Lihat diskusi, statistik, dan profil penulis untuk publikasi ini di: https://www.researchgate.net/publication/221989323
Distribusi diferensial dari 4-hydroxynonenal adducts untuk residu belerang dan nitrogen dalam
protein darah seperti yang diungkapkan menggunakan Raney nikel dan kromatografi gas–
spektrometri massa
CITATIONS
Dibaca
11
122
7penulis,termasuk:
Kontribusi Asli
artikel info
abstrak
Quantifikasi dari 4-hidroksi-2-nonenal (HNE) terikat dengan protein
Artikel sejarah: beredar mungkin terbukti bermanfaat dalam eva luating peran bioaktif
Diterima 28 Oktober 2008 lipoperoxidation ini oleh-produk dalam patogenesis berbagai penyakit. Baru-
Revisi 13 Juli 2009
baru ini, kami mengembangkan kromatografi gas kuantitatif-spektrometri
Diterima 6 Agustus 2009 Tersedia online xxxx
massa (GCMS) pengujian total HNE protein terikat (HNE-P) dalam darah
setelah reduksi dengan NaB 2H4 dan pembelahan dengan nikel Raney.
Sedangkan diasumsikan bahwa nikel Raney memotong hanya Michael
Kata kunci: stres aldehida Lipoperoxidation oksidatif Plasma
adducts dari HNE untuk sistein melalui ikatan thioether (HNE-SP), hasil
protein modifikasi, Hiperkolesterolemia radikal bebas
dari penelitian ini menunjukkan bahwa metode GCMS kami juga mendeteksi
dengan picomoles presisi dari adduct HNE melalui residu nitrogen (HNE-
NP). ).Secarakhusus, bukti yang diperoleh dengan menggunakan berbagai
model studi, termasuk asam poliaminokarboksilat terdiri dari sistein, lisin,
dan histidin dan molekul biologis yang relevan, albumin. Selanjutnya, kami
menunjukkan bahwa pengobatan dinitrofenilhidrazin sebelum perlakuan
nikel Raney dapat digunakan untuk membedakan dan mengukur berbagai
spesies molus HNE-P dalam plasma dan sampel darah dari tikus normal,
yang berkisar antara 0,15 dan 3 pmol / mg protein atau 10 hingga 600 nM.
Namun, sementara HNE-SP mendominasi dalam darah utuh, kami
mendeteksi HNE-NP hanya dalam plasma. Kami
jugadiidentifikasilainsignifikansinyal MS, yang kami atribut untuk protein-
terikat 1,4-dihydroxynonane (DHN-P) mungkin terbentuk dari pengurangan
enzimatik HNE-P. Distribusi profile dari semua spesies ini dalam plasma
berbeda dari yang diamati ketika konsentrasi fisiologis yang relevan dari
albumin dan HNE diinkubasi in vitro. Lebih lanjut, yang menarik, kelinci
hiperkolesterolemia menunjukkan kadar plasma HNE-NP yang lebih tinggi,
tetapi bukan DHN-P. Selain mendokumentasikan keberadaan berbagai jenis
HNE-P dalam sirkulasi protein, hasil kami menekankan pentingnya
mekanisme enzimatik di situ sebagai faktor yang menentukan distribusi
mereka di berbagai kompartemen darah dalam berbagai kondisi.
©
2009
Elsevi
er Inc.
Semu
a hak
dilind
ungi
undan
g-
undan
g.
Semakin banyak bukti mendukung keterlibatan senyawa karbonil yang paling beracun adalah 4-hidroksi-2-non-ginjal (HNE) 3. HNE
reaktif, terutama α,β-aldehidajenuh yang dihasilkan secara konstan mewakili N 95% dari total aldehida tak jenuh yang diproduksi selamain
selama peroksidasi lipid dari asam lemak tak jenuh ganda, dalam onset vitro
dan perkembangan penyakit kardiovaskular [1]. Salah satu aldehida
ARTICLE IN PRESS
peroksidasi lipid mikrosomal dan dihasilkan dalam 100 kali lipat
Singkatan: DHN, 1,4-dihidroksinonana; DNPH, 2,4-dinitrofenilhidrazin; GCMS,
lebih dari malondialdehid selama oksidasi asam arakidonat [2,3].
kromatografi gas-spektrometri massa; HNE, 4-hydroxy-2-nonenal; HNE-P, HNE yang terikat
protein; DHN-P, DHN terikat protein; PAA, asam poliamino; TBDMS, t- butyldimethylsilyl.
Penambahan Michael karbon 3 dari HNE ke kelompok sulfhidril
⁎ Sesuai penulis. Faks: +1 514 376 1355. dari sistein, ɛ-amino kelompok lisin, dan fungsi imidazol histidin
Alamat e-mail: christine.des.rosiers@umontreal.ca (CD Rosiers). telah didokumentasikan dengan baik dan urutan reaktivitas terhadap
1
Alamat sekarang: Pusat Diabetes dan Obesitas, Divisi Kardiologi Molekuler, Universitas residu asam amino protein ini ditemukan menjadi sistein NN histidin.
Louisville, 580 Jalan South Preston, Kamar 421, Louisville, KY 40202, AS.
N lisin [4]. Beberapa target protein untuk HNE mengikat
2
Alamat sekarang: Saint-Genès-Champanelle, INRA, Pusat Clermont-Ferrand -
Theix, UMR1019, Unité de Nutrition Humaine Prancis. telahdiidentifikasi,seperti mitokondria NADP-linked nase isocitrate
dehydroge-, sitokrom c oksidase, hemoproteins, dan, baru-baru ini,
asam lemak protein yang mengikat [2-8].
Protein-terikat HNE (HNE-P) dalam matriks biologi adalah
pertamadideteksi dengan menggunakan pendekatan immunochemical
dalam berbagai tions menderita penyakit yang berhubungan dengan
stres oksidatif pada hewan dan manusia (misalnya, lesi
aterosklerosis) [9].Penggunaan antibodi monoklonal yang mengenali
berbagai epitop yang diturunkan dari HNE telah memungkinkan para
peneliti untuk memperoleh data yang mendukung keterlibatan HNE
dalam beberapa kondisi patologis seperti aterosklerosis [10], penyakit
Parkinson [11], dan
0891-5849 / $ - lihat masalah depan © 2009 Elsevier Inc. Semua hak dilindungi undang-undang. doi:10.1016 /
j.freeradbiomed.2009.08.002
ARTICLE IN PRESS
2 J.-F. Lesgards et al. / Biologi Radikal Bebas & Pengobatan xxx (2009) xxx-xxx
Gambar. 1. Sekilas tentang protokol eksperimental untuk mengukur Michael adduct dari 4-hidroksi-2-nonenal (HNE) ke protein atau asam poliamino dengan kromatografi gas-spektrometri
massa (GCMS). Prosedur ini melibatkan pengurangan HNE terikat 1,4- [2H] dihydroxynonane([2H] DHN) dengan NaB 2H4 diikuti oleh pengobatan dengan Raney nikel untuk melepaskan [2H] DHN,
yang kemudian dikonversi kesebuah di-tturunan-butyldimethyl (TBDMS). Di bawah kondisi operasi GCMS kami, derivatif ini mengalami kehilangan O-TBDMS, menghasilkan pembentukan ion
pada m / z 258 (struktur A). Juga digambarkan adalah struktur turunan TBDMS spesies DHN lain yang dianalisis dalam penelitian ini bersama dengan asal setiap sinyal untuk analisis berbagai
sampel: DHN tak berlabel dari HN terikat nitrogen dan DHN sistein (struktur B); ion pada m / z 257), [2H11] DHN dari standar internal (struktur C; ion pada m / z 268), [2H3] DHN dari nitrogen
ARTICLE IN PRESS
terikat [2H3] HNE (struktur D; ion pada m / z 260), dan [2H4] DHN dari sistein-terikat [2H3] HNE dikurangi dengan NaB2H4 (struktur E; ion pada m / z 261).
ARTICLE IN PRESS
J.-F. Lesgards et al. / Biologi Radikal Bebas & Pengobatan xxx (2009) xxx-xxx 3
Pengobatan DNPH sampel darah dan plasma
poli-L-glutamat, butilhidroksitoluena, dan 2,4-dinitrofenilhidradizena
(DNPH) dibeli dari Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA), dan Aliquot darah (0,4 ml) dan plasma (0,5 ml) diobati dengan 5
albumin serum bovine berasal dari Serologicals Protein (Kankakee, IL, volume 0,15% (w / v) DNPH dalam 2 N HCl dan diinkubasi selama 1
USA). Poli-L-cysteine:Lasam -glutamic (20:80) disintesis oleh Genscript jam pada suhu kamar [28]. Campuran ini diperlakukan dengan 0,4
Corp (San Francisco, CA, USA). Pelarut organik dan asam berasal dari ml SSA, dan setelah sentrifugasi, endapan dilarutkan dengan
Fischer Ilmiahfic (Nepean, ON, Canada). Unlabeled dan 2H3-labeled 0,5 ml 8 M guanidin hidroklorida. Sampel kemudian diperlakukan
HNE berasal dari Cayman (Ann Arbor, MI, USA). Sodium dengan nikel Raney dan diderivatisasi untuk analisis GCMS.
borodeuteride (NaB2H4), 2H2O, dan trans-4-hydroxy-2-none- nal-
[5,5,6,6,7,7,8,8,9,9,9-2H11] dietil asetal dipasok oleh Laboratorium Sampel plasma dari kelinci hiperkolesterolemia
Isotop Cam-jembatan (Andover, MA, USA) dan Isotop CDN (Montreal,
QC, Kanada). Larutan stok dari standar internal 1,4- [ 2H11] dihydroxy- Kami menganalisis sampel plasma dari kontrol dan
2-nonene disiapkan seperti yang dijelaskan sebelumnya [23]. Semua hiperkolesterolemia (HC) kelinci (n = 6 dalam setiap kelompok) yang
larutan air siap dengan puri airfikasi melalui Milli-Q-system (Millipore, diperoleh dalam konteks penelitian lain [29].Secarasingkat,kelinci
Montreal, QC, Canada). jantan Selandia Baru White (12-13 minggu usia) diberi makan 0,5%
kaya kolesterol diet ditambah vitamin D 2 (50.000 IU sehari-1)dalam
PersiapanHNE-dimodifikasiPAA air minum sampaisignifikanstenosis katup aorta
(dedidefinisikansebagai ≥10% penurunan di daerah katup aorta) dan
PolyL-lysine(Mr= 150.000-300.000), poliL-histidine(Mr N 5000), kemudian kembali ke diet normal selama 2 minggu. Sampel kontrol
poli-L-arginine (Mr N 70.000), poliL-cysteine-L-glutamate (Glu / Cys diperoleh dari kelinci usia yang diberi makan secara eksklusif dengan
5/1, 30 unit), danpoli-L-arginine, poli-L-serine, poli-L-glutamate(Mr= diet normal. Sampel darah diperoleh berdasarkan ketamin / xylazine
50.000-100.000 ) (2 mg / ml) dilarutkan dalam 50 mM buffer natrium anestesi melalui arteri perut saat exsanguination
fosfat, pH 7,4, diinkubasi dengan HNE atau [9,9,9 - 2H3] HNE (2 mM) untukpengorbanan.Kadar kolesterol dipengorbananyang 11,9 ± 2,5 mM
pada 37 ° C selama 15 jam. Kemudian, campuran reaksi didialisis untuk HC dan 0,60 ± 0,08 mM untuk kontrol. Sampel plasma untuk
selama 24 jam terhadap 50 mM buffer natrium fosfat, pH 7,4 (tiga analisis berbagai spesies HNE dan DHN yang terikat dengan protein
perubahan buffer, 1/200 v / v) untuk menghapus HNE yang tidak diperlakukan dengan NaB2H4 atau DNPH dan diproses seperti yang
bereaksi. dijelaskan di atas.
Inkubasi albumin serum bovin dengan albumin serum HNE Analisis GCMS
Bovine (50 atau 600 μM) diinkubasi dengan HNE (10 μM hingga 2 Prosedur untuk analisis GCMS telah dijelaskan sebelumnya secara
mM) di 50 mM buffer natrium fosfat, pH 7,4, pada 37 ° C hingga 15 rinci [23].Secarasingkat,sebuah 1-μl aliquot disuntikkan ke dalam
jam. Campuran reaksi didialisis seperti yang dijelaskan untuk Agilent 6890 N GC yang dilengkapi dengan kolom kapiler HP-5 (50
campuran inkubasi PAA. m × 0,2 mm diameter bagian × 0.5-μketebalan fase m) digabungkan
ke 5973 detektor beroperasi di Modus ionisasi kimia positif dengan
Inkubasi glutathione (GSH) dengan HNE amonia sebagai gas reagen pada tekanan 10 - 3 Torr dan energi
elektron 153 eV. Sumber MS dan suhu quadrupole ditetapkan pada
Kelebihan 100 kali lipat GSH berkurang (3,2 mM) diinkubasi 300 dan 176 ° C, masing-masing. Suhu kolom GC ditetapkan pada
dengan [9,9,9-2H3] HNE (0,031 mM) di 50 mM sodium phosphate 170 ° C selama 1 menit, meningkat sebesar 20 ° C / menit sampai 325
buffer, pH 7,2, pada 37 ° C selama 16 jam. Dalam kondisi ini, kami ° C, dan disimpan pada suhu ini selama 8 menit. Ion-ion berikut
mengevaluasi bahwa antara 80 dan 85% dari kuantitas awal [ 2H3] HNE dimonitor dengan waktu tinggal 100 ms per ion untuk analisis
ditambahkan terikat pada GSH. derivatif TBDMS dari spesies molek DHN yang tidak berlabel atau
berlabel (lihat Gambar 1): (i) m / z = 258 untuk [2H] DHN ( dari HNE
Pengobatan sampel dengan NaB2H4 dan Raney nikel(Gbr.1) terikat dikurangi dengan NaB2H4), (ii) m / z = 268 untuk standar
internal terdeuterasi [2H11] DHN. Kami juga secara rutin memantau
didialisis solusi dariHNE-dimodifikasiPAA (2 mg / ml), albumin, ion pada m / z 257, yang sesuai dengan DHN tanpa label. Untuk
atau GSH, serta plasma darah dan sampel, entah diencerkan (1 / 1000 inkubasi dengan 2H3-labeled HNE, kami memantau ion pada m / z
untuk poli-L-cysteine-L-glutamat, 1/40 untuk PAA lain dan untuk 260 sesuai dengan [2H3] DHN dan pada m / z 261 sesuai dengan [2H4]
albumin) atau diobati langsung dengan 1 M NaB 2H4 pada 4 ° C selama 1 DHN (dari terikat [2H3] HNE dikurangi dengan NaB 2H4). Semua ion
jam untuk mengurangi kelompok karbonil bebas HNE ke deuterated ini dihasilkan dari hilangnya [M-OTBDMS] dari ion molekuler [M ·]+.
kelompok alkohol. Kondisi reduksi ini sebelumnya digunakan untuk Konsentrasi HNE-P yang dilaporkan dalam penelitian ini mewakili
sampel darah atau jaringan [23,24], karena mereka meminimalkan rata-rata duplikat atau duplikasi sampel suntikan. Area puncak GC
produksi artifactual HNE dari peroksidasi lipid selama pemrosesan yang ditentukan oleh integrasi komputer dikoreksi untuk isotop berat
sampel. Sampel diperlakukan dengan 5 volume etanol dingin (PAA) dan isotop isotop ringan dari standar internal [ 2H11] DHN.
atau dengan asam sulfosalicylic jenuh (SSA) (albumin, GSH, plasma, Konsentrasi dihitung menggunakan area yang dikoreksi dan dari
dan sampel darah) dan disentrifugasi pada 6.500 rpm selama 45 menit kuantitas standar internal yang ditambahkan ke masing-masing
pada 4 ° C. PAA, albumin, atau darah dan protein plasma pelet sampel seperti yang dijelaskan sebelumnya [23].
disuspensikan ke dalam 2 ml guanidin (pH 7,2), dibubuhi0,1-0,3nmol
Protein carbonyl assay
standar internal yang deuterated 1,4[2H11]dihidroksi-2-nonene dan
diinkubasi dengan 1.7 g katalis nikel Raney selama 5 hingga 30 jam
pada 55 ° C. Pengendalian inkubasi juga dilakukan tanpa adanya Aliquot (1 ml) dariHNE-larutanPAA diinkubasi selama 1 jam
katalis nikel Raney. Dalam beberapa percobaan, kami menguji dampak dengan 0,1% (wt / vol) DNPH dalam 2 M HCl pada suhu kamar.
penggantian air dengan 2H2O, yang digunakan untuk melarutkan PAA Setelah presipitasi dengan 10 ml etanol dingin untuk menghilangkan
atau pelet protein dan / atau nikel Raney. Setelah inkubasi, sampel HNE yang tidak bereaksi,HNE-peletPAA dilarutkan dalam 2 ml 8 M
supernatan dibawa ke pH b 2 dan diekstraksi dua kali dengan etil guanidin hidroklorida, 13 mM EDTA, dan 133 mM Tris (pH 7,4).
asetat. Ekstrak gabungan diuapkan sampai kering di bawah N 2 dan Absorbsi UV dinilai pada 365 nm. Konsentrasi dinyatakan sebagai
rasio molar [DNPH] / [AA] (mol / mol) dan dihitung menggunakan
bereaksi dengan N-methyl-N-(ters-butyldimethylsilyl)
trifluoroacetamide pada 80 ° C selama 6 jam. molar absorptiv- itykoefisiendari 21,0 mM / cm-1 [28].
ARTICLE IN PRESS
4 J.-F. Lesgards et al. / Radikal Bebas Biologi & Kedokteran xxx (2009) xxxxxx
Hasil
Percobaan dengan
PAA
Gambar yang. 3. Representasi kromatogram ion terpilih dari sampel dari inkubasi (A) Lpoly--lysine dan (B) poly-L-histidine dengan HNE. PAA yang diindikasikan (2 mg / ml sesuai dengan
13,7 mM lisin dan 12,9 mM histidin, masing-masing) dilarutkan dalam 50 mM buffer natrium fosfat, pH 7,4, dan diinkubasi dengan HNE (2 mM) pada 37 ° C selama 15 jam. Setelah dialisis
selama 24 jam untuk menghapus HNE yang tidak bereaksi, sampel diproses seperti yang dijelaskan di bawah Bahan dan metode dan diilustrasikan pada Gambar. 1. Data ditampilkan sebagai
ARTICLE IN PRESS
persentase intensitas relatif tidak dikoreksi untuk kelimpahan alam di isotop berat. Asal sinyal pada berbagai ion ditunjukkan dalam tanda kurung.
ARTICLE IN PRESS
J.-F. Lesgards et al. / Biologi Radikal Bebas & Pengobatan xxx (2009) xxx-xxx 5
Tabel 1
Konsentrasi HNE terikat pada berbagai asam poliamino yang mengandung residu sistein, histidin, lisin, dan arginin yang ditentukan dengan kromatografi gas -spektrometri massa dan dengan uji
karbonil menggunakan spektrofotometri
Uji GCMS (mol (DHN + Uji GCMS (relatif terhadap Protein karbonil (mol as Protein karbonil (relatif
[2H] DHN) / Cys) DNPH / mol sa terhadap Cys)
y
A
A)
Cysteine 5.7 × 10- 1 1 8,6 × 10-2 1
Histidine 1,6 × 10- 3 2.8 × 10-3 2.6 × 10-3 3.0 × 10-2
Lysine 1.2 × 10- 3 2.2 × 10-3 9.4 × 10-4 1.1 × 10-2
Arginine 3.8 × 10- 5 6.8 ×10-5 nd nd
Data dinyatakan sebagai rasio molar: [(DHN + [2H] DHN)] / [AA] dan [DNPH] / [AA], masing-masing. Nilai adalah cara tiga atau empat peniruan replikasi (CV b 10%) dan perwakilan dari dua
atau tiga eksperimen. Kondisi inkubasi dan analisis rinci di bawah Bahan dan metode. Cys, sistein; DHN, 1,4-dihidroksinonan; GCMS, kromatografi gas-spektrometri massa; DNPH,
difenilhidrazin; PAA, asam poliamino. nd, tidak terdeteksi.
Gambar. 4. Kromatogram ion yang dipilih dari sampel dari inkubasi (A) Lpoly--lysine dan (B) poly-L-histidine dengan [2H3] HNE. Kondisi inkubasi dan pengolahan sampel seperti yang dijelaskan
ARTICLE IN PRESS
untuk Gambar. 3 kecuali bahwa HNE digantikan oleh [2H3] HNE. Asal sinyal pada berbagai ion ditunjukkan dalam tanda kurung.
ARTICLE IN PRESS
6 J.-F. Lesgards et al. / Biologi Radikal Bebas & Pengobatan xxx (2009) xxx-xxx
Gambar. 5. Analisis GCMS sampel dari inkubasiLpoly--lysine dan HNE diobati dengan nikel
Raney dalam kondisi H2O dan 2H2O. Inkubasi dan pengolahan sampel seperti yang dijelaskan Gambar. 7. Analisis GCMS solusi albumin diinkubasi dengan HNE. Bovine serum albumin
untuk Gambar. 3 kecuali bahwa pada langkah nikel Raney, sampel dilarutkan baik dalam H 2O (30 atau 600 μM) diinkubasi dengan HNE (10 μMhingga 2 mM) di 50 mM sodium
atau dalam 2H2O. Data GCMS dikoreksi untuk kelimpahan alam dalam isotop berat dan phosphate buffer, pH 7.4, pada 37 ° C dalam berbagai kondisi dan campuran reaksi
dinyatakan sebagai% dari intensitas sinyal GCMS total pada ion m / z 257 dan 258. Nilai adalah didialisis seperti yang dijelaskan untuk inkubasi PAA campuran di bawah Bahan dan
sarana ± SD dari dua percobaan yang dilakukan di tiga sampai limameniru penentuan (CV b metode. Data GCMS dikoreksi untuk kelimpahan alam di isotop berat dan dinyatakan
10%). Perhatikan peningkatan intensitas sinyal pada m / z 258 untuk sampel yang diobati sebagai%dari total GCMS sinyal intensitas pada ion m / z 257 dan 258. Nilai adalah sarana
dengan 2H2O. ± SD dari enam kondisi yang dilakukan di penentuan rangkap tiga (600 μM albumin + 10
μM HNE) atau dua percobaan (50 μMalbumin + 2 mM HNE). Asal sinyal pada ion m / z
257 dan 258 ditunjukkan dalam tanda kurung.
Gambar. 6. Mekanisme yang diusulkan untuk de-deuterasi HNE terikat nitrogen selama pembelahan dengan nikel Raney. Meskipun nitrogen-terikat HNE dapat dikonversi ke [ 2H] DHN oleh
NaBmedium.Hal2H4, deuterium yang tergabung dapat bertukar dengan hidrogen dari katalis nikel Raney atauini dapat terjadi ketika berkurang HNE terikat pada permukaan logam melalui atom
nitrogen. Mekanisme yang diusulkan diilustrasikan dengan HNE terikat ke lisin melalui penambahan Michael, tetapi juga akan terjadi untuk histidin. Waktu tinggal yang lebih lama pada katalis
akan menjelaskankita temuantentang de-deuterasi untuk lisin atau histidin, tetapi tidak untuk sistein.
ARTICLE IN PRESS
J.-F. Lesgards dkk. / Radikal Bebas Biologi & Kedokteran xxx (2009) xxx-xxx 7
diinkubasi dengan HNE (data tidak ditampilkan) .Catat bahwa
penambahan 2H2O pada langkah NaB2H4 dengan nikel Raney yang
dilarutkan dalam air yang tidak berlabel tidak r esult dalam
pergeseran massa seperti itu.
Hence, in summary, the results obtained concur with HNE being
at the origin of the signal observed at m/z 257 for samples from
experiments conducted with PAA-containing lysine and histidine.
They also suggest that the loss of deuterium through hydrogen
exchange with the medium at the Raney nickel step may explain the
GCMS signal that is observed at 1 mass unit less (ie, at m/z 257,
corresponding to DHN; Fig. 1, structure B) than expected (ie, at m/z
258, corresponding to [2H]DHN; Fig. 1, structure A). Fig. 6 illustrates
the proposed scheme of reactions involved in the hydrogen exchange.
2 2
min) and samples (plasma and blood). This seems to be particularly
Plasma samples (400 μl) were processed as described under Materials and methods and shown
in Fig. 1 except that at the Raney nickel step, samples were dissolved either in H 2O or in 2H2O. relevant given that in our previous study [23], we found that GCMS
GCMS data are corrected for the natural abundance intensity and expressed as % of the total analyses of plasma samples, for which albumin is the predominant
GCMS signal at ions m/z 257 and 258. Values are means± SD of two experiments conducted in
protein, resulted in a predominant signal at m/z 257; there was little
three to five replicate determinations (CV b 10%). Note the increase in signal intensity at m/z
258 for samples treated with 2H2O.
if any signal at m/z 258. Results from the present study raised the
possibility that the GCMS signal at m/z 257 may arise from HNE
bound to lysine and/or histidine residues of circulating proteins.
expected if bound [2H3]HNE had been reduced with NaB 2H4; Fig. 1,
structure E) becomes marginal after correction for natural abundance Incubations of albumin with HNE
in heavy isotopes of the base peak at m/z 260, representing b 10% of Incubation of 10 μM HNE with 600 μM albumin, which is similar
the total GCMS signal detected at both ions. to conditions described by Aldini et al. [31] and equivalent to
concentrations found in plasma, resulted in a predominant GCMS
Incubation with 2H2O signal at m/z 258 corresponding to [2H]DHN (75% Fig. 1, structure A)
Finally, we tested the possibility of a loss of deuterium through irrespective of incubation time (1–15 h) and HNE concentration (10
hydrogen exchange with the medium at the Raney nickel step. This was μM–2 mM; Fig. 7). However, when the concentration of albumin in
achieved by replacing H2O with 2H2O during Raney nickel treat- ment the incubation mixture was decreased 20-fold, thus increasing the
of solutions of poly-L-cysteine-L-glutamate or poly-L-lysine, which had HNE-to-albumin ratio from 1/60 (10 μM HNE + 600 μM albumin) to
been incubated with HNE and reduced with NaB 2H4. For poly-L- 60 (2 mM HNE + 30 μM albumin), similar to conditions used by
cysteine-L-glutamate, we obtained data identical to that depicted in Fig. Szapacs et al. [32], the GCMS signal at m/z 257 was increased from 25
2 (data tidak ditampilkan). However, with poly- L-lysine, we observed a to 50%, suggesting increasing binding of HNE through nitrogen-
shift in the MS signal from m/z 257 to m/z 258 (Fig. 5) corresponding based residues, most likely histidine or lysine residues (Fig. 7).
to [2H]DHN, the percentage of which was increased from 11 ± 3 to 51 ± Together these results emphasize the importance of the albumin-to-
5% of the total MS signal (mean± SD, n = 2). Similar results were HNE ratio as a factor determining the proportion of HNE bound to
obtained with solutions of poly-L-histidine cysteine versus histidine and lysine residues to albumin molecules.
Fig. 9. Overview of the experimental strategy to quantify sulfur- and nitrogen-bound HNE via Michael adducts using diphenylhydrazine (DNPH). DNPH reacts with the free carbonyl group of
HNE bound to protein via cysteine, histidine, or lysine residues to form an imine, which is subsequently reduced to a secondary amine by NaB 2H4. After Raney nickel treatment, the C–N bond will
be cleaved, releasing unlabeled or 2H-labeled 4-hydroxynonane, which upon derivatization will form a mono-TBDMS derivative.
ARTICLE IN PRESS
8 J.-F. Lesgards et al. / Free Radical Biology & Medicine xxx (2009) xxx–xxx
3
To assess the potential contribution of GSH–HNE conjugates to the GCMS signal at
m/z 258, samples of whole blood (400 μl; in duplicates) were spiked with 0, 0.2, 0.4, or
Fig. 10. Calibration curve obtained for the GCMS assay of HNE-P at m/z 257 in increasing
0.6 nmol of GSH-bound [ 2H4]DHN (prepared by incubating GSH with [ 2H3]HNE followed
volumes of plasma in the presence of DNPH. Samples for the various volumes were processed
for analysis in triplicate. Data are reported as concentration, calculated using the internal by reduction with NaB2H4); this corresponds to 0.5–1.5 μM GSH–HNE, which implies that
0.1 to 0.5% of blood GSH would be modified by HNE. After treatment with SSA and
standard of [2H11]DHN after correction for the natural abundance in heavy isotopes. The
centrifugation, precipitates and supernatants were collected and processed in parallel as
regression line with 95% confidence interval is shown: slope= 0.12 ± 0.03, y intercept= 26 ± 11;
described under Materials and methods: (i) spiked with the deuterated internal standard
Pearson correlation coefficient r = 0.996; p b 0.004.
[2H11]DHN, (ii) treated with guanidine hydrochloride followed by Raney nickel, and (iii)
derivatized for GCMS analysis. The GCMS signal at m/z 261 (corresponding to [2H4]DHN
released from GSH–HNE conjugates treated with NaB 2H4) in precipitated fractions of
whole blood samples spiked with various quantities of GSH-bound [ 2H4]DHN represented
7.1 ± 0.3% of the total signal recovered; the remaining 93% was recovered in the
supernatant fractions under all conditions.
ARTICLE IN PRESS
J.-F. Lesgards et al. / Free Radical Biology & Medicine xxx (2009) xxx–xxx 9
HNE mixtures in the protein carbonyl assay (Table 1). Indeed, the
orders of reactivity of the various amino acids with HNE determined
by GCMS and protein carbonyl assays are similar and consistent with
literature results: cysteine NN histidine N lysine NN arginine [4]. It is
usually considered that cysteine is the most reactive amino acid
toward HNE, whereas HNE adducts of histidine are more stable than
either cysteine or lysine conjugates toward retro-Michael addition
[4,35,36]. The very low levels of HNE found for poly- L-arginine and
the absence of signal for poly-L-glutamate or poly-L-serine are also
consistent with the general reactivity of HNE toward amino acids.
Nevertheless, there were some differences in the absolute quantity of
HNE adducts evaluated by GCMS vs DNPH, particularly for cysteine
(6-fold greater) and histidine (1.6-fold lower), which may be ex-
plained by conditions used for sample processing and analyses,
specifically NaB2H4 reduction of the reactive carbonyl group of HNE
Fig. 12. Plasma levels of various protein-bound HNE and DHN species in control and
hypercholesterolemic rabbits. Plasma samples were processed in the absence or in the presence
at 4 °C for GCMS vs room temperature for the DNPH method.
of DNPH for the GCMS analysis of DHN released from protein-bound HNE via histidine/lysine Collectively, these data provide evidence that in addition to sulfur-
residues (HNE-NP) and protein-bound DHN (DHN-SP). Data shown are expressed as bound HNE, Raney nickel treatment also cleaves nitrogen-bound
concentrations, which were calculated for the GCMS signal at m/z 257, corrected for the HNE at 55 °C. To the best of our knowledge, cleavage of the latter
natural abundance in heavy isotopes, using the internal standard [ 2H11]
adducts with Raney nickel has not been previously documented. This
DHN. Shown are the means± SE of six plasma samples from control and hypercholes-
terolemic rabbits. ⁎p b 0.05 and ⁎⁎p b 0.05 for comparisons as indicated; Δ, difference in may be due to variations in the catalytic strength of the Raney nickel
concentration at m/z 257 ± DNPH; #p b 0.05, HNE-NP, hypercholesterolemic vs control. pre- parations or duration of treatment. Indeed, further supporting
this notion is the fact that the GCMS signal observed required
Impact of hypercholesterolemia on the plasma level of various HNE-P minimally 15 h of treatment with Raney nickel to reach a maximal
molecular species value, as opposed to 5 h for HNE adducts with cysteine. This is
To further substantiate the biological significance of the various consistent with the binding energies of the carbon–nitrogen and
HNE-P molecular species, specifically HNE bound to proteins via carbon–sulfur bonds, which are 305 and 272 kJ/mol, respectively.
histidine or lysine residues, we evaluated the impact of hypercholes- We reason that our method detects only Michael adducts and not
terolemia, a condition associated with enhanced oxidative stress [1,34]. Schiff bases. Specifically, HNE released from Schiff bases using Raney
As shown in Fig. 12, compared to controls, hypercholesterolemic nickel is expected to form a mono-TBDMS derivative of 4-
rabbits showed a significant increase in the GCMS signal detected at hydroxynonane, which would not be detected under the GCMS
m/z 257 for samples that had not been treated with DNPH, but not for conditions (ie, retention time and ions monitored) selected for the di-
samples treated with DNPH, indicating that the levels of DHN-P were TBDMS derivative of DHN that is formed with Michael HNE–
similar for both groups. This increase in signal intensity between protein adducts (Fig. 1) because it would elute at an earlier time [30].
samples with or without DNPH treatment is attributed to HNE-P via Additionally, when the temperature of the MS source is set at 150 °C,
nitrogen residues, whose levels are evaluated to be 1.40 ± 0.54 it is possible to analyze and quantify the TBDMS derivatives of DHN
pmol/mg proteins in hy- percholesterolemic rabbits, whereas they are and [2H]DHN at m/z 389 and 390, respectively, which correspond to
undetectable in controls. the molecular ion (no loss of the [OTBDMS] group as shown in Fig.
1), rather than at m/z 257 and 258. In previous studies [23,24], we
Discussion did not find any differences in the GCMS signals at these two ion sets,
further supporting the notion that we are detecting HNE released
Nature of HNE–protein adducts detected by GCMS assay after from Michael adducts. In fact, it is well established that Schiff bases
Raney nickel treatment are generated in lower amounts than Michael adducts with HNE,
which is in contrast to 4-oxo-2-nonenal [37]. Furthermore, other
The ability of Raney nickel to cleave thioether bonds is well known authors were unable to detect any compound consistent with the
and has been applied to the measurement of HNE bound to glutathione predicted structure of the reduced Schiff-base adduct of HNE to
and protein thiols [26]. Our results obtained from incubations of poly- lysine as detected by GCMS when HNE was incubated with Nα-
L- cysteine-L-glutamate with HNE have confirmed this notion as (formyl)lysine after reduction and acid hydrolysis [22].
evidenced by a predominant GCMS signal at m/z 258 (Fig. 2), which Based on the results of this study and data from the literature
corresponds to [2H]DHN (HNE reduced with NaB2H4) released after [31,32,38], we also reasoned that the protein amino acid residues that
treatment of incubation solutions with Raney nickel. In contrast, to the bind HNE through a carbon–nitrogen linkage are likely to be
best of our knowledge, the possibility of carbon–nitrogen cleavage with histidine and/or lysine. Most probably, our method detects all
Raney nickel has been reported only by Keefer and Lunn [27], although histidine-bound HNE, because these are exclusively Michael-type
this was not specifically examined for HNE-P. In the present study, we adducts. However, lysine residues can react with HNE to form both
have tested this possibility using HNE incubated with poly- L-lysine and Michael adducts (eg, albumin lysine residues 199 and 525) and Schiff
poly- L-histidine. The GCMS analysis of samples from incubations of bases (albumin lysine residues 195, 199, and 525) [38], which are not
poly- L-lysine (Fig. 3A) or poly-L-histidine (Fig. 3B) with HNE exhibited detected by our GCMS assay.
a predominant GCMS signal at m/z 257 corresponding to unlabeled
DHN (Fig. 1, structure B) rather than the expected signal at m/z 258 Differential reactivity of sulfur- and nitrogen-bound HNE to
corresponding to [2H]DHN (Fig. 1, structure A). Furthermore the treatment with NaB2H4 and Raney nickel
incubations with poly-L-lysine or poly-L-histidine and [2H3]HNE led to a
GCMS signal that was increased by 3 mass units (Figs. 4A and B). From Replacing H2O with 2H2O during Raney nickel treatment of poly-
these results, we concluded that the ions at m/z 257 in Figs. 3A and B, L-lysineor poly-L-histidine, which had been incubated with HNE and
but at m/z 260 in Figs. 4A and B had to come from unlabeled or 2H3- reduced with NaB2H4, induced a shift in the MS signal from m/z 257
labeled HNE, respectively. to m/z 258, corresponding to [2H]DHN (Fig. 5). These data can be
Additional support for the notion that our GCMS method detects related to similar observations made with sugars under treatment
nitrogen-bound HNE is provided by our finding that our GCMS data with Raney
concur with those obtained from the analysis of incubations of PAA/
ARTICLE IN PRESS
10 J.-F. Lesgards et al. / Free Radical Biology & Medicine xxx (2009) xxx–xxx