Anda di halaman 1dari 18

ARTICLE IN PRESS

Lihat diskusi, statistik, dan profil penulis untuk publikasi ini di: https://www.researchgate.net/publication/221989323

Distribusi diferensial dari 4-hydroxynonenal adducts untuk residu belerang dan nitrogen dalam
protein darah seperti yang diungkapkan menggunakan Raney nikel dan kromatografi gas–
spektrometri massa

Pasal Biologi Radikal Bebas dan Obat-obatan · November 2009


DOI: 10,1016 / j.freeradbiomed.2009.08.002

CITATIONS
Dibaca
11
122

7penulis,termasuk:

Jean-François Lesgards Aix-Marseille Université


Blandine Comte
10 PUBLIKASI 487 CITATIONS
French National Institute for Agricultural Research
91 PUBLIKASI 1916 CITATIONS

SEE PROFILE SEE PROFILE

David Busseuil Montreal Heart Institute


Eric Rhéaume
39 PUBLIKASI 481 CITATIONS
Montreal Heart Institute
120 PUBLIKASI 3.115 CITASI

SEE PROFILE SEE PROFILE

Beberapa penulis publikasi ini juga mengerjakan proyek terkait ini:

Mekanisme yang terkait dengan fungsi dalcetrapib Lihat proyek

SemBioSys Technology Lihat proyek


ARTICLE IN PRESS
Semua konten yang mengikuti halaman ini diupload oleh David Busseuil pada 19 Oktober 2017.

Pengguna telah meminta peningkatan file yang diunduh.


ARTICLE IN PRESS
FRB-09903; Jumlah halaman: 11; 4C:
Biologi Radikal Bebas &
Pengobatan xxx (2009)
xxx-xxx

Contents lists available at ScienceDirect

Free Radical Biology & Medicine


journal homepage: www.el sevier. com/l oca te/ freeradbiome d

Kontribusi Asli

Distribusi diferensial dari 4-hydroxynonenal adducts untuk sulfur dan residu


nitrogen dalam protein darah seperti yang diungkapkan menggunakan Raney nikel
dan kromatografi gas-Spektrometri massa
Jean-François Lesgards a,b,1, Isabelle Robillard Frayne a,b, Blandine Comte a,2,David Busseuil b,c,
Éric Rhéaume b,c,Jean-Claude Tardif b,c,Christine Des Rosiers a,b,⁎
Departemen
Gizi, Université de Montréal, Montreal, QC H3C 3J7, Kanada
b
Research Center , Montreal Heart Institute, Montreal, QC H1T 1C8, Kanada
c
Departemen Kedokteran, Université de Montréal, Montreal, QC H3C 3J7, Kanada

artikel info
abstrak
Quantifikasi dari 4-hidroksi-2-nonenal (HNE) terikat dengan protein
Artikel sejarah: beredar mungkin terbukti bermanfaat dalam eva luating peran bioaktif
Diterima 28 Oktober 2008 lipoperoxidation ini oleh-produk dalam patogenesis berbagai penyakit. Baru-
Revisi 13 Juli 2009
baru ini, kami mengembangkan kromatografi gas kuantitatif-spektrometri
Diterima 6 Agustus 2009 Tersedia online xxxx
massa (GCMS) pengujian total HNE protein terikat (HNE-P) dalam darah
setelah reduksi dengan NaB 2H4 dan pembelahan dengan nikel Raney.
Sedangkan diasumsikan bahwa nikel Raney memotong hanya Michael
Kata kunci: stres aldehida Lipoperoxidation oksidatif Plasma
adducts dari HNE untuk sistein melalui ikatan thioether (HNE-SP), hasil
protein modifikasi, Hiperkolesterolemia radikal bebas
dari penelitian ini menunjukkan bahwa metode GCMS kami juga mendeteksi
dengan picomoles presisi dari adduct HNE melalui residu nitrogen (HNE-
NP). ).Secarakhusus, bukti yang diperoleh dengan menggunakan berbagai
model studi, termasuk asam poliaminokarboksilat terdiri dari sistein, lisin,
dan histidin dan molekul biologis yang relevan, albumin. Selanjutnya, kami
menunjukkan bahwa pengobatan dinitrofenilhidrazin sebelum perlakuan
nikel Raney dapat digunakan untuk membedakan dan mengukur berbagai
spesies molus HNE-P dalam plasma dan sampel darah dari tikus normal,
yang berkisar antara 0,15 dan 3 pmol / mg protein atau 10 hingga 600 nM.
Namun, sementara HNE-SP mendominasi dalam darah utuh, kami
mendeteksi HNE-NP hanya dalam plasma. Kami
jugadiidentifikasilainsignifikansinyal MS, yang kami atribut untuk protein-
terikat 1,4-dihydroxynonane (DHN-P) mungkin terbentuk dari pengurangan
enzimatik HNE-P. Distribusi profile dari semua spesies ini dalam plasma
berbeda dari yang diamati ketika konsentrasi fisiologis yang relevan dari
albumin dan HNE diinkubasi in vitro. Lebih lanjut, yang menarik, kelinci
hiperkolesterolemia menunjukkan kadar plasma HNE-NP yang lebih tinggi,
tetapi bukan DHN-P. Selain mendokumentasikan keberadaan berbagai jenis
HNE-P dalam sirkulasi protein, hasil kami menekankan pentingnya
mekanisme enzimatik di situ sebagai faktor yang menentukan distribusi
mereka di berbagai kompartemen darah dalam berbagai kondisi.
©
2009
Elsevi
er Inc.
Semu
a hak
dilind
ungi
undan
g-
undan
g.

Semakin banyak bukti mendukung keterlibatan senyawa karbonil yang paling beracun adalah 4-hidroksi-2-non-ginjal (HNE) 3. HNE
reaktif, terutama α,β-aldehidajenuh yang dihasilkan secara konstan mewakili N 95% dari total aldehida tak jenuh yang diproduksi selamain
selama peroksidasi lipid dari asam lemak tak jenuh ganda, dalam onset vitro
dan perkembangan penyakit kardiovaskular [1]. Salah satu aldehida
ARTICLE IN PRESS
peroksidasi lipid mikrosomal dan dihasilkan dalam 100 kali lipat
Singkatan: DHN, 1,4-dihidroksinonana; DNPH, 2,4-dinitrofenilhidrazin; GCMS,
lebih dari malondialdehid selama oksidasi asam arakidonat [2,3].
kromatografi gas-spektrometri massa; HNE, 4-hydroxy-2-nonenal; HNE-P, HNE yang terikat
protein; DHN-P, DHN terikat protein; PAA, asam poliamino; TBDMS, t- butyldimethylsilyl.
Penambahan Michael karbon 3 dari HNE ke kelompok sulfhidril
⁎ Sesuai penulis. Faks: +1 514 376 1355. dari sistein, ɛ-amino kelompok lisin, dan fungsi imidazol histidin
Alamat e-mail: christine.des.rosiers@umontreal.ca (CD Rosiers). telah didokumentasikan dengan baik dan urutan reaktivitas terhadap
1
Alamat sekarang: Pusat Diabetes dan Obesitas, Divisi Kardiologi Molekuler, Universitas residu asam amino protein ini ditemukan menjadi sistein NN histidin.
Louisville, 580 Jalan South Preston, Kamar 421, Louisville, KY 40202, AS.
N lisin [4]. Beberapa target protein untuk HNE mengikat
2
Alamat sekarang: Saint-Genès-Champanelle, INRA, Pusat Clermont-Ferrand -
Theix, UMR1019, Unité de Nutrition Humaine Prancis. telahdiidentifikasi,seperti mitokondria NADP-linked nase isocitrate
dehydroge-, sitokrom c oksidase, hemoproteins, dan, baru-baru ini,
asam lemak protein yang mengikat [2-8].
Protein-terikat HNE (HNE-P) dalam matriks biologi adalah
pertamadideteksi dengan menggunakan pendekatan immunochemical
dalam berbagai tions menderita penyakit yang berhubungan dengan
stres oksidatif pada hewan dan manusia (misalnya, lesi
aterosklerosis) [9].Penggunaan antibodi monoklonal yang mengenali
berbagai epitop yang diturunkan dari HNE telah memungkinkan para
peneliti untuk memperoleh data yang mendukung keterlibatan HNE
dalam beberapa kondisi patologis seperti aterosklerosis [10], penyakit
Parkinson [11], dan

0891-5849 / $ - lihat masalah depan © 2009 Elsevier Inc. Semua hak dilindungi undang-undang. doi:10.1016 /
j.freeradbiomed.2009.08.002
ARTICLE IN PRESS
2 J.-F. Lesgards et al. / Biologi Radikal Bebas & Pengobatan xxx (2009) xxx-xxx

diabetes [12]. Meskipun adducts HNE telah terdeteksi dalam sirkulasi


oleh GCMS.Kuantifikasidicapai dengan menggunakan standar
protein [13,14], teknik immunochemical tidak mudah meminjamkan
deuterated internal yang 1,4-[2H11]dihidroksi-2-nonene, yang
diri ke penilaian kuantitatif dari adducts ini dalam plasma dan darah
dikurangi menjadi[2H11]DHN oleh Raney nikel. Pengobatan dengan
[15]. Baru-baru ini, analisis HNE-P telah ditingkatkan oleh ionisasi laser
nikel Raney, yang melibatkan reaksi hidrogenasi katalitik yang
dibantu matriks dan spektrometri massa ionisasi elektrospray [5,16].
dikenal sebagai "desulfurisasi," sebelumnya ditunjukkan untuk
Beberapa aplikasi ini telah membuktikan keakuratan dan
membelah HNE-P hanya melalui hubungan thioether [25,26]. Ada
sensitivitasmereka, [17,18]tetapi untuk yang terbaik dari langkan tahu-
satu laporan yang membahas kemungkinan bahwa nikel Raney juga
kami, mereka belum digunakan untukkuantifikasidan analisis sebagian
dapat membelahkarbon-hubungannitrogen [27], tetapi
besar HNE-P dibiologis. fluidaNamun, ini lapanganberkembang pesat
sepengetahuan kami, kemungkinan ini belum diperiksa untuk HNE-
dan pendekatan baru sedang dikembangkan untuk menghindari
P.
keterbatasan saat ini (untuk ulasan terakhir melihat [1,19]).
Oleh karena itu, tujuan dari penelitian ini adalah pertamauntuk
Sementara itu, beberapa kromatografi gas-spektrometri massa
menentukan apakah metode GCMS baru-baru ini dikembangkan
(GCMS) metode yang dikembangkan untuk penentuan HNE gratis
kami mendeteksi Michael adduct dari HNE dengan lisin dan histidin
sebagai pentafluorobenzyl derivatif oxime dalam plasma darah atau
residu. Menggunakan sebagai model penelitian kami asam
low-density lipoprotein [20,21].Requena dkk. adalah yangpertama
poliamino (PAA) yang terdiri dari lisin atau histidin, atau sistein,
untuk menerapkan GCMS untuk penentuan HNE terikat residu lisin
kami telah menemukan bahwa pengujian GCMS kami dapat
dari protein setelah pengurangan dengan NaBH 4 dan peptida hidrolisis
mendeteksi HNE terikat pada residu lisin dan histidin dan bahwa
dalam kondisi asam [22].Baru-baru ini, kami mengembangkan dan
aduk ini bereaksi terhadap perlakuan nikel Raney secara berbeda
memvalidasi metode GCMS kuantitatif yang memungkinkan deteksi
dibandingkan dengan HNE-sistein adducts. Jadi, kita melakukan
pada tingkat pikomolar HNE-P dalam darah, plasma, dan jaringan
eksperimen tambahan untuk menggali potensisignifikansidarikami
biologis lainnya [23,24]. Prinsip metode ini diilustrasikan pada Gambar.
perintisanmenggunakan molekul biologis yang relevan (albumin)
1 (kiri).Secarasingkat,melibatkan pengurangan gugus karbonil reaktif
dan sampel (darah dan plasma) dari hewan normal dan
bebas HNE untuk alkohol deuterated tidak aktif menggunakan
hiperkolesterolemia.
NaB2H4.Kemudian, sampel diperlakukan dengan nikel Raney untuk
membelah hubungan thioether, sehingga melepaskan 1,4- [2H2]
Bahan dan Bahan-Bahan
dihydroxynonane ([2H] DHN), yang kemudian diubah menjadi t-
butyldimethylsilyl (TBDMS) eter dan dianalisis
Kimia

Raney nikel diperoleh dari Laboratoire Mat (Montreal, QC,


Kanada). Poli-L-lysine, poli-L-histidine, poli-L-arginine, poli-L-
serine,

Gambar. 1. Sekilas tentang protokol eksperimental untuk mengukur Michael adduct dari 4-hidroksi-2-nonenal (HNE) ke protein atau asam poliamino dengan kromatografi gas-spektrometri
massa (GCMS). Prosedur ini melibatkan pengurangan HNE terikat 1,4- [2H] dihydroxynonane([2H] DHN) dengan NaB 2H4 diikuti oleh pengobatan dengan Raney nikel untuk melepaskan [2H] DHN,
yang kemudian dikonversi kesebuah di-tturunan-butyldimethyl (TBDMS). Di bawah kondisi operasi GCMS kami, derivatif ini mengalami kehilangan O-TBDMS, menghasilkan pembentukan ion
pada m / z 258 (struktur A). Juga digambarkan adalah struktur turunan TBDMS spesies DHN lain yang dianalisis dalam penelitian ini bersama dengan asal setiap sinyal untuk analisis berbagai
sampel: DHN tak berlabel dari HN terikat nitrogen dan DHN sistein (struktur B); ion pada m / z 257), [2H11] DHN dari standar internal (struktur C; ion pada m / z 268), [2H3] DHN dari nitrogen
ARTICLE IN PRESS
terikat [2H3] HNE (struktur D; ion pada m / z 260), dan [2H4] DHN dari sistein-terikat [2H3] HNE dikurangi dengan NaB2H4 (struktur E; ion pada m / z 261).
ARTICLE IN PRESS
J.-F. Lesgards et al. / Biologi Radikal Bebas & Pengobatan xxx (2009) xxx-xxx 3
Pengobatan DNPH sampel darah dan plasma
poli-L-glutamat, butilhidroksitoluena, dan 2,4-dinitrofenilhidradizena
(DNPH) dibeli dari Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA), dan Aliquot darah (0,4 ml) dan plasma (0,5 ml) diobati dengan 5
albumin serum bovine berasal dari Serologicals Protein (Kankakee, IL, volume 0,15% (w / v) DNPH dalam 2 N HCl dan diinkubasi selama 1
USA). Poli-L-cysteine:Lasam -glutamic (20:80) disintesis oleh Genscript jam pada suhu kamar [28]. Campuran ini diperlakukan dengan 0,4
Corp (San Francisco, CA, USA). Pelarut organik dan asam berasal dari ml SSA, dan setelah sentrifugasi, endapan dilarutkan dengan
Fischer Ilmiahfic (Nepean, ON, Canada). Unlabeled dan 2H3-labeled 0,5 ml 8 M guanidin hidroklorida. Sampel kemudian diperlakukan
HNE berasal dari Cayman (Ann Arbor, MI, USA). Sodium dengan nikel Raney dan diderivatisasi untuk analisis GCMS.
borodeuteride (NaB2H4), 2H2O, dan trans-4-hydroxy-2-none- nal-
[5,5,6,6,7,7,8,8,9,9,9-2H11] dietil asetal dipasok oleh Laboratorium Sampel plasma dari kelinci hiperkolesterolemia
Isotop Cam-jembatan (Andover, MA, USA) dan Isotop CDN (Montreal,
QC, Kanada). Larutan stok dari standar internal 1,4- [ 2H11] dihydroxy- Kami menganalisis sampel plasma dari kontrol dan
2-nonene disiapkan seperti yang dijelaskan sebelumnya [23]. Semua hiperkolesterolemia (HC) kelinci (n = 6 dalam setiap kelompok) yang
larutan air siap dengan puri airfikasi melalui Milli-Q-system (Millipore, diperoleh dalam konteks penelitian lain [29].Secarasingkat,kelinci
Montreal, QC, Canada). jantan Selandia Baru White (12-13 minggu usia) diberi makan 0,5%
kaya kolesterol diet ditambah vitamin D 2 (50.000 IU sehari-1)dalam
PersiapanHNE-dimodifikasiPAA air minum sampaisignifikanstenosis katup aorta
(dedidefinisikansebagai ≥10% penurunan di daerah katup aorta) dan
PolyL-lysine(Mr= 150.000-300.000), poliL-histidine(Mr N 5000), kemudian kembali ke diet normal selama 2 minggu. Sampel kontrol
poli-L-arginine (Mr N 70.000), poliL-cysteine-L-glutamate (Glu / Cys diperoleh dari kelinci usia yang diberi makan secara eksklusif dengan
5/1, 30 unit), danpoli-L-arginine, poli-L-serine, poli-L-glutamate(Mr= diet normal. Sampel darah diperoleh berdasarkan ketamin / xylazine
50.000-100.000 ) (2 mg / ml) dilarutkan dalam 50 mM buffer natrium anestesi melalui arteri perut saat exsanguination
fosfat, pH 7,4, diinkubasi dengan HNE atau [9,9,9 - 2H3] HNE (2 mM) untukpengorbanan.Kadar kolesterol dipengorbananyang 11,9 ± 2,5 mM
pada 37 ° C selama 15 jam. Kemudian, campuran reaksi didialisis untuk HC dan 0,60 ± 0,08 mM untuk kontrol. Sampel plasma untuk
selama 24 jam terhadap 50 mM buffer natrium fosfat, pH 7,4 (tiga analisis berbagai spesies HNE dan DHN yang terikat dengan protein
perubahan buffer, 1/200 v / v) untuk menghapus HNE yang tidak diperlakukan dengan NaB2H4 atau DNPH dan diproses seperti yang
bereaksi. dijelaskan di atas.

Inkubasi albumin serum bovin dengan albumin serum HNE Analisis GCMS

Bovine (50 atau 600 μM) diinkubasi dengan HNE (10 μM hingga 2 Prosedur untuk analisis GCMS telah dijelaskan sebelumnya secara
mM) di 50 mM buffer natrium fosfat, pH 7,4, pada 37 ° C hingga 15 rinci [23].Secarasingkat,sebuah 1-μl aliquot disuntikkan ke dalam
jam. Campuran reaksi didialisis seperti yang dijelaskan untuk Agilent 6890 N GC yang dilengkapi dengan kolom kapiler HP-5 (50
campuran inkubasi PAA. m × 0,2 mm diameter bagian × 0.5-μketebalan fase m) digabungkan
ke 5973 detektor beroperasi di Modus ionisasi kimia positif dengan
Inkubasi glutathione (GSH) dengan HNE amonia sebagai gas reagen pada tekanan 10 - 3 Torr dan energi
elektron 153 eV. Sumber MS dan suhu quadrupole ditetapkan pada
Kelebihan 100 kali lipat GSH berkurang (3,2 mM) diinkubasi 300 dan 176 ° C, masing-masing. Suhu kolom GC ditetapkan pada
dengan [9,9,9-2H3] HNE (0,031 mM) di 50 mM sodium phosphate 170 ° C selama 1 menit, meningkat sebesar 20 ° C / menit sampai 325
buffer, pH 7,2, pada 37 ° C selama 16 jam. Dalam kondisi ini, kami ° C, dan disimpan pada suhu ini selama 8 menit. Ion-ion berikut
mengevaluasi bahwa antara 80 dan 85% dari kuantitas awal [ 2H3] HNE dimonitor dengan waktu tinggal 100 ms per ion untuk analisis
ditambahkan terikat pada GSH. derivatif TBDMS dari spesies molek DHN yang tidak berlabel atau
berlabel (lihat Gambar 1): (i) m / z = 258 untuk [2H] DHN ( dari HNE
Pengobatan sampel dengan NaB2H4 dan Raney nikel(Gbr.1) terikat dikurangi dengan NaB2H4), (ii) m / z = 268 untuk standar
internal terdeuterasi [2H11] DHN. Kami juga secara rutin memantau
didialisis solusi dariHNE-dimodifikasiPAA (2 mg / ml), albumin, ion pada m / z 257, yang sesuai dengan DHN tanpa label. Untuk
atau GSH, serta plasma darah dan sampel, entah diencerkan (1 / 1000 inkubasi dengan 2H3-labeled HNE, kami memantau ion pada m / z
untuk poli-L-cysteine-L-glutamat, 1/40 untuk PAA lain dan untuk 260 sesuai dengan [2H3] DHN dan pada m / z 261 sesuai dengan [2H4]
albumin) atau diobati langsung dengan 1 M NaB 2H4 pada 4 ° C selama 1 DHN (dari terikat [2H3] HNE dikurangi dengan NaB 2H4). Semua ion
jam untuk mengurangi kelompok karbonil bebas HNE ke deuterated ini dihasilkan dari hilangnya [M-OTBDMS] dari ion molekuler [M ·]+.
kelompok alkohol. Kondisi reduksi ini sebelumnya digunakan untuk Konsentrasi HNE-P yang dilaporkan dalam penelitian ini mewakili
sampel darah atau jaringan [23,24], karena mereka meminimalkan rata-rata duplikat atau duplikasi sampel suntikan. Area puncak GC
produksi artifactual HNE dari peroksidasi lipid selama pemrosesan yang ditentukan oleh integrasi komputer dikoreksi untuk isotop berat
sampel. Sampel diperlakukan dengan 5 volume etanol dingin (PAA) dan isotop isotop ringan dari standar internal [ 2H11] DHN.
atau dengan asam sulfosalicylic jenuh (SSA) (albumin, GSH, plasma, Konsentrasi dihitung menggunakan area yang dikoreksi dan dari
dan sampel darah) dan disentrifugasi pada 6.500 rpm selama 45 menit kuantitas standar internal yang ditambahkan ke masing-masing
pada 4 ° C. PAA, albumin, atau darah dan protein plasma pelet sampel seperti yang dijelaskan sebelumnya [23].
disuspensikan ke dalam 2 ml guanidin (pH 7,2), dibubuhi0,1-0,3nmol
Protein carbonyl assay
standar internal yang deuterated 1,4[2H11]dihidroksi-2-nonene dan
diinkubasi dengan 1.7 g katalis nikel Raney selama 5 hingga 30 jam
pada 55 ° C. Pengendalian inkubasi juga dilakukan tanpa adanya Aliquot (1 ml) dariHNE-larutanPAA diinkubasi selama 1 jam
katalis nikel Raney. Dalam beberapa percobaan, kami menguji dampak dengan 0,1% (wt / vol) DNPH dalam 2 M HCl pada suhu kamar.
penggantian air dengan 2H2O, yang digunakan untuk melarutkan PAA Setelah presipitasi dengan 10 ml etanol dingin untuk menghilangkan
atau pelet protein dan / atau nikel Raney. Setelah inkubasi, sampel HNE yang tidak bereaksi,HNE-peletPAA dilarutkan dalam 2 ml 8 M
supernatan dibawa ke pH b 2 dan diekstraksi dua kali dengan etil guanidin hidroklorida, 13 mM EDTA, dan 133 mM Tris (pH 7,4).
asetat. Ekstrak gabungan diuapkan sampai kering di bawah N 2 dan Absorbsi UV dinilai pada 365 nm. Konsentrasi dinyatakan sebagai
rasio molar [DNPH] / [AA] (mol / mol) dan dihitung menggunakan
bereaksi dengan N-methyl-N-(ters-butyldimethylsilyl)
trifluoroacetamide pada 80 ° C selama 6 jam. molar absorptiv- itykoefisiendari 21,0 mM / cm-1 [28].
ARTICLE IN PRESS
4 J.-F. Lesgards et al. / Radikal Bebas Biologi & Kedokteran xxx (2009) xxxxxx

Hasil

Percobaan dengan
PAA

Gambar 1 (kiri) menggambarkan prosedur eksperimental yang


digunakan berdasarkan publikasi kami sebelumnya [23] untuk
menghitung HNE sulfur dan nitrogen yang terikat melalui Michael
adduct dalam berbagai percobaan yang dijelaskan di bawah ini.
Sepanjang artikel, kami mengacu pada struktur kimia dari derivatif
TBDMS dari berbagai spesies molekul DHN deuterated dan
nondeuterated yang dirilis oleh pengobatan dengan nikel Raney dan
dianalisis oleh GCMS oleh pemantauan ion terpilih dari
nilaiditunjukkan m / z yang . Untuk referensi, Gambar. 1 (kanan)
daftar berbagai ion yang telah dianalisis dan asal mereka yang
diusulkan untuk analisis sampel darah atau plasma. Patut dicatat
bahwa asal dari sinyal GCMS yang diberikan dapat bervariasi dalam
kondisi lain; oleh karena itu akandispesifikasikanuntuk setiap
percobaan. Buah ara. 2 dan 3 menggambarkan data GCMS
representatif untuk analisis yang dilakukan dengan berbagai PAA,
sedangkan Tabel 1 melaporkan nilai-nilai kuantitatif yang diperoleh
untuk analisis ini oleh GCMS dan dengan uji protein karbonil. Perlu
dicatat bahwa untuk semua percobaan ini, solusi didialisis dariHNE-
-.Gambar 2. Perwakilan dipilih ion kromatogram sampel yang diperoleh dari incubations dari dimodifikasiPAA diencerkan (1/1000 untuk poli- L-cysteine-L-
poli-L-cysteine-L-glutamate dengan HNE. Poli-L-cysteine-L-glutamate (sistein: rasio molar gluta- glutamate dan 1/40 untuk PaaS lainnya) untuk mendapatkan data
pasangan 1: 5, 30 unit; 2 mg / ml sesuai dengan 3,3 mM sistein) dilarutkan dalam 50 mM bufer MS akurasi tinggi (N 90%) dan presisi (N 2%).Secarakhusus, kami
natrium fosfat, pH 7,4, dan diinkubasi dengan HNE (2 mM) pada 37 ° C selama 15 jam. Setelah
dialisis selama 24 jam untuk menghapus HNE yang tidak bereaksi, sampel diproses seperti yang
sebelumnya telah menunjukkan bahwa ini diperoleh untuk
dijelaskan di bawah Bahan dan metode dan diilustrasikan pada Gambar. 1. Data ditampilkan konsentrasi DHN antara 100 dan 500 pmol [23].
sebagai persentase intensitas relatif tidak dikoreksi untuk kelimpahan alam di isotop berat. Asal
sinyal pada berbagai ion ditunjukkan dalam tanda kurung. GCMS assay dari adduct HNE dengan poli-L-cysteine-L-glutamat
Gambar. 2 menggambarkan perwakilan kromatogram ion yang
Statistik dipilih diperoleh setelah analisis GCMS sampel yang diperoleh dari
incubations dari poli- L-cysteine-L-glutamate (2 mg / ml sesuai
Datadisajikan sebagai sarana ± SEM (n = 3) atau SD (n = 2) dan dengan 3.3 mM cysteine) dengan 2 mM HNE (menghasilkan rasio
merupakan perwakilan dari dua hingga tujuh percobaan yang dilakukan cysteine-to-HNE 1,65). Seperti yang diharapkan, kami mengamati
dalam rangkap dua atau rangkap tiga. Statistiksignifikansidicapai pada P sinyal pada m / z 258, yang sesuai dengan [2H] DHN (dari adduct
b 0,05 menggunakanberpasangan t-testatau arah dua ANOVA, diikuti HNE dikurangi dengan NaB2H4; Gambar. 1, struktur A) yang
oleh Bonferroni test yang dipilih-perbandingan. dilepaskan dari poli-L-sisteinL-- larutan glutamat diinkubasi dengan
HNE setelah pengobatan dengan nikel Raney selama 15 jam. Ada
sedikit jika ada sinyal pada m / z 257, yang sesuai dengan DHN tak
berlabel (Gambar 1, struktur B); sinyal rendah mungkin timbul dari
pengotor isotop cahaya dalam NaB2H4 dan / atau dalam standar
internal [2H11] DHN [30].lebih besar

Gambar yang. 3. Representasi kromatogram ion terpilih dari sampel dari inkubasi (A) Lpoly--lysine dan (B) poly-L-histidine dengan HNE. PAA yang diindikasikan (2 mg / ml sesuai dengan
13,7 mM lisin dan 12,9 mM histidin, masing-masing) dilarutkan dalam 50 mM buffer natrium fosfat, pH 7,4, dan diinkubasi dengan HNE (2 mM) pada 37 ° C selama 15 jam. Setelah dialisis
selama 24 jam untuk menghapus HNE yang tidak bereaksi, sampel diproses seperti yang dijelaskan di bawah Bahan dan metode dan diilustrasikan pada Gambar. 1. Data ditampilkan sebagai
ARTICLE IN PRESS
persentase intensitas relatif tidak dikoreksi untuk kelimpahan alam di isotop berat. Asal sinyal pada berbagai ion ditunjukkan dalam tanda kurung.
ARTICLE IN PRESS
J.-F. Lesgards et al. / Biologi Radikal Bebas & Pengobatan xxx (2009) xxx-xxx 5

Tabel 1
Konsentrasi HNE terikat pada berbagai asam poliamino yang mengandung residu sistein, histidin, lisin, dan arginin yang ditentukan dengan kromatografi gas -spektrometri massa dan dengan uji
karbonil menggunakan spektrofotometri

Uji GCMS (mol (DHN + Uji GCMS (relatif terhadap Protein karbonil (mol as Protein karbonil (relatif
[2H] DHN) / Cys) DNPH / mol sa terhadap Cys)
y
A
A)
Cysteine 5.7 × 10- 1 1 8,6 × 10-2 1
Histidine 1,6 × 10- 3 2.8 × 10-3 2.6 × 10-3 3.0 × 10-2
Lysine 1.2 × 10- 3 2.2 × 10-3 9.4 × 10-4 1.1 × 10-2
Arginine 3.8 × 10- 5 6.8 ×10-5 nd nd

Data dinyatakan sebagai rasio molar: [(DHN + [2H] DHN)] / [AA] dan [DNPH] / [AA], masing-masing. Nilai adalah cara tiga atau empat peniruan replikasi (CV b 10%) dan perwakilan dari dua
atau tiga eksperimen. Kondisi inkubasi dan analisis rinci di bawah Bahan dan metode. Cys, sistein; DHN, 1,4-dihidroksinonan; GCMS, kromatografi gas-spektrometri massa; DNPH,
difenilhidrazin; PAA, asam poliamino. nd, tidak terdeteksi.

sinyal pada m / z 268 sesuai dengan standar internal [2H11] DHN.


mewakili hanya 11 dan 5 ± 2% dari total sinyal MS untuk poli- L- lisin
Dalam percobaan tambahan, di mana kami memeriksa dampak waktu
dan poli-L-Histidin, masing-masing.
inkubasi dengan nikel Raney pada 55 ° C, kami menemukan bahwa
Oleh karena itu, analisis solusi dari poli- L-lysine dan poli-L-
kuantitas [2H] DHN dilepaskan dari poli-L-sistein-L-glutamat maksimal
histidine diinkubasi dengan HNE mengakibatkan sinyal dominan
setelah 5 h dan konstan untuk periode inkubasi yang lebih lama hingga
GCMS pada m / z 257, yang merupakan 1 unit massa kurang dari
30 jam (data tidak ditampilkan). Selain itu, kami telah confirmed yang
yang diharapkan untuk adduct HNE dikurangi dengan NaB 2H4 (m / z
bation incu- dari poli-L-glutamate dengan HNE tidak menghasilkan
258) dan dibelah dengan nikel Raney. Hasil ini berbeda dengan yang
apapun GCMS terdeteksi sinyal pada m / z 258 atau 257.
diperoleh untuk poli-L-cysteine-L-glutamate(Gbr.2).Juga kontras
dengan PAA terakhir adalahkami findingbahwa sinyal GCMS pada
GCMS assay dari adduct HNE dengan poli-L-lysine dan poli-L-
histidine m / z 257 yang diamati untuk solusi dari poli- L-lysine dan poli- L-
Fig. 3 menunjukkan analisis GCMS representatif dari sampel dari histidine diinkubasi dengan HNE diperlukan minimal 15 jam
inkubasiLpoly--lysine (Gambar 3A) atauLpoly--histidine (Gambar. 3B) pengobatan dengan nikel Raney pada 55 ° C untuk mencapai nilai
(2 mg / ml sesuai dengan 13,7 mM lysine dan 12,9 mM histidin, maksimal (data tidak ditampilkan). Perlu dicatat bahwa sinyal GCMS
masing-masing) dengan 2 mM HNE (menghasilkan rasio asam amino- tidak terdeteksi ketika langkah nikel Raney dihilangkan dari prosedur
ke-HNE persiapan sampel (data tidak ditampilkan).
6,85 dan 6,45, masing-masing). Tanpa diduga, dalam kedua kasus,
kami mengamati sinyal GCMS yang dominan pada m / z 257 sesuai HNE PAA-terikat ditentukan oleh GCMS vs uji protein karbonil
dengan DHN tak berlabel (Gambar 1, struktur B). Ini kontras Untuk memberikan dukungan tambahan untuk pembebasan HNE
dengankami temuandari sinyal dominan pada m / z 258 sesuai dengan dari berbagai PAA dan lebihsecarakhusus dari poli-L-lysine atau poli-L-
[2H] DHN (Gbr. 1, struktur A) untuk sampel dianalisis setelah inkubasi histidin setelah pengobatan nikel Raney, kami membandingkan kami
HNE dengan poly-L-sistein-L-glutamat (Gbr. 2). Selanjutnya, pada GCMS assay ke uji protein karbonil untuk berbagai PAA diinkubasi
Gambar. 3, sinyal GCMS di m / z 258 belum dikoreksi untuk dengan HNE. Seperti ditunjukkan pada Tabel 1, jumlah HNE yang
kelimpahan alami dari isotop berat (seperti karbon 13 dan deuterium) dilepaskan dari berbagaiHNE-solusiPAA (dinyatakan sebagai rasio
dalam DHN tak berlabel. Meskipun koreksi ini pada dasarnya dapat HNE-to-AA molar) dievaluasi oleh GCMS adalah sistein (0,57) NN
diabaikan untuk ion pada m / z 257 dan 268, hal ini menjelaskan histidin (1,6 × 10-3) N lisin (1,2 × 10-3), sesuai dengan uji protein
sebagian besar sinyal GCMS pada m / z 258. Sesungguhnya, kontribusi karbonil standar. Kadar HNE sangat rendah untukLpoly--arginine,
dari sinyal kelimpahan alami pada m / z ion258 adalah 21% dari tetapi tidak terdeteksi untukL-poly-glutamat atau poli-L-serin. Oleh
besarnya puncak pangkalan di m / z 257. Setelah koreksi untuk karena itu, urutan reaktivitas dari berbagai asam amino dengan HNE
kelimpahan alam, sinyal GCMS yang tersisa di m / z 258 menjadi yang kami amati konsisten dengan
sangat rendah,

Gambar. 4. Kromatogram ion yang dipilih dari sampel dari inkubasi (A) Lpoly--lysine dan (B) poly-L-histidine dengan [2H3] HNE. Kondisi inkubasi dan pengolahan sampel seperti yang dijelaskan
ARTICLE IN PRESS
untuk Gambar. 3 kecuali bahwa HNE digantikan oleh [2H3] HNE. Asal sinyal pada berbagai ion ditunjukkan dalam tanda kurung.
ARTICLE IN PRESS
6 J.-F. Lesgards et al. / Biologi Radikal Bebas & Pengobatan xxx (2009) xxx-xxx

Gambar. 5. Analisis GCMS sampel dari inkubasiLpoly--lysine dan HNE diobati dengan nikel
Raney dalam kondisi H2O dan 2H2O. Inkubasi dan pengolahan sampel seperti yang dijelaskan Gambar. 7. Analisis GCMS solusi albumin diinkubasi dengan HNE. Bovine serum albumin
untuk Gambar. 3 kecuali bahwa pada langkah nikel Raney, sampel dilarutkan baik dalam H 2O (30 atau 600 μM) diinkubasi dengan HNE (10 μMhingga 2 mM) di 50 mM sodium
atau dalam 2H2O. Data GCMS dikoreksi untuk kelimpahan alam dalam isotop berat dan phosphate buffer, pH 7.4, pada 37 ° C dalam berbagai kondisi dan campuran reaksi
dinyatakan sebagai% dari intensitas sinyal GCMS total pada ion m / z 257 dan 258. Nilai adalah didialisis seperti yang dijelaskan untuk inkubasi PAA campuran di bawah Bahan dan
sarana ± SD dari dua percobaan yang dilakukan di tiga sampai limameniru penentuan (CV b metode. Data GCMS dikoreksi untuk kelimpahan alam di isotop berat dan dinyatakan
10%). Perhatikan peningkatan intensitas sinyal pada m / z 258 untuk sampel yang diobati sebagai%dari total GCMS sinyal intensitas pada ion m / z 257 dan 258. Nilai adalah sarana
dengan 2H2O. ± SD dari enam kondisi yang dilakukan di penentuan rangkap tiga (600 μM albumin + 10
μM HNE) atau dua percobaan (50 μMalbumin + 2 mM HNE). Asal sinyal pada ion m / z
257 dan 258 ditunjukkan dalam tanda kurung.

hasil literatur: cysteine NN histidin N lysine NN arginine [4]. Perlu


dicatat bahwa untuk semua analisis yang dilaporkan pada Tabel 1,% CV
untuk konsentrasi terukur adalah b 10%. Inkubasi dengan [2H3] HNE
First, untuk memberikan bukti tambahan bahwa HNE berada
Karakterisasi sinyal GCMS yang diperoleh dari adduct HNE dengan pada titik asal sinyal GCMS ini, kami menginkubasi Lpoly--lysine
poly-L-lysine danLpoly--histidine atau poly-L-histidine dengan [2H3] HNE dan memproses sampel
dengan NaB2H4 dan Raney nikel seperti yang dijelaskan sebelumnya
Sedangkan data yang disebutkan di atas memberikan bukti bahwa untuk Gambar. 2 dan 3. Seperti dapat dilihat dari Gambar 4, yang
perlakuan nikel Raney dapat membelah adducts HNE ke PAA melalui menggambarkan hasil dari sampel yang representatif dari percobaan
ikatan karbon- nitrogen (C-N) pada 55 ° C, di samping link thioether ini, pola sinyal GCMS mirip dengan Gambar 3, kecuali untuk
pergeseran 3 unit massa.Secarakhusus, sinyal GCMS dominan
(C-S), percobaan tambahan dilakukan untuk lebih memahami mengapa
sinyal GCMS adalah 1 unit massa kurang dari yang diharapkan untuk sekarang diamati pada m / z 260 (sesuai dengan[2H3]
analisis larutanLpoly--lysine dan poly-L-histidine diinkubasi dengan DHN;.Gambar1,struktur D)bukan 257, sehingga menunjukkan
HNE. bahwa itu muncul dari[2H3]HNE. Perlu dicatat bahwa sinyal pada
m / z 261 (yang akan menjadi

Gambar. 6. Mekanisme yang diusulkan untuk de-deuterasi HNE terikat nitrogen selama pembelahan dengan nikel Raney. Meskipun nitrogen-terikat HNE dapat dikonversi ke [ 2H] DHN oleh
NaBmedium.Hal2H4, deuterium yang tergabung dapat bertukar dengan hidrogen dari katalis nikel Raney atauini dapat terjadi ketika berkurang HNE terikat pada permukaan logam melalui atom
nitrogen. Mekanisme yang diusulkan diilustrasikan dengan HNE terikat ke lisin melalui penambahan Michael, tetapi juga akan terjadi untuk histidin. Waktu tinggal yang lebih lama pada katalis
akan menjelaskankita temuantentang de-deuterasi untuk lisin atau histidin, tetapi tidak untuk sistein.
ARTICLE IN PRESS
J.-F. Lesgards dkk. / Radikal Bebas Biologi & Kedokteran xxx (2009) xxx-xxx 7
diinkubasi dengan HNE (data tidak ditampilkan) .Catat bahwa
penambahan 2H2O pada langkah NaB2H4 dengan nikel Raney yang
dilarutkan dalam air yang tidak berlabel tidak r esult dalam
pergeseran massa seperti itu.
Hence, in summary, the results obtained concur with HNE being
at the origin of the signal observed at m/z 257 for samples from
experiments conducted with PAA-containing lysine and histidine.
They also suggest that the loss of deuterium through hydrogen
exchange with the medium at the Raney nickel step may explain the
GCMS signal that is observed at 1 mass unit less (ie, at m/z 257,
corresponding to DHN; Fig. 1, structure B) than expected (ie, at m/z
258, corresponding to [2H]DHN; Fig. 1, structure A). Fig. 6 illustrates
the proposed scheme of reactions involved in the hydrogen exchange.

Experiments with biologically relevant samples

To assess the significance of our findings with PAA, we conducted


additional experiments with biologically relevant molecules (albu-
Gambar. 8. Analisis GCMS sampel plasma diperlakukan dengan nikel Raney di HO dan 2H O.

2 2
min) and samples (plasma and blood). This seems to be particularly
Plasma samples (400 μl) were processed as described under Materials and methods and shown
in Fig. 1 except that at the Raney nickel step, samples were dissolved either in H 2O or in 2H2O. relevant given that in our previous study [23], we found that GCMS
GCMS data are corrected for the natural abundance intensity and expressed as % of the total analyses of plasma samples, for which albumin is the predominant
GCMS signal at ions m/z 257 and 258. Values are means± SD of two experiments conducted in
protein, resulted in a predominant signal at m/z 257; there was little
three to five replicate determinations (CV b 10%). Note the increase in signal intensity at m/z
258 for samples treated with 2H2O.
if any signal at m/z 258. Results from the present study raised the
possibility that the GCMS signal at m/z 257 may arise from HNE
bound to lysine and/or histidine residues of circulating proteins.
expected if bound [2H3]HNE had been reduced with NaB 2H4; Fig. 1,
structure E) becomes marginal after correction for natural abundance Incubations of albumin with HNE
in heavy isotopes of the base peak at m/z 260, representing b 10% of Incubation of 10 μM HNE with 600 μM albumin, which is similar
the total GCMS signal detected at both ions. to conditions described by Aldini et al. [31] and equivalent to
concentrations found in plasma, resulted in a predominant GCMS
Incubation with 2H2O signal at m/z 258 corresponding to [2H]DHN (75% Fig. 1, structure A)
Finally, we tested the possibility of a loss of deuterium through irrespective of incubation time (1–15 h) and HNE concentration (10
hydrogen exchange with the medium at the Raney nickel step. This was μM–2 mM; Fig. 7). However, when the concentration of albumin in
achieved by replacing H2O with 2H2O during Raney nickel treat- ment the incubation mixture was decreased 20-fold, thus increasing the
of solutions of poly-L-cysteine-L-glutamate or poly-L-lysine, which had HNE-to-albumin ratio from 1/60 (10 μM HNE + 600 μM albumin) to
been incubated with HNE and reduced with NaB 2H4. For poly-L- 60 (2 mM HNE + 30 μM albumin), similar to conditions used by
cysteine-L-glutamate, we obtained data identical to that depicted in Fig. Szapacs et al. [32], the GCMS signal at m/z 257 was increased from 25
2 (data tidak ditampilkan). However, with poly- L-lysine, we observed a to 50%, suggesting increasing binding of HNE through nitrogen-
shift in the MS signal from m/z 257 to m/z 258 (Fig. 5) corresponding based residues, most likely histidine or lysine residues (Fig. 7).
to [2H]DHN, the percentage of which was increased from 11 ± 3 to 51 ± Together these results emphasize the importance of the albumin-to-
5% of the total MS signal (mean± SD, n = 2). Similar results were HNE ratio as a factor determining the proportion of HNE bound to
obtained with solutions of poly-L-histidine cysteine versus histidine and lysine residues to albumin molecules.

Fig. 9. Overview of the experimental strategy to quantify sulfur- and nitrogen-bound HNE via Michael adducts using diphenylhydrazine (DNPH). DNPH reacts with the free carbonyl group of
HNE bound to protein via cysteine, histidine, or lysine residues to form an imine, which is subsequently reduced to a secondary amine by NaB 2H4. After Raney nickel treatment, the C–N bond will
be cleaved, releasing unlabeled or 2H-labeled 4-hydroxynonane, which upon derivatization will form a mono-TBDMS derivative.
ARTICLE IN PRESS
8 J.-F. Lesgards et al. / Free Radical Biology & Medicine xxx (2009) xxx–xxx

DNPH to discriminate between various HNE-P molecular species in


blood and plasma samples
To assess the proportion of HNE bound to circulating proteins via
cysteine vs lysine and/or histidine residues, we first treated parallel
plasma samples with Raney nickel in the presence of H 2O or 2H2O, based
on the observed selective reactivity of HNE bound to PAA containing
cysteine, lysine, or histidine residues to these two treatments (see Fig.
5). As shown in Fig. 8, treatment of plasma samples with Raney nickel
in the presence of 2H2O resulted in a shift in the intensity of the GCMS
signal observed at m/z 257 (∼25% decrease) to m/z 258, which
suggested the presence of HNE bound to histidine and/or lysine
residues. However, the partial shift of the GCMS signal at m/z 257
raised the possibility of an incomplete deuterium exchange. An
alternative explanation would be that plasma samples also contain
protein adducts consisting of DHN covalently linked to cysteine
residues, which may arise from the reduction of the free carbonyl group
of HNE bound to proteins via thioether linkages to an alcohol group by
aldose reductase [33].
Thus, we tested the capacity of DNPH, which reacts readily with the
carbonyl group of aldehydes, to discriminate between HNE-P via
cysteine vs histidine and/or lysine residues, as well as protein-bound
DHN (DHN-P). We reasoned that DNPH will react with the free
carbonyl group of HNE bound to proteins via cysteine, histidine, or Fig. 11. GCMS analysis of various protein-bound HNE and DHN species in blood and
lysine residues to form an imine, which would be subsequently reduced plasma rat samples with or without treatment with DNPH. Whole blood and plasma
samples were processed in the absence or in the presence of DNPH for the GCMS analysis of
to a secondary amine by NaB2H4. After Raney nickel treatment, the C–N
DHN released from the various protein adducts: protein-bound HNE via cysteine (HNE-SP)
bond will be cleaved, releasing unlabeled or 2H-labeled 4- or histidine/lysine residues (HNE-NP) and protein-bound DHN (DHN-P). Data shown are
hydroxynonane, which upon derivatization will form a mono-TBDMS expressed as concentrations, which were calculated for the GCMS signal at m/z 258 (A and
derivative (Fig. 9). The latter derivative cannot be detected using the C) and m/z 257 (B and D), corrected for the natural abundance in heavy isotopes, using the
internal standard [2H11]DHN. Shown are the means± SE of seven rat plasma or blood
GCMS conditions selected for the di-TBDMS derivative of DHN (shown
samples. ⁎⁎p b 0.01; +DNPH vs −DNPH. nd, not detected; Δ, difference in concentration at
in Fig. 1). However, DHN-P will not be modified by DNPH treatment m/z 257 ± DNPH.
and after Raney nickel treatment, these adducts will release unlabeled
DHN, which will be converted to a di-TBDMS derivative, yielding a
GCMS signal at m/z 257 (Fig. 1, structure B). noteworthy that treatment of samples with NaB 2H4 after DNPH
The aforementioned DNPH-based approach was first tested using addition did not modify the results.
standard solutions of HNE and DHN. This yielded the expected result, Finally, Fig. 11 reports quantitative values for the various HNE-P
that is, a GCMS signal corresponding to DHN (m/z 257), but resulted in species, including DHN-P for whole blood and plasma collected from
the complete abrogation of the signal corresponding to HNE (m/z 258) normal 22-week-old Wistar rats. A GCMS signal at m/z 258 was
(data not shown). Then, we conducted a calibration curve in plasma detected exclusively in whole blood samples and evaluated at 0.75 ±
samples similar to that reported in our previous publication (see Fig. 3 0.12 pmol/mg proteins in agreement with our previous study [23].
in Ref. [23]) to test the linearity of GCMS signal response at m/z 257 in This signal was completely abolished by DNPH treatment (Fig. 11A),
the presence of DNPH. As shown in Fig. 10, the GCMS signal intensity which was expected for [2H]DHN released from HNE-P via cysteine
at m/z 257 in plasma treated with DNPH, which was ∼ 50% lower than residues. It is noteworthy that the percentage contribution of blood
that of untreated samples, displayed a linear relationship with sample GSH–HNE conjugates to this m/z 258 signal was estimated be ∼
volumes between 200 and 500 μl; the positive value at the y intercept 7%3.
indicates a constant bias similar to that previously described [23]. It is In contrast to the signal at m/z 258, the strong GCMS signal at
m/z 257 in whole blood was not affected by DNPH treatment (Fig.
11B), indicating the presence of DHN-P, whose level is evaluated at
1.59 ±
0.02 pmol/mg proteins. Conversely, in plasma, DNPH treatment
decreased by ∼60% the intensity of the GCMS signal at m/z 257
(Fig. 11D): the difference in signal intensity in the absence and in the
presence of DNPH is attributed to HNE-P via nitrogen residues (1.71
±
0.31 pmol/mg proteins), whereas the remaining signal in the
presence of DNPH is attributed to DHN-P (1.14± 0.15 pmol/mg
proteins).

3
To assess the potential contribution of GSH–HNE conjugates to the GCMS signal at
m/z 258, samples of whole blood (400 μl; in duplicates) were spiked with 0, 0.2, 0.4, or
Fig. 10. Calibration curve obtained for the GCMS assay of HNE-P at m/z 257 in increasing
0.6 nmol of GSH-bound [ 2H4]DHN (prepared by incubating GSH with [ 2H3]HNE followed
volumes of plasma in the presence of DNPH. Samples for the various volumes were processed
for analysis in triplicate. Data are reported as concentration, calculated using the internal by reduction with NaB2H4); this corresponds to 0.5–1.5 μM GSH–HNE, which implies that
0.1 to 0.5% of blood GSH would be modified by HNE. After treatment with SSA and
standard of [2H11]DHN after correction for the natural abundance in heavy isotopes. The
centrifugation, precipitates and supernatants were collected and processed in parallel as
regression line with 95% confidence interval is shown: slope= 0.12 ± 0.03, y intercept= 26 ± 11;
described under Materials and methods: (i) spiked with the deuterated internal standard
Pearson correlation coefficient r = 0.996; p b 0.004.
[2H11]DHN, (ii) treated with guanidine hydrochloride followed by Raney nickel, and (iii)
derivatized for GCMS analysis. The GCMS signal at m/z 261 (corresponding to [2H4]DHN
released from GSH–HNE conjugates treated with NaB 2H4) in precipitated fractions of
whole blood samples spiked with various quantities of GSH-bound [ 2H4]DHN represented
7.1 ± 0.3% of the total signal recovered; the remaining 93% was recovered in the
supernatant fractions under all conditions.
ARTICLE IN PRESS
J.-F. Lesgards et al. / Free Radical Biology & Medicine xxx (2009) xxx–xxx 9
HNE mixtures in the protein carbonyl assay (Table 1). Indeed, the
orders of reactivity of the various amino acids with HNE determined
by GCMS and protein carbonyl assays are similar and consistent with
literature results: cysteine NN histidine N lysine NN arginine [4]. It is
usually considered that cysteine is the most reactive amino acid
toward HNE, whereas HNE adducts of histidine are more stable than
either cysteine or lysine conjugates toward retro-Michael addition
[4,35,36]. The very low levels of HNE found for poly- L-arginine and
the absence of signal for poly-L-glutamate or poly-L-serine are also
consistent with the general reactivity of HNE toward amino acids.
Nevertheless, there were some differences in the absolute quantity of
HNE adducts evaluated by GCMS vs DNPH, particularly for cysteine
(6-fold greater) and histidine (1.6-fold lower), which may be ex-
plained by conditions used for sample processing and analyses,
specifically NaB2H4 reduction of the reactive carbonyl group of HNE
Fig. 12. Plasma levels of various protein-bound HNE and DHN species in control and
hypercholesterolemic rabbits. Plasma samples were processed in the absence or in the presence
at 4 °C for GCMS vs room temperature for the DNPH method.
of DNPH for the GCMS analysis of DHN released from protein-bound HNE via histidine/lysine Collectively, these data provide evidence that in addition to sulfur-
residues (HNE-NP) and protein-bound DHN (DHN-SP). Data shown are expressed as bound HNE, Raney nickel treatment also cleaves nitrogen-bound
concentrations, which were calculated for the GCMS signal at m/z 257, corrected for the HNE at 55 °C. To the best of our knowledge, cleavage of the latter
natural abundance in heavy isotopes, using the internal standard [ 2H11]
adducts with Raney nickel has not been previously documented. This
DHN. Shown are the means± SE of six plasma samples from control and hypercholes-
terolemic rabbits. ⁎p b 0.05 and ⁎⁎p b 0.05 for comparisons as indicated; Δ, difference in may be due to variations in the catalytic strength of the Raney nickel
concentration at m/z 257 ± DNPH; #p b 0.05, HNE-NP, hypercholesterolemic vs control. pre- parations or duration of treatment. Indeed, further supporting
this notion is the fact that the GCMS signal observed required
Impact of hypercholesterolemia on the plasma level of various HNE-P minimally 15 h of treatment with Raney nickel to reach a maximal
molecular species value, as opposed to 5 h for HNE adducts with cysteine. This is
To further substantiate the biological significance of the various consistent with the binding energies of the carbon–nitrogen and
HNE-P molecular species, specifically HNE bound to proteins via carbon–sulfur bonds, which are 305 and 272 kJ/mol, respectively.
histidine or lysine residues, we evaluated the impact of hypercholes- We reason that our method detects only Michael adducts and not
terolemia, a condition associated with enhanced oxidative stress [1,34]. Schiff bases. Specifically, HNE released from Schiff bases using Raney
As shown in Fig. 12, compared to controls, hypercholesterolemic nickel is expected to form a mono-TBDMS derivative of 4-
rabbits showed a significant increase in the GCMS signal detected at hydroxynonane, which would not be detected under the GCMS
m/z 257 for samples that had not been treated with DNPH, but not for conditions (ie, retention time and ions monitored) selected for the di-
samples treated with DNPH, indicating that the levels of DHN-P were TBDMS derivative of DHN that is formed with Michael HNE–
similar for both groups. This increase in signal intensity between protein adducts (Fig. 1) because it would elute at an earlier time [30].
samples with or without DNPH treatment is attributed to HNE-P via Additionally, when the temperature of the MS source is set at 150 °C,
nitrogen residues, whose levels are evaluated to be 1.40 ± 0.54 it is possible to analyze and quantify the TBDMS derivatives of DHN
pmol/mg proteins in hy- percholesterolemic rabbits, whereas they are and [2H]DHN at m/z 389 and 390, respectively, which correspond to
undetectable in controls. the molecular ion (no loss of the [OTBDMS] group as shown in Fig.
1), rather than at m/z 257 and 258. In previous studies [23,24], we
Discussion did not find any differences in the GCMS signals at these two ion sets,
further supporting the notion that we are detecting HNE released
Nature of HNE–protein adducts detected by GCMS assay after from Michael adducts. In fact, it is well established that Schiff bases
Raney nickel treatment are generated in lower amounts than Michael adducts with HNE,
which is in contrast to 4-oxo-2-nonenal [37]. Furthermore, other
The ability of Raney nickel to cleave thioether bonds is well known authors were unable to detect any compound consistent with the
and has been applied to the measurement of HNE bound to glutathione predicted structure of the reduced Schiff-base adduct of HNE to
and protein thiols [26]. Our results obtained from incubations of poly- lysine as detected by GCMS when HNE was incubated with Nα-
L- cysteine-L-glutamate with HNE have confirmed this notion as (formyl)lysine after reduction and acid hydrolysis [22].
evidenced by a predominant GCMS signal at m/z 258 (Fig. 2), which Based on the results of this study and data from the literature
corresponds to [2H]DHN (HNE reduced with NaB2H4) released after [31,32,38], we also reasoned that the protein amino acid residues that
treatment of incubation solutions with Raney nickel. In contrast, to the bind HNE through a carbon–nitrogen linkage are likely to be
best of our knowledge, the possibility of carbon–nitrogen cleavage with histidine and/or lysine. Most probably, our method detects all
Raney nickel has been reported only by Keefer and Lunn [27], although histidine-bound HNE, because these are exclusively Michael-type
this was not specifically examined for HNE-P. In the present study, we adducts. However, lysine residues can react with HNE to form both
have tested this possibility using HNE incubated with poly- L-lysine and Michael adducts (eg, albumin lysine residues 199 and 525) and Schiff
poly- L-histidine. The GCMS analysis of samples from incubations of bases (albumin lysine residues 195, 199, and 525) [38], which are not
poly- L-lysine (Fig. 3A) or poly-L-histidine (Fig. 3B) with HNE exhibited detected by our GCMS assay.
a predominant GCMS signal at m/z 257 corresponding to unlabeled
DHN (Fig. 1, structure B) rather than the expected signal at m/z 258 Differential reactivity of sulfur- and nitrogen-bound HNE to
corresponding to [2H]DHN (Fig. 1, structure A). Furthermore the treatment with NaB2H4 and Raney nickel
incubations with poly-L-lysine or poly-L-histidine and [2H3]HNE led to a
GCMS signal that was increased by 3 mass units (Figs. 4A and B). From Replacing H2O with 2H2O during Raney nickel treatment of poly-
these results, we concluded that the ions at m/z 257 in Figs. 3A and B, L-lysineor poly-L-histidine, which had been incubated with HNE and
but at m/z 260 in Figs. 4A and B had to come from unlabeled or 2H3- reduced with NaB2H4, induced a shift in the MS signal from m/z 257
labeled HNE, respectively. to m/z 258, corresponding to [2H]DHN (Fig. 5). These data can be
Additional support for the notion that our GCMS method detects related to similar observations made with sugars under treatment
nitrogen-bound HNE is provided by our finding that our GCMS data with Raney
concur with those obtained from the analysis of incubations of PAA/
ARTICLE IN PRESS
10 J.-F. Lesgards et al. / Free Radical Biology & Medicine xxx (2009) xxx–xxx

nickel incubated in 2H2O [39,40], which is known as the Koch–Stuart


Conclusion
procedure. The authors describe the exchange of deuterium for hy-
drogen atoms that are bound to carbon atoms carrying free hydroxyl
The results from this study demonstrate that Raney nickel treat-
groups. This may also occur while reduced HNE is tied to the metal
ment cleaves not only Michael adducts of HNE and cysteine
surface through the N atom, following the sequence of reactions
residues, but also nitrogen-bound HNE, most probably through
proposed in Fig. 6. The longer residence time on the catalyst would
histidine and lysine residues. More importantly, additional data
explain our finding that the exchange occurs only for lysine and
demonstrate that the parallel processing of blood and plasma
histidine, not for cysteine.
samples with or without DNPH combined with Raney nickel
treatment enables one to discriminate and quantify with precision
Experiments with biologically relevant samples
the levels of these various HNE-P species in blood and plasma
samples, which amount to 0.15 to
Our results have shown that when the HNE-to-albumin ratio
2.9 nmol/mg protein or 10–600 nM. Interestingly, we found that,
increases from 1/60 (10 μM HNE +600 μM albumin) to 60 (2 mM HNE
whereas normal rat blood samples contained cysteine-bound HNE-
+ 30 μM albumin), the GCMS signal at m/z 257 was doubled (Fig. 7).
P, significant levels of nitrogen-bound HNE-P were detected only in
The former incubation conditions are similar to the albumin
plasma. It is noteworthy that the distribution profile of all these
concentration in plasma and the HNE concentration during acute
species in plasma differed from that observed when physiologically
oxidative stress conditions and the corresponding results are consis-
relevant concentrations of albumin and HNE were incubated in
tent with the finding of Aldini et al. [31,38] that cysteine at position 34
vitro. Finally, our finding of a significant level of DHN-P in blood and
of albumin is the most reactive site for binding of HNE, followed by
plasma suggests the existence of a detoximficeacthioannism in situ
lysine 1999 and histidine 146. However, the latter incubation conditions
for
are similar to those used by Szapacs et al. [32], who found that HNE was
HNE-P, which seems to be impaired in hypercholesterolemic
adducted with histidine (H) and lysine (K) in the following order of
rabbits. Additional investigations are needed to evaluate the impact
reactivity: H242 N H510 N H67 N H367 N H247 N K233. Accordingly,
of age and disease on the levels of the various HNE-P molecular
our results concur with the notion that binding of HNE to histidine
species as well as that of DHN-P.
and/or lysine residues becomes more important when the HNE
concentration is severalfold in excess over that of albumin. This may
explain why in the recent study by Roe et al., histidine adducts AcknowledgThents
predominated when 1 mg protein from yeast whole cell extracts was
incubated with 250 μM to 5 mM HNE [41]. We are very thankful to Dr. Lawrence Sayre for helpful
More importantly, the results of this study substantiate the con- discussions. This work was presented at the Meeting of the HNE
centration and distribution of the various HNE-P species in blood and Club held in Genoa, Italy, in June 2006. This study was supported by
plasma samples using DNPH, a reagent that shows great reactivity the Canadian Institutes of Health Research (CIHR Grant 10816 to
toward carbonyl groups, as illustrated in Fig. 9. Specifically, treatment CDR) and the Montreal Heart Institute Research Foundation.
of whole blood samples with excess DNPH abolished completely the
signal at m/z 258 corresponding to [H2]DHN (arising from HNE bound References
to protein thiols treated with NaB2H4) (Fig. 11A). In contrast, the signal
[1] Poli, G.; Schaur, RJ; Siems, WG; Leonarduzzi, G. 4-Hydroxynonenal: a membrane
observed at m/z 257 in plasma and whole blood samples was quenched
lipid oxidation product of medicinal interest. Med. Res. Rev. 28: 569–631; 2008.
differently by DNPH treatment. In fact, it was unaffected in whole blood [2] Benedetti, A.; Comporti, M.; Esterbauer, H. Identification of 4-hydroxynonenal as a
(Fig. 11B), indicating that it arises exclusively from DHN bound to cytotoxic product originating from the peroxidation of liver microsomal lipids.
protein thiols, but was decreased by ∼ 60% in plasma (Fig. 11D). This Biochim. Biofisika. Acta 620:281–296; 1980.
[3] Mlakar, A.; Spiteller, G. Previously unknown aldehydic lipid peroxidation compounds
signal loss is attributed to HNE-P via nitrogen residues. Circulating
of arachidonic acid. Chem. Phys. Lipids 79:47–53; 1996.
levels of all these various adducts in plasma and blood ranged between [4] Doorn, JA; Petersen, DR Covalent modification of amino acid nucleophiles by the
0.15 and 2.9 pmol/mg protein, which is equivalent to 10 and 600 nM. lipid peroxidation products 4-hydroxy-2-nonenal and 4-oxo-2-nonenal. Chem. Res.
These values are similar to those reported for HNE- modified albumin in Toksikol. 15:1445–1450; 2002.
[5] Carini, M.; Aldini, G.; Facino, RM Mass spectrometry for detection of 4-hydroxy-
human subjects using a specific monoclonal antibody against histidine– trans-2-nonenal (HNE) adducts with peptides and proteins. Mass Spectrom. Rev. 23:
HNE adducts plus an antibody against human serum albumin (611 nM) 281–305; 2004.
[14], which implied that ∼ 0.1% of circulating albumin was modified by [6] Uchida, K. Role of reactive aldehyde in cardiovascular diseases. Radic Gratis. Biol.
Med. 28:1685–1696; 2000.
HNE. [7] Benderdour, M.; Charron, G.; DeBlois, D.; Comte, B.; Des Rosiers, C. Cardiac
Our finding of a significant level of DHN-P in both plasma and blood mitochon- drial NADP +-isocitrate dehydrogenase is inactivated through 4-
raises the possibility that cysteine-bound HNE-P is detoxified to some hydroxynonenal adduct formation: an event that precedes hypertrophy development.
J. Biol. Chem. 278:45154–45159; 2003.
extent in situ. Furthermore, the discrepancy between our findings with
[8] Grimsrud, PA; Picklo Sr., MJ; Griffin, TJ; Bernlohr, DA Carbonylation of adipose
plasma proteins (almost exclusively nitrogen-bound HNE and cyste- proteins in obesity and insulin resistance: identification of adipocyte fatty acid-
ine-bound DHN), which consist predominantly of albumin, and those binding protein as a cellular target of 4-hydroxynonenal. Mol. Sel. Proteomics 6:624–
from in vitro incubations of physiological concentrations of albumin and 637; 2007.
[9] Uchida, K. 4-Hydroxy-2-nonenal: a product and mediator of oxidative stress. Prog.
HNE (80 and 20% of cysteine- and nitrogen-bound HNE, respec- tively) Lipid Res. 42:318–343; 2003.
suggests the existence of an enzymatic mechanism in situ (that is absent [10] Uchida, K.; Itakura, K.; Kawakishi, S.; Hiai, H.; Toyokuni, S.; Stadtman, ER Charac-
from the in vitro incubation) [42–45]. For example, ery- throcytes are terization of epitopes recognized by 4-hydroxy-2-nonenal specific antibodies.
Lengkungan. Biochem. Biofisika. 324:241–248; 1995.
well known to efficiently metabolize free HNE to GSH conjugates and 4- [11] Yoritaka, A.; Hattori, N.; Uchida, K.; Tanaka, M.; Stadtman, ER; Mizuno, Y.
hydroxynonanoic acid [45], whereas aldose reduc- tase has been shown Immunohistochemical detection of 4-hydroxynonenal protein adducts in Parkin- son
to reduce GSH-bound HNE to its dihydroxy derivative [33]. However, disease. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:2696–2701; 1996.
further investigations are needed to substantiate the detoxification role [12] Traverso, N.; Menini, S.; Cosso, L.; Odetti, P.; Albano, E.; Pronzato, MA; Marinari,
UM Immunological evidence for increased oxidative stress in diabetic rats.
of this enzyme, particularly toward HNE-P. This appears warranted Diabetologia 41:265–270; 1998.
given that in plasma proteins from hypercholesterolemic rabbits, there [13] Moreau, R.; Nguyen, BT; Doneanu, CE; Hagen, TM Reversal by aminogua- nidine of
seems to be a selective increase in the level of nitrogen-bound HNE, the age-related increase in glycoxidation and lipoxidation in the cardio- vascular
system of Fischer 344 rats. Biochem. Pharmacol. 69:29–40; 2005.
whereas that of DHN-P remains unchanged, suggesting impaired [14] Toyokuni, S.; Yamada, S.; Kashima, M.; Ihara, Y.; Yamada, Y.; Tanaka, T.; Hiai, H.;
detoxification. Seino, Y.; Uchida, K. Serum 4-hydroxy-2-nonenal-modified albumin is elevated in
patients with type 2 diabetes mellitus. Antioxid. Redox Signal. 2:681–685; 2000.
[15] Kimura, H.; Liu, S.; Yamada, S.; Uchida, K.; Matsumoto, K.; Mukaida, M.; Yoshida,
K. Rapid increase in serum lipid peroxide 4-hydroxynonenal (HNE) through
ARTICLE IN PRESS
J.-F. Lesgards et al. / Free Radical Biology & Medicine xxx (2009) xxx–xxx 11
[30] Des Rosiers, C.; Rivest, MJ; Boily, MJ; Jette, M.; Carrobe-Cohen, A.; Kumar, A. Gas
chromatographic–mass spectrometric assay of tissue malondialdehyde, 4-
monocyte NADPH oxidase in early endo-toxemia. Radic Gratis. Res. 39:845–851; 2005.
hydroxynonenal, and other aldehydes after their reduction to stable alcohols. Anal.
[16] Alderton, AL; Faustman, C.; Liebler, DC; Hill, DW Induction of redox instability of
Biochem. 208:161–170; 1993.
bovine myoglobin by adduction with 4-hydroxy-2-nonenal. Biochemistry 42: 4398–
[31] Aldini, G.; Gamberoni, L.; Orioli, M.; Beretta, G.; Regazzoni, L.; Maffei, FR; Carini,
4405; 2003.
M. Mass spectrometric characterization of covalent modification of human serum
[17] Orioli, M.; Aldini, G.; Beretta, G.; Facino, RM; Carini, M. LC-ESI-MS/MS determination
of 4-hydroxy-trans-2-nonenal Michael adducts with cysteine and histidine-containing albumin by 4-hydroxy-trans-2-nonenal. J. Mass Spectrom. 41:1149–1161; 2006.
peptides as early markers of oxidative stress in excitable tissues. J. Chromatogr. B Anal. [32] Szapacs, ME; Riggins, JN; Zimmerman, LJ; Liebler, DC Covalent adduction of human
serum albumin by 4-hydroxy-2-nonenal: kinetic analysis of competing alkylation
Technol. Biomed. Life Sci. 827:109–118; 2005.
[18] Han, B.; Stevens, JF; Maier, CS Design, synthesis, and application of a hydrazide- reactions. Biochemistry 45:10521–10528; 2006.
[33] Oppermann, U. Carbonyl reductases: the complex relationships of mammalian
functionalized isotope-coded affinity tag for the quantification of oxylipid– protein
carbonyl- and quinone-reducing enzymes and their role in physiology. Annu. Rev.
conjugates. Anal. Chem. 79:3342–3354; 2007.
Pharmacol. Toksikol. 47:293–322; 2007.
[19] Grimsrud, PA; Xie, H.; Griffin, TJ; Bernlohr, DA Oxidative stress and covalent
[34] Ong, WY; Jenner, AM; Pan, N.; Ong, CN; Halliwell, B. Elevated oxidative stress, iron
modification of protein with bioactive aldehydes. J. Biol. Chem 283:21837–21841; 2008.
accumulation around microvessels and increased 4-hydroxynonenal immu- nostaining
[20] Selley, ML Determination of the lipid peroxidation product (E)-4-hydroxy-2- nonenal in
in zone 1 of the liver acinus in hypercholesterolemic rabbits. Radic Gratis. Res. 43:241–
clinical samples by gas chromatography–negative-ion chemical ioni- sation mass
249; 2009.
spectrometry of the O-pentafluorobenzyl oxime. J. Chromatogr. B Biomed. Sci. Appl.
[35] Petersen, DR; Doorn, JA Reactions of 4-hydroxynonenal with proteins and cellular
691:263–268; 1997.
targets. Radic Gratis. Biol. Med. 37:937–945; 2004.
[21] Spies-Martin, D.; Sommerburg, O.; Langhans, CD; Leichsenring, M. Measurement of 4-
[36] Nadkarni, DV; Sayre, LM Structural definition of early lysine and histidine adduction
hydroxynonenal in small volume blood plasma samples: modification of a gas
chemistry of 4-hydroxynonenal. Chem. Res. Toksikol. 8:284–291; 1995.
chromatographic–mass spectrometric method for clinical settings.
[37] Sayre, LM; Lin, D.; Yuan, Q.; Zhu, X.; Tang, X. Protein adducts generated from
J.Chromatogr. B Anal. Technol. Biomed. Life Sci. 774:231–239; 2002.
products of lipid oxidation: focus on HNE and ONE. Drug Metab. Rev. 38:651–675;
[22] Requena, JR; Fu, MX; Ahmed, MU; Jenkins, AJ; Lyons, TJ; Baynes, JW; Thorpe, SR
2006.
Quantification of malondialdehyde and 4-hydroxynonenal adducts to lysine residues in
[38] Aldini, G.; Vistoli, G.; Regazzoni, L.; Gamberoni, L.; Facino, RM; Yamaguchi, S.;
native and oxidized human low-density lipoprotein. Biochem. J. 322 (Pt. 1):317–325;
Uchida, K.; Carini, M. Albumin is the main nucleophilic target of human plasma: a
1997.
protective role against pro-atherogenic electrophilic reactive carbonyl species? Chem.
[23] Asselin, C.; Bouchard, B.; Tardif, JC; Des Rosiers, C. Circulating 4-hydroxynonenal –
Res. Toksikol. 21:824–835; 2008.
protein thioether adducts assessed by gas chromatography–mass spectrometry are [39] Angyal, SJ; Stevens, JD; Odier, L. Selective deuteration over Raney nickel in deuterium
increased with disease progression and aging in spontaneously hypertensive rats. Radic
oxide:1,6-anhydrohexoses. Karbohidrat Res. 169:151–157; 1987.
Gratis. Biol. Med. 41:97–105; 2006.
[40] Djedaini, F.; Desalos, J.; Perly, B. Regio- and stereo-selective deuterium labelling of
[24] Veronneau, M.; Comte, B.; Des Rosiers, C. Quantitative gas chromatographic –mass β-cyclodextrin. J. Labelled Compd. Radiopharm. 28:785–791; 1990.
spectrometric assay of 4-hydroxynonenal bound to thiol proteins in ischemic/ reperfused [41] Roe, MR; Xie, H.; Bandhakavi, S.; Griffin, TJ Proteomic mapping of 4- hydroxynonenal
rat hearts. Radic Gratis. Biol. Med. 33:1380–1388; 2002. protein modification sites by solid-phase hydrazide chemistry and mass spectrometry.
[25] Rilling, HC; Bruenger, E.; Epstein, WW; Kandutsch, AA Prenylated proteins: Anal. Chem. 79:3747–3756; 2007.
demonstration of a thioether linkage to cysteine of proteins. Biochem. Biofisika. Res. [42] Ohara, H.; Miyabe, Y.; Deyashiki, Y.; Matsuura, K.; Hara, A. Reduction of drug ketones
Komunike. 163:143–148; 1989. by dihydrodiol dehydrogenases, carbonyl reductase and aldehyde reductase of human
[26] Uchida, K.; Stadtman, ER Selective cleavage of thioether linkage in proteins modified liver. Biochem. Pharmacol. 50:221–227; 1995.
with 4-hydroxynonenal. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:5611–5615; 1992. [43] O'Connor, T.; Ireland, LS; Harrison, DJ; Hayes, JD Major differences exist in the
[27] Keefer, LK; Lunn, G. Nickel–aluminum alloy as a reducing agent. Chem. Rev. 89: function and tissue-specific expression of human aflatoxin B1 aldehyde reductase and
459–502; 1989. the principal human aldo-keto reductase AKR1 family members. Biochem. J. 343 (Pt.
[28] Uchida, K.; Kanematsu, M.; Sakai, K.; Matsuda, T.; Hattori, N.; Mizuno, Y.; Suzuki, D.; 2):487–504; 1999.
Miyata, T.; Noguchi, N.; Niki, E.; Osawa, T. Protein-bound acrolein: potential markers [44] Luckey, SW; Petersen, DR Metabolism of 4-hydroxynonenal by rat Kupffer cells.
for oxidative stress. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:4882–4887; 1998. Lengkungan. Biochem. Biofisika. 389:77–83; 2001.
[29] Busseuil, D.; Shi, Y .; Mecteau, M.; Brand, G.; Kernaleguen, AE; Thorin, E.; Latour, [45] Srivastava, S.; Dixit, BL; Cai, J.; Sharma, S.; Hurst, HE; Bhatnagar, A.; Srivastava,
J. G.; Rheaume, E.; Tardif, JC Regression of aortic valve stenosis by ApoA-I mimetic SK Metabolism of lipid peroxidation product, 4-hydroxynonenal (HNE) in rat
peptide infusions in rabbits. Br. J. Pharmacol. 154:765–773; 2008. erythrocytes: role of aldose reductase. Radic Gratis. Biol. Med. 29:642–651; 2000.
Please cite this article as: Lesgards, J.-F.; et al., Differential distribution of 4-hydroxynonenal adducts to sulfur and nitrogen residues in blood
proteins as revealed using Raney nickel and gas..., Free Radic. Biol. Med. (2009), doi:10.1016/j.freeradbiomed.2009.08.002
View publication stats