BAB VIII VEKTOR KLONING

Bab ini akan membahas pengertian dan macam-macam vektor kloning, baik yang
digunakan pada sel inang prokariot maupun eukariot. Setelah mempelajari pokok bahasan
di dalam bab ini mahasiswa diharapkan mampu menjelaskan:
1. pengertian vektor kloning,
2. ciri-ciri plasmid,
3. ciri-ciri kosmid,
4. ciri-ciri bakteriofag, dan
5. ciri-ciri vektor kloning pada khamir dan eukariot tingkat
tinggi.

Pengertian dan Macam-macam Vektor Kloning

Pada Bab IX antara lain telah dibicarakan bahwa transformasi sel inang dilakukan
menggunakan perantara vektor. Jadi, vektor adalah molekul DNA yang berfungsi sebagai
wahana atau kendaraan yang akan membawa suatu fragmen DNA masuk ke dalam sel
inang dan memungkinkan terjadinya replikasi dan ekspresi fragmen DNA asing tersebut.
Vektor yang dapat digunakan pada sel inang prokariot, khususnya E. coli, adalah
plasmid, bakteriofag, kosmid, dan fasmid. Sementara itu, vektor YACs dan YEps dapat
digunakan pada khamir. Plasmid Ti, baculovirus, SV40, dan retrovirus merupakan
vektor-vektor yang dapat digunakan pada sel eukariot tingkat tinggi.

Plasmid
Secara umum plasmid dapat didefinisikan sebagai molekul DNA sirkuler untai
ganda di luar kromosom yang dapat melakukan replikasi sendiri. Plasmid tersebar luas di
antara organisme prokariot dengan ukuran yang bervariasi dari sekitar 1 kb hingga lebih
dari 250 kb (1 kb = 1000 pb).
Agar dapat digunakan sebagai vektor kloning, plasmid harus memenuhi syarat-
syarat berikut ini:
1. mempunyai ukuran relatif kecil bila dibandingkan dengan pori dinding sel inang
sehingga dapat dengan mudah melintasinya,
2. mempunyai sekurang-kurangnya dua gen marker yang dapat menandai masuk
tidaknya plasmid ke dalam sel inang,
3. mempunyai tempat pengenalan restriksi sekurang-kurangnya di dalam salah satu
marker yang dapat digunakan sebagai tempat penyisipan fragmen DNA, dan
4. mempunyai titik awal replikasi (ori) sehingga dapat melakukan replikasi di dalam sel
inang.
Salah satu contoh plasmid buatan yang banyak digunakan dalam kloning gen
adalah pBR322. Plasmid ini dikonstruksi oleh F. Bolivar dan kawan-kawanya pada tahun
1977. Urutan basa lengkapnya telah ditentukan sehingga baik tempat marker maupun
pengenalan restriksinya juga telah diketahui. Sayangnya, tempat pengenalan EcoR I,
salah satu enzim restriksi yang sangat umum digunakan, terletak di luar marker. Oleh
karena salah satu marker akan menjadi tempat penyisipan fragmen DNA asing, maka
EcoR I tidak dapat digunakan untuk memotong pBR322 di tempat penyisipan tersebut.
Namun, saat ini telah dikonstruksi derivat-derivat pBR322 yang mempunyai tempat
pengenalan EcoR I di dalam marker, misalnya plasmid pBR324 dan pBR325 yang
masing-masing mempunyai tempat pengenalan EcoR I di dalam gen struktural kolisin
dan di dalam gen resisten kloramfenikol.
EcoR I
ampR tetR

4.363 kb

3.147
(ori)

Gambar 11.1. Plasmid pBR322

ampR = marker resisten ampisilin
tetR = marker resisten tetrasiklin

Misalnya saja kita menyisipkan suatu fragmen DNA pada daerah marker resisten
ampisilin dengan memotong daerah ini menggunakan enzim restriksi tertentu selain
EcoR I (mengapa harus selain EcoR I?). Plasmid pBR322 yang tersisipi oleh fragmen
DNA akan kehilangan sifat resistensinya terhadap ampisilin, tetapi masih mempunyai

Bahan ajar ini diambil dari Susanto (2000) Page 2

sifat resistensi terhadap tetrasiklin. Oleh karena itu, ketika plasmid pBR322 rekombinan
ini dimasukkan ke dalam sel inangnya, yakni E. coli, bakteri transforman ini tidak
mampu tumbuh pada medium yang mengandung ampisilin, tetapi tumbuh pada medium
tetrasiklin. Secara alami E. coli tidak mampu tumbuh baik pada medium ampisilin
maupun tetrasiklin sehingga sel transforman dapat dengan mudah dibedakan dengan sel
nontransforman yang tidak mengandung pBR322 sama sekali. Sementara itu, E. coli
transforman yang membawa plasmid pBR322 utuh (religasi) mampu tumbuh pada kedua
medium antibiotik tersebut. Jadi, untuk memperoleh sel E. coli transforman yang
membawa DNA rekombinan dicari koloni yang hidup di tetrasiklin tetapi mati di
ampisilin. Secara teknis pekerjaan ini dilakukan menggunakan transfer koloni atau
replica plating.

Bakteriofag λ
Bakteriofag atau fag λ merupakan virus kompleks yang menginfeksi bakteri E.
coli. Berkat pengetahuan yang memadai tentang fag ini, kita dapat memanfaatkannya
sebagai vektor kloning semenjak masa-masa awal perkembangan rekayasa genetika.
DNA λ yang diisolasi dari partikel fag ini mempunyai konformasi linier untai ganda
dengan panjang 48,5 kb. Namun, masing-masing ujung fosfatnya berupa untai tunggal
sepanjang 12 pb yang komplementer satu sama lain sehingga memungkinkan DNA λ
untuk berubah konformasinya menjadi sirkuler. Dalam bentuk sirkuler, tempat
bergabungnya kedua untai tunggal sepanjang 12 pb tersebut dinamakan kos.
Seluruh urutan basa DNA λ telah diketahui. Secara alami terdapat lebih dari satu
tempat pengenalan restriksi untuk setiap enzim restriksi yang biasa digunakan. Oleh
karena itu, DNA λ tipe alami tidak cocok untuk digunakan sebagai vektor kloning. Akan
tetapi, saat ini telah banyak dikonstruksi derivat-derivat DNA λ yang memenuhi syarat
sebagai vektor kloning. Ada dua macam vektor kloning yang berasal dari DNA λ , yaitu
(1) vektor insersional, yang dengan mudah dapat disisipi oleh fragmen DNA asing,
(2) vektor substitusi, yang untuk membawa fragmen DNA asing harus membuang
sebagian atau seluruh urutan basanya yang terdapat di daerah nonesensial dan
menggantinya dengan urutan basa fragmen DNA asing tersebut.

Bahan ajar ini diambil dari Susanto (2000) Page 3

 Di antara kedua macam vektor λ tersebut, vektor substitusi lebih banyak
digunakan karena kemampuannya untuk membawa fragmen DNA asing hingga 23 kb.
Cara substitusi fragmen DNA asing pada daerah nonesensial membutuhkan dua
tempat pengenalan restriksi untuk setiap enzim restriksi. Jika suatu enzim restrisksi
memotong daerah nonesensial di dua tempat berbeda, maka segmen DNA λ di antara
kedua tempat tersebut akan dibuang untuk selanjutnya digantikan oleh fragmen DNA
asing. Jika pembuangan segmen DNA λ tidak diikuti oleh substitusi fragmen DNA
asing, maka akan terjadi religasi vektor DNA λ yang kehilangan sebagian segmen pada
daerah nonesensial. Vektor religasi semacam ini tidak akan mampu bertahan di dalam sel
inang. Dengan demikian, ada suatu mekanisme seleksi automatis yang dapat
membedakan antara sel inang dengan vektor rekombinan dan sel inang dengan vektor
religasi.
Bakteriofag λ mempunyai dua fase daur hidup, yaitu fase litik dan fase lisogenik.
Pada fase litik, transfeksi sel inang (istilah transformasi untuk DNA fag) dimulai dengan
masuknya DNA λ yang berubah konformasinya menjadi sirkuler dan mengalami
replikasi secara independen atau tidak bergantung kepada kromosom sel inang. Setelah
replikasi menghasilkan sejumlah salinan DNA λ sirkuler, masing-masing DNA ini akan
melakukan transkripsi dan translasi membentuk protein kapsid (kepala). Selanjutnya, tiap
DNA akan dikemas (packaged) dalam kapsid sehingga dihasilkan partikel λ baru yang
akan keluar dari sel inang untuk menginfeksi sel inang lainnya. Sementara itu, pada fase
lisogenik DNA λ akan terintegrasi ke dalam kromosom sel inang sehingga replikasinya
bergantung kepada kromosom sel inang. Fase lisogenik tidak menimbulkan lisis pada sel
inang.
Di dalam medium kultur, sel inang yang mengalami lisis akan membentuk plak
(plaque) berupa daerah bening di antara koloni-koloni sel inang yang tumbuh. Oleh
karena itu, seleksi vektor rekombinan dapat dilakukan dengan melihat terbentuknya plak
tersebut.

Bahan ajar ini diambil dari Susanto (2000) Page 4

 % total molekul

12 pb 15 38 rekombinasi 70 80 85 95 100
5’ dan integrasi 3’
3’ daerah non esensial daerah sint fungsi lisis 5’
kepala ekor cI DNA lanjut inang 12 pb

a)

kos
12 pb
lisis inang kepala

ekor
fungsi lanjut

daerah
sintesis DNA nonesensial

cI
b)
Gambar 11.2. DNA bakteriofag λ
a) konformasi linier (di luar sel inang)
b) konformasi sirkuler (di dalam sel inang)

Kosmid
Kosmid merupakan vektor yang dikonstruksi dengan menggabungkan kos dari
DNA λ dengan plasmid. Kemampuannya untuk membawa fragmen DNA sepanjang 32
hingga 47 kb menjadikan kosmid lebih menguntungkan daripada fag λ dan plasmid.

Vektor YACs
Seperti halnya kosmid, YACs (yeast artifisial chromosomes atau kromosom
buatan dari khamir) dikonstruksi dengan menggabungkan antara DNA plasmid dan

Bahan ajar ini diambil dari Susanto (2000) Page 5

segmen tertentu DNA kromosom khamir. Segmen kromosom khamir yang digunakan
terdiri atas sekuens telomir, sentromir, dan titik awal replikasi.
YACs dapat membawa fragmen DNA genomik sepanjang lebih dari 1 Mb. Oleh
karena itu, YACs dapat digunakan untuk mengklon gen utuh manusia, misalnya gen
penyandi cystic fibrosis yang panjangnya 250 kb. Dengan kemampuannya itu YACs
sangat berguna dalam pemetaan genom manusia seperti yang dilakukan pada Proyek
Genom Manusia.

Bahan ajar ini diambil dari Susanto (2000) Page 6