb. 24-28a). hasil dari kedu cara tersebut
diamati in vivo pada eukario
dan prokariot.
Rekombinasi homolog seperti yang diilustrasikan pad gb 24-28merupakan
proses yang sangat rumit dengan
konsekuensi molekul halus. Untuk memahami bagaiman proses ini
mempengaruhi perbedaan genetic, perlu
diperhatikan homologous tidak berate identical (identik). Dua kromosom
homolog yang direkombinasi bisa
mengandung gen linear kesatuan yang sama, tetapi masing-masing
kromosom bisa memiliki perbedaan
susunan basa pada beberapa gen ini. Pada manusia, satu kromosom bisa
mengandung gen normal utuk
hemoglobin, sementara yang lain bisa mengandung gen hemoglobin dengan
mutasi sickle sel. Perbedaan ini
menunjukann tidak ada yang tidak berubah pada sebuah atau dua pasangan
basa diantara jutaan pasangan
basa yang identik. Meskipun rekombinan homolog tidak mengubah kesatuan
linear gen, rekombina homolog
dapat menentukan yang mana dari versi berbeda (atau allele) gen
dihubungkan bersama dalam kromosom
tunggal (Gb. 24-28).

Rekombinasi membutuhkan enzim spesifik

Enzim telah diisolasi pada prokariot dan eukariot yang menunjukan satu atau
lebih tahapan rekombinasi
homolog. Proses identifikasi dan memahami enzim-enzim tersebut
ditunjukan oleh E. coli. Enzim
rekombinasi penting dikode oleh gen recA, B, C, dan D dan oleh gen ruvC.
Gen rec B, C, dan D mengkode
enzim RecBCD yang dapat menginisiasi rekombinan dengan melepaskan
DNA dan kadang-kadang
menyayat satu strand. Protei RecA mempromosikan semua tahapan sentral
pada proses: pemasangan dua
DNA, formasi Holliday intermediate, dan cabang imigrasi seperti yang
dijelaskan berikut. Kelas baru
nucleus yang menyayat secara spesifik Holliday intermediatejuga diisolasi
dari bakteri dan yeast. Nukleus
tersebut sering disebut resolvases; resolvase E. coli merupakan protein
RuvC.
Enzim RecBCD berikatan dengan DNA linear pada salah satu ujung dan
menggunakan energy ATp untuk
berpindah sepanjang helix, melepaskan DNA didpan dan melepaskannya
kembaki dibelakang (Gb. 24-30).
Pelepasan kembali lebih lambat dari pelepasan sehingga gelembung strand
tunggal segera terbentuk dan
membesar. Strand tunggal dalam gelembung segera dipotong saat enzim
bertemu susunan tertentu yang
disebut chi ((5’)GCTGGTGG(3’). Ada sekitar 1000 dari sususna tersebut pada
genom E. coli, dan
berpengaruh meningkatkan frekuensi rekombinasi pada daerah dimana
rekombinasi itu terjadi. Susunan
yang meningkatkan frekuensi rekombinasi diidentifikasi pada beberapa
organisme.
Protein RecA tidak biasa telibat dalam metabolism DNA karena bentuk aktif
enzim ini merupakan perintah,
filament helix yang memasang secara kooperatif pada DNA dan mampu
melibatkan monomer RecA (Gb.
24-31). Formasi filament ini secara normal terjadi pada DNA strand tunggal
seperti yang diproduksi oleh
enzim RecBCD. Filamen juga akan terbentuk pada DNA duplex dengan gap
strand tunggal, dimana
monomer RecA berikataan pertama kali dengan DNA strand tunggal dalam
gap dan kemudian kumpulan
filament menyelimuti dupleks tetangganya.
Paradigma in vitro yang berguna untuk aktivitas rekombinasi filament RecA
adalah reaksi yang disebut
pertukaran DNA strand (Gb. 24-32). DNA dalam filament dibentangkan
dengan DNA duplex kedua, dan
strand ditukar antar dua DNA untuk membentuk heteroduplex DNA.
Pertukaran yang terjadi antara
tingkatan 3 samapi 6 pasangan basa dan berkembang menjadi arah yang
unik, 5’_3’ yang berkaitan dengan
DNA strand tunggal didalam filament. Seperti yang ditunjukan Gb. 24-32,
reaksi ini dapat melibatkan tiga
sampai empat strand, dan pada kasus berikutnya struktur Holliday
merupakan intermediate dalam proses.
Susunan yang lengkap dari setiap peristiwa seperti ditunjukan oleh Gb. 24-
33 memperkenalkan dua cirri
tambahan dari protein RecA-memediasi tiga reaksi pertukaran strand.
Pertama, jajran dua DNA bisa
melibatkan dua formasi dari struktur DNA yang tidak biasa, dimana tiga
strand dilepaskan. Detail struktur
masih belum diketahui. Kedua, harena DNA merupakan struktur helix,
pertukaran strand membutuhkan
perintah rotasi untuk dua DNA yang berjajaran. Hal ini menimbulkan aksi
gelondong (spooling) yang
memindahkan titik cabang sepanjang helix. ATP dihidrolisis dengan protein
RecA seperti reaksi ini
berlangsung.
Ketika intermediate Holliday terbentuk, enzim yang terlibat dalam
melengkapi rekombinasi termasuk
topoisomerase, resolvase, dan nuclease yang lain, DNA polymerase I atau III,
dan DNA ligase. Protein
RuvC (Mr20.000) pada E. coli menyayat intermediate Holliday
denganperlakuan seperti pada Gb. 24-28a.
banyak detail dari reaksi ini yang dilaksanakan oleh enzim rekombinasi dan
koordinasi dari enzim ini belum
banyak diketahui.
Rekombinasi Homolog merupakan jalur penting untuk perbaikan
DNA
Rekombinasi menyediakan jalan untuk perbaikan DNA yang akurat ketika
informasi susunan yang
diperlukan tidak tersediadari strand yang berpasangan denga strand yang
rusak (lihat Gb. 24-27). Untuk
mengilustrasikan peranan rekombinasi pada perbaikan DNA, kamiakan
memerikasa luka yang ditemukan
selama replikasi normal dan tertinggal setelah tidak tereplikasi pada DNa
strand tunggal (lihat Gb. 24-24,
24-27). Pernaikan luka disebut perbaikan postreplication, dan pada E.coli,
prose ini membutuhkan protein
RecA.
Jalur yang masuk akal untuk perbaikan postreplication ditunjukan oleh Gb.
24-34. Luka pada strand DNa
yang tidak berpasangan tidak dapat dihilangkan, karena hal ini akan
meinggalakan patahanpada kedua strand
DNA. , hasil yang mungkin letal bagi sel. Untuk menghindari kerusakan
kromosom dan memungkinkan
perbaikan, , daerah yang mengandung luka harus mendapatkan strand
komplemeter. Jalur rekombinasi
membuat penggunaan DNa homolog pada cabang lain dari cabang replikasi.
Protein RecA- memediasi
reaksi pertukaran strand yang menjalankan perbaikan DNA dengan bantuan
energy ATP hidrolisis. Ketika
luka dibuat menjadi bagian duplexkerusakan dapar berangsur-angsur
diperbaiki. Perbaikan luka pad tipe ini
telihat sebagai fungsi utama sistem rekombinasi homolog pada setiap sel.

Rekombinasi daerah spesifik menghasilkan penyusunan DNA

kembali yang tepat
Kita sekarang beralih pada rekombinasi secar umum, yang dapat melibatkan
dua susunan homolog,
rekombinasi pada tipe berbeda yang terbatas untuk susunan khusus. Reaksi
rekombinasi daerah spesifik
terjadi hampir pada setiap sel, namun fungsinya dispesialisasi dan beragan
dari satu spesies ke spesies
lainnya. Fungsi ini termasuk fungsi regulasi ekspressi gen tertentu , promosi
penyusunan kembali gen
yang diprogram berikatan pada lingkaran replikasi beberapa viral dan DNA
plasmid, seperti yang akan
diilustrasikan kemudian. Sistem rekombinasi daerah spesifik terdiri atas
enzim yang disebut rekombinase
dan sebuah pendekan (20-200 pasangan basa, tergantung sistem) susunan
DNA unik dimana rekombinase
berperan (daerah rekombinasi). Beberapa sistem juga termasuk protein
tambahan yang mergulasi pemilihan
waktu atau hasil reaksi.
Dari studi in vitro pada lebih dari lusinan sistem rekombinasi daerak spesifik,
beberapa prinsip muncul. Jalur
reaksi pokok untuk banyak sistem ditunukan oleh Gb. 24-35. Rekombinase
menyadari dan berikatan dengan
masing-masing dari dua daerak rekombinasipada moleku DNA yang
berbedadalam DNA yang sama. Satu
dari masing-masing strand DNA disayat pada titik khusus widalam daerah,
dan rekombinase terhubung
secara kovalen pada DNA pada daerah sayatan melaui ikatan pospotirosin
(kadang posposerin). Protein
sementara-sambunga DNA menjaga ikatan pospodiester yang dihilangkan
pada DNA yang luka, dan
kofaktor energy tinggi seperti ATP tidak diperlukan pada tahapan berikutnya.
Strand DNA yang terluka
digabungkan kembali pada pasangan baru, dengan ikatan pospodiester baru
yang dibentuk dari
protein-sambungan DNA. Hasil dari proses kerusakan awal dan
penggabungan ini adalah intermediate
Holliday. Untuk melengkapi reaksi, proses harus diulangi pada titik kedua
dalam masing-masing dua daerah
rekombinasi. Pada beberapa sistem, kedua strand dari masing-masing
daerah rekombinasi bisa dipotong
secara bersamaan dan digabungkan lagi pada pasangan baru tanpa Holliday
intermediate. Pertukaran pada
masing-masing kasus merupakan pertukaran timbale balik dan nyata
sehingga daerah rekomendasi
diregenerasi setelah reaksi. Kesimpulannya, rekombinase dapat dilihat
sebagai daerah khusus endonuklease
dan ligase pada satu paket.
Susunan daerah rekombinasi yang disadari oleh rekombinase asimetris
secara parsial (nonpalindromic), dan
dua daerah yang direkomendasidibentangkan pada orientasi yang sama
untuk reaksi oleh rekombinase.
Reaksi tersebut bisa memiliki beberapa hasil, tergantung pada lkasi terdekat
dan orientasi daerah
rekombinasi (Gb. 24-36). Jika kedua tempat pada molekul DNA yang sama,
reaksi akan menghasilakan
inverse dan delesi DNA diantara tempat tersebut, tergantung pada apakah
tempat tersebut memiliki arah
yang berlawanan atau sama, secara beurutan. Jika tempat berada pada DNA
yang berbeda rekombinasi
disebut sebagai intermolecular, dan reaksi insersi terjadi jika salah satu atau
kedua DNA tersebut sirkuler.
Beberapa sistem sangat khusus untuk satu reaksi (misalnya inversi). Dan
tidak akan mertindak pada tempat
yang salah orientasi.
Sistem rekombinasi tempat khusus pertama kali diidentifikasi dan diteliti in
vitro dikode oleh bakteri fage
. Ketika DNA fage memasuki sel E. coli komples dari seri peristiwa
regulator terjadi bahwa
memperlakukan DNA sebagai salah satu dari dua takdir; apakah DNA ini
direplikasi dan digunakan untuk
memproduksi bakteri fage lebih banyak (di satu sisi inang sel dihancurkan),
atau DNA diintegrasi kedalam
inang kromosom dimana DNA bisa direplikasi secara pasif sepanjang
kromosom inang untuk generasi
banyak sel. Integrasi diselesaikan oleh rekombinase fage yang dikode yang
disebut integrasi ,
berperan pada tempat rekombinasi (tempat penempelan sistem bakteri
fage) pada fage DNA bakteri
yang disebut attP dan attB, secara berturut-turut (Gb 24-37). Beberapa
protein tambahan juga digunakan
pada reaksi ini, beberapa dikode oleh bakteri fage dan sisanya dikode oleh
sel inang bakteri. Perlu
diperhatikan reaksi rekombinasi tempat khusus (Gb. 24-35) simetris secara
kimia dalam hal ikatan kimia
yang terjadi sebelum dan sesudah, dan reaksi ini harus memiliki konstan
keseimbangan 1.0. Fungsi utama
dari protein pelengkap pada integrasi adalah untuk mengubah
keseimbangannya denan membiarkan
integrasi dan/atau mencegah reaksi berkebalikan (penghilangan).
Mekanisme dimana reaksi ini diselesaikan
belum diketahui secara detail. Saat DNA bateri fage harus secepatnya
dikeluarkan secepatnya dari
kromosom (yang terjadi ketika sel diperlakukan pada stress lingkummham
yang beragam), reaksi
pengeluaran tempat khusus menggunakan protein pelengkap yang berbeda
(Gb. 24-37)
Penggunaan rekombinasi tempat khusus untuk meregulasi ekspresi sel akan
dibahan kemudian pada bab 27.
Gen Imunoglobulin dirakit dengan rekombinasi.
Contoh yang penting dari peristiwa rekombinasi terprogram yang terjadi
selama perkembangan adalah
generasi gen Imunoglobulin dari segmen gen yang dipisahkan pada genome.
Imunoglobulin (atau antibody),
diproduksi oleh B lymphocytes, merupakan prajurit darin sistem imun
vertebrata-molekul yang berikatan
dengan agen menular dan semua substansi asing bagi organisme. Mamalia
seperti manusia mampu
meproduksi jutaan antibody dengan perbedaan ikatan khusus. Namun,
genom manusia mengandung hanya
100.000 gen. rekombinasi membiarkan organisme untuk memproduksi
perbedaan yang luar biasadari
sejumlah kecil kapsitas DNA-coking.
Vertebrata umumnya memproduksi kelas ganda immunoglobulin. Untuk
mengilustrasikan bagaimana
keanekaragaman antibody digenerisasi, kami akan fokus pada kelas
immunoglobulin (IgG) pada manusia.
Imunoglobulin terdiri atas dua cincin polipeptida berat dan dua cincin
polipeptida ringan (Gb. 24-38a).
masing-masing cincin memiliki daerah tidak tetap dengan susunan yang
sangat berbeda dari satu
immunoglobulin dengan immunoglobulin yang lainnya. Ada dua family
berbeda dari cincin polipeptida
ringan, yaitu kappa dan lambda, yang bebeda pada susunan daerah
konstannya. Masing-masing dari tiga tipe
cincin polipeptida tersebut (cincin berat, cincin ringan kappa, dan lambda),
perbedaan dari daerah
variablenya digenerasi dengan mekanisme yang sama. Gen untuk
polipeptida ini dibagi menjadi segmen
dank tandan yang mengandung versi ganda dari masing-masing segmen
yang ada pada genom. Satu versi
dari masing-masing segmen digabungkan untuk membentuk gen lengkap.
Organisasi DNA yang mengkode cincin ringan kappa IgG manusia dan proses
yang mana cincin ringan
kappa dewasa digenerasi ditunjukan oleh GB 24-38b. sel yang tidak
terdiferensiasi, informasi yang dikode
untuk cincin polipeptida ini dipisahkan menjadi tiga segmen. Segmen V
(variable)mengkode residu 95
pasangan basa wilayah variable, segmen J (joining) mengkode residu 12
asam amino wilayah variable
berikutnya, dan segmen C mengkode wilayah konstan. Ada sekitar 300
segmen V berbeda , 4 segmen J
berbeda, dan 1 segmen C. seperti pada sel batang (stem)tulang sumsum
membedakan untuk membentuk B
limposit dewasa, satu V dan satu J dibawa secara bersama-sama oleh
rekombinasi tempat khusus. Ini
merupakan delesi DNA yang deprogram secara efektif, dan DNA yang terlibat
dibuang. Ada 300x 4=1200
kemungkinan kombinasi. Proses rekombinasi tidaklah senyata rekombinasi
tempat khusus seperti yang
dijelaskan sebelumnya, dan beberapa variasi kombinasi terjadi pada susunan
persimpangan V-J yang
menambahkan faktor sekurangnya 2.5 pada total variasi yang mungkin,
sehingga sekitar 2.5 x 1200
=3000kombinasi V-J yang berbeda dapat digenerasi. Penggabungan akhir
kombinasi V-Jke wilayah C
diselesaikan dengan reaksi penyambungan RNa setelah transkripsi (Gb. 24-
38b). Penyambungan RNA akan
dijelaskan pada bab berikutnya. Gen untuk cincin berat dan lambda cinicn
ringan dibentuk secara sama.
Pada cincin berat, ada lebuh banyak segmen gen dan lebih dari 5000
kemungkinan kombinasi. Karena
semua cincin berat dapat berkombinasi dengan semua cincin ringan untuk
mengenerasi immunoglobulin,
ada sekurangnya 3000 x 5000 atau 1.5 x 107 kemungkinan IgG.
Keberagaman lainnya digenerasi karena
susunan Vdiperlakukan pada mutasi tinggi (mekanisme yang tidak diketahui)
selama diferensiasi
B-limposit. Masing-masing B-limposit dewasa memproduksi hanya satu
antibody, tetapi cakupan antibody
yang diproduksi oleh sel yang berbeda sangat banyak. Enzim yang
mengkatalisasi penyusunan kembali
gen ini belum diisolasi , tetapi susunan yng mengkoreksi proses
penggabungan V-J yang sepertinya disadari
oleh enzim yang telah teridentifikasi ini.
Proses rekombinasi ini membantu untuk mengilustrasikan prinsip bahwa
rekombinasi tidak menghancurkan
material genetic yang dipelihara oleh proses replikasi dan perbaikan. di sini
kita bisa lihat proses
penyusunan yang nyata yang terjadi hanya pada sel-sel khususn (germ-line
DNA tidak tipengaruhi) dan
memungkinkan ornanisme lebih efisien menggunakan sumebr informasi
genetic.
Genetic element yang dapat dipindahkan berpindah dari satu lokasi
ke lokasi yang lain
Akhirnya, kita beralih pada pembahasana elemenyang dapat berpindah atau
transposon. Transposon
merupakan DNA segmen, yang ditemukan hampir pada semua sel, yang
berpindah atau “loncat” dari satu
tempat di kromosom (tempat donor) ke tempat yang lain pada kromosom
yang sama atau berebeda (tempat
target). Tidak ada homology yang dibutuhkan untuk perpindahan,
transposisi. Lokasi yang dipilih ditentukan
secara acak. Karena insersi transposon merupakan gen esensial yang
mungkin membunuh sel, peristiwa
yang diregulasi secara ketat dan jarang terjadi (mungkin pada jutaan divisi
sel).
Ada dua kelas transposon pada bakteri. Susunan insersi (transposon
sederhana) mengandung hanya susunan
yang dibutuhkan untuk trasposisi dan gen untuk protein (transposase) yang
mempromosikan proses tersebut.
TRansposon kompleks mengandung satu atau lebih gen disampin gen yang
dibutuhkan untuk transposisi.
Gen tambahan ini sering memberikan ketahan untuk antibiotic. Penyebarab
elemen ketahanan antibiotic
melalui penyakit- penyebab populasi bakteri, dimediasi sebagian dengan
transposisi, memberikan beberapa
antibiotic yang tidak berguna (p.796).
Transposon bakteri berpariasi dalam hal struktur, tetapi sebaian besar
memiliki pengulangn pendek pad dua
ujung elem yang bertindak sebagai tempat berikatan untuk transposase.
Ketika transposisi terjadi, susunan
pendek tempat target (5-10 pasangan basa) diduplikasi untuk membentuk
tambahan pengulangan pendek
yang mengapit masing-masing ujung transposon yang diinsersi (Gb. 24-39),
pengulangan ujung pendek
menununjukan mekanisme pemotongan yang digunakan untuk memasukkan
transposon kedalam DNA di
tempat yang baru.
Ada du jalur umum transposisi pada bakteri (Gb. 24-40). Pada transposon
sederhana atau langsung,
pemotongan dilakukan pada masing-masing sisi transposon untuk
menghilangkan transposon, dan
transposon berpindah ke lokasi baru, meninggalkan strand ganda yang rusak
pada DNA dimana transposon
berasal. Di tempat target, jalan pemotongan dibuat, transposon disambung
kedalam DNA yang rusak, dan
beberapa DNA replikasi dibutuhkan untuk menduplikasi susunan tempat
target (Gb. 24-40a). pada
ytransposisi replikatif, keseluruhan transposon direplikasi sehingga salinan
ditinggalkan di lokasi donor (Gb.
24-40b). Sebuah intermediate pada reaksi berikutnya merupakan
cointegrate, dimana wilayah donor
dihubungkan secara kovalen dengan DNA pada tempat target. Untuk
melengkapi salinan transposon yang
ada pada intermediate, disusun dengan orientasi yang sama pada DNA.
Intermediate ini dikonversi pada
produk transposon yang diketahui karakteristiknya dengan baik dengan
rekombinasi tempat khusus dimana
rekombinase khusus mempromosikan reaksi delesi yang diperlukan.
Transposon juga ditemukan pada eukariot.transposon ini secara strukstur
sama dengan transposon bakteri,
dan memakai mekanisme transposisi yang sama. Namun, pada beberapa
kasus, mekanisme transposisi
cukup berbeda dan cenderung melibatkan intermediate RNA. Transposon ini
akan dijelaskan pada bab
berikutnya, dimana kita melewatkan DNA metabolism dan beralih pada
pembahansan tentan RNA.
Rekombinasi Deoxyribolnucleic Acid (DNA)
 Setiap makhluk hidup mempunyai gen. Gen merupakan penentu sifat yang

terdapat di dalam kromosom. Apabila gen ini berubah, maka sifat dari makhluk hidup

juga berubah, sehingga banyak ahli yang memanfaatkan untuk mengubah gen dengan

tujuan mendapatkan organisme baru yang memiliki sifat sesuai yang dikehendaki. Proses

pengubahan gen-gen ini disebut dengan nama rekayasa genetika. Ada beberapa macam

rekayasa genetika di antaranya adalah rekombinasi DNA, fusi sel, dan transfer inti.

Rekombinasi DNA merupakan hal yang mendasar dan sangat penting dalam makhluk

hidup adalah jika terjadi proses reproduksi secara seksual yang normal, maka akan terjadi

pemisahan dan penggabungan kembali molekul-molekul DNA dari kromosom. Teknik

pemisahan dan penggabungan ini dijadikan oleh ilmuwan untuk lebih dikembangkan.

Setiap jenis makhluk hidup mempunyai struktur DNA yang sama, untuk itulah DNA dari

satu spesies dapat disambungkan dengan DNA dari spesies yang lain, dengan tujuan agar

mendapatkan sifat yang baru. Proses penyambungan ini dikenal dengan nama

rekombinasi DNA. Misalnya, telah ditemukannya gen seekor sapi yang berhasil

dipindahkan ke dalam bakteri sehingga bakteri tersebut telah menerima gen asing yang

tepat seperti gen aslinya. Gen ini akan mempunyai sifat-sifat dari sapi tersebut dan akan

mempunyai sifat gen baru disebut gen yang diklon. (Watson,dkk 1988).

Rekayasa genetik dapat mengubah genotipe suatu organisme dengan cara

mengenalkan gen-gen baru yang belum dimiliki oleh suatu spesies. Teknik menyambung

gen ini telah berhasil dan sukses dalam menghasilkan gen baru. Para ahli menggunakan

teknik rekayasa genetika dengan menggunakan mikroba-mikroba seperti bakteri untuk

membuat substansi yang tidak dapat dibuat oleh organisme yang direkayasa. Tetapi
pengenalan gen-gen dalam bakteri jauh lebih sulit, karena para ahli harus mendapatkan

gen yang diinginkan kemudian menggabungkan ke dalam DNA dari bakteri (Kimbal,

John W. 1989).
Gen yang diinginkan ini akan dihubungkan menjadi suatu lingkaran DNA

bakteri kecil yang disebut dengan plasmid. Kemudian plasmid ini siap untuk memasuki

sel bakteri dan akan direplikasi bersama-sama DNA selnya sendiri. Dengan cara ini,

maka semua gen plasmid dan sel-selnya sama seperti gen-gen aslinya. Selanjutnya,

plasmid ini akan diteruskan dari satu sel ke sel lainnya dengan cara transformasi. Untuk

menghubungkan gen-gen asing ke dalam plasmid memerlukan rekombinasi genetik.

(Milkman and Bridges,1993).

Berbagai penyakit viral diperkirakan akan bisa disembuhkan dengan vaksinasi

jenis baru. Vaksin baru ini dibuat dari protein bibit penyakit yang dipisahkan melalui

rekayasa genetik. Protein pembangkit antibodi ini aman karena sifat-sifat bibit

penyakitnya telah dilumpuhkan sama sekali. Bila dibandingkan, vaksin di masa kini

dibuat dari bibit penyakit yang masih membawa sifat-sifatnya (yang dilemahkan).

Pengembangan rekayasa genetik yang paling spektakuler dan mungkin menentukan

perkembangan di bidang kedokteran adalah teknik pembuatan antibodi monoklonal.

Teknik yang ditemukan dua ilmuwan Georges Kohler dan Cesar Milstein di tahun 1975

ini mampu memisahkan antibodi yang khas dari jutaan jenis antibodi yang terdapat dalam

tubuh manusia. Maka, suatu antibodi dapat dengan pasti mengatasi suatu penyakit.

Percobaan Kohler-Milstein, pada awalnya, adalah mencari antibodi untuk mengatasi

kanker. Pada eksperimentasi itu, kedua penemu menyatukan sel-sel pembuat antibodi

yang didapat dari tikus yang sudah dijangkiti kanker, dengan sel-sel kankernya. Sel-sel
hasil gabungan, yang dikenal dengan nama sel-sel hibridomas, ternyata mampu

menghasilkan antibodi yang khas untuk menghadapi kankernya dalam suatu koloni

jaringan (Roberts, dkk. 1995).

Kloning gen dalam akukultur sekarang sangat berguna dalam memperbanyak

serta menyimpan baik insulin maupun protein-protein penyandi gen tertentu yang nanti

akan digunakan dalam kepentingan akuakultur. Pengklonan gen GFP (Green Fluorescent

Protein) yang berasal dari ubur-ubur Aequorea Victoria pada masa sekarang lagi

maraknya. Para peneliti dan ilmuwan banyak menggunakan bakteri seperti E.coli sebagai

tempat insersi protein GFP ini. Selain itu kloning gen mampu memproduksi insulin.

Fragmen DNA spesifik penyandi insulin di isolasi dan diklon dalam suatu vektor

sehingga membentuk DNA rekombinan yang selanjutnya dapa memproduksi insulin.

Jenis bakteri E.coli digunakan karena mudah diinsersi dan DNA juga mudah melewati

membran dari jenis bakteri ini selain bakteri ini memiliki kompeten sel yang bagus.

Rekombinasi genetika
Dari Wikipedia bahasa Indonesia, ensiklopedia bebas

Belum Diperiksa

Langsung ke: navigasi, cari

Rekombinasi genetika merupakan proses pemutusan seunting bahan genetika (biasanya DNA,
namun juga bisa RNA) yang kemudian diikuti oleh penggabungan dengan molekul DNA
lainnya. Pada eukariota rekombinasi biasanya terjadi selama meiosis sebagai pindah silang
kromosom antara kromosom yang berpasangan. Proses ini menyebabkan keturunan suatu
makhluk hidup memiliki kombinasi gen yang berbeda dari orang tuanya, dan dapat
menghasilkan alel kimerik yang baru. Pada biologi evolusioner, perombakan gen ini diperkirakan
memiliki banyak keuntungan, yakni mengijinkan organisme yang bereproduksi secara seksual
menghindari Ratchet Muller.
Dalam biologi molekular, rekombinasi juga dapat merujuk pada rekombinasi rantai DNA yang
tidak sama secara buatan, sering kali merupakan DNA organisme yang berbeda. Rekombinasi ini
menghasilkan DNA rekombinan.

Telomerase (aktivitasreverse transcription)

Enzimygbekerjamemanjangkanutaslagging ujung3’ OH →
mengatasipemendekanukuranutaslagging pd DNA linier
•Topoisomerase

dHDNA → relax (“nick”) → unwind

Memisah2 DNA sirkularhslreplikasi+ btkneg. supercoil
Memisahkankromatidturunan

BAB I
REKOMBINASI DNA
Teknologi DNA rekombinan
Teknik DNA rekombinan adalah rekayasa genetika untuk
menghasilkan sifat baru dengan cara merekombinasikan gen tertentu
dengan DNA genom. Teknik DNA rekombinan merupakan
kumpulan bertujuan untuk merekombinasi gen dalam tabung reaksi.
Teknik DNA rekombinan meliputi isolasi DNA, teknik memotong
DNA, teknik menggbung DNA dan teknik untuk memasukan DNA
ke dalam sel hidup. Teknologi DNA rekombinan atau sering disebut
juga rekayasa genetika ini adalah suatu ilmu yang mempelajari
pembentukan kombinasi materi genetik yang baru dengan cara
penyisipan molekul DNA ke dalam suatu vektor sehingga
memungkinkannya terjadinya integrasi dan mengalami perbanyakan
dalam suatu sel organisme lain yang berperan sebagai sel inang.
Manfaat rekayasa genetika ini diantaranya adalah dimungkinkannya
melakukan isolasi dan mempelajari fungsi masing-masing gen dan
mekanisme kontrolnya. Selain itu, rekayasa genetika juga
memungkinkan diperolehnya suatu produk dengan sifat tertentu
dalam waktu lebih cepat dan jumlah lebih besar daripada produksi
secara konvensional. Sejak jaman dahulu, nenek moyang kita telah
mengetahui adanya keanekaragaman makhluk hidup.
Keanekaragaman makhluk hidup ini memungkinkan manusia untuk
memilih jenis makhluk hidup yang dikehendakinya. Salah satu upaya
nenek moyang kita dalam memilih jenis makhluk hidup yang unggul
adalah dengan breeding atau mengawinkan beberapa spesies unggul
untuk didapatkan keturunan yang unggul pula dan memiliki sifat dari
kedua induknya. Dengan semakin berkembangnya ilmu genetika dan
ditemukannya gen, maka manusia pun memiliki alternatif lain yang
lebih efektif yaitu melalui teknik rekayasa genetika (Genetic Engineering)
dengan cara melakukan perubahan langsung pada DNA. Salah satu
upaya yang dilakukan adalah dengan DNA rekombinan. Teknik DNA
rekombinan adalah suatu teknik di dalam rekayasa genetika untuk
menghasilkan sifat baru dengan cara merekombinasikan gen tertentu
dengan DNA genom. Teknik DNA rekombinan merupakan
kumpulan teknik untuk merekombinasi gen dalam tabung reaksi.
Teknik itu diantaranya isolasi DNA, teknik memotong DNA, teknik
menggbung DNA dan teknik untuk memasukan DNA ke dalam sel
hidup. Setelah DNA rekombinan terbentuk maka dilakukan proses
transformasi ke host cell kemudian dilkakukan proses inkubasi sel
bakteri tersebut. Setelah dilakukan inkubasi maka sel bakteri dapat
diuji kehadiran DNA rekombinannya yaitu melalui uji antibiotik, uji
medium seleksi dan seleksi putih biru. Setelah didapatkan bakteri
dengan DNA rekombinan maka dilakukan purifikasi untuk
mengisolasi gen yang direplikasi.
Secara klasik analisis molekuler protein dan materi lainnya
dari kebanyakan organisme ternyata sangat tidak mudah untuk
dilakukan karena adanya kesulitan untuk memurnikannya dalam
jumlah besar. Namun, sejak tahun 1970-an berkembang suatu
teknologi yang dapat diterapkan sebagai pendekatan dalam mengatasi
masalah tersebut melalui isolasi dan manipulasi terhadap gen yang
bertanggung jawab atas ekspresi protein tertentu atau pembentukan
suatu produk. Teknologi yang dikenal sebagai teknologi DNA
rekombinan, atau dengan istilah yang lebih populer rekayasa genetika,
ini melibatkan upaya perbanyakan gen tertentu di dalam suatu sel
yang bukan sel alaminya sehingga sering pula dikatakan sebagai
kloning gen. Banyak definisi telah diberikan untuk mendeskripsikan
pengertian teknologi DNA rekombinan. Salah satu di antaranya, yang
mungkin paling representatif, menyebutkan bahwa teknologi DNA
rekombinan adalah pembentukan kombinasi materi genetik yang baru
dengan cara penyisipan molekul DNA ke dalam suatu vektor
sehingga memungkinkannya untuk terintegrasi dan mengalami
perbanyakan di dalam suatu sel organisme lain yang berperan sebagai
sel inang. Teknologi DNA rekombinan mempunyai dua segi manfaat.
Pertama, dengan mengisolasi dan mempelajari masing-masing gen
akan diperoleh pengetahuan tentang fungsi dan mekanisme
kontrolnya. Kedua, teknologi ini memungkinkan diperolehnya
produk gen tertentu dalam waktu lebih cepat dan jumlah lebih besar
daripada produksi secara konvensional. Pada dasarnya upaya untuk
mendapatkan suatu produk yang diinginkan melalui teknologi DNA
rekombinan melibatkan beberapa tahapan tertentu. Tahapan-tahapan
tersebut adalah isolasi DNA genomik atau kromosom yang akan
diklon, pemotongan molekul DNA menjadi sejumlah fragmen
dengan berbagai ukuran, isolasi DNA vektor, penyisipan fragmen
DNA ke dalam vektor untuk menghasilkan molekul DNA
rekombinan, transformasi sel inang menggunakan molekul DNA
rekombinan, reisolasi molekul DNA rekombinan dari sel inang, dan
analisis DNA rekombinan.
Dasar teknologi DNA rekombinan
Bakteri memiliki mekanisme seksual yang telah dibuktikan
pada tahun 1946. Konsekwensi dari mekanisme seksual adalah:
1. Menyebabkan terbentuknya kombinasi gen-gen yang berasal dari
dua sel yang berbeda
2. Terjadi pertukaran DNA atau gen dari satu sel ke sel yang lain.
Mekanisme seksual ini tidak bersifat reproduktif atau tidak
menghasilkan keturunan
Gambar 1. Hasil Penelitian Lederberg dan Tatum
Transfer DNA atau perpindahan DNA atau perpindahan
DNA ke dalam bakteri dapat melalui tiga cara, yaitu konjugasi,
transformasi, dan transduksi. DNA yang masuk ke dalam sel bakteri
selanjutnya dapat berintegrasi dengan DNA atau kromosom bakteri
sehingga terbentuk kromosom rekombinan. Konjugasi merupakan
perpindahan DNA dari satu sel (sel donor) ke dalam sel bakteri
lainnya (sel resepien) melalui kontak fisik antara kedua sel. Sel donor
memasukkan sebagian DNA-nya ke dalam sel resepien. Transfer
DNA ini melalui pili seks yang dimiliki oleh sel donor. Sel resepien
tidak memiliki pili seks. DNA dari sel resepie berpindah ke sel
resipien secara replikatif sehingga setelah proses ini selesai, sel jantan
tidak kehilangan DNA. Ke dua sel tidak mengalami peningkatan
jumlah sel dan tidak dihasilkan sel anak. Oleh karena itu, proses
konjugasi disebut juga sebagai proses atau mekanisme seksual yang
tidak reproduktif.
Gambar 2. Proses konjugasi
Gambar 3. Proses konjugasi yang menyebabkan resistensi pada plasmid
Transformasi merupakan pengambilan DNA oleh bakteri dari
lingkungan di sekelilingnya. DNA yang berada di sekitar bakteri
(DNA asing) dapat berupa potongan DNA atau fragmen DNA yang
berasal dari sel bakteri yang lain atau organisme yang lain. Masuknya
DNA dari lingkungan ke dalam sel bakteri ini dapat terjadi secara
alami. Pada tahun 1928 ditemukan strain bakteri yang tidak virulen
dapat berubah sifatnya menjadi virulen disebabkan adanya strain yang
tidak virulen dicampur dengan sel-sel bakteri strain virulen yang telah
dimatikan. Tahun 1944 ditemukan bahwa perubahan sifat atau
transformasi dari bakteri yang tidak virulen menjadi virulen
disebabkan oleh adanya DNA dari sel bakteri strain virulen yang
masuk ke dalam bakteri strain yang tidak virulen.
Gambar 4. Proses transformasi
Gambar 5. Proses transformasi pada sel bakteri
Transduksi adalah cara pemindahan DNA dari satu sel ke
dalam sel lainnya melalui perantaraan bakteriofage. Beberapa jenis
virus berkembang biak di dalam sel bakteri. Virus-virus yang inangnya
adalah bakteri sering disebut bakteriofag atau fage. Ketika virus
menginfeksi bakteri, fage memasukkan DNA-nya ke dalam sel
bakteri. DNA tersebut kemudian akan bereplikasi di dalam sel bakteri
atau berintegrasi dengan kromosom baketri. DNA fage yang dikemas
ketika membentuk partikel fage baru akan membawa sebagian DNA
bakteri yang menjadi inangnya. Selanjutnya jika fage tersebut
menginfeksi bakteri yang lain, maka fage akan memasukkan DNAnya
yang sebagian mengandung DNA sel inang sebelumnya. Jadi,
secara alami fage memindahkan DNA dari satu sle bakteri ke bakteri
yang lain.
Gambar 6. Proses transduksi pada sel bakteri
Perangkat teknologi DNA rekombinan
Adapun perangkat yang digunakan dalam teknik DNA
rekombinan diantaranya enzim restriksi untuk memotong DNA,
enzim ligase untuk menyambung DNA dan vektor untuk
menyambung dan mengklonkan gen di dalam sel hidup, transposon
sebagai alat untuk melakukan mutagenesis dan untuk menyisipkan
penanda, pustaka genom untuk menyimpan gen atau fragmen DNA
yang telah diklonkan, enzim transkripsi balik untuk membuat DNA
berdasarkan RNA, pelacak DNA atau RNA untuk mendeteksi gen
atau fragmen DNA yang diinginkan atau untuk mendeteksi klon yang
benar. Vektor yang sering digunakan diantarnya plasmid, kosmid dan
bakteriofag.
Gambar 7. Plasmid bakteri sebagai vektor
Enzim restriksi digunakan untuk memotong DNA. Enzim
restriksi mengenal dan memotong DNA pada sekuens spesifik yang
panjangnya empat sampai enam pasang basa. Enzim tersebut dikenal
dengan nama enzim endonuklease restriksi. Berikut ini adalah
macam-macam enzim endonuklease restriksi.
Tabel 1. Enzim restriksi yang sering digunakan pada proses rekombinasi DNA
Enzyme Source
Recognition
Sequence
Cut
EcoRI Escherichia coli
5'GAATTC
3'CTTAAG
5'---G AATTC---3'
3'---CTTAA G---5'
EcoRII Escherichia coli
5'CCWGG
3'GGWCC
5'--- CCWGG---3'
3'---GGWCC ---5'
BamHI
Bacillus
amyloliquefaciens
5'GGATCC
3'CCTAGG
5'---G GATCC---
3'
3'---CCTAG G---
5'
HindIII
Haemophilus
influenzae
5'AAGCTT
3'TTCGAA
5'---A AGCTT---3'
3'---TTCGA A---5'
TaqI Thermus aquaticus
5'TCGA
3'AGCT
5'---T CGA---3'
3'---AGC T---5'
NotI Nocardia otitidis
5'GCGGCCGC
3'CGCCGGCG
5'---GC GGCCGC-
--3'
3'---CGCCGG CG-
--5'
HinfI
Haemophilus
influenzae
5'GANTCA
3'CTNAGT
5'---G ANTC---3'
3'---CTNA G---5'
Sau3A Staphylococcus aureus
5'GATC
3'CTAG
5'--- GATC---3'
3'---CTAG ---5'
PovII* Proteus vulgaris
5'CAGCTG
3'GTCGAC
5'---CAG CTG---3'
3'---GTC GAC---5'
SmaI* Serratia marcescens
5'CCCGGG
3'GGGCCC
5'---CCC GGG---3'
3'---GGG CCC---5'
HaeIII*
Haemophilus
aegyptius
5'GGCC
3'CCGG
5'---GG CC---3'
3'---CC GG---5'
HgaI[33]
Haemophilus
gallinarum
5'GACGC
3'CTGCG
5'---NN NN---3'
3'---NN NN---5'
AluI* Arthrobacter luteus
5'AGCT
3'TCGA
5'---AG CT---3'
3'---TC GA---5'
EcoRV* Escherichia coli
5'GATATC
3'CTATAG
5'---GAT ATC---3'
3'---CTA TAG---5'
EcoP15I Escherichia coli
5'CAGCAGN25NN
3'GTCGTCN25NN
5'---
CAGCAGN25NN --
-3'
3'---GTCGTCN25
NN---5'
KpnI[34] Klebsiella pneumoniae
5'GGTACC
3'CCATGG
5'---GGTAC C---3'
3'---C CATGG---5'
PstI[34] Providencia stuartii
5'CTGCAG
3'GACGTC
5'---CTGCA G---3'
3'---G ACGTC---5'
SacI[34]
Streptomyces
achromogenes
5'GAGCTC
3'CTCGAG
5'---GAGCT C---3'
3'---C TCGAG---5'
SalI[34] Streptomyces albus
5'GTCGAC
3'CAGCTG
5'---G TCGAC---3'
3'---CAGCT G---5'
ScaI[34]
Streptomyces
caespitosus
5'AGTACT
3'TCATGA
5'---AGT ACT---3'
3'---TCA TGA---5'
SpeI Sphaerotilus natans
5'ACTAGT
3'TGATCA
5'---A CTAGT---3'
3'---TGATC A---5'
SphI[34]
Streptomyces
phaeochromogenes
5'GCATGC
3'CGTACG
5'---G CATGC---3'
3'---CGTAC G---5'
StuI[35][36]
Streptomyces
tubercidicus
5'AGGCCT
3'TCCGGA
5'---AGG CCT---3'
3'---TCC GGA---5'
XbaI[34] Xanthomonas badrii
5'TCTAGA
3'AGATCT
5'---T CTAGA---3'
3'---AGATC T---5'
Ada beberapa bagian terpenting yang selalu digunakan dalam
rekayasa genetika.Yang pertama adalah enzim seluler dan yang kedua
adalah vektor. Hal tersebut akan dibahas sebagai berikut:
Enzim seluler
Enzim yang dipakai oleh orang-orang bioteknologi dalam
memanipulasi DNA diantaranya adalah enzim Endonuklease, yaitu
enzim yang mengenali batas-batas sekuen nukleotida spesifik dan
berfungsi dalam proses restriction atau pemotongan bahan-bahan
genetik. Penggunaan enzim ini yang paling umum antara lain pada
sekuen palindromik. Enzim ini dibentuk dari bakteri yang dibuat
sedemikian rupa sehingga dapat menahan penyusupan DNA, seperti
genom bacteriophage.Ada juga DNA polimerisasi, yaitu enzim yang
biasa dipakai untuk meng-copy DNA. Enzim ini mengsintesis DNA
dari sel induknya dan membentuk DNA yang sama persis ke sel
induk barunya. Enzim ini juga bisa didapatkan dari berbagai jenis
organisme, yang tidak mengherankan, karena semua organisme pasti
harus meng-copy DNA mereka. Selain DNA polimerisasi, ada juga
enzim RNA polimerisasi yang berfungsi untuk ’membaca’ sekuen
DNA dan mengsintesis molekul RNA komplementer. Seperti halnya
DNA polimerisasi, RNA polimerisasi juga banyak ditemukan di
banyak organisme karena semua organisme harus ’merekam’
gennya.Selanjutnya yang akan dibahas adalah enzim DNA ligase.
Enzim DNA ligase merupakan suatu enzim yang berfungsi untuk
menyambungkan suatu bahan genetik dengan bahan genetik yang
lain. Contohnya saja, enzim DNA ligase ini dapat bergabung dengan
DNA (atau RNA) dan membentuk ikatan phosphodiester baru antara
DNA (atau RNA) yang satu dengan lainnya.Kemudian, ada pula
enzim reverse transcriptases yang berfungsi membentuk blue-print
dari molekul RNA membentuk cDNA (DNA komplementer). Enzim
ini dibuat dari virus RNA yang mengubah genom RNA virus menjadi
DNA ketika virus menginfeksi inangnya. Enzim ini biasa dipakai
ketika bertemu dengan gen eukariotik yang biasanya terpisah-pisah
menjadi potongan kecil dan dipisahkan oleh introns dalam
kromosom.
Vektor natural
Sebagai salah satu cara untuk memanipulasi DNA di luar sel,
para ilmuwan dalam bioteknologi harus bisa membuat suatu tempat
yang keadaannya stabil dan cocok dengan tempat DNA yang
dimanipulasi. Sekali lagi, alam telah memberikan solusi dari masalah
ini. Vektor disini bisa diartikan sebagai alat yang membawa DNA ke
dalam sel induk barunya. Agar suatu metode dalam rekayasa genetika
dianggap berhasil, di dalam vektor, DNA hasil rekombinan
seharusnya benar-benar hanya dibawa setelah sebelumnya DNA
rekombinan digabungkan dengan DNA vektor melalui enzim ligase.
Namun di dalam vektor, DNA rekombinan tidak termutasi lagi
membentuk DNA dengan sifat baru. Contoh dari vektor natural dari
alam adalah plasmid dan virus atau bacteriophage.
Manfaat teknologi rekombinan DNA
Aplikasi teknik DNA rekombinan dalam bioteknologi
diantaranya adalah produksi vaksin, insulin, antibodi dan sebagainya.
Misalkan saja insulin yang digunakan untuk mengatasi diabetes
diproduksi dengan menggunakan teknik DNA rekombinan. Gen
insulin yang berasal dari sapi kemudian ditentukan urutan DNA-nya
setelah itu direkombinasikan di dalam suatu vektor misal plasmid
kemudian dimasukan dalam sel bakteri. Selanjutnya bakteri ini
mengalami transformasi dan bisa menghasilkan insulin. Ini adalah
salah satu contoh aplikasi teknik DNA rekombinan dalam
bioteknologi. Beberapa produk DNA rekombinan yang digunakan
dalam terapi manusia, diantaranya :
Insulin untuk penderita diabetes
Faktor VIII untuk laki-laki menderita hemofilia a
Faktor IX untuk hemofilia b
Hormon pertumbuhan manusia (hgh)
Erythropoietin (epo) untuk mengobati anemia
Beberapa jenis interferon
Beberapa interleukin
Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (gm-csf)
untuk menstimulasi sumsum tulang setelah transplantasi sumsum
tulang
Granulocyte koloni-stimulating factor (g-csf) untuk merangsang
neutrofil produksi, misalnya, setelah kemoterapi dan untuk
memobilisasi sel induk hematopoietik dari sumsum tulang ke
dalam darah.
Aktivator plasminogen jaringan (tpa) untuk melarutkan gumpalan
darah
Adenosin deaminase (ada) untuk mengobati beberapa bentuk
severe combined immunodeficiency (scid)
Hormon paratiroid
Beberapa antibodi monoklonal
Antigen permukaan hepatitis B untuk vaksinasi terhadap virus
hepatitis B
C1 inhibitor (c1inh) digunakan untuk mengobati edema
angioneurotic turun-temurun.