Elsa Rahmi-FKIK PDF

UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA
Validasi Metode Analisis N-(hidroksietil)-p-metoksi

sinamamida dalam Plasma secara In Vitro menggunakan
Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT)
SKRIPSI
Farmasi
ELSA RAHMI
1112102000034
FAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU KESEHATAN

PROGRAM STUDI FARMASI
JAKARTA
JULI 2016
UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA
Validasi Metode Analisis N-(hidroksietil)-p-metoksi

Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT)
SKRIPSI
Diajukan sebagai salah satu syarat memperoleh gelar Sarjana Farmasi
ELSA RAHMI
1112102000034
FAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU KESEHATAN

PROGRAM STUDI FARMASI
JAKARTA
JULI 2016
i
ABSTRAK
Nama : Elsa Rahmi

NIM : 1112102000034
Program Studi : Farmasi
Judul Skripsi : Validasi Metode Analisis N-(hidroksietil)-p-metoksi
Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT).
N-(hidroksietil)-p-metoksi sinamamida merupakan senyawa hasil modifikasi etil

p-metoksisinamat melalui reaksi amidasi dengan menggunakan etanolamin.
Substitusi gugus ester pada etil p-metoksisinamat menjadi bentuk amida terbukti
meningkatkan aktifitas antiinflamasi. Kadar N-(hidroksietil)-p-metoksi
sinamamida perlu diukur dan dipantau, sehingga keamanan, dosis dan efikasi dari
penggunaan N-(hidroksietil)-p-metoksi sinamamida sebagai agen antiinflamasi
dapat dipastikan. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk memperoleh kondisi
optimum dan metode bioanalisis yang tervalidasi untuk analisis N-(hidroksietil)-
p-metoksi sinamamida dalam plasma secara in vitro menggunakan KCKT dengan
Diode Array Detector (DAD). N-(hidroksietil)-p-metoksi sinamamida diekstraksi
dari plasma dengan metode pengendapan protein menggunakan metanol. Metanol
ditambahkan ke dalam plasma dengan perbandingan metanol-plasma 4:1
kemudian divortex selama 20 detik dan disentrifugasi selama 10 menit dengan
kecepatan 3000 rpm. Sistem kromatografi terdiri dari kolom Dionex C18 (150 x
4,6 mm, 3 µm) dengan fase gerak metanol-akuabides perbandingan 40:60 dengan
laju alir 1,0 mL/menit. Senyawa dideteksi pada panjang gelombang 290 nm. Pada
rentang konsentrasi 5,04 − 40,32 µL dihasilkan kurva kalibrasi yang linier dengan
nilai koefisien korelasi (r) sebesar 0,9962. Nilai akurasi (% diff) dari metode ini
berada diantara -1,813% sampai 11,954% dengan nilai presisi (KV) antara
0,439% sampai 3,895% dan uji perolehan kembali antara 98,187% sampai
111,954%.
Kata kunci: Kromatografi Cair Kinerja Tinggi, N-(hidroksietil)-p-metoksi

sinamamida, pengendapan protein plasma, validasi metode.
v
ABSTRACT
Name : Elsa Rahmi

Study Program : Farmasi
Title : Validation of Analytical Method of N-(hydroxyethyl)-p-
methoxycinnamamide in Plasma In Vitro by High
Performance Liquid Chromatography (HPLC).
N-(hydroxyethyl)-p-methoxycinnamamide is a modified compound of ethyl p

methoxycinnamate (EPMC) through amidation reaction using ethanolamine.
Substitution of the ester of EPMC to amide can increase the anti-inflammatory
activity. The level of N-(hydroxyethyl)-p-methoxycinnamamide in the plasma
needs to be quantified and monitored so that the safety, dosage, and efficacy of
the use of N-(hydroxyethyl)-p-methoxycinnamamide as an anti-inflammatory
agent can be ascertained. The aim of this study was to obtain the optimum
conditions and validates methods for analysis of N-(hydroxyethyl)-p-
methoxycinnamamide in plasma in vitro using HPLC with Diode Array Detector
(DAD). N-(hydroxyethyl)-p-methoxycinnamamide was extracted from plasma by
protein deproteination using methanol. Chromatographic system consisted of a
Dionex C18 column (150 x 4,6 mm, 3 µm) with an isocratic mobile phase of the
methanol-aquabidest ratio of 40:60 with a flow rate of 1,0 mL/min. Samples were
detected at a wavelength of 290 nm. Linearity was established for range
concentration of 5,04 − 40,32 µL with a correlation coefficient (r) of 0,9962.
Accuracy (% diff) of this method is between -1,813% to 11,954% with precision
(CV) between 0,439% to 3,895% and test recovery between 98,187% to
111,954%.
Keyword: High Performance Liquid Chromatography, method validation, N-

(hydroxyethyl)-p-metoxycinnamamide, plasma protein deproteination.
vi
KATA PENGANTAR
Puji syukur saya ucapkan kehadirat Allah SWT, yang telah memberikan
rahmat, karunia serta nikmat iman dan islam yang tak terhingga, Shalawat serta
salam kepada Nabi Muhammad SAW. Syukur atas limpahan nikmat dan kasih
sayang-Nya, sehingga penulis dapat menyelesaikan penyusunan skripsi yang
berjudul “Validasi Metode Analisis N-(hidroksietil)-p-metoksi sinamamida dalam
Plasma secara In Vitro menggunakan Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT).”
bertujuan guna memperoleh gelar Sarjana Farmasi pada Fakultas Kedokteran dan
Ilmu Kesehatan Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah Jakarta.
Pada penyelesaian penelitian dan penyusunan skripsi ini, penulis mendapat
bantuan dari berbagai pihak. Oleh karena itu, penulis ingin mengucapkan rasa
terima kasih kepada semua pihak yang telah membantu dan mengarahkan, yaitu
kepada :
1. Kedua orang tua, ibunda tersayang Elmi dan ayahanda Guslimar, yang selalu
memberikan kasih sayang, doa yang tak pernah putus, semangat serta
dukungan baik moril dan materil.
2. Bapak Supandi, M.Si.,Apt selaku pembimbing I dan Ibu Ismiarni Komala,
M.Sc., Ph.D., Apt selaku pembimbing II, yang telah meluangkan waktu,
tenaga dan pikiran serta dengan sabar membimbing dan memberikan saran
sehingga penulis dapat menyelesaikan skripsi ini.
3. Dr. H. Arif Sumantri, SKM, M.Kes, selaku Dekan Fakultas Kedokteran dan
Ilmu Kesehatan Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah Jakarta.
4. Ibu Dr.Nurmeilis, M.si.,Apt selaku Ketua Program Studi Farmasi Fakultas
Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah
Jakarta.
5. Ibu/Bapak Dosen Program Studi Farmasi Fakultas Kedokteran dan Ilmu
Kesehatan Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah Jakarta atas ilmu dan
pengetahuan selama penulis menempuh pendidikan.
6. Kakak-kakak laboran: Mbak Rani, Kak Eris, Kak Anis, Kak Walid, Kak
Yaenab, Kak Lisna, Mbak Ai, Kak Rahmadi, dan Kak Tiwi, yang telah selalu
vii
DAFTAR ISI
Halaman
HALAMAN JUDUL ..................................................................................... i
HALAMAN PERNYATAAN ORISINALITAS ........................................ ii
HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING ......................................... iii
HALAMAN PENGESAHAN SKRIPSI ...................................................... iv
ABSTRAK ..................................................................................................... v
ABSTRACT ................................................................................................... vi
KATA PENGANTAR ................................................................................... vii
HALAMAN PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI .................. ix
DAFTAR ISI .................................................................................................. x
DAFTAR TABEL ......................................................................................... xiii
DAFTAR GAMBAR ..................................................................................... xiv
DAFTAR LAMPIRAN ................................................................................. xv
BAB I PENDAHULUAN ......................................................................... 1

1.1. Latar Belakang ........................................................................ 1
1.2. Perumusan Masalah ................................................................ 2
1.3. Tujuan Penelitian .................................................................... 3
1.4.Manfaat Penelitian ................................................................... 3
BAB II TINJAUAN PUSTAKA ................................................................. 4

2.1 N-(hidroksietil)-p-metoksi sinamamida .................................. 4
2.2 Plasma ...................................................................................... 5
2.3. Analisis Obat dalam Plasma .................................................... 6
2.4 Kromatografi Cair Kinerja Tinggi ............................................ 8
2.4.1 Teori Dasar KCKT ......................................................... 8
2.4.2 Instrumentasi .................................................................. 10
2.4.2.1 Wadah Fase Gerak pada KCKT ......................... 10
2.4.2.2 Fase Gerak pada KCKT ...................................... 11
2.4.2.3 Pompa pada KCKT ............................................ 11
2.4.2.4 Penyuntikan Sampel pada KCKT ...................... 11
2.4.2.5 Kolom pada KCKT ............................................ 12
2.4.2.6 Fase Diam pada KCKT ...................................... 12
2.4.2.7 Detektor .............................................................. 13
2.4.2.8 Komputer, Integrator, atau Rekorder ................. 15
2.5 Uji Kesesuaian Sistem .............................................................. 15
2.6 Validasi Metode Analisis .......................................................... 16
2.6.1 Tipe dan Tingkatan Validasi .......................................... 17
2.6.1.1Validasi Lengkap ................................................ 17
2.6.1.2 Validasi Parsial ................................................... 17
2.6.1.3 Validasi Silang ................................................... 18
2.6.2 Pengembangan Metode Bioanalisis ............................... 18
2.6.2.1Selektivitas .......................................................... 19
2.6.2.2 Kurva Kalibrasi .................................................. 19
x
2.6.2.3 Batas Deteksi ....................................................... 20
2.6.2.4 Batas Kuantifikasi .............................................. 20
2.6.2.5 Akurasi ............................................................... 21
2.6.2.6 Presisi ................................................................ 21
2.6.2.7 Perolehan Kembali ............................................ 22
2.6.2.8 Stabilitas ............................................................. 22
BAB III METODE PENELITIAN ............................................................ 25

3.1 Tempat dan Waktu Penelitian................................................... 25
3.2 Alat dan Bahan ......................................................................... 25
3.2.1 Alat ................................................................................ 25
3.2.2 Bahan ............................................................................ 25
3.3 Prosedur Kerja .......................................................................... 26
3.3.1 Pembuatan Larutan Induk N-(hidroksietil)-p-metoksi
sinamamida konsentrasi 1000 µg/mL .......................... 26
3.3.2 Pembuatan Fase Gerak ................................................ 26
3.3.3 Penentapan Panjang Gelombang Analisis ................... 26
3.3.4 Optimasi Kondisi Analisis ........................................... 27
3.3.4.1 Pemilihan Komposisi Fase Gerak .................... 27
3.3.5 Uji Kesesuaian Sistem ................................................. 27
3.3.6 Penetapan Metode Ekstraksi ....................................... 27
3.3.7 Validasi Metode Bioanalisis N-(hidroksietil)-p-
metoksi sinamamida dalam Plasma secara in vitro ..... 28
3.3.7.1 Pengukuran Batas Kuantitasi Terendah
(LLOQ) .......................................................... 28
3.3.7.2 Pembuatan Kurva Kalibrasi dan Uji
Linearitas dalam Plasma secara in vitro ........ 28
3.3.7.3 Uji Selektivitas ............................................... 29
3.3.7.4 Uji Akurasi, Presisi dan Perolehan Kembali .. 29
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN ..................................................... 31

4.1 Penetapan Panjang Gelombang Analisis ................................. 31
4.2 Optimasi Kondisi analisis ........................................................ 31
4.2.1 Pemilihan Komposisi Fase Gerak ................................. 31
4.3 Uji Kesesuaian Sistem ............................................................. 34
4.4 Penetapan Metode Ekstraksi .................................................... 36
4.5 Validasi Metode Analisis N-(hidroksietil)-p-metoksi
sinamamida dalam Plasma secara In Vitro ............................... 38
4.5.1 Pengukuran Batas Kuantifikasi Terendah (LLOQ) ........ 38
4.5.2 Pembuatan Kurva Kalibrasi dan Uji Linieritas dalam
Plasma secara In Vitro..................................................... 38
4.5.3 Uji Selektivitas ............................................................... 39
4.5.4 Uji Akurasi, Presisi, dan Perolehan Kembali ................. 40
xi
BAB V KESIMPULAN DAN SARAN ..................................................... 42
5.1 Kesimpulan ............................................................................... 42
5.2 Saran ......................................................................................... 42
DAFTAR PUSTAKA .................................................................................... 43
xii
DAFTAR TABEL
Tabel 3.1 Komposisi Fase Gerak ............................................................... 26

Tabel 4.1 Data hubungan antara waktu retensi, jumlah lempeng teoritis
dan asimetrisitas terhadap perubahan komposisi fase gerak ..... 34
Tabel 4.2 Hasil uji rata-rata kesesuaian sistem .......................................... 35
Tabel 4.3 Hasil optimasi metode ekstraksi N-(hidroksietil)-p-metoksi
sinamamida dalam plasma .......................................................... 37
Tabel 4.4 Hasil uji akurasi, presisi dan perolehan kembali hari ke-1 ........ 41
Tabel 5.1 Data hasil uji kesesuaian sistem ................................................. 50
Tabel 5.2 Data pengukuran kurva kalibrasi N-(hidroksietil)-p-metoksi
sinamamida dalam plasma untuk penentuan LLOQ ................... 51
Tabel 5.3 Data kurva kalibrasi N-(hidroksietil)-p-metoksi sinamamida
dalam plasma ............................................................................. 52
Tabel 5.4 Data uji selektivitas N-(hidroksietil)-p-metoksi sinamamida
dalam plasma .............................................................................. 54
Tabel 5.5 Data uji akurasi, perolehan kembali (%recovery), dan presisi
N-(hidroksietil)-p-metoksi sinamamida dalam plasma, Hari ke-
1 ................................................................................................. 55
Tabel 5.6 Data uji akurasi, perolehan kembali (%recovery), dan presisi
N-(hidroksietil)-p-metoksi sinamamida dalam plasma, Hari ke-
2 ................................................................................................. 55
Tabel 5.7 Rumus-Rumus ........................................................................... 56
xiii
DAFTAR GAMBAR
Halaman
Gambar 2.1 Struktur kimia N-(hidroksietil)-p-metoksi sinamamida ........... 4

Gambar 2.2 Diagram Alat dan Komponen KCKT ...................................... 10
Gambar 4.1 Kromatogram N-(hidroksietil)-p-metoksi sinamamida
menggunakan fase gerak metanol 100% ................................. 32
menggunakan fase gerak metanol : akubides (70:30) .............. 32
menggunakan fase gerak metanol : akuabides (60:40)............. 32
menggunakan fase gerak metanol : akuabides (40:60)............. 33
Gambar 4.5 Kromatogram plasma blangko dengan perbandingan metanol
- plasma (1:1) ........................................................................... 37
Gambar 4.6 Kromatogram N-(hidroksietil)-p-metoksi sinamamida dalam
plasma dengan perbandingan metanol - plasma (1:1) ............. 37
Gambar 4.7 Kromatogram plasma blangko dengan perbandingan metanol
- plasma (4:1) ........................................................................... 37
plasma dengan perbandingan metanol - plasma (4:1) ............. 37
Gambar 4.9 Kurva Kalibrasi N-(hidroksietil)-p-metoksi sinamamida
dalam plasma ........................................................................... 39
Gambar 5.1 Spektrum serapan N-(hidroksietil)-p-metoksi sinamamida
pada spektofotometer UV-Vis ................................................. 48
Gambar 5.2 Kromatogram N-(hidroksietil)-p-metoksi sinamamida ............ 49
Gambar 5.3 Kromatogram Plasma Blangko................................................. 49
plasma ...................................................................................... 49
dalam plasma ........................................................................... 51
dalam plasma ........................................................................... 52
Gambar 5.7 Alat Kromatografi Cair Kinerja Tinggi Dionex Ultimate®
3000 ......................................................................................... 57
Gambar 5.8 Kolom KCKT .......................................................................... 58
Gambar 5.9 Plasma ...................................................................................... 58
Gambar 5.10 Pot penyimpanan sampel ......................................................... 58
Gambar 5.11 Vial penyuntikan KCKT .......................................................... 58
Gambar 5.12 Plasma mengandung senyawa untuk disentrifugasi ................ 58
Gambar 5.13 Penyaring fase gerak ................................................................ 58
Gambar 5.14 Sonikator .................................................................................. 58
Gambar 5.15 Sentrifus ................................................................................... 58
xiv
DAFTAR LAMPIRAN
Lampiran 1 Alur penelitian ......................................................................... 46

Lampiran 2 Perhitungan pembuatan larutan ............................................... 47
Lampiran 3 Spektrum serapan N-(hidroksietil)-p-metoksi sinamamida
pada spektrofotometer UV-Vis ................................................ 48
Lampiran 4 Kromatogram Hasil Analisis ................................................... 49
Lampiran 5 Uji kesesuaian sistem .............................................................. 50
Lampiran 6 Pengukuran Batas Kuantifikasi Terendah (LLOQ) ................. 51
Lampiran 7 Hasil pengukuran kurva kalibrasi N-(hidroksietil)-p-metoksi
sinamamida dalam plasma ....................................................... 52
Lampiran 8 Uji selektivitas N-(hidroksietil)-p-metoksi sinamamida dalam
plasma ...................................................................................... 54
Lampiran 9 Uji akurasi dan presisi N-(hidroksietil)-p-metoksi
sinamamida dalam plasma ....................................................... 55
Lampiran 10 Rumus-rumus .......................................................................... 56
Lampiran 11 Alat Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) .................... 57
Lampiran 12 Dokumentasi Penelitian ........................................................... 58
xv
BAB I
PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang

Etil p-metoksisinamat (EPMS) memiliki potensi yang besar sebagai
dasar sintesis untuk turunan sinamat karena memiliki gugus fungsi ester
yang sangat reaktif sehingga mudah ditransformasikan dengan gugus fungsi
lainnya seperti gugus amina (Barus, 2009). N-(hidroksietil)-p-metoksi
sinamamida merupakan hasil modifikasi etil p-metoksisinamat melalui
reaksi amidasi dengan etanolamin. Penelitian sebelumnya yang dilakukan
oleh Muhammad Reza (2015), telah melaporkan mengenai hubungan
struktur aktivitas hasil modifikasi EPMS terhadap aktivitas anti-inflamasi
melalui reaksi amidasi dengan etanolamin menunjukkan bahwa
penambahahan gugus amida terbukti meningkatkan aktivitas anti-inflamasi.
Peningkatan aktifitas tersebut mejadikan N-(hidroksietil)-p-metoksi
sinamamida ini layak untuk dikembangkan lebih lanjut serta bisa menjadi
agen terapi yang menjanjikan (kandidat obat) karena aktifitas yang
dimilikinya.
Setelah diperoleh kandidat obat, maka selanjutnya kandidat obat
tersebut akan melalui serangkaian uji yang memakan waktu yang panjang
dan biaya yang tidak sedikit sebelum diresmikan sebagai obat oleh Badan
pemberi izin. Uji yang harus ditempuh oleh kandidat obat adalah uji
praklinik dan uji klinik. Uji praklinik merupakan persyaratan uji untuk
kandidat obat, dari uji ini diperoleh informasi tentang efikasi (efek
farmakologi), profil farmakokinetik dan toksisitas kandidat obat. Setelah
dinyatakan mempunyai manfaat dan aman pada hewan percobaan, barulah
dapat diujikan pada manusia (uji klinik) (Sukandar, 2006).
Dalam pengembangan obat baru, analisis obat pada matriks biologi
merupakan salah satu tahapan yang penting. Untuk itu diperlukan suatu
metode analisis obat yang terpercaya dalam matriks biologis yang sesuai.
Metode analisis yang selektif dan sensitif untuk penilaian secara kuantitatif
suatu senyawa penting agar dapat dijadikan pedoman untuk uji praklinik
1 UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

2
dan/atau biofarmasetik dan uji farmakologi klinik (Food and Drug

Administration, 2001; Harahap. Y., 2010).
Pengukuran analit dalam matriks biologis harus divalidasi. Validasi
metode bioanalisis mencakup semua prosedur yang menunjukkan bahwa
metode yang digunakan untuk pengukuran kuantitatif analit yang berasal
dalam matriks biologis, seperti darah, plasma, serum, atau urin, dapat
dipercaya dan dapat dilakukan ulang (reproducible) untuk penggunaan yang
diinginkan. Beberapa parameter validasi metode meliputi limit deteksi
(LOD) dan limit kuantifikasi (LOQ), selektivitas, linearitas, akurasi, dan
presisi, stabilitas (Food and Drug Administration, 2001).
Pada penelitian ini, akan dilakukan validasi metode analisis N-
(hidroksietil)-p-metoksi sinamamida dalam plasma secara in vitro
menggunakan Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) dengan detektor
DAD (Diode Array Detector). Analisis kadar senyawa dalam plasma
merupakan hal yang kompleks karena plasma mengandung sejumlah unsur
endogen, sehingga perlu untuk memisahkan analit yang akan dianalisis dari
unsur endogen tersebut (Swarbrick dan Boylan, 1988). Metode ekstraksi
yang digunakan pada penelitian ini adalah metode pengendapan protein
menggunakan metanol. Metode KCKT fase balik dengan menggunakan fase
diam oktadesil silika (ODS atau C18) merupakan metode yang populer
digunakan saat ini untuk menetapkan kadar obat baik dalam bentuk sediaan
atau dalam sampel hayati. Hal ini dikarenakan metode ini bersifat selektif,
memiliki sensitifitas dan spesifisitas yang tinggi, serta sederhana dalam
perlakuannya (Harmita, 2006; Gandjar dan Rohman, 2007).
1.2 Perumusan masalah

a. Bagaimanakah optimasi kondisi analisis N-(hidroksietil)-p-metoksi
sinamamida menggunakan KCKT?
b. Bagaimanakah metode ekstraksi untuk analisis N-(hidroksietil)-p-
metoksi sinamamida dalam plasma secara in vitro menggunakan
KCKT?
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

3
c. Apakah metode analisis N-(hidroksietil)-p-metoksi sinamamida dalam

plasma secara in vitro menggunakan KCKT memiliki nilai validitas
yang sesuai dengan persyaratan?
1.3 Tujuan Penelitian

a. Memperoleh kondisi optimum metode analisis N-(hidroksietil)-p-
metoksi sinamamida menggunakan KCKT.
b. Memperoleh metode ekstraksi untuk analisis N-(hidroksietil)-p-
KCKT.
c. Memperoleh metode yang valid untuk analisis N-(hidroksietil)-p-
KCKT.
1.4 Manfaat Penelitian

Penelitian ini diharapkan mampu mendapatkan metode analisis yang
valid untuk N-(hidroksietil)-p-metoksi sinamamida dalam plasma secara in
vitro menggunakan KCKT.

BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
2.1 N-(hidroksietil)-p-metoksi sinamamida

Struktur kimia :
Gambar 2.1 Struktur kimia N-(hidroksietil)-p-metoksi sinamamida

(Reza, 2015)
Nama kimia : N-(hidroksietil)-p-metoksi sinamamida

Rumus Molekul : C14H15NO3
Bobot Molekul : 221,0 g/mol
Pemerian : Berbentuk serbuk krem, tidak berbau
Titik leleh : 1210C-1250C
Kelarutan : Larut dalam metanol, etil asetat, tidak larut dalam n-
heksan.
N-(hidroksietil)-p-metoksi sinamamida merupakan senyawa hasil

modifikasi etil p-metoksisinamat melalui reaksi amidasi dengan
menggunakan etanolamin. Substitusi gugus ester pada etil p-
metoksisinamat menjadi bentuk amida terbukti meningkatkan aktifitas
antiinflamasi. N-(hidroksietil)-p-metoksi sinamamida aktif menghambat
denaturasi Bovine Serum Albumin (BSA) dengan persen inhibisi terbesar
78,62% (Reza, 2015). Pada uji BSA, jika senyawa dapat menghambat
denaturasi protein dengan persen inhibisi ˃ 20%, dianggap memiliki
aktivitas antiinflamasi dan layak untuk dikembangkan lebih lanjut
(Williams et al., 2008). Sehingga N-(hidroksietil)-p-metoksi sinamamida
memiliki potensi yang cukup baik sebagai antiinflamasi (Reza, 2015).

5
2.2 Plasma
Darah terdiri atas plasma dan sel-sel darah. Sebagian besar sel darah
merupakan sel darah merah atau eritrosit, sedangkan jumlah sel darah
putih atau leukosit relatif sangat sedikit, yaitu 0,2% dari jumlah eritrosit.
Disamping eritrosit dan leukosit, ada partikel lain yang disebut trombosit.
Trombosit sangat berguna pada proses penggumpalan darah (Pudjiadi,
1994).
Apabila darah yang sebelumnya telah diberi antikoagulan dilakukan
sentrifugasi, maka sel-sel darah merah akan mengendap sedangkan plasma
akan berada dalam bentuk cairan bening atau supernatan di atasnya
(Pudjiadi, 1994).
Volume rata-rata plasma pada pria adalah 55%, pada wanita 58%
dari volume darah (Sherwood, 1996). Plasma manusia mengandung 90-
92% air. Peranan air dalam darah sangat besar, sebab disamping sebagai
pelarut zat - zat, air diperlukan untuk menjaga tekanan darah, kondisi
osmotik, dan pengatur suhu tubuh dengan meratakan panas tubuh
(Pudjiadi, 1994).
Zat-zat yang terdapat dalam plasma diantaranya adalah protein
darah; garam-garam mineral (garam kalsium, kalium, natrium, dan lain-
lain) yang berguna dalam metabolisme dan juga mengadakan osmotik; zat
makanan (asam amino, glukosa, lemak, mineral, dan vitamin); hormon;
dan antibodi/ antitoksin (Syaifuddin, 2006). Protein adalah zat padat yang
paling banyak terdapat di dalam plasma, yaitu antara 6-8% dari plasma.
Protein yang terdapat di dalam plasma antara lain adalah fibrinogen,
globulin, dan albumin. Albumin dan globulin merupakan protein yang
paling banyak terdapat dalam plasma yang berfungsi sebagai zat yang
menentukan besarnya tekanan osmotik (Pudjiadi, 1994). Adapun
fibrinogen merupakan suatu protein darah yang sangat berguna dalam
peristiwa penggumpalan darah. Plasma masih terdapat fibrinogen di
dalamnya, hal ini disebabkan fibrinogen tidak berubah menjadi fibrin
karena penambahan antikoagulan (Sadikin, 2001).

6
2.3 Analisis Obat dalam Plasma

Farmakokinetik obat berhubungan dengan paparan obat terhadap
tubuh dan perubahan konsentrasi obat terhadap waktu. Darah merupakan
salah satu cairan biologis yang bisa diperoleh dan konsentrasi obat dapat
dianalisis berulang kali dalam beberapa waktu setelah pemberian obat.
Namun, konsentrasi obat dalam darah utuh jarang digunakan untuk
melihat profil farmakokinetik obat karena darah merupakan sistem fisik
yang sangat kompleks. Darah mengandung sel darah merah, sel darah
putih, dan platelet yang tersuspensi dalam air plasma. Darah dengan
penghilangan unsur sel tersebut dengan cara sentrifugasi setelah
sebelumnya ditambahkan antikoagulan sehingga mendapatkan plasma,
atau dengan penggumpalan darah sehingga diperoleh serum, lebih disukai.
Alasan lain fokus terhadap konsentrasi plasma dalam farmakokinetik
adalah karena plasma merupakan suatu cairan kompleks yang terdapat
dalam sistem sirkulasi yang berfungsi sebagai medium transportasi zat-zat
yang di angkut dalam darah (Ganong, 2001; Rosenbaum, 2011). Selain itu,
intensitas efek farmakologi atau efek toksik suatu obat seringkali dikaitkan
dengan konsentrasi obat pada reseptor, yang biasanya terdapat dalam sel-
sel jaringan. Oleh karena sebagian besar sel-sel jaringan diperfusi oleh
cairan jaringan atau plasma, maka pemeriksaan kadar obat dalam plasma
merupakan suatu metode yang sesuai untuk pemantauan pengobatan
(Shargel, 2005).
Obat ditemukan dalam kompleks matriks biologi seperti darah, urin,
saliva, cairan serebrospinal (CSF) dan jaringan. Dalam banyak kasus,
konsentrasi obat dihitung dalam mikrogram sampai nanogram atau
pikogram. Penentuan kadar obat dalam matriks biologis termasuk plasma
merupakan hal yang kompleks. Hal ini dikarenakan plasma mengandung
sejumlah unsur endogen yang dapat mengganggu metode analisis kimia
dan fisika yang digunakan untuk mendeteksi dan mendeterminasi zat yang
ingin dianalisis. Oleh karena itu, dibutuhkan suatu perlakuan awal sebelum
di injeksikan untuk memisahkan analit yang akan dianalisis dari unsur
endogen tersebut (Swarbrick dan Boylan, 1988).

7
Ada beberapa teknik penyiapan sampel yang biasa digunakan untuk

analisis dalam matriks plasma, antara lain :
a. Pengendapan protein
Pada metode ini, digunakan asam atau pelarut organik yang
bercampur dengan air untuk menghilangkan protein dengan cara
denaturasi atau presipitasi. Asam seperti asam trikloroasetat (TCA)
dan asam perklorat merupakan pengendap protein yang sangat efisien
untuk mengendapkan protein pada konsentrasi 5-20%. Pelarut organik
seperti metanol, asetonitril, aseton, dan etanol meskipun kurang
efisien dalam mengendapkan protein, namun pelarut-pelarut tersebut
telah secara luas digunakan untuk bioanalisis karena kompatibel
dengan fase gerak KCKT serta dapat mengekstraksi senyawa
berdasarkan prinsip kepolaran. Pelarut organik dapat menurunkan
solubilitas protein sehingga protein akan mengendap (Evans, 2004).
b. Ekstraksi cair-cair
Ekstraksi cair-cair berguna untuk memisahkan analit dari
pengotor dengan menyekat sampel diantara 2 fase larutan yang tidak
tercampurkan. Fase pertama umumnya berupa fase aqueous,
sedangkan fase kedua berupa fase organik. Analit yang akan
diekstraksi harus larut diantara satu fase larutan tersebut. Prinsip
ekstraksi cair-cair ini adalah senyawa yang bersifat lebih hidrofobik
akan cenderung mudah ditemukan di fase organik. Analit yang
terekstraksi ke dalam fase organik akan dengan mudah diperoleh
kembali melalui penguapan, sedangkan analit yang terkstraksi ke
dalam fase aqueous dapat langsung disuntikkan ke dalam kolom
KCKT fase terbalik. Larutan aqueous yang dapat digunakan adalah
air, larutan yang bersifat asam/ basa, garam, dan lainnya. Pelarut
organik yang dapat digunakan adalah heksan, etil asetat, toluen, dan
lainnya. Kelemahan dari metode ini adalah tidak dapat diaplikasikan
ke semua analit, contohnya analit yang bersifat sangat polar akan sulit
menggunakan metode ini (Evans, 2004).

8
c. Ekstraksi fase padat

Prinsip mekanisme pemisahan dan isolasi yang digunakan dalam
ekstraksi fase padat adalah fase terbalik, fase normal, dan ion
exchange, sama seperti yang digunakan dalam KCKT. Prinsip umum
ekstraksi fase padat yaitu adsorbsi obat dari larutan ke dalam adsorben
atau fase diam. Adsorben yang digunakan pada ekstraksi ini terdiri
dari partikel silika ukuran 40-60 µm yang berikatan membentuk fase
hidrokarbon. C18 merupakan adsorben yang memiliki kapasitas paling
baik dalam mengadsorbsi analit. Ekstraksi fase padat adalah suatu
teknik yang dapat mengatasi beberapa masalah yang ditemui pada
ekstraksi cair-cair. Ektraksi fase padat secara umum melalui 5 tahap
proses, diantaranya pengkondisian (conditioning), penyeimbangan
fase diam (equlibration), memasukkan sampel (loading), pencucian
dan elusi sampel (washing dan elution). (Evans, 2004 ; Harahap, Y.,
2010).
2.4 Kromatografi Cair Kinerja Tinggi

2.4.1 Teori Dasar KCKT
Kromatografi adalah suatu istilah umum yang digunakan
untuk bermacam-macam teknik pemisahan yang didasarkan atas
partisi sampel diantara suatu fase gerak yang bisa berupa gas atau
cair, serta fase diam yang juga bisa berupa cairan atau suatu solid
(padatan). Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) atau High
Pressure Liquid Chromatography (HPLC) termasuk metode
analisis terbaru, merupakan teknik kromatografi dengan fase gerak
cairan dan fase diam cairan atau padatan (Effendy, 2004). KCKT
dikembangkan pada akhir tahun 1960-an dan awal 1970-an. Saat
ini KCKT merupakan teknik pemisahan yang diterima secara luas
untuk analisis dan pemurnian senyawa tertentu dalam suatu sampel
pada sejumlah bidang, termasuk bidang farmasi. KCKT merupakan
suatu teknik dimana solut atau zat-zat terlarut terpisah oleh
perbedaan kecepatan elusi disebabkan solut melewati kolom

9
kromatografi. Pemisahan solut dipengaruhi oleh distribusi solut

dalam fase gerak dan fase diam. Penggunaan kromatografi cair
membutuhkan penggabungan berbagai macam kondisi operasional
secara tepat seperti jenis kolom, fase gerak, panjang dan diameter
kolom, kecepatan alir fase gerak, suhu kolom, dan ukuran sampel.
Kegunaan umum KCKT adalah untuk pemisahan sejumlah
senyawa organik, anorganik, maupun senyawa biologis, analisis
ketidakmurnian (impurities); analisis senyawa-senyawa tidak
mudah menguap (non volatile); penentuan molekul-molekul netral,
ionik, maupun zwitter ion; isolasi dan pemurnian senyawa;
pemisahan senyawa-senyawa yang memiliki struktur hampir sama;
pemisahan senyawa-senyawa dalam jumlah sekelumit (trace
elements), dalam jumlah banyak, dan dalam skala proses industri.
KCKT merupakan metode yang tidak destruktif dan dapat
digunakan baik untuk analisis kualitatif maupun kuantitatif
(Gandjar dan Rohman, 2007).
Dalam analisis farmasi, metode KCKT merupakan metode
yang sangat populer untuk menetapkan kadar senyawa obat baik
dalam bentuk sediaan maupun dalam sampel hayati. Hal ini
disebabkan KCKT merupakan metode yang memberikan
sensitifitas dan spesifisitas yang tinggi.
Kelebihan metode KCKT jika dibandingkan dengan
Kromatografi Cair tradisional, yaitu (Johnson dan Stevenson,
1991):
a. Cepat;
b. Daya pisah baik;
c. Peka; detektor unik;
d. Kolom dapat dipakai kembali;
e. Ideal untuk molekul besar dan ion;
f. Mudah memperoleh kembali cuplikan.

10
2.4.2 Instrumentasi
Instrumentasi KCKT pada dasarnya terdiri atas delapan
komponen pokok, yaitu wadah fase gerak, sistem penghantaran
fase gerak dan alat untuk memasukkan sampel, kolom, detektor,
wadah penampung buangan fase gerak, dan komputer atau
integrator atau perekam (Gandjar dan Rohman, 2007).
Keterangan : 1 = Wadah fase gerak; 2 = saluran penghubung dengan frit; 3 =

pompa; 4 = autosampler; 5 = kolom; 6 = detektor; 7 = pembuangan; 8 =
pengolah data
Gambar 2.2 Diagram Alat dan Komponen KCKT

(Sumber : Practical High-Performance Liquid Chromatography 4th edition,
2004)
2.4.2.1 Wadah Fase Gerak pada KCKT

Wadah fase gerak harus bersih dan lembam (inert).
Wadah ini biasanya dapat menampung fase gerak antara 1-2
liter pelarut. Fase gerak sebelum digunakan harus dilakukan
degassing (penghilang gas) yang ada pada fase gerak, sebab
adanya gas akan berkumpul dengan komponen lain
terutama di pompa dan detektor sehingga akan
mengacaukan analisis (Gandjar dan Rohman, 2007).
11
2.4.2.2 Fase Gerak pada KCKT

Fase gerak atau eluen biasanya terdiri atas campuran
pelarut yang dapat bercampur, berperan dalam daya elusi
dan resolusi. Daya elusi dan resolusi ini ditentukan oleh
polaritas keseluruhan pelarut, polaritas fase diam, dan sifat
komponen-komponen sampel. Untuk fase normal (fase
diam lebih polar daripada fase gerak), kemampuan elusi
meningkat dengan meningkatnya polaritas pelarut (Gandjar
dan Rohman, 2007).
2.4.2.3 Pompa pada KCKT

Pompa yang digunakan untuk KCKT harus inert
terhadap fase gerak. Pompa berfungsi untuk mengalirkan
eluen ke dalam kolom. Pompa yang digunakan sebaiknya
mampu memberikan tekanan sampai 5000 psi dan mampu
mengalirkan fase gerak dengan kecepatan alir 3 mL/menit.
Untuk tujuan preparatif, pompa yang digunakan harus
mampu mengalirkan fase gerak dengan kecepatan 20
mL/menit.
Tujuan penggunaan pompa atau sistem penghantaran
fase gerak adalah untuk menjamin proses penghantaran fase
gerak berlangsung secara tepat, reprodusibel, konstan, dan
bebas dari gangguan. Terdapat 2 jenis pompa dalam KCKT,
yaitu pompa dengan tekanan konstan dan pompa dengan
aliran fase gerak yang konstan (Gandjar dan Rohman,
2007).
2.4.2.4 Penyuntikan Sampel pada KCKT

Injektor merupakan komponen KCKT yang berfungsi
untuk memasukkan analit ke dalam kolom. Alat ini terbuat
dari tembaga tahan karat dan katup teflon yang dilengkapi
dengan keluk sampel (sample loop) internal dan eksternal.

12
Pada saat penyuntikan, katup diputar sehingga fase gerak

mengalir melewati keluk sampel dan memasukkan sampel
ke kolom (Gandjar dan Rohman, 2007).
2.4.2.5 Kolom pada KCKT

Kolom merupakan jantung kromatografi.
Keberhasilan atau kegagalan analisis bergantung pada
pilihan kolom dan kondisi kerja yang tepat. Kolom dapat
dibagi menjadi dua kelompok, yaitu kolom analitik dan
kolom preparatif. Kolom umumnya terbuat dari tembaga
tahan karat dan biasanya dioperasikan pada temperatur
kamar, tetapi bisa juga digunakan temperatur lebih tinggi,
terutama untuk kromatografi pertukaran ion dan
kromatografi eksklusi (Johnson dan Stevenson, 1991).
Terdapat beberapa hal yang perlu diperhatikan dalam
memilih kolom, yaitu (Harmita, 2006) :
a. Panjang kolom
b. Diameter kolom
c. Pengisi kolom
d. Fase gerak
e. Tekanan kolom
2.4.2.6 Fase Diam pada KCKT

Kebanyakan fase diam pada KCKT berupa silika yang
dimodifikasi secara kimiawi, silika yang tidak dimodifikasi,
atau polimer-polimer stiren dan divinil benzen. Permukaan
silika adalah polar dan sedikit asam karena adanya residu
gugus silanol (Si-OH).
Silika dapat dimodifikasi secara kimiawi dengan
menggunakan reagen-reagen seperti klorosilan. Reagen-
reagen ini akan bereaksi dengan gugus silanol dan
menggantinya dengan gugus-gugus fungsional yang lain.

13
Hasil reaksi yang diperoleh disebut dengan silika fase

terikat yang stabil terhadap hidrolisis karena terbentuk
ikatan-ikatan siloksan (Si-O-O-Si). Silika yang dimodifikasi
ini mempunyai karakteristik kromatografi dan selektifitas
yang berbeda jika dibandingkan dengan silika yang tidak
dimodifikasi.
Oktadesil silika (ODS atau C18) merupakan fase diam
yang paling banyak digunakan karena mampu memisahkan
senyawa-senyawa dengan kepolaran yang rendah, sedang,
maupun tinggi (Gandjar dan Rohman, 2007).
2.4.2.7 Detektor
Detektor pada KCKT dikelompokkan menjadi 2
golongan, yaitu detektor universal (yang mampu
mendeteksi zat secara umum, tidak bersifat spesifik, dan
tidak bersifat selektif) seperti detektor indeks bias dan
detektor spektrometri massa; dan golongan detektor yang
spesifik, seperti detektor UV-Vis, detektor fluoresensi, dan
elektrokimia.
Idealnya, suatu detektor harus mempunyai
karakteristik sebagai berikut:
a. Mempunyai respon terhadap solut yang cepat dan
reprodusibel,
b. Mempunyai sensitifitas yang tinggi, yakni mampu
mendeteksi solut pada kadar yang sangat kecil,
c. Stabil dalam pengoperasiannya,
d. Mempunyai sel volume yang kecil sehingga mampu
meminimalkan peleburan pita. Untuk kolom
konvensional, selnya bervolume 8 µl atau lebih kecil,
sementara kolom mokrobor selnya bervolume 1 µl
atau lebih kecil lagi,

14
e. Signal yang dihasilkan berbanding lurus dengan

konsentrasi solut pada kisaran yang luas (kisaran
dinamis linier), dan
f. Tidak peka terhadap perubahan suhu dan kecepatan alir
fase gerak.
Beberapa detektor yang sering digunakan pada KCKT :

a. Detektor Spektrofotometri UV-Vis
Detektor ini didasarkan pada adanya penyerapan
radiasi ultraviolet (UV) dan sinar tampak (Vis) pada
kisaran panjang gelombang 190-800 nm oleh spesies
solut yang mempunyai struktur-struktur atau gugus-
gugus kromoforik. Detektor spektrofotometri UV-Vis
dapat berupa detektor dengan panjang gelombang tetap
(merupakan detektor yang paling sederhana) serta
detektor dengan panjang gelombang bervariasi.
b. Detektor photodiode-array (PDA)

Detektor PDA merupakan detektor UV-Vis
dengan berbagai keistimewaaan. Detektor ini mampu
memberikan kumpulan kromatogram secara simultan
pada panjang gelombang yang berbeda pada sekali
proses (single run). Selama proses berjalan, suatu
kromatogram pada panjang gelombang yang diinginkan
(biasanya antara 190-400) dapat ditampilkan.
c. Detektor Flouresensi
Fluoresensi merupakan fenomena luminisensi
yang terjadi ketika suatu senyawa menyerap sinar UV
atau visibel lalu mengemisikannya pada panjang
gelombang yang lebih besar. Tidak semua senyawa
obat mempunyai sifat flouresen sehingga detektor

15
flouresensi ini sangat spesifik. Disamping itu, detektor

ini juga sangat sensitif dibandingkan dengan detektor
UV.
d. Detektor Indeks Bias

Detektor ini akan merespon setiap perbedaan
indeks bias antara analit (zat terlarut) dengan
pelarutnya (fase geraknya). Penggunaan detektor ini
terutama untuk senyawa-senyawa yang tidak
mempunyai gugus kromofor.
e. Detektor Elektrokimia
Detektor ini bekerja berdasarkan oksidasi dan
reduksi senyawa organik (termasuk obat) secara
elektrokimia pada elektroda yang cocok.
2.4.2.8 Komputer, Integrator, atau Rekorder

Alat pengumpul data seperti komputer, integrator,
atau rekorder dihubungkan dengan detektor. Alat ini akan
mengukur sinyal elektronik yang dihasilkan oleh detektor
lalu memplotkannya sebagai suatu kromatogram yang
selanjutnya dapat dievaluasi oleh analis (Gandjar dan
Rohman, 2007).
2.5 Uji Kesesuaian Sistem

Seorang analisis harus memastikan bahwa sistem dan prosedur yang
digunakan mampu memberikan data yang dapat diterima. Hal ini dapat
dilakukan dengan uji kesesuaian sistem. Uji kesesuaian sistem adalah
serangkaian uji untuk menjamin bahwa metode tersebut dapat
menghasilkan akurasi dan presisi yang dapat diterima. Persyaratan-

16
persyaratan kesesuian sistem biasanya dilakukan setelah dilakukan

pengembangan metode dan validasi metode.
United States Pharmacopeia (USP) menentukan parameter yang
dapat digunakan untuk menentukan kesesuaian sistem sebelum analisis.
Parameter-parameter yang digunakan meliputi: jumlah lempeng teoritis
(N), asimetrisitas, faktor kapasitas (k’ atau α) dan nilai standar deviasi
relatif (RSD) tinggi puncak dan luas puncak dari serangkaian injeksi. Pada
umumnya, paling tidak ada 2 kriteria yang biasanya dipersyaratkan untuk
menunjukkan kesesuaian sistem suatu metode. Parameter yang berguna
untuk uji kesesuaian sistem adalah keberulangan penyuntikan larutan baku
yang dinyatakan dalam standar deviasi relatif (RSD) yang dinyatakan
dalam persen bila tidak dinyatakan lain dalam monografi baku yang
digunakan dengan nilai RSD kurang dari 2% (Farmakope Indonesia edisi
IV).
2.6 Validasi Metode Analisis

Validasi metode menurut United States Pharmacopeia (USP)
dilakukan untuk menjamin bahwa metode analisis akurat, spesifik,
reprodusibel, dan tahan pada kisaran analit yang akan dianalisis.
Suatu metode analisis harus divalidasi untuk melakukan verifikasi
bahwa parameter-parameter kinerjanya cukup mampu untuk mengatasi
masalah analisis. Oleh karena itu suatu metode harus divalidasi ketika:
a. Metode baru dikembangkan untuk mengatasi masalah analisis
tertentu,
b. Metode yang sudah baku direvisi untuk menyesuaikan
perkembangan atau karena munculnya suatu masalah yang
mengarahkan bahwa metode baku tersebut harus direvisi,
c. Penjaminan mutu yang mengindikasikan bahwa metode baku telah
berubah seiring dengan berjalannya waktu,
d. Metode baku digunakan di laboratorium yang berbeda, dikerjakan
oleh analis yang berbeda, atau dikerjakan dengan alat yang berbeda,

17
e. Untuk mendemonstrasikan kesetaraan antar 2 metode, seperti antara

metode baru dan metode baku.
Validasi metode bioanalisis ini digunakan pada studi farmakologi

klinis, pengujian ketersediaan hayati (bioavailabilitas) dan bioekuivalensi,
serta uji farmakokinetika. Metode analisis yang selektif dan sensitif
sangat penting untuk evaluasi obat dan metabolitnya (analit) secara
kuantitatif untuk keberhasilan studi farmakologi pre-klinis dan klinis.
Validasi metode bioanalisis mencakup semua prosedur yang menunjukkan
bahwa metode yang digunakan untuk analisis analit secara kuantitatif di
dalam matriks biologis, seperti darah, plasma, serum, atau urin dapat
dipercaya dan reprodusibel sesuai tujuan penggunaannya.
2.6.1 Tipe dan Tingkatan Validasi

Dalam bioanalisis, validasi metode dibagi menjadi 3 kategori,
yaitu (Food and Drug Administration, 2001):
2.6.1.1 Validasi Lengkap
Validasi lengkap penting dilakukan saat melakukan
pengembangan dan implementasi metode bioanalisis untuk
pertama kali. Validasi lengkap juga penting untuk obat-obat
baru dan dilakukan jika ada metabolit yang ditambahkan
pada suatu penetapan kadar.
2.6.1.2 Validasi Parsial

Validasi parsial merupakan suatu modifikasi dari
metode bionalasis yang telah divalidasi. Validasi parsial
dilakukan mulai dari akurasi dan presisi pada proses inta-
assay sampai mendekati validasi lengkap. Perubahan
metode bioanalisis yang termasuk kedalam kategori ini,
yaitu :

18
a. Metode bioanalisis yang di pindahkan antar laboratorium

atau analis,
b. Perubahan dalam metode analisis (misal perubahan
dalam sistem deteksi),
c. Perubahan dalam antikoagulan yang digunakan dalam
cairan biologis,
d. Perubahan matriks (misal dari plasma menjadi urin),
e. Perubahan dalam prosedur proses sampel,
f. Perubahan spesies pada matriks yang sama (misal dari
rat plasma menjadi mouse plasma),
g. Perubahan dalam rentang konsentrasi,
h. Perubahan instrumen dan/ atau software yang digunakan,
i. Volume sampel yang terbatas (misal pada studi pediatri),
j. Matriks yang jarang.
2.6.1.3 Validasi Silang

Validasi silang merupakan perbandingan parameter
validasi ketika 2 atau lebih metode bioanalisis digunakan
untuk mendapatkan data pada studi yang sama ataupun
studi yang berbeda. Salah satu contoh dari validasi silang
adalah keadaan dimana metode bioanalisis yang telah
tervalidasi dianggap sebagai referensi dan metode
bioanalisis hasil revisi dijadikan sebagai pembanding.
Perbandingan harus dilakukan dua arah.
2.6.2 Pengembangan Metode Bioanalisis

Pengukuran terhadap setiap analit dalam matriks biologis
harus divalidasi terlebih dahulu. Berikut beberapa parameter pokok
untuk validasi metode bioanalisis, yaitu akurasi, presisi,
selektivitas, sensitivitas, reprodusibilitas, dan stabilitas.

19
Pengembangan dan penetapan metode bioanalisis meliputi :

2.6.2.1 Selektivitas
Selektivitas adalah kemampuan metode analisis untuk
membedakan dan mengukur secara kuantitatif analit dengan
adanya komponen lain di dalam sampel. Untuk selektivitas,
analisis sampel blangko dari matriks biologi yang sesuai
(seperti plasma, urin, atau matriks lainnya) harus dilakukan
sedikitnya dari enam sumber yang berbeda. Tiap sampel
blangko harus diuji terhadap interferensi, dan selektivitas
harus dipastikan pada kadar batas kuantifikasi terendah
(LLOQ). Jika suatu metode mengukur lebih dari satu analit,
maka tiap analit harus diuji untuk memastikan tidak ada
interferensi (Food and Drug Administration, 2001).
2.6.2.2 Kurva Kalibrasi

Kurva kalibrasi merupakan hubungan antara respon
instrumen dan konsentrasi analit yang diketahui. Kurva
kalibrasi disiapkan dalam matriks biologi yang sama dengan
sampel, dengan cara menambahkan sejumlah analit dengan
konsentrasi yang diketahui ke dalam matriks. Rentang
konsentrasi standar dipilih berdasarkan literatur atau
penelitian. Pembuatan kurva kalibrasi harus mencakup
sampel blangko (matriks tanpa baku dalam), sampe zero
(matriks dengan baku dalam), dan 6 sampai 8 non-zero
sampel pada rentang konsentrasi standar, termasuk LLOQ.
a. Lower Limit of Quantification (LLOQ)

Standar terendah dari kurva kalibrasi harus
diterima sebagai LLOQ jika berada pada kondisi
berikut: respon analit pada LLOQ setidaknya 5 kali
respon sampel blangko, puncak analit (respon) harus
dapat teridentifikasi, dapat terpisah dengan baik, dan

20
reprodusibel dengan nilai presisi ≤20% dan akurasi

80-120%.
b. Kurva Kalibrasi/ Kurva Standar/ Konsentrasi-Respon

Syarat kurva kalibrasi agar dapat diterima, yaitu
nilai nilai deviasi sebesar ≤20% dari konsentrasi
LLOQ dan nilai nilai deviasi sebesar ≤15% dari
konsentrasi standar selain LLOQ. Sedikitnya empat
dari enam standar non-zero berada diatas kriteria
diatas, termasuk LLOQ dan konsentrasi tertinggi dari
kurva kalibrasi.
(Food and Drug Administration, 2001)
2.6.2.3 Batas Deteksi (limit of detection, LOD)

Batas deteksi didefinisikan sebagai konsentrasi analit
terendah dalam sampel yang masih dapat dideteksi,
meskipun tidak selalu dapat dikuantifikasi. LOD merupakan
batas uji yang secara spesifik menyatakan apakah analit
diatas atau dibawah nilai tertentu. Definisi batas deteksi
yang paling umum digunakan dalam kimia analisis adalah
kadar analit yang memberikan respon sebesar respon
blangko (yb) ditambah dengan 3 simpangan baku blangko
(3Sb).
LOD dapat dihitung berdasarkan pada standar deviasi
(SD) respon dan kemiringan (slope, S) kurva baku pada
level yang mendekati LOD sesuai dengan rumus, LOD =
3,3 (SD/S) (Gandjar dan Rohman, 2007).
2.6.2.4 Batas Kuantifikasi (limit of quantification, LOQ)

Batas Kuantifikasi didefinisikan sebagai konsentrasi
analit terendah dalam sampel yang dapat ditentukan dengan
presisi dan akurasi yang dapat diterima pada kondisi

21
operasional metode yang digunakan. Seperti halnya LOD,

LOQ juga diekspresikan sebagai konsentrasi (dengan
akurasi dan presisi juga dilaporkan). Untuk menentukan
LOQ, dapat menggunakan perhitungan yang didasarkan
pada standar deviasi respon (SD) dan slope (S) kurva baku
sesuai rumus : LOQ = 10 (SD/S) (Gandjar dan Rohman,
2007).
2.6.2.5 Akurasi
Akurasi adalah suatu metode analisis yang
menggambarkan kedekatan nilai rata-rata hasil uji yang
diperoleh dengan nilai konsentrasi analit sebenarnya.
Akurasi ditentukan oleh analisis berulang dari sampel yang
telah diketahui kadar analit yang terkandung didalamnya
(Food and Drug Administration, 2001). ICH
merekomendasikan pengukuran minimal menggunakan 3
kali pengukuran (Ravichandranravichandran, V., Shalini S.,
Sundram K. M., Harish Rajak, 2010). Uji akurasi minimal
menggunakan tiga konsentrasi pada rentang yang telah
direkomendasikan, yaitu pada konsentrasi rendah (tiga kali
LLOQ), sedang, dan tinggi dari kurva standar. Perbedaan
nilai rata-rata harus + 15% terhadap nilai sebenarnya,
kecuali pada LLOQ tidak boleh lebih dari 20% (Food and
Drug Administration, 2001).
2.6.2.6 Presisi
Presisi adalah suatu metode analisis yang
menggambarkan kedekatan hasil pengukuran individu analit
ketika suatu metode analisis diulang. ICH
merekomendasikan pengukuran minimal menggunakan 3
kali pengukuran (Ravichandranravichandran, V., Shalini S.,
Sundram K. M., Harish Rajak, 2010). Uji presisi minimal

22
menggunakan tiga konsentrasi pada rentang yang telah

direkomendasikan, yaitu pada konsentrasi rendah (tiga kali
LLOQ), sedang, dan tinggi dari kurva standar. Pengukuran
presisi dikelompokkan menjadi within-run (selama waktu
analisis), intra-batch precision atau repeatabilitas (dalam
satu kali analisis) dan between-run, inter-batch precision
atau repeatabilitas (bila metode dilakukan oleh analis, alat,
reagen, dan laboratorium yang berbeda). Perbedaan nilai
rata-rata harus tidak lebih dari 15% terhadap nilai
sebenarnya, kecuali pada LLOQ tidak boleh lebih dari 20%
(Food and Drug Administration, 2001).
2.6.2.7 Perolehan Kembali

Perolehan kembali suatu analit adalah respon detektor
yang diperoleh dari jumlah analit yang ditambahkan dan
diekstraksi dari matriks biologi dibandingkan dengan
respon detektor analit yang diketahui konsentrasinya.
Perolehan kembali analit tidak harus 100% namun tingkat
perolehan kembali analit dan baku dalam harus konsisten,
presisi, dan reprodusibel dengan rentang syarat 80-120%.
Uji perolehan kembali harus dilakukan dengan
membandingkan hasil analisis sampel pada tiga konsentrasi
(rendah, sedang, dan tinggi) yang diekstraksi dari matriks
biologi dengan baku yang tidak diekstraksi yang mewakili
perolehan kembali 100% (Food and Drug Administration,
2001).
2.6.2.8 Stabilitas
Stabilitas obat dalam cairan biologis adalah fungsi
dari kondisi penyimpanan, sifat-sifat kimia obat, matriks,
dan sistem penyimpanan. Stabilitas analit dalam suatu
matriks dan sistem penyimpanan hanya relevan pada

23
matriks dan sistem penyimpanan tersebut dan tidak dapat

diekstrapolasikan ke matriks dan sistem penyimpanan lain.
Semua penentuan stabilitas harus menggunakan
sampel yang disiapkan dari larutan stok analit yang dibuat
baru dalam matriks biologis yang bebas analit dan bebas
dari interferensi. Larutan stok analit harus disiapkan dalam
pelarut yang sesuai pada konsentrasi yang diketahui.
Penentuan uji stabilitas dapat menggunakan beberapa
cara, antara lain :
a. Stabilitas Beku-Cair
Stabilitas analit dapat ditentukan setelah tiga
siklus beku-cair. Sedikitnya tiga larutan senyawa dari
setiap konsentrasi rendah, sedang, dan tinggi di
simpan pada kondisi penyimpanan yang diinginkan
selama 24 jam kemudian dikeluarkan dan dibiarkan
hingga mencair pada temperatur ruang. Setelah semua
mencair, sampel dibekukan kembali selama 12-24 jam
pada kondisi yang sama. Siklus beku-cair ini harus
diulang sebanyak 2 kali lagi, kemudian dianalisis
setelah tiga siklus. Jika analit tidak stabil pada
temperatur penyimpanan, maka uji dapat dilakukan
dengan menyimpan sampel pada suhu -700C selama
tiga siklus beku-cair.
b. Stabilitas Jangka Pendek

Tiga larutan senyawa dari setiap konsentrasi
rendah, sedang, dan tinggi dicairkan pada suhu ruang
dan dibiarkan pada suhu ini selama 4 sampai 24 jam
(atau berdasarkan durasi yang diperkirakan sampel
stabil pada temperatur ruang berdasarkan penelitian)
kemudian dianalisis.

24
c. Stabilitas Jangka Panjang

Waktu penyimpanan pada evaluasi stabilitas
jangka panjang harus melebihi waktu pertama kali
sampel di kumpulkan sampai waktu terakhir sampel
dianalisis. Stabilitas jangka panjang ditentukan
dengan menyimpan sedikitnya tiga larutan senyawa
dari setiap konsentrasi rendah, sedang, dan tinggi
dicairkan pada kondisi yang sama seperti uji sampel.
Konsentrasi dari semua sampel dibandingkan dengan
rata-rata nilai perolehan kembali yang sesuai dengan
konsentrasi standar dari hari pertama uji stabilitas
jangka panjang.
d. Stabilitas Larutan Stok

Stabilitas larutan stok obat dan baku dalam
harus dievaluasi pada temperatur ruang selama
minimal 6 jam. Jika larutan stok dibekukan selama
periode tertentu, perlu dicatat stabilitasnya. Setelah
itu, dilakukan uji stabilitas dengan membandingkan
respon instrumen terhadap larutan yang baru dibuat.
e. Stabilitas Post-Preparatif
Stabilitas dari sampel yang telah diproses,
termasuk waktu sampel berada dalam autosampler.
Stabilitas obat dan baku dalam harus ditentukan
selama waktu analisis untuk setiap batch dalam
validasi sampel dengan menentukan konsentrasi
berdasarkan kalibrasi standar.
(Food and Drug Administration, 2001).

BAB III
METODE PENELITIAN
3.1 Tempat dan Waktu Penelitian

Penelitian dilaksanakan di Laboratorium Farmakognosi dan Fitokimia,
Laboratorium Penelitian II, Laboratorium Kimia Obat, Laboratorium
Penelitian I, Laboratorium Analisa Obat dan Pangan Halal Fakultas
Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas Islam Negeri Syarif
Hidayatullah Jakarta. Penlitian dimulai dari bulan Maret sampai Juni 2016.
3.2 Alat dan Bahan

3.2.1 Alat
Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (Dionex UltiMate® 3000)
dilengkapi dengan; pompa, autosampler, kolom Acclaim® Polar
Advantage II (C18; 3 µm; 4,6 x 150 mm), detektor DAD (Diode
Array Detector), dan program komputer PC (Chromeleon®).
Spektrofotometer Ultaviolet-Visibel (Hitachi U-2910), sentrifus
(Eppendorf 5417R) dengan tabung sentrifugasi, syringe filter
(Sartorius, RC 0,45 µm), timbangan analitik kepekaan 220 g – 1
mg (AND-GH202), vorteks, mikropipet (Rainin 20-200 µL dan
100-1000 µL), dry vacuum pump/compressor (Welch®), tabung
vacutainer, lemari pendingin, sonikator (Elmasonic®), dan alat-alat
gelas.
3.2.2 Bahan
N-(hidroksietil)-p-metoksi sinamamida, metanol grade
Liquid Chromatography (Merck), akuabides (Otsuka), plasma
(PMI DKI Jakarta).

26
3.3 Prosedur Kerja

3.3.1 Pembuatan Larutan Induk N-(hidroksietil)-p-metoksi
sinamamida konsentrasi 1008 µg/mL
Ditimbang sebanyak 50,4 mg N-(hidroksietil)-p-metoksi
sinamamida. Dilarutkan ke dalam metanol hingga 50,0 mL
sehingga diperoleh konsentrasi 1008 µg/mL. Pengenceran
dilakukan untuk memperoleh larutan dengan konsentrasi tertentu.
3.3.2 Pembuatan Fase Gerak

Beberapa komposisi fase gerak dibuat dengan
mengkombinasikan metanol dan akuabides dengan komposisi yang
dapat dilihat pada tabel 3.1.
Tabel 3.1 Komposisi Fase Gerak

No. Metanol Akuabides
1 100 -
2 70 30
3 60 40
4 40 60
Fase gerak yang telah dibuat disaring menggunakan vakum

dan filter 0,45 um. Gas yang terdapat di dalam larutan dihilangkan
menggunakan sistem penghilang gas (degasser).
3.3.3 Penentapan Panjang Gelombang Analisis

Larutan induk N-(hidroksietil)-p-metoksi sinamamida
diencerkan dengan metanol hingga diperoleh konsentrasi 5,04
µg/mL. Kemudian diukur nilai serapannya pada panjang
gelombang 200-400 nm menggunakan Spektrofotometer UV-
Visibel. Ditentukan nilai panjang gelombang maksimumnya untuk
analisis.

27
3.3.4 Optimasi Kondisi Analisis

3.3.4.1 Pemilihan Komposisi Fase Gerak
Larutan induk N-(hidroksietil)-p-metoksi sinamamida
diencerkan dengan metanol hingga diperoleh konsentrasi
10,08 µg/mL. Sebanyak 20,0 µL supernatan disuntikkan ke
dalam KCKT menggunakan komposisi fase gerak dalam
variasi perbandingan diatas dengan laju alir 1,0 mL/menit,
dan dideteksi pada panjang gelombang terpilih. Kemudian
dicatat waktu retensi (tR), luas puncak, dihitung jumlah
lempeng teoritis (N), HETP (height equivalent theoritical
plate), dan asimetrisitas. Hasil analisis yang diperoleh dari
beberapa perbandingan fase gerak dibandingkan.
3.3.5 Uji Kesesuaian Sistem

Larutan yang mengandung N-(hidroksietil)-p-metoksi
sinamamida pada konsentrasi 10,08 µg/mL disiapkan. Sebanyak
20,0 µL supernatan disuntikkan ke dalam KCKT pada kondisi
analisis terpilih. Kemudian dihitung jumlah lempeng teoritis (N),
HETP, asimetrisitas dan nilai RSD (standar deviasi relatif) pada
lima kali penyuntikan.
3.3.6 Penetapan Metode Ekstraksi (Polson, 2002)

Sebanyak 0,5 mL plasma diekstraksi menggunakan metanol,
dengan perbandingan metanol-plasma (1:1) dan (4:1) dalam tabung
sentrifugasi. Kemudian dikocok dengan vorteks selama ± 20 detik
dilanjutkan dengan sentrifugasi selama 10 menit dengan kecepatan
3.000 rpm. Supernatan yang diperoleh kemudian diambil dan
disaring menggunakan syringe filter. Sebanyak 20,0 µL supernatan
disuntikkan ke dalam KCKT dan dianalisis kromatogram dari
masing-masing perbandingan untuk mengetahui kondisi
kromatogram blanko plasma.

28
Dibuat larutan N-(hidroksietil)-p-metoksi sinamamida 10,08

µg/mL dalam plasma. Lalu diambil 0,5 mL campuran tersebut dan
dilakukan ekstraksi sesuai dengan perbandingan metanol-plasma
(1:1) dan (4:1), lalu sebanyak 20,0 µL supernatan diinjeksikan ke
dalam KCKT. Kemudian dilakukan pengamatan kromatogram
plasma mengandung N-(hidroksietil)-p-metoksi sinamamida
dengan membandingkan luas area, resolusi, jumlah lempeng
teoritis, dan asimetrisitas puncak N-(hidroksietil)-p-metoksi
sinamamida dari masing-masing perbandingan tersebut.
3.3.7 Validasi Metode Analisis N-(hidroksietil)-p-metoksi

sinamamida dalam Plasma secara In Vitro
3.3.7.1 Pengukuran Batas Kuantifikasi Terendah (LLOQ)

Larutan N-(hidroksietil)-p-metoksi sinamamida dalam
plasma dengan konsentrasi 10,08 µg/mL; 15,12 µg/mL;
20,16 µg/mL; 30,24 µg/mL; dan 40,32 µg/mL disiapkan.
Kemudian masing-masing larutan diekstraksi sesuai dengan
prosedur. Sebanyak 20 µL supernatan disuntikkan ke dalam
KCKT pada kondisi analisis terpilih. Dibuat kurva
kalibrasi, ditentukan persamaan garis regresi linier dan
koefisien korelasinya, kemudian dihitung nilai LOQ.
Setelah diperoleh nilai LOQ, dibuat larutan N-
(hidroksietil)-p-metoksi sinamamida dalam plasma dengan
konsentrasi ½ atau ¼ dari nilai LOQ tersebut.
3.3.7.2 Pembuatan Kurva Kalibrasi dan Uji Linieritas dalam

Plasma secara In Vitro
Dibuat sampel blangko (plasma), serta 6 larutan N-
konsentrasi 5,04 µg/mL; 10,08 µg/mL; 15,12 µg/mL; 20,16
µg/mL; 30,24 µg/mL; dan 40,32 µg/mL. Kemudian masing-
masing larutan diekstraksi sesuai dengan prosedur.
Sebanyak 20,0 µL supernatan disuntikkan ke dalam KCKT
29
pada kondisi analisis terpilih. Setelah itu dianalisis regresi

luas puncak terhadap konsentrasi N-(hidroksietil)-p-metoksi
sinamamida dalam plasma dari masing-masing konsentrasi
dan dibuat kurva kalibrasi dengan persamaan garis regresi
linier (y = a + bx). Dihitung pula koefisien korelasi (r) dari
kurva tersebut, kemudian dihitung lengukuran batas deteksi
(LOD) dan limit batas kuantifikasi (LOQ).
Nilai LOD dan LOQ dihitung dengan menggunakan
data kalibrasi. LOQ diperoleh dengan rumus :
LOQ =
Sedangkan LOD diperoleh dengan rumus :
LOD =
dimana ( ) adalah simpangan baku residual, b adalah
slope dari persamaan regresi.
3.3.7.3 Uji Selektivitas

Sebanyak 20,0 µL plasma hasil deproteinasi yang
mengandung N-(hidroksietil)-p-metoksi sinamamida pada
konsentrasi LLOQ (5,04 µg/mL) disuntikkan ke dalam
KCKT dengan kondisi analisis terpilih. Diulang sebanyak
enam kali menggunakan enam plasma dari sumber yang
berbeda. Kemudian dihitung koefisien variasinya (KV)
dengan nilai ≤20% dan akurasi (%diff) dengan nilai ± 20%.
3.3.7.4 Uji Akurasi, Presisi dan Perolehan Kembali (% recovery)

Dibuat larutan N-(hidroksietil)-p-metoksi sinamamida
dalam plasma dengan tiga seri konsentrasi, yaitu
konsentrasi rendah 12,096 µg/mL, konsentrasi sedang
18,144 µg/mL dan konsentrasi tinggi 28,224 µg/mL.
Kemudian masing-masing larutan diekstraksi sesuai dengan
prosedur. Sebanyak 20,0 µL supernatan disuntikkan ke
30
dalam KCKT pada kondisi analisis terpilih. Prosedur

tersebut diulangi sebanyak tiga kali untuk masing-masing
konsentrasi. Kemudian dihitung persentase akurasi (%diff),
perolehan kembali (% recovery) dan nilai koefisien
variasinya (KV) pada masing-masing konsentrasi larutan
tersebut. Nilai rata-rata % diff yang disyaratkan adalah +
15%, dan nilai koefisien variasi (KV) yang disyaratkan
tidak lebih dari 15%. Adapun % recovery dihitung dengan
membandingkan nilai terukur dari konsentrasi N-
nilai yang sebenarnya dikalikan 100%. Nilai % recovery
yang disyaratkan berada pada rentang 80-120%. Perolehan
kembali analit tidak harus 100% namun tingkat perolehan
kembali analit harus konsisten, presisi, dan reprodusibel.
Uji akurasi dan presisi dilakukan selama dua hari.

BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1 Penetapan Panjang Gelombang Analisis

Pada penelitian ini, penetapan panjang gelombang analisis dilakukan dengan
menggunakan alat spektrofotometer UV-Vis. Sebanyak 5,04 µg/mL larutan N-
(hidroksietil)-p-metoksi sinamamida diukur pada panjang gelombang 200 nm hingga
400 nm. Diperoleh spektrum serapan maksimumnya. Spektrum serapan yang
dihasilkan memperlihatkan bahwa N-(hidroksietil)-p-metoksi sinamamida berada
pada panjang gelombang sinar UV, yaitu 290 nm. Hal ini disebabkan karena N-
(hidroksietil)-p-metoksi sinamamida mempunyai gugus kromofor yang terdeteksi
pada daerah UV. Spektrum N-(hidroksietil)-p-metoksi sinamamida pada
spektrofotometer UV-Vis dapat dilihat pada lampiran 3 gambar 5.1. Pemilihan
panjang gelombang analisis ini berguna untuk meningkatkan selektivitas dan
sensitivitas analisis sampel yang digunakan. Panjang gelombang ini kemudian yang
digunakan pada instrumen Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) untuk
mendeteksi sampel pada analisis N-(hidroksietil)-p-metoksi sinamamida dalam
plasma secara in vitro.
4.2 Optimasi Kondisi Analisis

4.2.1 Pemilihan Komposisi Fase Gerak
Pada pemilihan komposisi fase gerak, analisis dilakukan menggunakan
KCKT dengan kolom C18 panjang 150 mm, dengan volume penyuntikan
sampel sebanyak 20,0 µL. Sistem kromatografi yang digunakan adalah sistem
isokratik dengan kombinasi fase gerak metanol dan akuabides pada beberapa
perbandingan. Struktur molekul N-(hidroksietil)-p-metoksi sinamamida
tersusun dari molekul-molekul yang bersifat sedikit polar dikarenakan adanya
gugus amida. Oleh karena itu, komposisi fase gerak yang digunakan untuk
memisahkan N-(hidroksietil)-p-metoksi sinamamida terdiri dari campuran
pelarut organik metanol dan akuabides agar diperoleh fase gerak yang mampu
membawa N-(hidroksietil)-p-metoksi sinamamida dan memisahkannya dari
pengotor dalam plasma.

32
N-(hidroksietil)-p-metoksi sinamamida diujikan pada beberapa

komposisi fase gerak. Komposisi fase gerak yang pertama kali diujikan adalah
metanol 100% dengan laju alir 1,0 mL/menit. Pada komposisi fase gerak ini,
diperoleh kromatogram tunggal dengan waktu retensi sekitar 1,863 menit.
Gambar 4.1. Kromatogram N-(hidroksietil)-p-metoksi sinamamida

menggunakan fase gerak metanol 100%
Kemudian komposisi fase gerak diubah menjadi metanol-akuabides

dengan perbandingan (70:30), (60:40), dan (40:60) masing-masing dengan laju
alir 1,0 mL/menit. Pada komposisi fase gerak metanol-akuabides (70:30) dan
laju alir 1,0 mL/menit, N-(hidroksietil)-p-metoksi sinamamida muncul pada
waktu retensi 2,873 menit, dan pada komposisi fase gerak (60:40) muncul
pada waktu retensi 3,800 menit. Sedangkan pada komposisi fase gerak
metanol-akuabides (40:60) muncul pada waktu retensi sekitar 7,247 menit.
Gambar 4.2 Kromatogram N- Gambar 4.3 Kromatogram N-

(hidroksietil)-p-metoksi sinamamida (hidroksietil)-p-metoksi sinamamida
menggunakan fase gerak metanol : menggunakan fase gerak metanol :
akuabides (70:30) akuabides (60:40)

33
Gambar 4.4. Kromatogram N-(hidroksietil)-p-metoksi sinamamida

menggunakan fase gerak metanol : akuabides (40:60)
Pada fase gerak metanol-akuabides (70:30) dan (60:40) muncul disekitar

menit kedua, sedangkan pengotor plasma umumnya muncul disekitar menit
kedua, sehingga fase gerak tersebut tidak dapat digunakan. Komposisi fase
gerak yang dapat digunakan adalah metanol-akuabides dengan perbandingan
40:60 karena dengan kondisi fase gerak ini pada kromatogram plasma blangko
tidak ada puncak yang mengganggu pada waktu retensi N-(hidroksietil)-p-
metoksi sinamamida.
Komposisi fase gerak metanol-akuabides (40:60) memberikan hasil
dengan waktu retensi 7,247 menit, dan asimetrisitas (Tf) 1,57, jumlah
lempeng teoritis (N) 163, dan HETP 0,920. Dari hasil percobaan, komposisi
fase gerak tersebut memberikan jumlah lempeng teoritis yang kecil yang
menunjukkan keefisienan kolom yang kurang baik. Adapun asimetrisitas
kromatogram senyawa yang diperoleh kurang dari 2,5 yang berarti sudah
memenuhi persyaratan, dengan komposisi fase gerak ini N-(hidroksietil)-p-
metoksi sinamamida dapat terpisah dengan baik dari pengotor plasma.

34
Tabel. 4.1 Data hubungan antara waktu retensi, jumlah lempeng teoritis dan
asimetrisitas terhadap perubahan komposisi fase gerak
Waktu Lempeng
Fase Gerak (v/v) Retensi Teoritis HETP Asimetri
(menit) (N)
Metanol 100% 1,863 141 1,064 1,36
Metanol-akuabides (70:30) 2,873 77 1,948 2,38
Dari hasil optimasi ini, maka diperoleh suatu kondisi analisis N-

(hidroksietil)-p-metoksi sinamamida di dalam plasma dengan ketentuan
sebagai berikut:
HPLC merk Dionex UltiMate® 3000 dilengkapi
Spesifikasi alat dengan; pompa, autosampler, detektor DAD
(Diode Array Detector).
Acclaim® Polar Advantage II (C18; 3 µm; 4,6 x
Kolom
150 mm)
Fase Gerak Metanol : Akuabides (40:60)
Laju Alir 1,0 mL/menit
Teknik Isokratik
Panjang Gelombang 290 nm
Volume Injeksi 20 µL
Suhu Kolom Ambient
Waktu Akuisisi 15 menit
4.3 Uji Kesesuaian Sistem

Uji kesesuaian sistem perlu dilakukan sebelum validasi metode analisis
dilakukan. Uji kesesuaian sistem bertujuan untuk menjamin bahwa sistem operasional
KCKT yang tersedia memberikan hasil yang sesuai dengan tujuan analisis. Hal ini
dilakukan karena terdapat variasi dalam peralatan dan teknis analisis. Uji kesesuaian
sistem dilakukan sebanyak 5 kali penyuntikan.

35
Parameter yang berguna untuk uji kesesuaian sistem adalah keberulangan

penyuntikan larutan baku yang dinyatakan dalam standar deviasi relatif (RSD) yang
dinyatakan dalam persen bila tidak dinyatakan lain dalam monografi baku yang
digunakan dengan nilai RSD kurang dari 2% (Farmakope Indonesia edisi IV).
Menurut USP, ada beberapa parameter yang dijadikan rujukan untuk
menunjukkan bahwa metode telah sesuai dengan sistem yang tersedia. Parameter-
parameter tersebut meliputi: jumlah lempeng teoritis (N), asimetrisitas, faktor
kapasitas dan nilai standar deviasi relatif (RSD) tinggi puncak dan luas area dari
serangkaian injeksi. Suatu metode dinyatakan memenuhi syarat uji kesesuaian sistem
bila minimal ada 2 parameter yang memenuhi persyaratan dari beberapa parameter
yang diujikan.
Dari uji kesesuaian sistem, diperoleh rata-rata waktu retensi N-(hidroksietil)-p-
metoksi sinamamida muncul pada menit 7,258 dengan rata-rata nilai area N-
(hidroksietil)-p-metoksi sinamamida pada 5 kali penyuntikan adalah 65,062 mAu
dengan % RSD luas area sebesar 0,042%. Data uji kesesuaian sistem dapat dilihat
pada tabel 4.2 dan data selengkapnya tercantum dalam lampiran 5 tabel 5.1.
Tabel 4.2 Hasil uji rata-rata kesesuaian sistem analisis N-(hidroksietil)-p-metoksi

sinamamida menggunakan fase gerak metanol : akuabides (40:60 (v/v))
Parameter Syarat Hasil yang diperoleh Kesimpulan

RSD waktu retensi <2% 0,493 % ✓
RSD luas area <2% 0,042 % ✓
Lempeng teoritis ≥2500 103,6 ✖
Asimetrisitas <2,5 2,24 ✓
Nilai jumlah lempeng teoritis dan asimetrisitas menunjukkan kinerja kolom

dalam memisahkan komponen dengan menggunakan metode tersebut. Semakin besar
nilai lempeng teoritis berarti semakin efisien suatu kolom dalam memisahkan
komponen menggunakan metode tersebut. Asimetrisitas menunjukkan bentuk puncak
N-(hidroksietil)-p-metoksi sinamamida yang simetris atau tidak memiliki pengekoran.
Dari uji kesesuaian sistem ini, fase gerak yang ditetapkan telah memberikan hasil
parameter yang telah memenuhi persyaratan uji kesesuaian sistem, kecuali untuk
parameter lempeng teoritis yang kurang dari kondisi ideal.

36
4.4 Penetapan Metode Ekstraksi

Sebelum dianalisis menggunakan KCKT, N-(hidroksietil)-p-metoksi
sinamamida dalam plasma perlu diekstraksi terlebih dahulu, terutama protein yang
ada dalam plasma. Ekstraksi N-(hidroksietil)-p-metoksi sinamamida dalam plasma
dilakukan dengan menggunakan pelarut organik, yaitu metanol. Penyiapan sampel
dengan menggunakan metanol sebagai pengendap protein ini bertujuan untuk
memisahkan analit dari gangguan yang ada dalam plasma seperti protein dan senyawa
endogen lainnya. Penambahan larutan organik seperti metanol pada larutan protein
dalam air akan menurunkan konstanta dielektrik air yang meningkatkan tarikan antara
molekul-molekul bermuatan dan memfasilitasi interaksi elektrostatik protein. Selain
itu pelarut organik juga akan menggantikan beberapa molekul air disekitar daerah
hidrofob dari permukaan protein yang berasosiasi dengan protein sehingga
menurunkan konsentrasi air dalam larutan dengan demikian kelarutan protein akan
menurun dan memungkinkan terjadinya pengendapan.
Pada penelitian ini, ekstraksi dilakukan dengan menambahkan sejumlah metanol
ke dalam plasma. Komposisi yang diujikan adalah metanol-plasma dengan
perbandingan 1 : 1 dan 4 : 1, kemudian dilakukan perngamatan kromatogram plasma
blangko dengan melihat apakah pada daerah waktu retensi N-(hidroksietil)-p-metoksi
sinamamida terdapat pengotor plasma atau tidak. Hasil yang diperoleh dari kedua
komposisi metanol yang diujikan untuk mengendapkan protein adalah tidak satupun
komposisi pelarut yang menghasilkan puncak pengotor pada waktu retensi N-
(hidroksietil)-p-metoksi sinamamida saat analisis dilakukan. Gambar dapat dilihat
pada Gambar 4.5 dan 4.7.
Kemudian dilakukan ekstraksi dengan proses yang sama pada plasma yang
telah mengandung N-(hidroksietil)-p-metoksi sinamamida. Selanjutnya dilakukan
pengamatan kromatogram plasma yang mengandung N-(hidroksietil)-p-metoksi
sinamamida dengan membandingkan luas area, jumlah lempeng teoritis, resolusi, dan
asimetrisitas puncak N-(hidroksietil)-p-metoksi sinamamida pada masing-masing
perbandingan metanol untuk mengendapkan protein. Gambar dapat dilihat pada
gambar 4.6 dan gambar 4.8. Berikut data hasil analisis N-(hidroksietil)-p-metoksi
sinamamida yang diekstraksi dengan beberapa perbandingan metanol dapat dilihat
pada tabel 4.3.

37
Tabel 4.3 Hasil optimasi pengendapan protein
Pengendap Luas Area Lempeng

Resolusi Asimetrisitas
Protein (mAU) Teoritis
1x Metanol 3,857 46 0,72 1,13
4x Metanol 1,914 194 3,37 1,19
Gambar 4.5 Kromatogram plasma blangko Keterangan: A. Pengotor plasma, B. N-HEPMS

dengan perbandingan metanol - plasma (1:1) Gambar 4.6 Kromatogram N-(hidroksietil)-
dengan fase gerak metanol-air (40:60v/v), p-metoksi sinamamida dalam plasma dengan
kecepatan alir 1,0 mL/menit, panjang perbandingan metanol - plasma (1:1) dengan
gelombang 290 nm dan volume penyuntikan fase gerak metanol-air (40:60v/v), kecepatan
20,0 µL alir 1,0 mL/menit, panjang gelombang 290
nm dan volume penyuntikan 20,0 µL
Gambar 4.7 Kromatogram plasma blangko Keterangan: A. Pengotor plasma, B. N-HEPMS

dengan perbandingan metanol - plasma (4:1) Gambar 4.8 Kromatogram N-(hidroksietil)-
dengan fase gerak metanol-air (40:60v/v), p-metoksi sinamamida dalam plasma
kecepatan alir 1,0 mL/menit, panjang dengan perbandingan metanol - plasma (4:1)
gelombang 290 nm dan volume penyuntikan dengan fase gerak metanol-air (40:60v/v),
20,0 µL kecepatan alir 1,0 mL/menit, panjang
gelombang 290 nm dan volume penyuntikan
20,0 µL

38
Dari data diatas, dengan membandingkan kedua komposisi metanol yang

digunakan untuk mengendapkan protein plasma dapat dilihat bahwa pada
penambahan metanol 4 kali volume plasma memberikan pemisahan yang paling baik
dengan pengotor dalam plasma, yaitu dengan nilai resolusi 3,37 dimana telah
memenuhi persyaratan resolusi ≥1,5, serta menghasilkan puncak senyawa dengan
kriteria puncak yang paling baik. Hal ini dapat dilihat dari nilai resolusi yang lebih
besar, nilai lempeng teoritis yang lebih besar, serta asimetrisitas yang kecil bila
dibandingkan dengan penambahan metanol 1 kali volume plasma.
Nilai resolusi yang besar menyatakan metode ekstraksi menggunakan metanol 4
kali volume plasma dapat memisahkan puncak pengotor plasma yang muncul pada
waktu retensi sekitar 1,753 dengan puncak N-(hidroksietil)-p-metoksi sinamamida
yang muncul pada waktu retensi sekitar 7,237 dengan pemisahan yang paling baik.
4.5 Validasi Metode Analisis N-(hidroksietil)-p-metoksi sinamamida dalam Plasma

secara In Vitro
4.5.1 Pengukuran Batas Kuantifikasi Terendah (LLOQ)
Pengukuran sebanyak 5 konsentrasi larutan N-(hidroksietil)-p-metoksi
sinamamida dalam plasma dengan konsentrasi 10,08 µg/mL; 15,12 µg/mL;
20,16 µg/mL; 30,24 µg/mL; dan 40,32 µg/mL menghasilkan persamaan
regresi y = 0,361x - 1,7941 dengan linieritas koefisien korelasi 0,9953. Dari
hasil pengolahan data diperoleh LOQ 9,675 µg/mL.
Kemudian LLOQ dibuat dengan cara mengencerkan ½ konsentrasi LOQ.
LLOQ merupakan standar terendah pada kurva kalibrasi yang dapat diterima
(Food and Drug Administration, 2001). Pada penelitian ini, konsentrasi LLOQ
yang dibuat adalah 5,04 µg/mL.
4.5.2 Pembuatan Kurva Kalibrasi dan Uji Linieritas dalam Plasma secara In Vitro
Kurva kalibrasi merupakan hubungan antrara respon instrumen dan
konsentrasi analit yang diketahui. Untuk analisis N-(hidroksietil)-p-metoksi
sinamamida dalam plasma, kurva kalibrasi terdiri dari plasma blangko (plasma
tanpa penambahan N-(hidroksietil)-p-metoksi sinamamida) dan 6 konsentrasi
N-(hidroksietil)-p-metoksi sinamamida dalam plasma (termasuk LLOQ) yaitu
5,04 µg/mL; 10,08 µg/mL; 15,12 µg/mL; 20,16 µg/mL; 30,24 µg/mL; dan

39
40,32 µg/mL. Persamaan garis kurva kalibrasi yang diperoleh adalah y =

0,3559x - 1,6435 dengan koefisien korelasi 0,9962; dimana x adalah
konsentrasi senyawa dan y adalah luas area senyawa. Koefisien korelasi ini
mendekati persyaratan nilai koefisien korelasi yang ideal sehingga dapat dapat
disimpulkan bahwa metode analisis N-(hidroksietil)-p-metoksi sinamamida
dalam plasma dengan konsentrasi 5,04 – 40,32 µg/mL memenuhi kriteria uji
linieritas dan dapat diterima untuk suatu metode analisis yang valid. Pada
analisis senyawa dalam plasma, nilai koefisien korelasi yang dapat diterima
adalah lebih dari 0,95 (Food and Drug Administration, 1998). Kurva kalibrasi
dalam plasma dapat dilihat pada gambar 4.9. Kemudian dari pengolahan data
kurva kalibrasi tersebut diperoleh nilai LOD 2,982 µg/mL dan LOQ 9,037
µg/mL.
Kurva Kalibrasi N-(hidroksietil)-p-

metoksi sinamamida dalam Plasma
14.00
Rata-rata luas area (mAU)
12.00
10.00
8.00
6.00
4.00
2.00
0.00
0 10 20 30 40 50
Konsentrasi (µg/mL)
Gambar 4.9 Kurva Kalibrasi N-(hidroksietil)-p-metoksi sinamamida dalam

plasma
4.5.3 Uji Selektivitas

Selektivitas adalah kemampuan metode analisis untuk membedakan dan
mengukur secara kuantitatif analit dengan adanya komponen lain di dalam
sampel (Food and Drug Administration, 2001). Pada percobaan ini komponen
lain tersebut adalah pengotor plasma. Uji selektivitas ini dilakukan terhadap
enam plasma manusia dari sumber yang berbeda pada konsentrasi LLOQ yaitu
5,04 µg/mL, diperoleh nilai koefisien variasi 2,123% dan % diff antara 8,795%

40
sampai 15,045% serta tidak terdapat puncak pengotor plasma yang muncul
pada kromatogram. Data hasil uji selektivitas dapat dilihat pada lampiran 8
tabel 5.4.
4.5.4 Uji Akurasi, Presisi dan Perolehan Kembali (% recovery)

Uji akurasi bertujuan memperoleh data kedekatan nilai rata-rata hasil uji
yang diperoleh dengan nilai konsentrasi analit sebenarnya. Untuk analisis
dalam matriks biologis, selisih hasil analisis dengan nilai konsentrasi yang
sebenarnya adalah + 15%, kecuali jika pengukuran dilakukan pada kadar
LLOQ maka tidak boleh melebihi 20% dan nilai dari uji perolehan kembali
berada dalam rentang 80-120% (Food and Drug Administration, 2001).
Perolehan kembali analit tidak harus 100% namun tingkat perolehan kembali
analit harus konsisten, presisi, dan reprodusibel (Food and Drug
Administration, 2001).
Uji presisi bertujuan memperoleh data kedekatan hasil uji yang satu
dengan yang lainnya. Pengukuran presisi pada setiap level konsentrasi, harus
memiliki nilai koefesien variasi (KV) tidak lebih dari 15%, kecuali LLOQ
dimana nilai KV tidak boleh lebih dari 20% (Food and Drug Administration,
2001). Pada penelitian ini, uji akurasi dan presisi dilakukan selama 2 hari.
Uji akurasi dan presisi digunakan larutan N-(hidroksietil)-p-metoksi
sinamamida dalam plasma dengan tiga konsentrasi, yaitu konsentrasi rendah,
sedang, dan tinggi (Food and Drug Administration,2001). Pada penelitian ini,
konsentrasi rendah yang digunakan adalah 12,096 µg/mL, konsentrasi sedang
18,144 µg/mL dan konsentrasi tinggi 28,224 µg/mL. Pada uji akurasi dan
presisi hari ke-1, hasil rata-rata % diff yang diperoleh untuk konsentrasi
rendah, sedang, dan tinggi berturut-turut sebesar 7,204%, 4,628%, dan 3,230%
dengan nilai koefisien variasi (%KV) diperoleh 1,158%, 2,705%, dan 1,707%
untuk konsentrasi rendah, sedang dan tinggi. Sedangkan pada pengujian hari
ke-2, hasil rata-rata % diff yang diperoleh untuk konsentrasi rendah, sedang,
dan tinggi berturut-turut sebesar 5,295%, 6,597%, dan 7,974% dengan nilai
koefisien variasi sebesar 4,306%, 3,307% dan 0,439% untuk konsentrasi
rendah, sedang dan tinggi.

41
Adapun pada uji perolehan kembali hari ke-1, diperoleh rata-rata

%recovery untuk konsentrasi rendah sebesar 107,204%, konsentrasi sedang
104,628% dan konsentrasi tinggi 103,320%. Adapun pada hari ke-2, diperoleh
rata-rata %recovery untuk konsentrasi rendah sebesar 105,295%, konsentrasi
sedang 106,597% dan konsentrasi tinggi 107,974%. Dari hasil percobaan ini,
uji akurasi, presisi, dan perolehan kembali analisis N-(hidroksietil)-p-metoksi
sinamamida dalam plasma yang dilakukan sudah memenuhi kriteria yang
dipersyaratkan. Hasil uji rata-rata dapat dilihat pada tabel 4.4 dan data
selengkapnya dapat dilihat pada lampiran 9 tabel 5.5 untuk hari ke-1 dan tabel
5.6 untuk hari ke-2.
Tabel 4.4 Hasil uji akurasi, presisi dan perolehan kembali hari ke-1
Luas Konsentrasi
Konsentrasi KV
area terukur %diff %recovery SD
(µg/mL) (%)
(mAU) (µg/mL)
12,096 2,972 12,967 7,204 107,204 0,150 1,158
18,144 5,106 18,984 4,628 104,628 0,514 2,705
28,224 8,726 29,136 3,230 103,230 0,497 1,707

BAB V
KESIMPULAN DAN SARAN
5.1 Kesimpulan
1. Kondisi optimum untuk analisis N-(hidroksietil)-p-metoksi
sinamamida menggunakan KCKT dapat dilakukan dengan detektor
DAD, kolom Acclaim® Polar Advantage II C18 dengan panjang
kolom 4,6 x 150 mm ukuran partikel 3 µm; fase gerak metanol
akuabides (40:60); laju alir 1,0 mL/menit; volume injeksi 20 µL;
waktu akuisisi 15 menit dan dideteksi pada panjang gelombang 290
nm.
2. N-(hidroksietil)-p-metoksi sinamamida dalam plasma diekstraksi
dengan cara pengendapan protein dengan mencampurkan metanol
pada perbandingan metanol-plasma 4:1, lalu di vortex selama 20 detik
kemudian disentrifugasi pada kecepatan 3000 rpm selama 10 menit.
3. Dari hasil validasi diperoleh nilai LLOQ sebesar 5,04 µg/mL, pada
rentang konsentrasi 5,04 – 40,32 µg/mL dihasilkan kurva kalibrasi N-
(hidroksietil)-p-metoksi sinamamida yang linier dengan koefisien
korelasi (r) 0,9962, akurasi (%diff) dari metode ini antara -2,961%
sampai 11,954% dengan presisi (KV) antara 0,439% sampai 4,306%.
Hasil validasi metode tersebut menunjukkan bahwa metode analisis
telah memenuhi kriteria linieritas, presisi, dan akurasi sesuai ketentuan
yang berlaku sehingga dapat digunakan untuk analisis N-
(hidroksietil)-p-metoksi sinamamida dalam plasma.
5.2 Saran
1. Disarankan untuk dapat dilakukan pengembangan metode validasi
analisis N-(hidroksietil)-p-metoksi sinamamida dalam plasma secara
in vitro yang lebih lengkap.
2. Dapat dilakukan analisis -(hidroksietil)-p-metoksi sinamamida secara
in vivo untuk penelitian lebih lanjut.

DAFTAR PUSTAKA
Anonim. (1995). Farmakope Indonesia edisi IV. Jakarta: Departemen Kesehatan

RI.
Barus, Rosbina. (2009). Amidasi Etil p-Metoksi Sinamat yang Diisolasi dari
Kencur (Kaempferia galanga, L) melalui Amidasi dengan Dietanolamin.
Skripsi. Medan: Universitas Sumatera Utara.
Effendy. (2004). Kromatografi Cair Kinerja Tinggi dalam Bidang Farmasi.

Sumatera Utara: FMIPA USU.
Evans, G. (2004). A Handbook of Bioanalysis and Drug Metabolism. USA: CRC

Press.
Food and Drug Administration. (2001). Bioanalytical Method Validation.

Rockville: Center for Veterinary Medicine.
Food and Drug Administration. 1988. Guidance for Industry: Bioanalytical

Methods Validation for Human Studies. Rockville: Center for Drug
Evaluation and Research (CDER).
Gandjar, I. G. dan Abdul Rohman. (2007). Kimia Farmasi Analisis. Yogyakarta:

Pustaka Pelajar.
Ganong, W.F. (2001). Fisiologi kedokteran Edisi 20. Terj. Djauhari W, Dewi I,
dan Minarma S. Jakarta: ECG.
Harahap, Y. (2010). Peran Bioanalisis dalam Penjaminan Kualitas Obat dan

Peningkatan Kualitas Hidup Pasien. Depok: UI Press.
Harmita. (2006). Analisis Fisikokimia. Departemen Farmasi FMIPA UI.

44
Johnson, E.L. dan R.Stevenson. (1991). Dasar Kromatografi Cair. Terj. Kosasih
Padmawinata. Bandung: Penerbit ITB Press.
Meyer, Veronica R. (2010). Practical High-Performance Liquid Chromatography

5th Edition. Chichester: Wiley.
Pudjiadi, Anna. (1994). Dasar-Dasar Biokimia. Jakarta: UI Press. Hal. 209-212.
Ravichandran V, Shalini S, Sundram K. M., & Rajak, H. (2010). Validation Of

Analytical Methods – Strategies & Importance. International Journal of
Pharmacy and Pharmaceutical Sciences, 2(3), 18-22.
Reza, Muhammad. (2015). Amidasi Senyawa Etil p-metoksisinamat Melalui

Reaksi Langsung dengan Iradiasi Microwave Serta Uji Aktivitas Sebagai
Antiinflamasi. Skripsi. Jakarta: UIN Syarif Hidayatullah.
Rosenbaum, Sara E. (2011). Basic Pharmaceutics and Pharmacodynamics. USA:

John Wiley and Sons.
Sadikin, Mohammad. (2001). Biokimia Darah. Jakarta: Widya Medika.
Shargel, Leon dan Andrew B.C. (2005). Biofarmasetika dan Farmakokinetika

Terapan Edisi Kedua. Surabaya: Airlangga University Press.
Sherwood, Lauralee. (1996). Fisiologi Manusia Dari Sel ke Sistem Edisi Kedua.
Terj. Brahm U. Pendit. Jakarta: Penerbit Buku Kedokteran EGC.
Sukandar. E. Y. 2006. Tren dan Paradigma Dunia Farmasi. Industri-Klinik-

Teknologi Kesehatan. disampaikan dalam orasi ilmiah Dies Natalis ITB,
http://itb.ac.id/focus/focus_file/orasi-ilmiah-dies-45.pdf. diakses 10
Maret 2016.

45
Swarbick, J. Jammes C. B. (1988). Encyclopedia of Pharmaceutical Technology

(3th ed). New York: Informa Healthcare USA, Inc
.
Syaifuddin, H. (2006). Anatomi Fisiologi Untuk Mahasiswa Keperawatan Edisi 3.
Jakarta: Penerbit Buku Kedokteran EGC.
United States of Pharmacopeia (30th ed). (2006). USA: The United States
Pharmacopeial Convention.
Williams, LAD; A.O Connar; L. Latore; O Dennis; S.Ringer; J.A Whittaker; J

Conrad; B.Vogler; H Rosner; W Krause. (2008). The In Vitro Anti –
denaturation Effects Induced by Natural Product and No-steroidal
Compounds in Heat Treated (Immunogenic) Bovine Serum Albumin is
Proposed as a Sreening Assay for the Detection of Anti-inflmmatory
compounds, without the Use of Animals, in the Early Stages of The Drug
Discovery Process. West Indian Medical 57 (4), 327.

46
Lampiran I. Alur penelitian
Modifikasi Etil-p-metoksisinamat melalui reaksi amidasi

menghasilkan N-(hidroksietil)-p-metoksi sinamamida terbukti
meningkatkan aktivitas anti-inflamasi
Tergolong senyawa baru
Dilakukan analisis N-(hidroksietil)-p-metoksi sinamamida dalam

plasma menggunakan KCKT
Optimasi kondisi analisis N-(hidroksietil)-p-metoksi sinamamida
Penetapan panjang Pemilihan komposisi

gelombang optimum dengan fase gerak
spektrofotometer Uv-Vis
Penetapan metode
Uji kesesuaian sistem
ekstraksi
Kurva
Pengukuran
kalibrasi dan
LLOQ Validasi metode
Uji linearitas
analisis
LOD, LOQ Uji akurasi Uji

dan presisi selektivitas

47
Lampiran 2. Perhitungan pembuatan larutan
1. Larutan induk N-(hidroksietil)-p-metoksi sinamamida

Dibuat dengan menimbang 50,4 mg N-(hidroksietil)-p-metoksi
sinamamida lalu dimasukkan kedalam labu ukur 50 mL, kemudian
dicukupkan dengan metanol hingga tanda batas.
Sehingga diperoleh konsentrasi larutan induk :
= 1008,0 µg/mL
2. Larutan N-(hidroksietil)-p-metoksi sinamamida 100,8 µg/mL

Diencerkan dari larutan 1008 µg/mL dibuat dalam labu ukur 50 mL.
V1 x C1 = V2 x C2
█ x 1008 µg/mL = 50 mL x 100,8 µg/mL
█ = 5,0 mL
3. Larutan N-(hidroksietil)-p-metoksi sinamamida 10,08 µg/mL
Diencerkan dari larutan 1008 µg/mL dibuat dalam labu ukur 50 mL.
V1 x C1 = V2 x C2
█ x 1008 µg/mL = 50 mL x 10,08 µg/mL
█ = 0,5 mL
4. Larutan N-(hidroksietil)-p-metoksi sinamamida dalam plasma dengan seri
konsentrasi 5,04 µg/mL; 10,08 µg/mL; 15,12 µg/mL; 20,16 µg/mL; 30,24
µg/mL; 40,32 µg/mL. Diencerkan dari larutan N-(hidroksietil)-p-metoksi
sinamamida 100,8 µg/mL dibuat dalam labu ukur 5 mL.
Konsentrasi larutan Volume Konsentrasi Volume larutan

N-(hidroksietil)-p- plasma larutan N- N-(hidroksietil)-
metoksi (mL) (hidroksietil)-p- p-metoksi
sinamamida dalam metoksi sinamamida yang
plasma yang sinamamida ditambahkan
diinginkan (µg/mL) (µg/mL) (µL)
5 5 100 25
10 5 100 50
15 5 100 75
20 5 100 100
30 5 100 150
40 5 100 200
48
Lampiran 3. Spektrum serapan N-(hidroksietil)-p-metoksi sinamamida pada

spektrofotometer UV-Vis
Keterangan
N-(hidroksietil)-p-metoksi sinamamida
Konsentrasi : 5,04 µg/mL
Serapan : 0,695
Panjang gelombang maksimum : 290 nm
Gambar 5.1 Spektrum serapan N-(hidroksietil)-p-metoksi sinamamida pada

spektofotometer UV-Vis

49
Lampiran 4. Kromatogram Hasil Analisis
Gambar 5.3 Kromatogram Plasma Blangko
Gambar 5.4 Kromatogram N-(hidroksietil)-p-metoksi sinamamida dalam plasma

50
Lampiran 5. Uji kesesuaian sistem
Tabel 5.1 Data hasil uji kesesuaian sistem

Lempeng
Waktu retensi Luas area
teoritis HETP Asimetrisitas
(menit) (mAU)
(N)
7,237 65,077 84 1,786 2,53
7,307 65,089 104 1,442 2,31
7,280 65,030 90 1,667 2,47
7,247 65,035 163 0,920 1,57
7,217 65,077 77 1,948 2,34
Rata-rata : 65,062 104 1,553 2,24
Hasil Parameter Uji :

Lempeng teoritis (>2500) : 103,6
Asimetris (<2,5) : 2,244
RSD waktu retensi (2%) : 0,493 %
RSD luas area (<2%) : 0,042 %

51
Lampiran 6. Pengukuran Batas Kuantifikasi Terendah (LLOQ)
Tabel 5.2 Data pengukuran kurva kalibrasi N-(hidroksietil)-p-metoksi

sinamamida dalam plasma untuk penentuan LLOQ
Luas area
Luas Rata-rata Konsentrasi
Kons berdasarkan
area luas area terukur %diff [Y-Y1] [Y-Y1]2
(µg/mL) persamaan
(mAU) (mAU) (µg/mL)
regresi (Y1)
1,899
10,08 1,914 1,880 10,178 0,968 1,845 0,035 0,001
1,826
3,321
15,12 3,335 3,346 14,239 -5,830 3,664 -0,318 0,101
3,381
5,613
20,16 5,627 5,618 20,532 1,846 5,484 0,134 0,018
5,614
9,530
30,24 9,528 9,537 31,388 3,797 9,123 0,414 0,172
9,553
12,588
40,32 12,289 12,490 39,568 -1,865 12,761 -0,271 0,074
12,592
N-(hidroksietil)-p-metoksi
sinamamida dalam Plasma
15.00
10.00
5.00
0.00
0 10 20 30 40 50
Gambar 5.5 Kurva kalibrasi N-(hidroksietil)-p-metoksi sinamamida dalam plasma
Keterangan :
- Persamaan garis : y = 0,361x - 1,7941
- Koefisien korelasi : r2 = 0,9953
Diketahui :
̄ ⁄
SD = √ = 0,349 LOQ = = 9,675 µg/mL
b = 0,361
⁄ LLOQ = ½ x 9,675 µg/mL
LOD = = 3,193 µg/mL
= ± 5,04 µg/mL
52
Lampiran 7. Hasil pengukuran kurva kalibrasi N-(hidroksietil)-p-metoksi

sinamamida dalam plasma
Tabel 5.3 Data kurva kalibrasi N-(hidroksietil)-p-metoksi sinamamida dalam

plasma
Luas area
Luas Rata-rata Konsentrasi
Kons berdasarkan
area luas area terukur %diff [Y-Y1] [Y-Y1]2
(µg/mL) persamaan
(mAU) (mAU) (µg/mL)
regresi (Y1)
0,316
5,040 0,322 0,315 5,503 9,186 0,150 0,165 0,027
0,308
1,899
10,08 1,914 1,880 9,900 -1,783 1,944 -0,064 0,004
1,826
3,321
15,12 3,335 3,346 14,019 -7,279 3,738 -0,392 0,153
3,381
5,613
20,16 5,627 5,618 20,403 1,206 5,531 0,087 0,007
5,614
9,530
30,24 9,528 9,537 31,415 3,885 9,119 0,418 0,175
9,553
12,588
40,32 12,289 12,490 39,712 -1,508 12,706 -0,216 0,047
12,592
Kurva Kalibrasi N-(hidroksietil)-p-metoksi

sinamamida dalam Plasma
15.00
10.00
5.00
0.00
0 10 20 30 40 50
Gambar 5.6 Kurva kalibrasi N-(hidroksietil)-p-metoksi sinamamida dalam plasma
Keterangan :
- Persamaan garis : y = 0,3559x - 1,6435
- Koefisien korelasi : r2 = 0,9962
⁄
LOD = = 2,982 µg/Ml
̄
SD = √ = 0,322 ⁄
LOQ = = 9,037 µg/mL
b = 0,3559
53
(lanjutan)
Kondisi analisis :
Kolom : Acclaim® Polar Advantage II (C18; 3 µm; 4,6 x 150 mm)
Fase Gerak : Metanol : akuabides (40:60)
Laju Alir : 1,0 mL/menit
Teknik : Isokratik
Panjang Gelombang : 290 nm
Volume Injeksi : 20 µL
Suhu Kolom : Ambient
Waktu Akuisisi : 15 menit

54
Lampiran 8. Uji selektivitas N-(hidroksietil)-p-metoksi sinamamida dalam

plasma
Tabel 5.4 Data uji selektivitas N-(hidroksietil)-p-metoksi sinamamida dalam

plasma
Luas Kons Rata-rata

Kons KV
Plasma area terukur kons terukur SD %diff
(µg/mL) (%)
(mAU) (µg/mL) (µg/mL)
A 0,316 5,505 9,219
B 0,324 5,527 9,665
C 0,362 5,634 5,599 0,119 2,123 11,778
5,040
D 0,366 5,647 12,034
E 0,420 5,798 15,045
F 0,308 5,483 8,795

55
Lampiran 9. Uji akurasi dan presisi N-(hidroksietil)-p-metoksi sinamamida

dalam plasma
Tabel 5.5 Data uji akurasi, perolehan kembali (%recovery), dan presisi N-
(hidroksietil)-p-metoksi sinamamida dalam plasma, Hari ke-1
Luas Konsentrasi
Konsentrasi KV
(µg/mL) (%)
(mAU) (µg/mL)
2,882 12,716 5,127 105,127
12,096 2,983 12,998 7,457 107,457
0,150 1,158
3,050 13,188 9,028 109,028
Rata-rata 2,972 12,967 7,204 107,204
5,435 19,890 9,621 109,621
18,144 5,026 18,740 3,287 103,287
0,514 2,705
4,877 18,321 0,976 100,976
Rata-rata 5,106 18,984 4,628 104,628
8,921 29,683 5,171 105,171
28,224 8,852 29,489 4,482 104,482
0,497 1,707
8,405 28,235 0,038 100,038
Rata-rata 8,726 29,136 3,230 103,230
Tabel 5.6 Data uji akurasi, perolehan kembali (%recovery), dan presisi N-
(hidroksietil)-p-metoksi sinamamida dalam plasma, Hari ke-2
Luas Konsentrasi
Konsentrasi KV
(µg/mL) (%)
(mAU) (µg/mL)
2,534 11,738 -2,961 97,039
12,096 3,045 13,173 8,902 108,902
0,548 4,306
3,090 13,299 9,945 109,945
Rata-rata 2,906 12,737 5,295 105,295
4,868 18,295 0,831 100,831
18,144 5,586 20,313 11,954 111,954
0,640 3,307
5,266 19,415 7,007 107,007
Rata-rata 5,240 19,341 6,597 106,597
9,167 30,375 7,623 107,623
28,224 9,289 30,718 8,835 108,835
0,134 0,439
9,151 30,331 7,464 107,464
Rata-rata 9,202 30,475 7,974 107,974

56
Lampiran 10. Rumus-rumus
Tabel 5.7 Rumus-Rumus
Rumus Formula
S(y/x) ̄
SD = √
LOD ⁄
LOD =
LOQ ⁄
LOQ =
% diff % diff = x 100%
% recovery % recovery = x 100%
SD ̄
SD = √
KV
̄

57
Lampiran 11. Alat Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT)
C
F
Keterangan :
A : Wadah penampungan fase gerak
B : Pompa
C : Autosampler
D : Oven kolom
E : Detektor DAD (Diode Array Detector)
F : Komputer dengan perangkat lunak Chromeleon®
Gambar 5.7 Alat Kromatografi Cair Kinerja Tinggi Dionex Ultimate® 3000

58
Lampiran 12. Dokumentasi Penelitian
Gambar 5.8. Kolom KCKT Gambar 5.12 Senyawa dalam plasma
Gambar 5.9 Plasma Gambar 5.13 Penyaring fase gerak
Gambar 5.10 Pot penyimpanan Gambar 5.14 Sonikator

sampel
Gambar 5.11 Vial penyuntikan Gambar 5.15 Sentrifus

KCKT

Elsa Rahmi-FKIK PDF

Diunggah oleh

Informasi Dokumen

Judul Asli

Hak Cipta

Format Tersedia

Bagikan dokumen Ini

Bagikan atau Tanam Dokumen

Opsi Berbagi

Apakah menurut Anda dokumen ini bermanfaat?

Apakah konten ini tidak pantas?

Hak Cipta:

Format Tersedia

Elsa Rahmi-FKIK PDF

Diunggah oleh

Hak Cipta:

Format Tersedia

UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA

Validasi Metode Analisis N-(hidroksietil)-p-metoksi

FAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU KESEHATAN

Validasi Metode Analisis N-(hidroksietil)-p-metoksi

FAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU KESEHATAN

Nama : Elsa Rahmi

N-(hidroksietil)-p-metoksi sinamamida merupakan senyawa hasil modifikasi etil

Kata kunci: Kromatografi Cair Kinerja Tinggi, N-(hidroksietil)-p-metoksi

Name : Elsa Rahmi

N-(hydroxyethyl)-p-methoxycinnamamide is a modified compound of ethyl p

Keyword: High Performance Liquid Chromatography, method validation, N-

BAB I PENDAHULUAN ......................................................................... 1

BAB II TINJAUAN PUSTAKA ................................................................. 4

BAB III METODE PENELITIAN ............................................................ 25

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN ..................................................... 31

DAFTAR PUSTAKA .................................................................................... 43

Tabel 3.1 Komposisi Fase Gerak ............................................................... 26

Gambar 2.1 Struktur kimia N-(hidroksietil)-p-metoksi sinamamida ........... 4

Lampiran 1 Alur penelitian ......................................................................... 46

1.1 Latar Belakang

1 UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

dan/atau biofarmasetik dan uji farmakologi klinik (Food and Drug

1.2 Perumusan masalah

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

c. Apakah metode analisis N-(hidroksietil)-p-metoksi sinamamida dalam

1.3 Tujuan Penelitian

1.4 Manfaat Penelitian

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

2.1 N-(hidroksietil)-p-metoksi sinamamida

Gambar 2.1 Struktur kimia N-(hidroksietil)-p-metoksi sinamamida

Nama kimia : N-(hidroksietil)-p-metoksi sinamamida

N-(hidroksietil)-p-metoksi sinamamida merupakan senyawa hasil

4 UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

2.3 Analisis Obat dalam Plasma

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

Ada beberapa teknik penyiapan sampel yang biasa digunakan untuk

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

c. Ekstraksi fase padat

2.4 Kromatografi Cair Kinerja Tinggi

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

kromatografi. Pemisahan solut dipengaruhi oleh distribusi solut

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

Keterangan : 1 = Wadah fase gerak; 2 = saluran penghubung dengan frit; 3 =

Gambar 2.2 Diagram Alat dan Komponen KCKT

2.4.2.1 Wadah Fase Gerak pada KCKT

2.4.2.2 Fase Gerak pada KCKT

2.4.2.3 Pompa pada KCKT

2.4.2.4 Penyuntikan Sampel pada KCKT

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

Pada saat penyuntikan, katup diputar sehingga fase gerak

2.4.2.5 Kolom pada KCKT

2.4.2.6 Fase Diam pada KCKT

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

Hasil reaksi yang diperoleh disebut dengan silika fase

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

e. Signal yang dihasilkan berbanding lurus dengan

Beberapa detektor yang sering digunakan pada KCKT :

b. Detektor photodiode-array (PDA)

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

flouresensi ini sangat spesifik. Disamping itu, detektor

d. Detektor Indeks Bias

2.4.2.8 Komputer, Integrator, atau Rekorder